JP4672815B2 - L−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子;
(c)配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(i)分子量:43kDa(SDS−PAGE);
(ii)基質特異性:N−サクシニルターシャリーロイシン、N−サクシニルシクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−4−ブロモフェニルアラニンに作用する;
(iii)温度安定性:30分間熱処理した場合、70℃では安定であり75℃以上では失活する;
(iv)至適温度:pH7〜8で反応させる場合、温度55〜60℃において作用が至適である;および
(v)至適pH:60℃で30分間反応させる場合、pH7において作用が至適である。
反応液中のN−サクシニル−DL−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に1重量%〜30重量%である。
完全な除去を表し、5は像受容層からの中間層及び乳剤層の除去がないことを表す。
白い点の全く存在しないことを表し、5は印刷領域で非常に多い数の白い点を示す。
(1)N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンの合成
L−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)10gを水50mLと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gに溶解し、無水コハク酸8gと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gを加え、20℃〜40℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンの白色粉末を14g得た。
(2)N−サクシニル−L−バリンの合成
L−バリン(ナカライテスク製)10gを水50mLと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)17gに溶解し、無水コハク酸(ナカライテスク製)8.8gと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)17gを加え、20℃〜40℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸(ナカライテスク製)で中和後、酢酸エチル(ナカライテスク製)で抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、N−サクシニル−L−バリンの白色粉末を15g得た。
(3)N−サクシニル−L−フェニルアラニン、N−サクシニル−L−トリプトファン、N−サクシニル−L−アスパラギン、N−サクシニル−L−アスパラギン酸、N−サクシニル−L−セリン、N−サクシニル−L−グルタミン酸、N−サクシニル−L−シクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−L−4−ブロモフェニルアラニンの合成
これらのN−サクシニル−L−アミノ酸は、(2)のN−サクシニル−L−バリンの合成方法に準じた方法で合成した。
(1)N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製
1M HEPES pH7.9
10mM CoCl2溶液
150mM N−サクシニル−L−ターシャリーロイシン
上記1M HEPES(2.0mL)、10mM CoCl2溶液(0.1mL)、150mM N−サクシニル−L−ターシャリーロイシン(1.0mL)および水(6.4mL)を混合して反応試薬とした。
(2)N−サクシニル−L−バリン、N−サクシニル−L−フェニルアラニン、N−サクシニル−L−トリプトファン、N−サクシニル−L−アスパラギン、N−サクシニル−L−アスパラギン酸、N−サクシニル−L−セリン、N−サクシニル−L−グルタミン酸、N−サクシニル−L−シクロヘキシルグリシン、またはN−サクシニル−L−4−ブロモフェニルアラニンを含む反応試薬の調製
これらのN−サクシニル−L−アミノ酸を含む反応試薬は、(1)のN−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを含む反応試薬の調製と同様の方法で調製した。
D−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)とL−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)の等モル混合物10gを水50mLと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gに溶解し、無水コハク酸8gと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gを加え、20℃〜40℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。濃縮物にヘキサンを加えて結晶化し、乾燥して、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンの白色粉末を14g得た。
1M HEPES pH7.9
10mM CoCl2溶液
150mM N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン
上記1M HEPES(2.0mL)、10mM CoCl2溶液(0.1mL)、150mM N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン(1.0mL)および水(6.4mL)を混合して反応試薬とした。
(1)特開2008−61642号公報に記載のN−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503の染色体DNAを次の方法で分離した。該菌株をLB液体培地(5mL仕込み/30mL容試験管;1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%NaCl、pH7.4)に1白金耳植菌し、50℃にて一晩振とう培養した。得られた培養物1mLを採取して、遠心分離(12000rpm、10分間、4℃)により菌体を回収した。回収した菌体よりMagExtractor−genome−キット(東洋紡製)を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体DNAを抽出した。上記の操作により、得られた培養物1mLより得られた菌体から、約20μgの染色体DNAを取得した。
次に、得られた染色体DNAを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503株由来のN−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子(配列番号3)を、PCRで増幅した。PCRプライマーとしては、配列番号4に示される5’プライマーおよび配列番号5に示される3’プライマーを用いた。これらのPCRプライマーおよびKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)を用いて、上記の染色体DNAを鋳型としてPCR(94℃・15秒、55℃・30秒、68℃・90秒を30サイクル)を行った。
次に、クローニングキットTarget Clone−Plus(東洋紡製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターpBluescriptにクローニングし、組換え発現プラスミドpBSNAR1を取得した。このpBSNAR1を用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーJM109(pBSNAR1)と命名した。
TB培地(500mL)を2L容坂口フラスコ2個に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が100μg/mLと0.1mMになるように添加した。この培地に、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地で予め30℃、16時間培養したエシェリヒア・コリーJM109(pBSNAR1)の培養液を5mL接種し、37℃で24時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、50℃、1時間の熱処理後、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で透析を行った。更にDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、およびオクチルセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス製)の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503株の染色体DNAを次の方法で分離した。該菌株をLB液体培地(5mL仕込み/30mL容試験管;1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%NaCl、pH7.4)に1白金耳植菌し、50℃にて一晩振とう培養した。得られた培養物1mLを採取して、遠心分離(12000rpm、10分間、4℃)により菌体を回収した。回収した菌体よりMagExtractor−genome−キット(東洋紡製)を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体DNAを抽出した。上記の操作により、得られた培養物1mLより得られた菌体から、約20μgの染色体DNAを取得した。
次に、得られた染色体DNAを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503株由来のL−サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子(配列番号1)を、PCRで増幅した。PCRプライマーとしては、配列番号6に示される5’プライマーおよび配列番号7に示される3’プライマーを用いた。これらのPCRプライマー、およびKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)を用いて、上記の染色体DNAを鋳型としてPCR(94℃・15秒、55℃・30秒、68℃・90秒を30サイクル)を行った。
次に、クローニングキット(Target Clone(登録商標)−Plus−、東洋紡製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターpBluescriptにクローニングし、組換え発現プラスミドpLSA1を取得した。このpLSA1を用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーJM109(pLSA1)と命名した。
TB培地(500mL)を2L容坂口フラスコ2個に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が100μg/mLと0.1mMになるように添加した。この培地に、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地で予め30℃、16時間培養したエシェリヒア・コリーJM109(pLSA1)の培養液を5mL接種し、37℃で24時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、50℃、1時間の熱処理後、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で透析を行った。さらにDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、およびオクチルセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス製)の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、SDS−PAGEにより、単一であることが確認された。
上述のN−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを含む反応試薬(9.5mL)に、実施例1で調製したL−サクシニルアミノアシラーゼ(2.3mg/mL、0.5mL)を添加し、緩やかに混和後、57℃で6時間反応を行なった。盲検はL−サクシニルアミノアシラーゼ溶液の代わりに50mM K−リン酸緩衝液 pH7.5を試薬混合液に加えて同様に反応させた。酵素反応後、溶液のサンプルをTLC上に、スポットし、展開溶媒(ブタノール:酢酸:水=3:1:1)で展開し、TLCで、ニンヒドリン反応により、生成物であるアミノ酸を呈色させ、生成物を検出することによりL−アミノ酸を直接定量した。
(1)N−アセチル−L−アミノ酸の合成
L−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)4.7gを氷酢酸(ナカライテスク製、40mL)に懸濁させ、これに3倍モルの無水酢酸(ナカライテスク製)を添加しながら40〜50℃に熱し、反応させた。減圧下で氷酢酸を留去後、粗結晶を得た。次に、粗結晶を20%イソプロピルアルコールで再結晶化した。沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、N―アセチル−L−ターシャリーロイシンの粉末を得た。詳細は(J.P.Greenstein,Chemistry of Amino acids,1961,3)に記載されている。
Acylase AMANO(シグマ社、コードNo.01818−5G)及びporcine kidney AcylaseI(シグマ社、コードNo.A3010−100MG)をそれぞれ2600U/mLとなるように50mM K−リン酸緩衝液 pH7.5で溶解してL−アミノアシラーゼ溶液とした。
1M HEPES pH7.9
10mM CoCl2溶液
150mM N−アセチル−L−ターシャリーロイシン
上記1M HEPES(2.0mL)、10mM CoCl2溶液(0.1mL)、150mM N−アセチル−L−ターシャリーロイシン(1.0mL)および水(6.4mL)を混合して反応試薬とした。
上述のN−アセチル−L−ターシャリーロイシンを含む反応試薬(9.5mL)に、上述の市販のL−アミノアシラーゼ溶液(比較例2)(0.5mL)を添加し、緩やかに混和後、25℃で12時間反応を行なった。盲検はL−アミノアシラーゼ溶液の代わりに50mM K−リン酸緩衝液 pH7.5を試薬混合液に加えて同様に反応させた。酵素反応後、実施例2と同様にしてTLCおよびニンヒドリン反応によりL−アミノ酸を直接定量した。
N−サクシニル−L−アミノ酸として、N−サクシニル−L−バリン、N−サクシニル−L−フェニルアラニン、N−サクシニル−L−トリプトファン、N−サクシニル−L−アスパラギン、N−サクシニル−L−アスパラギン酸、N−サクシニル−L−セリン、N−サクシニル−L−グルタミン酸、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシン、N−サクシニル−L−シクロヘキシルグリシン、またはN−サクシニル−L−4−ブロモフェニルアラニンを用い、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンに準じた方法で反応試薬を調製した。この反応試薬を用い、実施例2と同様の条件で実施例1のL−サクシニルアミノアシラーゼを反応させ、L−アミノ酸を生成させ、実施例2と同様にしてL−アミノ酸を直接定量した。
1重量% N−サクシニル−L−ターシャリーロイシン溶液(pH7〜8)10mL(1mM CoCl2を含む)に、L−サクシニルアミノアシラーゼ溶液1mL(2.3mg/mL)を添加し、撹拌しながら57℃で90時間反応を行なうことにより、L−ターシャリーロイシンを得た。反応開始の16時間後、42時間後、65時間後、および90時間後にサンプルを採取して以下の条件でHPLC測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
カラム:Inertsil ODS−2(粒径5μm、内4.6mm×長さ250mm)GLサイエンス(株)製
溶離液:pH2.3リン酸水溶液/HPLC用アセトニトリル=80:20
流速:0.8mL/min カラム温度:40℃ 検出器:210mn
1重量% N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン溶液(pH7〜8)10mL(1mM CoCl2を含む)に、L−サクシニルアミノアシラーゼ溶液1mL(2.3mg/mL)を添加し、撹拌しながら57℃で90時間反応を行なうことにより、L−ターシャリーロイシンを得た。反応終了後、サンプルを採取し、実施例4と同様の条件でHPLC測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。その結果、収率は45%以上であり、理論上の最高収率である50%に近い値が得られた。
1重量% N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン溶液(pH7〜8)10mL(1mM CoCl2を含む)に、実施例1で調製したL−サクシニルアミノアシラーゼの溶液1mL(2.3mg/mL)と、上述のN−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ0.1mL(10.5mg/mL)を添加し、撹拌しながら57℃で90時間反応を行なうことにより、L−ターシャリーロイシンを合成した。反応開始の24時間後および90時間後にサンプルを採取し、実施例4と同様の条件でHPLC測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
Claims (7)
- 下記(a)〜(d)のいずれか1つで表されることを特徴とするタンパク質:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1に記載の塩基配列に対して90%以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質。 - 下記(a)〜(d)のいずれか1つで表されることを特徴とする遺伝子:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子;
(c)配列番号1に記載の塩基配列に対して90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質をコードする遺伝子;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有し、N−サクシニル−L−ターシャリーロイシンを基質として利用することができるタンパク質をコードする遺伝子。 - 請求項2に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を用いてN−サクシニル−DL−アミノ酸中のN−サクシニル−L−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするL−アミノ酸の製造方法。
- N−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN−サクシニル−D−アミノ酸をラセミ化してN−サクシニル−L−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を用いてN−サクシニル−DL−アミノ酸中のN−サクシニル−L−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびN−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてN−サクシニル−D−アミノ酸をラセミ化してN−サクシニル−L−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- N−サクシニル−DL−アミノ酸がN−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンであることを特徴とする請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
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