JP4672654B2

JP4672654B2 - SiRNA against VP-1 of JC virus and pharmaceutical composition comprising the same

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Publication number: JP4672654B2
Application number: JP2006513677A
Authority: JP
Inventors: 和郎長嶋; 洋文澤; 靖子大場
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-05-24
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2025-04-26
Also published as: JPWO2005113014A1; WO2005113014A1

Description

本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡｉ法によるＪＣウイルス感染細胞に対する治療のための医薬組成物、そのための有効成分であるポリヌクレオチドを提供するものである。本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物、そのためのポリヌクレオチド、それらの製造のための使用に関する。 The present invention provides a pharmaceutical composition for treating JC virus-infected cells by the RNAi method using a short interfering RNA (siRNA) against the gene encoding VP-1 of JC virus, and a polynucleotide as an active ingredient therefor Is. The present invention relates to the treatment of JC virus infection comprising a short interfering RNA (siRNA) for a gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming the siRNA, and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention relates to a pharmaceutical composition, a polynucleotide therefor, and their use for production.

ＪＣウイルス（ＪＣＶ）はヒト大脳に脱髄病変を生じる進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）の原因ウイルスである。ＪＣウイルスはポリオーマウイルス属に属する２本鎖環状ＤＮＡウイルスであり、幼・小児期に過半数の人が感染し一生の持続感染を起こす。通常は７０％以上の健常人の尿路系に不顕性感染しているが、健常人で発症に至ることは極めてまれなことであった。しかし、宿主が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired immunodeficiency syndrome）などにより免疫不全状態に陥ると脳に移行し、オリゴデンドログリアに感染し増殖することで致死的な脱髄を起こす。また、ミエリン生成細胞である希突起膠細胞 (oligodendrocytes)が損傷を受けることも報告されている。さらに、最近では痴呆症の原因の一部としてＪＣＶとの関係も指摘されてきている。 JC virus (JCV) is a causative virus for progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), which causes demyelinating lesions in the human cerebrum. The JC virus is a double-stranded circular DNA virus belonging to the genus Polyomavirus, and a majority of people are infected during childhood and childhood and cause lifelong persistent infection. Normally, 70% or more of the healthy people have an occult infection in the urinary tract, but it has been extremely rare for healthy people to develop symptoms. However, when the host enters an immunodeficiency state due to acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) or the like, it moves to the brain, and is infected with oligodendroglia to proliferate and cause fatal demyelination. It has also been reported that oligodendrocytes, myelin-producing cells, are damaged. Furthermore, recently, a relationship with JCV has been pointed out as a cause of dementia.

１９８４年にフリスク (Frisque)らはＰＭＬ患者の脳組織よりＪＣウイルス（Mad-1株）を分離し（非特許文献１参照）、その後、ＪＣウイルスの感染について抗ＪＣウイルス抗体を用いる抗原の検出や、免疫組織染色法などの各種の診断法が開発されてきている（非特許文献２参照）。例えば、ＪＣウイルス粒子の製造方法及びＪＣウイルス外郭蛋白の製造方法に関するもの（特許文献１参照）、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質を抗原とする抗ＪＣウイルス抗体による診断法（特許文献２〜４参照）などについての特許出願がなされている。
また、ＰＭＬの治療法については、現在の段階では未だ有効な臨床的な治療法は確立されていない。ＰＭＬの治療法については、ＡＭＰＡ受容体又はカイニン酸受容体が関与する疾患の治療剤としてのピリダジノンおよびトリアジノン化合物類を使用する方法（特許文献５参照）、及び、１，２−ジヒドロピリジン化合物類を使用する方法（特許文献６参照）などが提案されているが、有効な治療薬は未だ開発されていないのが現状である。また、シトシンアラビノサイド（cytosine arabinoside）やシドフォビル（cidofovir）による治療は、ＰＭＬに罹った個体での有効性を証明することに失敗している。ＤＮＡトポイソメラーゼを阻害してインビトロでＪＣウイルスの複製を遮断するトポテカン（topotecan）による治験が現在進行中である。
さらに、本発明者らは、ＪＣウイルスの増殖を阻止する目的としてＪＣウイルスが有する遺伝子のうちで最も小さな遺伝子であるアグノ（ａｇｎｏ）タンパク質のアミノ酸配列を変異させてこの遺伝子の発現を停止させると、ＪＣウイルスの増殖が阻止されることを見出してきている（特許文献７参照）。In 1984, Frisque et al. Isolated JC virus (Mad-1 strain) from brain tissue of PML patients (see Non-Patent Document 1), and then detected antigen using anti-JC virus antibody for infection with JC virus. Various diagnostic methods such as immunohistochemical staining have been developed (see Non-Patent Document 2). For example, a method for producing a JC virus particle and a method for producing a JC virus outer protein (see Patent Document 1), and a diagnostic method using an anti-JC virus antibody using the VP-1 protein of JC virus as an antigen (see Patent Documents 2 to 4) ) And other patent applications have been filed.
In addition, regarding the treatment method for PML, an effective clinical treatment method has not yet been established at the present stage. For the treatment of PML, a method using pyridazinone and triazinone compounds as therapeutic agents for diseases involving AMPA receptors or kainate receptors (see Patent Document 5), and 1,2-dihydropyridine compounds Although a method of use (see Patent Document 6) has been proposed, an effective therapeutic agent has not been developed yet. Also, treatment with cytosine arabinoside and cidofovir has failed to prove efficacy in individuals with PML. A trial with topotecan that inhibits DNA topoisomerase and blocks JC virus replication in vitro is currently underway.
Furthermore, when the present inventors stop the expression of this gene by mutating the amino acid sequence of the agno protein, which is the smallest gene among the genes possessed by the JC virus, for the purpose of preventing the growth of the JC virus. And JC virus growth has been found to be inhibited (see Patent Document 7).

一方、近年になって、特定の遺伝子の発現を抑制する手法のひとつとしてＲＮＡｉ（RNA interference）法が開発されてきた。ＲＮＡｉは、もともと２本鎖ＲＮＡの導入により、それと相同なＲＮＡの発現が強力に抑制されるという生命現象として１９９８年に発見されたものであり、この現象を利用して２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）の導入により標的とする特定の遺伝子の発現を抑制する方法である。細胞に導入された長い（数百塩基対）ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒという２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）を特異的に切断するＲＮａｓｅIII様の酵素により分解されて、２１〜２５塩基対程度の短いｄｓＲＮＡ（これを、small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ。）を生成する。このｓｉＲＮＡが１本鎖の解離し、解離した１本鎖のｓｉＲＮＡが複合体ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）として標的のｍＲＮＡを特異的に認識して切断することにとり、当該ｍＲＮＡの発現が抑制されることになる。ＲＮＡｉ法としては、ｄｓＲＮＡの導入に代えて、ｓｉＲＮＡを導入することも行われている。
ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）によるＲＮＡｉ法が、細胞やウイルスの遺伝子発現を抑制するアプローチとして現在広く使用されるようになってきている（非特許文献３参照）。ｓｉＲＮＡｓをウイルスと同時にあるいは事前に投与することによってウイルスの感染を防げることが数々の研究によって示されている（非特許文献４参照）が、細胞や組織でいったん確立した感染をＲＮＡｉによって除去することは実証されていない。On the other hand, recently, RNAi (RNA interference) method has been developed as one of the techniques for suppressing the expression of a specific gene. RNAi was originally discovered in 1998 as a life phenomenon in which the expression of RNA homologous to it was strongly suppressed by the introduction of double-stranded RNA, and double-stranded RNA (dsRNA) was utilized by utilizing this phenomenon. ) To suppress the expression of a specific target gene. Long (several hundred base pairs) dsRNA introduced into cells is degraded by an RNaseIII-like enzyme that specifically cleaves double-stranded RNA (dsRNA) called Dicer, resulting in a short dsRNA of about 21 to 25 base pairs (this) Is called small interfering RNA (siRNA). This siRNA is dissociated into a single strand, and the dissociated single strand siRNA specifically recognizes and cleaves the target mRNA as a complex RISC (RNA-induced silencing complex), thereby suppressing the expression of the mRNA. Will be. As the RNAi method, siRNA is introduced instead of dsRNA.
The RNAi method using siRNA (small interfering RNA) is now widely used as an approach for suppressing gene expression of cells and viruses (see Non-Patent Document 3). Numerous studies have shown that siRNAs can be prevented at the same time or pre-administered with viruses (see Non-Patent Document 4), but removal of infection once established in cells and tissues by RNAi Has not been demonstrated.

特開平０９−２２４６５８号JP 09-224658 A 特開平０９−０６７３９７号JP 09-067397 特表２０００−５００９７３号Special table 2000-500973 特開２００３−０６１６９３号JP 2003-061693 A 再公表公報ＷＯ０２／０２２５８７号Republished publication WO02 / 022587 再公表公報ＷＯ０１／０９６３０８号Republication publication WO 01/096308 特開２００３−１６０５１０号JP 2003-160510 A Frisque,R.J. et al., J. Virol., 51, 458-469, 1984Frisque, R.J. et al., J. Virol., 51, 458-469, 1984 E.O.Major, et al., Clin. Microbiol. Rev., 5, 49-73, 1992E.O.Major, et al., Clin. Microbiol. Rev., 5, 49-73, 1992 Gitlin L., et al., Nature, vol.418, pp.430-434, 2002Gitlin L., et al., Nature, vol.418, pp.430-434, 2002 Andino R., Nature Biotechnol., vol.21, pp.629-630, 2003Andino R., Nature Biotechnol., Vol.21, pp.629-630, 2003

本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１の発現を抑制し、ＪＣウイルスの増殖を抑制することによりＪＣウイルス感染症、例えば進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）を治療するための医薬組成物、そのためのポリヌクレオチド、及びその使用を提供する。 The present invention is directed to treating JC virus infections, such as progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), by inhibiting the expression of JC virus VP-1 and inhibiting the growth of JC virus. Pharmaceutical compositions, polynucleotides therefor, and uses thereof are provided.

本発明者らは、ＪＣウイルスの増殖を抑制するために、アグノタンパク質（Agnoprotein）の発現を抑制すればよいことを報告してきた（特許文献７参照）が、そのためにはアグノタンパク質をコードする遺伝子（ａｇｎｏ遺伝子）の塩基配列を改変するなど、煩雑な操作を必要としていた。そこで、簡便な手法でＪＣウイルスの増殖を抑制できる手法を検討してきたところ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法により感染後の細胞においても短い干渉ＲＮＡ（small interfering RNA:ｓｉＲＮＡ）を感染細胞に導入することにより、当該細胞における感染を治療することができることを実証することに成功し、ＪＣウイルスの感染細胞における治療剤として短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が有効であることを見出した。 The present inventors have reported that the expression of Agnoprotein should be suppressed in order to suppress the growth of JC virus (see Patent Document 7). For this purpose, the gene encoding the Agnoprotein is used. Complicated operations such as altering the base sequence of (agno gene) were required. Therefore, we have studied a technique that can suppress the growth of JC virus by a simple technique. Introducing a short interfering RNA (siRNA) into infected cells using the RNA interference (RNAi) method. Thus, the inventors succeeded in demonstrating that infection in the cells can be treated, and found that short interfering RNA (siRNA) is effective as a therapeutic agent in cells infected with JC virus.

即ち、本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物に関する。
また、本発明は、前記本発明の医薬組成物の有効成分となる短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子であるポリヌクレオチド、より詳細には、ＤＮＡの配列として表記したときに少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列若しくはその相補配列又は対応するＲＮＡの配列を有する、４０塩基以下の長さからなるポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。より詳細には、本発明の使用は、ＪＣウイルス感染症を治療するための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用、及び、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物の製造のための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用に関する。That is, the present invention relates to a JC virus infection comprising a short interfering RNA (siRNA) for a gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming the siRNA, and a pharmaceutically acceptable carrier. It relates to a pharmaceutical composition for the treatment of
Further, the present invention relates to a short interfering RNA (siRNA) or a polynucleotide that is a gene capable of forming the siRNA, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, more specifically, when expressed as a DNA sequence. The present invention relates to a polynucleotide having a length of 40 bases or less, which has at least a 5′-tgaggatctaaccgtgtga-3 ′ base sequence or a complementary sequence thereof or a corresponding RNA sequence.
Furthermore, the present invention relates to the use of the polynucleotide of the present invention described above. More particularly, the use of the present invention comprises the use of a short interfering RNA (siRNA) to the gene encoding VP-1 of the JC virus or a gene capable of forming the siRNA for treating a JC virus infection, and , A short interfering RNA (siRNA) for the gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming said siRNA, and a pharmaceutically acceptable carrier, for the treatment of JC virus infection It relates to the use of a short interfering RNA (siRNA) against the gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming said siRNA for the manufacture of a pharmaceutical composition.

さらに、本発明は、ＪＣウイルス感染症の患者に、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物の有効量を投与することからなるＪＣウイルス感染症、例えば進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）を治療する方法に関する。
また、本発明は、ＪＣウイルスに感染した細胞又は生体に、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を導入することからなるＪＣウイルスの増殖を抑制する方法に関する。Furthermore, the present invention provides a patient with JC virus infection with a short interfering RNA (siRNA) for a gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming the siRNA, and a pharmaceutically acceptable carrier. It relates to a method of treating a JC virus infection, for example progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition for the treatment of a JC virus infection comprising .
The present invention also relates to a JC virus comprising introducing a short interfering RNA (siRNA) for a gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming the siRNA into a cell or living body infected with JC virus. The present invention relates to a method for suppressing proliferation.

ＪＣウイルスは、５，１３０ｂｐの２本鎖環状ＤＮＡを有するウイルスで、複製開始起点の塩基を１番（ｎｔ．１）とした場合、ＶＰ−１遺伝子はｎｔ．１４６９−２５３３にコードされ、ＶＰ−１は２５４個のアミノ酸からなるタンパク質である（Frisque,R.J., et al., J. Virol. 51 (2), 458-469 (1984)）。ＶＰ−１をコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、ＶＰ−１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ＶＰ−１は、ＪＣウイルスの後期ｍＲＮＡのひとつであるアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡにより、アグノタンパク質と同じｍＲＮＡにコードされている。このｍＲＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。 The JC virus is a virus having a double-stranded circular DNA of 5,130 bp. When the base of the replication origin is the first (nt. 1), the VP-1 gene is nt. VP-1 is a protein consisting of 254 amino acids (Frisque, R.J., et al., J. Virol. 51 (2), 458-469 (1984)). The base sequence of the gene encoding VP-1 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence of VP-1 is shown in SEQ ID NO: 2. VP-1 is encoded by the same mRNA as the agnoprotein by an agnoprotein which is one of the late mRNAs of JC virus and an mRNA encoding VP-1. The base sequence of this mRNA is shown in SEQ ID NO: 3.

本発明におけるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としては、ＶＰ−１をコードする遺伝子から転写されて生成されるｍＲＮＡの塩基配列（センス配列）と相同な連続した少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１９塩基以上の塩基配列を有する１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、又は１９〜２５塩基の長さを有し、全長において少なくとも９０％以上、好ましくは１００％の相同性を有する２本鎖ＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＶＰ−１遺伝子のｍＲＮＡの翻訳領域又は非翻訳領域のどの部分から選択してもよいが、好ましくは翻訳領域から選択され、またｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように選択されるのが好ましい。好ましい塩基配列としては、センス側の配列として、
５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−３’、
からなるＲＮＡが挙げられる。
本発明における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる塩基対を形成しない塩基が存在していることが好ましい。このような塩基対を形成しない塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような塩基対を形成しない塩基が存在している好ましい例としては、センス側の配列として、
５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−ｄｔ−ｄｔ−３’、
（式中、ｄｔは塩基対を形成しない塩基を示す。）
からなるＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。The short interfering RNA (siRNA) for the gene encoding VP-1 of the JC virus in the present invention is a sequence that is homologous to the base sequence (sense sequence) of mRNA transcribed from the gene encoding VP-1. It has a length of at least 10 bases, preferably 15 bases or more, more preferably 15 to 40 bases having a base sequence of 19 bases or more, preferably 15 to 30 bases, 15 to 25 bases, or 19 to 25 bases , A double-stranded RNA having a homology of at least 90% or more, preferably 100% over the entire length. Such a base sequence of siRNA may be selected from any part of the translation region or untranslation region of mRNA of VP-1 gene, but is preferably selected from the translation region, and the total GC content of siRNA is 70. % Or less, preferably 30 to 70%, preferably 30 to 60%. As a preferable base sequence, as a sequence on the sense side,
5′-ugaggaucukaaccuguga-3 ′,
RNA consisting of
The short interfering RNA (siRNA) in the present invention preferably has a base that does not form a base pair consisting of 5 bases or less, preferably 2 bases, at the 3 ′ end. Examples of such base sequences that do not form base pairs include sequences such as ug-3 ′, uu-3 ′, tg-3 ′, and tt-3 ′, but are not limited thereto. . As a preferable example in which such a base that does not form a base pair exists, as a sequence on the sense side,
5′-ugaggaucukaaccuguga-dt-dt-3 ′,
(In the formula, dt represents a base that does not form a base pair.)
However, the present invention is not limited to this.

本発明における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としては、前記してきた塩基配列を有するＲＮＡと、その相補鎖からなる２本鎖ＲＮＡが挙げられるが、ヘアピンループ型の構造をとることにより、前記した１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、又は１９〜２５塩基の長さの部分が２本鎖となるような構造であってもよい。この場合におけるヘアピンループのループ部分の塩基配列としては、ループを形成することができる配列であれば特に制限はない。
また、本発明は、ＤＮＡの配列として表記したときに少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列若しくはその相補配列又は対応するＲＮＡの配列を有する、４０塩基以下の長さからなるポリヌクレオチドを提供するものであり、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよく、さらに２本鎖のＲＮＡであってもよい。これらのポリヌクレオチドは、３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる塩基対を形成しない塩基が存在していることが好ましい。
これらの本発明のポリヌクレオチドは、人工的に合成したものであってもよいし、生体内や細胞内で発現させたものであってもよい。Examples of the short interfering RNA (siRNA) in the present invention include the RNA having the above-described base sequence and the double-stranded RNA consisting of its complementary strand. By taking a hairpin loop type structure, It may have a structure in which a portion having a length of 40 bases, preferably 15 to 30 bases, 15 to 25 bases, or 19 to 25 bases is double-stranded. In this case, the base sequence of the loop portion of the hairpin loop is not particularly limited as long as it is a sequence capable of forming a loop.
The present invention also provides a polynucleotide having a length of 40 bases or less having at least a 5′-tgaggtatactacgtgtga-3 ′ base sequence or a complementary sequence thereof or a corresponding RNA sequence when expressed as a DNA sequence. The polynucleotide may be DNA, RNA, or double-stranded RNA. These polynucleotides preferably have a base which does not form a base pair consisting of 5 bases or less, preferably 2 bases, at the 3 ′ end.
These polynucleotides of the present invention may be artificially synthesized or may be expressed in vivo or in cells.

本発明におけるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成し得る遺伝子としては、生体内において前記した短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖からなるＲＮＡ及びアンチセンス鎖からなるＲＮＡを生成させることができ、これらからなる２本鎖ＲＮＡを形成することができるものであれば特に制限はない。例えば、前記したＲＮＡを細胞内で発現することができる遺伝子、好ましくはＤＮＡである。このような遺伝子としては、センス鎖のＲＮＡを発現できる遺伝子とアンチセンス鎖のＲＮＡを発現できる遺伝子との組み合わせからなる遺伝子が挙げられる。各々の遺伝子のプロモーターは同じ条件で発現するものであってもよいし、異なる条件で発現でするプロモーターであってもよい。
また、前記したヘアピンループ型の構造をとるＲＮＡを発現させる場合には、ヘアピンループ型の構造をとるＲＮＡの全長を発現することができる遺伝子、例えば、プロモーターの下流側にセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ループ部分をコードする配列、アンチセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ポリＴストレッチ配列、及びストップコドンからなる塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。
本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成し得る遺伝子におけるプロモーターとしては、恒常的に発現するためのプロモーターであってもよいし、特定の条件下で発現するためのプロモーターであってもよい。例えば、ＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）プロモーター（Brummerlkamp,T.R., et al., Science, 297, 1352-1354, 2002）、Ｕ６プロモーター（a) Lee NS. et al., Nature Biotech. 20, 500-505, 2002；b) Miyagishi M. & Taira K., Nature Biotech. 20, 497-500, 2002；c) Paul CP. et al., Nature Biotech. 20, 505-508, 2002）、Ｈ１プロモーター（Brummelkamp TR et al: Science 296, 550-553, 2002）、ｔＲＮＡプロモーター（Oshima K., et al., Cancer Research 63, 6809-6814, 15, 2003）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。The gene capable of forming a short interfering RNA (siRNA) for the gene encoding VP-1 of the JC virus (VP-1 gene) in the present invention comprises the sense strand of the short interfering RNA (siRNA) described above in vivo. There is no particular limitation as long as RNA consisting of RNA and antisense strand can be generated and double-stranded RNA consisting of these can be formed. For example, it is a gene, preferably DNA, that can express the above-mentioned RNA in a cell. Examples of such a gene include a gene comprising a combination of a gene capable of expressing a sense strand RNA and a gene capable of expressing an antisense strand RNA. The promoter of each gene may be expressed under the same conditions, or may be a promoter expressed under different conditions.
In addition, when RNA having a hairpin loop type structure is expressed, a gene capable of expressing the full length of the RNA having a hairpin loop type structure, for example, a sense strand RNA is encoded downstream of the promoter. A gene having a base sequence consisting of a sequence that encodes, a sequence that encodes a loop portion, a sequence that encodes RNA of an antisense strand, a poly-T stretch sequence, and a stop codon.
The promoter in the gene capable of forming the short interfering RNA (siRNA) of the present invention may be a promoter for constitutive expression or a promoter for expression under specific conditions. For example, RNA polymerase III (polIII) promoter (Brummerlkamp, TR, et al., Science, 297, 1352-1354, 2002), U6 promoter (a) Lee NS. Et al., Nature Biotech. 20, 500-505, 2002; b) Miyagishi M. & Taira K., Nature Biotech. 20, 497-500, 2002; c) Paul CP. Et al., Nature Biotech. 20, 505-508, 2002), H1 promoter (Brummelkamp TR et al: Science 296, 550-553, 2002), tRNA promoter (Oshima K., et al., Cancer Research 63, 6809-6814, 15, 2003) and the like, but are not limited thereto.

前記してきた本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を、生体内や細胞内に導入する方法としては、公知の各種の手法を採用することができる。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの１本鎖ＲＮＡを直接導入する方法や、環状ＲＮＡとして導入する方法、またＤＮＡの場合には公知の遺伝子導入法、例えば、プラスミドやウイルスなどのベクター、例えばレンチウイルスベクター（Rubinson, D.A. et al., Nature Genet. 33, 401-406, 2003）などを使用する方法などを採用することができる。したがって、本発明の医薬組成物における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子としては、単にこれらのポリヌクレオチドそのものだけでなく、これらのポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入用の遺伝子、例えば、これらのポリヌクレオチが生体内に導入するためのベクターに組み込まれている遺伝子などのすべての態様の遺伝子を包含するものである。 As a method for introducing the above-described short interfering RNA (siRNA) of the present invention or a gene capable of forming the siRNA into a living body or a cell, various known techniques can be employed. For example, a method of directly introducing each single-stranded RNA of the sense strand and the antisense strand, a method of introducing as a circular RNA, and a known gene introduction method in the case of DNA, for example, vectors such as plasmids and viruses, For example, a method using a lentiviral vector (Rubinson, DA et al., Nature Genet. 33, 401-406, 2003) or the like can be employed. Therefore, as a short interfering RNA (siRNA) or a gene capable of forming the siRNA in the pharmaceutical composition of the present invention, not only these polynucleotides themselves but also genes for gene introduction containing these polynucleotides, for example, These genes include all types of genes such as genes incorporated into vectors for introduction into the living body.

本発明は、ＪＣウイルス感染症の治療、即ちＪＣウイルスに既に感染した細胞においても、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡｉ法が有効であることという技術的思想に基づくものであり、既存のＲＮＡｉ法の応用を本発明の具体的な適用に応用可能であることは当業者が容易には理解されるところである。例えば、
ＷＯ００／６３３６４号（特表２００２−５４２２６３号）には、各種のウイルスに対するアンチセンスの適用やＲＮＡｉ法の適用が開示されており、この記載を参照して本明細書に取り込む。また、ＷＯ０１／０９２５１３号（特表２００３−５３５５８３号）には、ＲＮＡｉ法に随伴する因子類の操作によりＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを増強するための改良法が開示されており、この記載を参照して本明細書に取り込む。The present invention relates to the treatment of JC virus infection, that is, the RNAi method using a short interfering RNA (siRNA) against the gene encoding VP-1 of the JC virus (VP-1 gene) even in cells already infected with the JC virus. Those skilled in the art can easily understand that the application of the existing RNAi method can be applied to the specific application of the present invention based on the technical idea of being effective. For example,
WO00 / 63364 (Special Table 2002-542263) discloses the application of antisense to various viruses and the application of RNAi method, which are incorporated herein by reference. In addition, WO01 / 092513 (Special Table No. 2003-535583) discloses an improved method for enhancing RNAi-mediated gene silencing by manipulating factors associated with the RNAi method. Incorporated herein.

本発明の医薬組成物は、前記してきた短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を単独で使用する場合も包含しているが、医薬組成物を形成するための製薬学的に許容される担体をさらに含有しているものも包含している。本発明の製薬学的に許容される担体としては、本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を生体に投与又は導入するための処方をなすものであり、生理学的に無害で不活性なものが挙げられる。このような担体としては、例えば、殺菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、エタノール、グリセリン、ショ糖、乳糖などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、本発明の医薬組成物は、薬学上許容可能なその他の任意の成分、例えば、溶解補助剤などの各種の補助剤、安定剤、ｐＨ調節剤、及び他の活性成分などが含まれていてもよい。
さらに、本発明の医薬組成物には、細胞へのＲＮＡや遺伝子の導入を促進する物質、例えば、局所麻酔剤、リポソームなどの脂質、ポリリジンなどのポリカチオン、カチオン性界面活性剤などをさらに含有することもできる。The pharmaceutical composition of the present invention includes the case where the short interfering RNA (siRNA) or the gene capable of forming the siRNA described above is used alone. Also included are those that further contain an acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier of the present invention is a formulation for administering or introducing the short interfering RNA (siRNA) of the present invention or a gene capable of forming the siRNA into a living body, and physiologically Harmless and inert. Examples of such carriers include, but are not limited to, sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, ethanol, glycerin, sucrose, and lactose. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention contains other optional components that are pharmaceutically acceptable, for example, various adjuvants such as a solubilizing agent, stabilizers, pH adjusting agents, and other active ingredients. May be.
Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention further contains substances that promote the introduction of RNA or genes into cells, for example, local anesthetics, lipids such as liposomes, polycations such as polylysine, and cationic surfactants. You can also

本発明の医薬組成物の具体的な処方としては、投与するＲＮＡ分子やＤＮＡ分子の形態や、患者の状態にもよるが、注射剤、外用剤、坐剤などの各種の剤型とすることができ、溶液状、乳化状、ゲル状、ゾル状などの各種の製薬形態をとることができる。
本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔などは、患者の性別、年齢、体重、及び病態などの各種条件等に応じて適宜設定される。好ましい投与量としては、ＶＰ−１遺伝子のｍＲＮＡ１個当たり１〜１０個、好ましくは３〜６個程度のｓｉＲＮＡが導入される量が上げられる。Specific prescriptions of the pharmaceutical composition of the present invention include various dosage forms such as injections, external preparations, and suppositories, depending on the form of RNA molecules and DNA molecules to be administered and the patient's condition. Various pharmaceutical forms such as solution, emulsion, gel and sol can be taken.
The dosage, administration interval, and the like of the pharmaceutical composition of the present invention are appropriately set according to various conditions such as the patient's sex, age, weight, and disease state. A preferable dose is an amount in which 1 to 10, preferably 3 to 6, siRNAs are introduced per mRNA of the VP-1 gene.

本発明の医薬組成物は、ＪＣウイルスの増殖を抑制し、ＪＣウイルス感染症を治療することができる。本発明のＪＣウイルス感染症としては、進行性多巣性白質脳症、特にヒト進行性多巣性白質脳症、痴呆症などのＪＣウイルスの感染に起因する各種の疾患が挙げられる。本発明の医薬組成物は、ＪＣウイルスに感染している細胞、哺乳動物由来の細胞、ヒト細胞、又は哺乳動物などの動物やヒトに投与される。 The pharmaceutical composition of the present invention can suppress the growth of JC virus and treat JC virus infection. Examples of the JC virus infection of the present invention include various diseases caused by JC virus infection such as progressive multifocal leukoencephalopathy, particularly human progressive multifocal leukoencephalopathy and dementia. The pharmaceutical composition of the present invention is administered to an animal or a human such as a cell infected with a JC virus, a cell derived from a mammal, a human cell, or a mammal.

また、本発明は、ＪＣウイルス感染症を治療するための、前記してきた本発明のＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用、及び本発明の医薬組成物の製造のための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用を提供するものである。 The present invention also provides use of a short interfering RNA (siRNA) against the gene encoding VP-1 of the JC virus of the present invention described above or a gene capable of forming the siRNA, for treating a JC virus infection, And the use of a short interfering RNA (siRNA) against the gene encoding VP-1 of JC virus or a gene capable of forming the siRNA for the production of the pharmaceutical composition of the present invention.

次に、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの具体的な説明に限定されるものではない。
本発明者らは、ＪＣウイルス感染細胞でのＪＣウイルスの増殖の阻害を試験するために、３つの異なるＪＣウイルスタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡを設計した。即ち、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）を標的とするＶＰ２７４及びＶＰ６９１、アグノタンパク質をコードする遺伝子（ａｇｎｏ遺伝子）を標的とするＡｇ１２２及びＡｇ１４７、並びにラージＴ抗原（Large T antigen; T-Ag）をコードする遺伝子を標的とするＬＴ７８及びＬＴ１３４を設計した。これらの２本鎖のＲＮＡはそれぞれの３’−末端に２個の非対の塩基を有している。Next, the present invention will be described more specifically, but the present invention is not limited to these specific descriptions.
We designed siRNAs targeting three different JC virus proteins to test the inhibition of JC virus growth in JC virus infected cells. That is, VP274 and VP691 targeting the gene encoding the VP-1 protein of JC virus (VP-1 gene), Ag122 and Ag147 targeting the gene encoding the agnoprotein (agno gene), and large T antigen ( LT78 and LT134 targeting the gene encoding Large T antigen (T-Ag) were designed. These double stranded RNAs have two unpaired bases at each 3′-end.

これらのｓｉＲＮＡを次に示す。
Ａｇ１２２：センス鎖 5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3'
アンチセンス鎖 3'-dGdT-CCACUUCUGUCACAUCUGC-5'
Ａｇ１４７：センス鎖 5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3'
アンチセンス鎖 3'-dTdT-UUUCUGUCUCUGUGUCACC-5'
ＶＰ２７４：センス鎖 5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖 3'-dTdT-ACUCCUAGAUUGGACACCU-5'
ＶＰ６９１：センス鎖 5'-UACUGCCACAACAGUGCUG-dTdT-3'
アンチセンス鎖 3'-dTdT-AUGACGGUGUUGUCACGAC-5'
ＬＴ７８：センス鎖 5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3'
アンチセンス鎖 3'-dGdT-AAGGACAGUACUCUUUUCG-5'
ＬＴ１３４：センス鎖 5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖 3'-dTdT-CCACCCCUGCUUCUGUUCU-5'These siRNAs are shown below.
Ag122: sense strand 5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3 '
Antisense strand 3'-dGdT-CCACUUCUGUCACAUCUGC-5 '
Ag147: sense strand 5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3 '
Antisense strand 3'-dTdT-UUUCUGUCUCUGUGUCACC-5 '
VP274: sense strand 5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3 '
Antisense strand 3'-dTdT-ACUCCUAGAUUGGACACCU-5 '
VP691: sense strand 5'-UACUGCCACAACUGUGCUG-dTdT-3 '
Antisense strand 3'-dTdT-AUGACGGUGUUGUCACGAC-5 '
LT78: sense strand 5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3 '
Antisense strand 3'-dGdT-AAGGACAGUACUCUUUUCG-5 '
LT134: sense strand 5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3 '
Antisense strand 3'-dTdT-CCACCCCUGCUUCUGUUCU-5 '

ＪＣウイルスの早期ｍＲＮＡ類および後期ｍＲＮＡ類は、選択的スプライシングにより生成され、主な後期ｍＲＮＡの二つの主要な型は、アグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡと、アグノタンパク質、ＶＰ−２及びＶＰ−３をコードするｍＲＮＡである。主な早期ｍＲＮＡとしてはスプライシングによる異型として翻訳されるスモールｔ抗原とラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）をコードするｍＲＮＡである。これらのｍＲＮＡと前記してきたｓｉＲＮＡの関係を図１に示す。図１の上段はラージＴ抗原又はスモールｔ抗原（small t antigen）をコードする早期ｍＲＮＡ（Early mRNA）を示し、図１の下段はアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡと、アグノタンパク質、ＶＰ−２及びＶＰ−３をコードするｍＲＮＡの後期ｍＲＮＡ（Late mRNA）を示す。図１中の矢印は、前記した本発明で設計されたｓｉＲＮＡの標的となるウイルスＲＮＡ類の領域を示す。 The early and late mRNAs of JC virus are produced by alternative splicing, and the two major types of major late mRNAs are the mRNA encoding agnoprotein and VP-1, and the agnoprotein, VP-2 and It is mRNA encoding VP-3. Major early mRNAs are mRNAs encoding small t antigen and large T antigen (T-Ag) that are translated as variants by splicing. The relationship between these mRNAs and the aforementioned siRNA is shown in FIG. The upper part of FIG. 1 shows early mRNA (Early mRNA) encoding large T antigen or small t antigen, and the lower part of FIG. 1 shows mRNA encoding agnoprotein and VP-1, an agnoprotein, and VP. -2 and late mRNA (Late mRNA) encoding mRNA encoding VP-3. The arrows in FIG. 1 indicate the regions of viral RNAs that are the targets of the siRNA designed in the present invention.

ＪＣウイルス（Ｍａｄ−１／ＳＶＥΔ株、赤血球凝集活性が細胞３×１０^５個あたり１０２４単位）をＳＶＧ−Ａ（ＳＶ４０形質転換ヒト胎児グリア）細胞に接種し、接種４日後に、ＪＣウイルスに特異的なそれぞれのｓｉＲＮＡをリポフェクション法により導入した。ｓｉＲＮＡ導入後におけるＪＣウイルスのＶＰ−１及びアグノタンパク質に対するイムノブロッティングを行った。最初にＪＣウイルスを感染させた後のＪＣウイルスタンパク質の発現と感染後の経過日数の関係を観察した。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の横方向は、ＪＣウイルス感染後からの経過日数（dpi:days post infection）を示し、図２の上段はＶＰ−１を示し、下段はアグノタンパク質を示す。この結果、ＶＰ−１やアグノタンパク質などのＪＣウイルスの後期に発現するタンパク質は、ＪＣウイルス感染から２日後（２ｄｐｉ）からイムノブロッティングによって検出され、導入４日後（４ｄｐｉ）では大量に検出された（図２参照）。JC virus (Mad-1 / SVEΔ strain, hemagglutination activity is 1024 units per 3 × 10 ⁵ cells) was inoculated into SVG-A (SV40 transformed human fetal glial) cells, and 4 days after inoculation, specific for JC virus Each siRNA was introduced by the lipofection method. Immunoblotting of VP-1 and agnoprotein of JC virus after siRNA introduction was performed. The relationship between the expression of JC virus protein after first infection with JC virus and the number of days elapsed after infection was observed. The results are shown in FIG. The horizontal direction of FIG. 2 shows the number of days (dpi: days post infection) after infection with JC virus, the upper part of FIG. 2 shows VP-1, and the lower part shows agnoprotein. As a result, proteins expressed later in the JC virus, such as VP-1 and agnoprotein, were detected by immunoblotting from 2 days after JC virus infection (2 dpi), and a large amount was detected 4 days after introduction (4 dpi) ( (See FIG. 2).

そこで、ウイルスの接種から４日後及び６日後のそれぞれの時点で、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いてＳＶＧ−Ａ細胞へ各ｓｉＲＮＡ（１２０ｐｍｏｌ／細胞６×１０^４個）を導入した。約８０％のＳＶＧ−Ａ細胞において、フルオレセイン色素結合Ａｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入することに成功した（ここでは、データは示していない。）。
２回目のｓｉＲＮＡの導入（ウイルス接種から６日後）から４８時間後での、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、アグノタンパク質、ＶＰ−１に関しては本発明者らが作製した特異抗体を、ラージＴ抗原に関してはＡｂ−２（オンコジーンリサーチプロダクト社）を用いて、イムノブロッティングを行った。対照として、哺乳動物細胞には存在しないスクランブル配列を持つｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）を導入した細胞を用いた。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質の種類を示す。下段のアクチンは、陽性コントロールである。
また、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ、または、６０pmol／ウェルもしくは１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入したＪＣウイルス感染細胞での、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）、ＬＴ、ＶＰ−１、アグノタンパク質、及びアクチンのそれぞれのタンパク質に対するイムノブロッティングを行った。コントロール（Cont）として、細胞に疑似物質を導入したものを用いた。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の横方向は、導入したｓｉＲＮＡを示し（Ａｇ１２２の左側は６０pmol／ウェルの場合を示し、右側は１２０pmol／ウェルの場合を示す。）、縦方向は各タンパク質の種類を示す。下段のアクチンは陽性コントロールである。Therefore, each siRNA (120 pmol / 6 × 10 ⁴ cells) was introduced into SVG-A cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) at 4 and 6 days after virus inoculation. In approximately 80% of SVG-A cells, fluorescein dye-bound Ag122 siRNA was successfully introduced (data not shown here).
48 hours after the second introduction of siRNA (6 days after virus inoculation), the expression levels of JC virus agnoprotein, VP-1, and SV40 large T antigen in each siRNA-introduced cell were expressed as agnoprotein, VP. Immunoblotting was performed using the specific antibody prepared by the present inventors for -1, and Ab-2 (Oncogene Research Products) for large T antigen. As a control, cells into which siRNA having a scramble sequence not present in mammalian cells (Dermacon) was introduced were used. The results are shown in FIG. 3 with a photograph replacing the drawing. The horizontal direction of FIG. 3 shows the introduced siRNA, and the vertical direction shows the type of protein. The lower actin is a positive control.
In addition, Lamin A / C (Lamin A / C), LT, VP− in a JC virus-infected cell into which Lamin A / C specific siRNA or 60 pmol / well or 120 pmol / well of Ag122 siRNA was introduced. 1, immunoblotting for each of the proteins agnoprotein and actin was performed. As a control (Cont), a cell in which a pseudo substance was introduced was used. The results are shown in FIG. 4 with a photograph replacing the drawing. The horizontal direction in FIG. 4 shows the introduced siRNA (the left side of Ag122 shows the case of 60 pmol / well, the right side shows the case of 120 pmol / well), and the vertical direction shows the type of each protein. The lower actin is a positive control.

この結果、Ａｇ１２２、Ａｇ１４７又はＶＰ２７４を導入した細胞では、ウイルスの蛋白質の顕著な減少が示された（図３参照）。また、Ａｇ１２２は、アグノタンパク質の発現だけでなくＶＰ−１の発現をも用量依存的に阻害したが、ラージＴ抗原、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）又はアクチンの発現量には影響しなかった（図３及び図４参照）。さらに、ＶＰ２７４は、ＶＰ−１だけでなくアグノタンパク質の発現も抑制することが示された（図３参照）。
ＳＶ４０ラージＴ抗原の抗体は、ＳＶ４０形質転換細胞において、ＪＣウイルスのラージＴ抗原とＳＶ４０のラージＴ抗原（これらの２つのタンパク質はアミノ酸配列で７０％以上の相同性を有する）を区別することができない。そこで本発明者らは、ＬＴ７８とＬＴ１３４のＪＣウイルスのラージＴ抗原発現に対する効果を、逆転写反応（ＲＴ）−ＰＣＲで評価した。その結果、どちらのｓｉＲＮＡを細胞に導入しても、ＪＣウイルスのラージＴ抗原のｍＲＮＡの発現量は影響を受けなかった（ここではデータは示していない。）。As a result, in the cells into which Ag122, Ag147 or VP274 had been introduced, a significant decrease in viral protein was shown (see FIG. 3). Ag122 inhibited not only the expression of agnoprotein but also the expression of VP-1 in a dose-dependent manner, but did not affect the expression level of large T antigen, lamin A / C (Lamin A / C) or actin. (See FIGS. 3 and 4). Furthermore, VP274 was shown to suppress not only VP-1 but also the expression of agnoprotein (see FIG. 3).
The SV40 large T antigen antibody can distinguish between JC virus large T antigen and SV40 large T antigen (these two proteins have 70% or more homology in amino acid sequence) in SV40 transformed cells. Can not. Therefore, the present inventors evaluated the effect of LT78 and LT134 on the expression of large T antigen of JC virus by reverse transcription reaction (RT) -PCR. As a result, the expression level of JC virus large T antigen mRNA was not affected when either siRNA was introduced into the cells (data not shown here).

次に、ＪＣウイルス感染細胞におけるＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果を、間接蛍光抗体免疫染色を用いて試験した。ｓｉＲＮＡ導入の４８時間後、メタノールで固定した細胞をＶＰ−１又はアグノタンパク質の抗体で処理し、次にアレクサフルオル４８８（Alexa Fluor 488）の結合した抗ウサギ二次抗体（モレキュラープローブ社）で処理した。ＶＰ−１又はアグノタンパク質に陽性である細胞は共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社）で可視化され、６フィールドで計測された。アグノタンパク質又はＶＰ−１陽性である細胞の割合を間接蛍光抗体免疫染色により測定した結果を図５にグラフで示す。図５の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の灰色部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。各データは少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。図５のグラフ中の＊＊印は、Ｐ＜０．０２（スチューデントのｔ検定）で有意差があることを示す。
この結果、アグノタンパク質陽性細胞の割合は、スクランブルｓｉＲＮＡを導入された細胞の値と比べ、Ａｇ１２２が導入された細胞、Ｖｐ２７４が導入された細胞、及びその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞において有意に減少していた（図５参照）。同様に、ＶＰ−１陽性細胞の割合は、Ａｇ１２２が導入された細胞、ＶＰ２７４が導入された細胞、及びＡｇ１２２とＶＰ２７４の両方が導入された細胞において有意に減少した。Next, the effects of Ag122 and VP274 in JC virus infected cells were tested using indirect fluorescent antibody immunostaining. Forty-eight hours after introduction of siRNA, cells fixed with methanol were treated with VP-1 or agnoprotein antibody, and then with anti-rabbit secondary antibody (Molecular Probes) conjugated with Alexa Fluor 488. Processed. Cells positive for VP-1 or agnoprotein were visualized with a confocal laser microscope (Olympus) and counted in 6 fields. FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the proportion of cells that are positive for agnoprotein or VP-1 by indirect fluorescent antibody immunostaining. The left side of FIG. 5 shows the case of an agnoprotein, and the right side shows the case of VP-1. The vertical axis of each graph shows the percentage (% of sc) of the cells that were positive for each protein to the cells into which scrambled siRNA was introduced, and the black part on the left side of each graph was when scrambled siRNA was introduced The gray part on the right side shows the case where Ag122 is introduced, the gray part on the right side shows the case where VP274 is introduced, and the white part on the right side shows the case where both Ag122 and VP274 are introduced. Show. Each data is the mean ± standard deviation from at least 3 independent tests. The ** marks in the graph of FIG. 5 indicate that there is a significant difference at P <0.02 (Student's t test).
As a result, the ratio of agnoprotein-positive cells was significantly higher in cells introduced with Ag122, cells introduced with Vp274, and cells introduced with both siRNAs compared to the values of cells introduced with scrambled siRNA. It decreased (see FIG. 5). Similarly, the percentage of VP-1 positive cells was significantly reduced in cells into which Ag122 was introduced, cells into which VP274 was introduced, and cells into which both Ag122 and VP274 were introduced.

そこで、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングにより確認することにした。それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞での、ＶＰ−１、アグノタンパク質およびアクチンの発現に対するイムノブロッティングの結果を図６に図面に代わる写真で示す。また、アグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化し、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化して図７に示す。図６の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質を示す。アクチンは陽性コントロールである。図７の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。
この結果、ウイルスの蛋白質の発現を阻害する程度は、Ａｇ１２２とＶＰ２７４を組み合わせによるものと、それぞれのｓｉＲＮＡ単独によるものとで、有意な差はなかった。これは、Ａｇ１２２もしくはＶｐ２７４のいずれかによって引き起こされるアグノタンパク質及びＶＰ１の発現の阻害は、これらの蛋白質の双方をコードするポリシストロン性後期ｍＲＮＡが、それぞれのｓｉＲＮＡにより減少したことによるものと考えられる。Therefore, it was decided to confirm the inhibition of the expression of agnoprotein and VP-1 in cells into which siRNA of either Ag122, VP274, or both was introduced by immunoblotting. The results of immunoblotting for the expression of VP-1, agnoprotein, and actin in JC virus-infected cells into which each siRNA was introduced are shown in FIG. Further, the signals of agnoprotein and VP-1 are quantified by an image analyzer, and the ratio (%) to the value in the cells into which scrambled siRNA is introduced is shown in FIG. The horizontal direction of FIG. 6 shows the introduced siRNA, and the vertical direction shows the protein. Actin is a positive control. The left side of FIG. 7 shows the case of an agnoprotein, and the right side shows the case of VP-1. The vertical axis of each graph indicates the percentage (% of sc) of cells positive for each protein relative to the cells into which scrambled siRNA was introduced, and the black part on the left side of each graph is when scrambled siRNA was introduced The shaded portion on the right side shows a case where Ag122 is introduced, the gray portion on the right side shows a case where VP274 is introduced, and the white portion on the right side shows a case where both Ag122 and VP274 are introduced. Show.
As a result, the degree of inhibition of viral protein expression was not significantly different between the combination of Ag122 and VP274 and the respective siRNA alone. This is probably because the inhibition of the expression of agnoprotein and VP1 caused by either Ag122 or Vp274 is due to the decrease in polycistronic late mRNA encoding both of these proteins by the respective siRNA.

ｓｉＲＮＡはそれと相同な配列を持つｍＲＮＡを標的とし、その分解を引き起こすと考えられている。そこで、ＪＣウイルスのｍＲＮＡの量に対するＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果を試験した。ｓｉＲＮＡを導入して１２もしくは２４時間後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理をした後、スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Superscript first-strand synthesis system（インビトロジェン社））で逆転写してＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムでの定量的ＰＣＲを行った。それぞれのウイルスにおけるｍＲＮＡの量は、同じサンプル中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量により規格した。データは、スクランブルｓｉＲＮＡ（コントロール）が導入されたＪＣウイルス感染細胞での標準化された値に対する割合（％）として表わし、少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。この結果を図８にグラフ化して示す。図８の左側はアグノタンパク質の１２時間及び２４時間後の場合であり、右側はＶＰ−１の１２時間及び２４時間後の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質のｍＲＮＡの量の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図８中の＊印はＰ＜０．０５で、＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。 siRNA is considered to target and cause degradation of mRNA having a sequence homologous thereto. Therefore, the effect of Ag122 and VP274 on the amount of JC virus mRNA was tested. Total RNA was extracted from cells 12 or 24 hours after introduction of siRNA, treated with DNase I, reverse-transcribed with a Superscript first-strand synthesis system (Invitrogen), and GeneAmp 5700 ( Real-time quantitative PCR was performed using Applied Biosystems). The amount of mRNA in each virus was normalized by the amount of β-actin mRNA in the same sample. Data are expressed as a percentage of the normalized value in JC virus infected cells into which scrambled siRNA (control) was introduced and are the mean ± standard deviation of at least 3 independent tests. The result is shown in a graph in FIG. The left side of FIG. 8 shows the case after 12 hours and 24 hours of the agnoprotein, and the right side shows the case after 12 hours and 24 hours of VP-1. The vertical axis of each graph shows the ratio of the amount of mRNA of each protein to the cells into which scrambled siRNA was introduced (% of sc), and the black part on the left side of each graph shows the case where scrambled siRNA was introduced. The hatched portion on the right side shows a case where Ag122 is introduced, the gray portion on the right side shows a case where VP274 is introduced, and the white portion on the right side shows a case where both Ag122 and VP274 are introduced. In FIG. 8, * indicates P <0.05, and ** indicates P <0.02, indicating that there is a significant difference.

この結果、アグノタンパク質とＶＰ−１のｍＲＮＡの発現量は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡｓが導入されたＪＣウイルス感染細胞で有意に減少していた（図８参照）。しかしながら、ウイルスのｍＲＮＡ量の減少は、それがコードするタンパク質の発現量の減少ほど大きなものではなかった（図５及び図８参照）。
そこで、（１）ＲＴ−ＰＣＲ反応前に逆転写酵素反応なしでＤＮａｓｅＩ処理をし、また（２）逆転写酵素反応の前にＲＮａｓｅＡ処理をすることによって、ＲＴ−ＰＣＲサンプル中にウイルスのＤＮＡが混入してくる可能性を無くした実験を行った。この両方の処理によって、ＲＴ−ＰＣＲのシグナルが失われたが、これはＲＴ−ＰＣＲサンプル中にウイルスのＤＮＡの混入がないことが示されたことになる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ；RNA-induced silencing complex）に結合し、ＲＩＳＣを介する配列特異的なｍＲＮＡの切断を誘起することが知られているが、このプロセスの詳細なメカニズムは未解明なままである。ＪＣウイルスの特異的なｓｉＲＮＡｓの効果の大きさが、ウイルスＲＮＡに対する効果とウイルスタンパク質に対する効果とで異なったことの説明のひとつとしては、ｓｉＲＮＡと結合した標的ＲＮＡが、切断される前にＲＴ−ＰＣＲによって検出されたということである。As a result, the expression levels of agnoprotein and VP-1 mRNA were significantly reduced in JC virus-infected cells into which si122s of Ag122, VP274, or both were introduced (see FIG. 8). However, the decrease in the amount of viral mRNA was not as great as the decrease in the expression level of the protein encoded by it (see FIGS. 5 and 8).
Therefore, (1) DNase I treatment without reverse transcriptase reaction before RT-PCR reaction, and (2) RNase A treatment before reverse transcriptase reaction, viral DNA is contained in the RT-PCR sample. An experiment was conducted to eliminate the possibility of contamination. Both treatments resulted in loss of RT-PCR signal, indicating that there was no viral DNA contamination in the RT-PCR sample. siRNA is known to bind to an RNA-induced silencing complex (RISC) and induce sequence-specific mRNA cleavage via RISC. The detailed mechanism of this process is It remains unclear. One explanation for the difference in the effect of JC virus on specific siRNAs between the effect on viral RNA and the effect on viral protein is that the target RNA bound to siRNA is RT- It was detected by PCR.

ＪＣウイルスの増殖に対するＲＮＡｉ法の効果を試験するために、ＪＣウイルス感染ＳＶＧ−Ａ細胞の赤血球凝集活性をｓｉＲＮＡ導入３６時間後に測定した。ＪＣウイルス感染細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した３６時間後のＪＣウイルス感染細胞から調製した抽出物について赤血球凝固活性（ＨＡ）を分析した。データは、細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価として表し、少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。結果を図９にグラフ化して示す。図９の縦軸は細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価（HA titer/25μL）を示し、グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図９中の＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。
この結果、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡｓを導入した細胞の赤血球凝集活性は、スクランブルｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較してそれぞれ、６．７％、９．３％、４．１％であった（図９参照）。このように、アグノタンパク質又はＶＰ−１を標的とするｓｉＲＮＡは、感染細胞でのＪＣウイルス増殖を大きく阻害した。In order to test the effect of the RNAi method on the growth of JC virus, the hemagglutination activity of JC virus-infected SVG-A cells was measured 36 hours after siRNA introduction. Erythrocyte coagulation activity (HA) was analyzed for extracts prepared from JC virus-infected cells 36 hours after introduction of the respective siRNA into JC virus-infected cells. Data are expressed as erythrocyte clotting activity titers per 25 μL of cell extract and are mean ± standard deviation from at least 3 independent tests. The results are shown in a graph in FIG. The vertical axis in FIG. 9 shows the erythrocyte clotting activity titer (HA titer / 25 μL) per 25 μL of cell extract, the black part on the left side of the graph shows the case where scrambled siRNA was introduced, and the hatched part on the right side is Ag122. The right gray part indicates the case where VP274 is introduced, and the right white part indicates the case where both Ag122 and VP274 are introduced. ** in FIG. 9 indicates that there is a significant difference at P <0.02.
As a result, the hemagglutination activity of cells into which si122s of Ag122 and VP274, or both were introduced was 6.7%, 9.3%, and 4.1%, respectively, as compared to cells into which scrambled siRNA was introduced. (See FIG. 9). Thus, siRNA targeting agnoprotein or VP-1 greatly inhibited JC virus growth in infected cells.

以上のことから、ＪＣウイルスに既に感染した細胞でのＪＣウイルスの増殖を、ＲＮＡｉ法によって顕著に阻害することができることを本発明者が初めて実証し、確認することができた。この結果は、ＰＭＬの治療に対する新しいアプローチの開発に重要な意味を持つものであり、ＰＭＬに対するＲＮＡｉ法に基づいた抗ウイルス戦略を適用するには、中枢神経系へのｓｉＲＮＡの効果的かつ特異的なデリバリーが極めて有効な手段であることを明らかにするものである。
ＪＣウイルス感染ＳＶＧ細胞においてＪＣウイルスのアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードしているｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを用いてウイルスのタンパク質の発現を抑制することが可能であり、ＪＣウイルス感染価も顕著に低下した。ウイルス感染が成立した後のウイルスの増殖の抑制が可能であることは、実際のウイルス感染症の治療を開発してゆく上で極めて有用であり、これによりウイルスの感染による各種の感染症、例えばＰＭＬや痴呆症の治療が可能となる。From the above, the present inventors have demonstrated and confirmed for the first time that the growth of JC virus in cells already infected with JC virus can be significantly inhibited by the RNAi method. This result has important implications for the development of new approaches to the treatment of PML, and to apply an antiviral strategy based on the RNAi approach to PML, the effective and specific of siRNA to the central nervous system It is clarified that effective delivery is a very effective means.
In SVG cells infected with JC virus, it is possible to suppress the expression of viral protein using siRNA specific for mRNA encoding JC virus agnoprotein and VP-1, and JC virus infection titer is also remarkable. Declined. The ability to suppress the growth of viruses after the establishment of a viral infection is extremely useful in developing treatments for actual viral infections, whereby various infectious diseases caused by viral infections, for example, PML and dementia can be treated.

本発明は、ｓｉＲＮＡという極めて短い２本鎖ＲＮＡの導入という簡便な手法により、ＪＣウイルスに感染した後の細胞におけるＪＣウイルスの増殖を抑制することができ、当該ウイルスの感染による各種の疾患の治療が可能となった。また、本発明は、ＪＣウイルスに感染した後の細胞におけるＪＣウイルスの増殖を抑制するための極めて有効な塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡを提供するものである。さらに、本発明のｓｉＲＮＡはＪＣウイルスの後期ｍＲＮＡにおけるアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡの発現を抑制することができ、両方のタンパク質の発現を同時に抑制することができることから、極めて有効なウイルス増殖抑制剤を提供するものでもある。 The present invention can suppress the growth of JC virus in cells after infection with JC virus by a simple technique of introducing an extremely short double-stranded RNA called siRNA, and treat various diseases caused by infection with the virus. Became possible. The present invention also provides a polynucleotide having a very effective base sequence for suppressing the growth of JC virus in cells after infection with JC virus, and siRNA comprising the polynucleotide. Furthermore, the siRNA of the present invention can suppress the expression of mRNA encoding agnoprotein and VP-1 in the late mRNA of JC virus, and can suppress the expression of both proteins simultaneously. It also provides a growth inhibitor.

図１は、ＪＣウイルスの主な早期ｍＲＮＡ（Early mRNA）及び後期ｍＲＮＡ（Late mRNA）と本発明のｓｉＲＮＡ（図１中の矢印）との関係を示したものである。FIG. 1 shows the relationship between main early mRNA (Early mRNA) and late mRNA (Late mRNA) of JC virus and siRNA of the present invention (arrows in FIG. 1). 図２は、ＪＣウイルス感染後におけるＪＣウイルスのＶＰ−１及びアグノタンパク質に対するイムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図２の横方向は、ＪＣウイルス感染からの経過日数（dpi:days post infection）を示し、図２の上段はＶＰ−１を示し、下段はアグノタンパク質を示す。FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing the results of immunoblotting of VP-1 and agnoprotein of JC virus after infection with JC virus. The horizontal direction of FIG. 2 shows the number of days (dpi: days post infection) since JC virus infection, the upper part of FIG. 2 shows VP-1, and the lower part shows agnoprotein. 図３は、２回目のｓｉＲＮＡの導入（ウイルス接種から６日後）から４８時間後での、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、イムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質の種類を示す。下段のアクチンは、陽性コントロールである。FIG. 3 shows the expression levels of JC virus agnoprotein, VP-1, and SV40 large T antigen in each siRNA-introduced cell 48 hours after the second siRNA introduction (6 days after virus inoculation). It is the photograph replaced with drawing which shows the result of having performed immunoblotting. The horizontal direction of FIG. 3 shows the introduced siRNA, and the vertical direction shows the type of protein. The lower actin is a positive control. 図４は、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ、または、６０pmol／ウェルもしくは１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入したＪＣウイルス感染細胞での、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）、ＬＴ、ＶＰ−１、アグノタンパク質、及びアクチンのそれぞれのタンパク質に対するイムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図４の横方向は、導入したｓｉＲＮＡを示し（Ａｇ１２２の左側は６０pmol／ウェルの場合を示し、右側は１２０pmol／ウェルの場合を示す。）、縦方向は各タンパク質の種類を示す。下段のアクチンは陽性コントロールである。FIG. 4 shows lamin A / C (LaminA / C), LT, and JC virus-infected cells transfected with 60 pmol / well or 120 pmol / well of Ag122 siRNA. It is a photograph replaced with drawing which shows the result of having performed the immunoblotting with respect to each protein of VP-1, an agnoprotein, and actin. The horizontal direction in FIG. 4 shows the introduced siRNA (the left side of Ag122 shows the case of 60 pmol / well, the right side shows the case of 120 pmol / well), and the vertical direction shows the type of each protein. The lower actin is a positive control. 図５は、アグノタンパク質又はＶＰ−１陽性である細胞の割合を間接蛍光抗体免疫染色により測定した結果を示すグラフである。図５の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の灰色部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。各データは少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。図５のグラフ中の＊＊印は、Ｐ＜０．０２（スチューデントのｔ検定）で有意差があることを示す。FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the proportion of cells that are positive for agnoprotein or VP-1 by indirect fluorescent antibody immunostaining. The left side of FIG. 5 shows the case of an agnoprotein, and the right side shows the case of VP-1. The vertical axis of each graph indicates the percentage (% of sc) of cells positive for each protein relative to the cells into which scrambled siRNA was introduced, and the black part on the left side of each graph is when scrambled siRNA was introduced The gray part on the right side shows the case where Ag122 is introduced, the gray part on the right side shows the case where VP274 is introduced, and the white part on the right side shows the case where both Ag122 and VP274 are introduced. Show. Each data is the mean ± standard deviation from at least 3 independent tests. ** in the graph of FIG. 5 indicates that there is a significant difference at P <0.02 (Student's t test). 図６は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングした結果を示す図面に代わる写真である。図６の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質を示す。アクチンは陽性コントロールである。FIG. 6 is a photograph instead of a drawing showing the results of immunoblotting of the inhibition of the expression of agnoprotein and VP-1 in cells introduced with siRNA of Ag122 and / or VP274. The horizontal direction of FIG. 6 shows the introduced siRNA, and the vertical direction shows the protein. Actin is a positive control. 図７は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングした結果のアグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化して、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化したものである。図７の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。FIG. 7 is an image analyzer showing the signals of agnoprotein and VP-1 as a result of immunoblotting the inhibition of the expression of agnoprotein and VP-1 in cells introduced with siRNA of Ag122 and / or VP274. The ratio (%) with respect to the value in the cell in which the scrambled siRNA was introduced is graphed. The left side of FIG. 7 shows the case of an agnoprotein, and the right side shows the case of VP-1. The vertical axis of each graph indicates the percentage (% of sc) of cells positive for each protein relative to the cells into which scrambled siRNA was introduced, and the black part on the left side of each graph is when scrambled siRNA was introduced The shaded portion on the right side shows a case where Ag122 is introduced, the gray portion on the right side shows a case where VP274 is introduced, and the white portion on the right side shows a case where both Ag122 and VP274 are introduced. Show. 図８は、ＪＣウイルス感染細胞に各ｓｉＲＮＡｓを導入して、１２時間及び２４時間経過後のＪＣウイルス感染細胞から全ＲＮＡを抽出し、アグノタンパク質及びＶＰ−１のｍＲＮＡに対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示すグラフである。図８の左側はアグノタンパク質の１２時間及び２４時間後の場合であり、右側はＶＰ−１の１２時間及び２４時間後の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質のｍＲＮＡの量の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図８中の＊印はＰ＜０．０５で、＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。FIG. 8 shows introduction of siRNAs into JC virus-infected cells, extraction of total RNA from JC virus-infected cells after 12 and 24 hours, and quantitative RT-PCR analysis for agnoprotein and VP-1 mRNA. It is a graph which shows the result of having performed. The left side of FIG. 8 shows the case after 12 hours and 24 hours of the agnoprotein, and the right side shows the case after 12 hours and 24 hours of VP-1. The vertical axis of each graph shows the ratio of the amount of mRNA of each protein to the cells into which scrambled siRNA was introduced (% of sc), and the black part on the left side of each graph shows the case where scrambled siRNA was introduced. The hatched portion on the right side shows a case where Ag122 is introduced, the gray portion on the right side shows a case where VP274 is introduced, and the white portion on the right side shows a case where both Ag122 and VP274 are introduced. In FIG. 8, * indicates P <0.05, and ** indicates P <0.02, indicating that there is a significant difference. 図９は、ＪＣウイルス感染細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した３６時間後のＪＣウイルス感染細胞から調製した抽出物について赤血球凝固活性（ＨＡ）を分析した結果をグラフ化したものである。図９の縦軸は細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価（HA titer/25μL）を示し、グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図９中の＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。FIG. 9 is a graph showing the results of analysis of erythrocyte coagulation activity (HA) for extracts prepared from JC virus-infected cells 36 hours after introduction of each siRNA into JC virus-infected cells. The vertical axis of FIG. 9 shows the erythrocyte coagulation activity titer (HA titer / 25 μL) per 25 μL of cell extract, the black part on the left side of the graph shows the case where scrambled siRNA is introduced, and the hatched part on the right side is Ag122. The right gray part indicates the case where VP274 is introduced, and the right white part indicates the case where both Ag122 and VP274 are introduced. ** in FIG. 9 indicates that there is a significant difference at P <0.02.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.

ｓｉＲＮＡの構築
以下に示す各センス鎖及びアンチセンス鎖となるＲＮＡを２’−ＡＣＥ−ＲＮＡ合成法（2'-acetoxyethoxy-methyl ether RNA synthesis）により合成し、それぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖から目的のｓｉＲＮＡを合成した。
Ａｇ１２２：センス鎖 5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3'
アンチセンス鎖 5'-CGUCUACACUGUCUUCACC-dTdG-3'
Ａｇ１４７：センス鎖 5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3'
アンチセンス鎖 5'-CCACUGUGUCUCUGUCUUU-dTdT-3'
ＶＰ２７４：センス鎖 5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖 5'-UCCACAGGUUAGAUCCUCA-dTdT-3'
ＶＰ６９１：センス鎖 5'-UACUGCCACAACAGUGCUG-dTdT-3'
アンチセンス鎖 5'-CAGCACUGUUGUGGCAGUA-dTdT-3'
ＬＴ７８：センス鎖 5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3'
アンチセンス鎖 5'-GCUUUUCUCAUGACAGGAA-dTdG-3'
ＬＴ１３４：センス鎖 5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖 5'-UCUUGUCUUCGUCCCCACC-dTdT-3'Construction of siRNA RNAs to be sense strands and antisense strands shown below were synthesized by 2′-ACE-RNA synthesis method (2′-acetoxyethoxy-methyl ether RNA synthesis), and the target strands were sensed from the respective sense strands and antisense strands. Of siRNA was synthesized.
Ag122: sense strand 5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3 '
Antisense strand 5'-CGUCUACACUGUCUUCACC-dTdG-3 '
Ag147: sense strand 5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3 '
Antisense strand 5'-CCACUGUGUCUCUGUCUUU-dTdT-3 '
VP274: sense strand 5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3 '
Antisense strand 5'-UCCACAGGUUAGAUCCUCA-dTdT-3 '
VP691: sense strand 5'-UACUGCCACAACUGUGCUG-dTdT-3 '
Antisense strand 5'-CAGCACUGUUGUGGCAGUA-dTdT-3 '
LT78: sense strand 5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3 '
Antisense strand 5'-GCUUUUCUCAUGACAGGAA-dTdG-3 '
LT134: sense strand 5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3 '
Antisense strand 5'-UCUUGUCUUCGUCCCCACC-dTdT-3 '

ＪＣウイルス感染後のＪＣウイルスタンパク質の発現に対するイムノブロッティング
ＳＶＧ−Ａ（ＳＶ４０形質転換ヒト胎児グリア）細胞に、ＪＣウイルス（Ｍａｄ−１／ＳＶＥΔ株、赤血球凝集活性が細胞３×１０^５個あたり１０２４単位）を接種した。
感染直後、感染２日後、３日後、４日後にＪＣウイルス後期タンパク質としてアグノタンパク質及びＶＰ−１を、抗アグノタンパク質抗体又は抗ＶＰ−１抗体を用いたイムノブロッティングを行った。
結果を図２に示す。Immunoblotting for expression of JC virus protein after JC virus infection SVG-A (SV40 transformed human fetal glial) cells have 1024 units of JC virus (Mad-1 / SVEΔ strain, hemagglutination activity per 3 × 10 ⁵ cells) ).
Immediately after infection, 2 days, 3 days, and 4 days after infection, immunoblotting was carried out using agnoprotein and VP-1 as anti-JC virus late proteins, and anti-agnoprotein antibody or anti-VP-1 antibody.
The results are shown in FIG.

ＪＣウイルス感染細胞への各種ｓｉＲＮＡの導入によるＪＣウイルスのタンパク質の発現に対するイムノブロッティング
実施例１で製造した各種のｓｉＲＮＡをＪＣウイルス感染細胞へ導入した。導入２日後（ウイルス接種から６日後）、再度同じｓｉＲＮＡを導入し、２回目のｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、それぞれの特異的な抗体を用いてイムノブロッティングを行った。対照として、スクランブル配列を持つｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）を導入した細胞を用いた。
結果を図３に示す。Immunoblotting for expression of protein of JC virus by introduction of various siRNAs into JC virus-infected cells. Various siRNAs produced in Example 1 were introduced into JC virus-infected cells. Two days after introduction (six days after virus inoculation), the same siRNA was introduced again, and 48 hours after the second introduction of siRNA, JC virus agnoprotein, VP-1, and SV40 large T antigen in each siRNA-introduced cell. The expression amount of was immunoblotted using each specific antibody. As a control, cells into which siRNA having a scrambled sequence (Dermacon) was introduced were used.
The results are shown in FIG.

Ａｇ１２２ｓｉＲＮＡによるタンパク質の発現の抑制
ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）（６０pmol／ウェル）、及びＡｇ１２２を６０pmol／ウェル又は１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡをＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、それぞれの特異的な抗体を用いてイムノブロッティングを行った。対照（Cont）として、細胞に形質導入試薬のみを導入したものを用いた。
結果を図４に示す。Suppression of protein expression by Ag122 siRNA Lamin A / C (LaminA / C) -specific siRNA (Dermacon) (60 pmol / well) and Ag122 at 60 pmol / well or 120 pmol / well of Ag122 siRNA were introduced into JC virus-infected cells. Forty-eight hours after the introduction of each siRNA, immunoblotting was performed on the expression levels of JC virus agnoprotein, VP-1, and SV40 large T antigen in each siRNA-introduced cell using each specific antibody. . As a control (Cont), a cell in which only a transduction reagent was introduced was used.
The results are shown in FIG.

ＪＣウイルス感染細胞におけるＡｇ１２２及びＶＰ２７４の間接蛍光抗体免疫染色
実施例２と同様にして、Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞をメタノールで固定し、当該細胞をＶＰ−１又はアグノタンパク質の抗体で処理し、次にアレクサフルオル４８８（Alexa Fluor 488）の結合した抗ウサギ二次抗体（モレキュラープローブ社）で処理した。ＶＰ−１又はアグノタンパク質に陽性である細胞は共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社）で可視化され、６フィールドで計測した。
結果を図５にグラフで示す。Indirect fluorescent antibody immunostaining of Ag122 and VP274 in JC virus infected cells In the same manner as in Example 2, Ag122 (120 pmol / well), VP274 (120 pmol / well), and Ag122 and VP274 (60 pmol / well, respectively) were infected with JC virus. Introduced into cells. 48 hours after introduction of siRNA, JC virus-infected cells into which each siRNA was introduced were fixed with methanol, the cells were treated with VP-1 or an agnoprotein antibody, and then Alexa Fluor 488 (Alexa Fluor 488). ) -Conjugated anti-rabbit secondary antibody (Molecular Probes). Cells positive for VP-1 or agnoprotein were visualized with a confocal laser microscope (Olympus) and counted in 6 fields.
The results are shown graphically in FIG.

Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現に対するイムノブロッティング
実施例２と同様にして、Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞での、ＶＰ−１、アグノタンパク質およびアクチンの発現に対するイムノブロッティングを行った。
結果を図６に示す。Immunoblotting for the expression of agnoprotein and VP-1 in JC virus-infected cells introduced with siRNA of either Ag122 or VP274, or both. Ag122 (120 pmol / well), VP274 (120 pmol) in the same manner as in Example 2. / Well), and Ag122 and VP274 (60 pmol / well each) were introduced into JC virus-infected cells. Forty-eight hours after the introduction of siRNA, immunoblotting was performed for the expression of VP-1, agnoprotein and actin in JC virus-infected cells into which each siRNA had been introduced.
The results are shown in FIG.

また、アグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化し、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化して図７に示す。 Further, the signals of agnoprotein and VP-1 are quantified by an image analyzer, and the ratio (%) to the value in the cells into which scrambled siRNA is introduced is shown in FIG.

ＪＣウイルスのｍＲＮＡの発現量に対するＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果試験
Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡを導入して１２時間後、２４時間後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理をした後、スーパースクリプトファーストストランド合成システム（インビトロジェン社）で逆転写して、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。それぞれのウイルスにおけるｍＲＮＡの量は、同じサンプル中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量により規格した。データは、スクランブルｓｉＲＮＡ（コントロール）が導入されたＪＣウイルス感染細胞での標準化された値に対する割合（％）として表わした。
この結果を図８にグラフ化して示す。Effect test of Ag122 and VP274 on the expression level of JC virus mRNA Ag122 (120 pmol / well), VP274 (120 pmol / well), and Ag122 and VP274 (60 pmol / well, respectively) were introduced into JC virus-infected cells. After 12 hours and 24 hours after introduction of each siRNA, total RNA was extracted from the cells, treated with DNase I, reversely transcribed with a superscript first strand synthesis system (Invitrogen), and GeneAmp5700 (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR. The amount of mRNA in each virus was normalized by the amount of β-actin mRNA in the same sample. Data were expressed as a percentage of the normalized value in JC virus infected cells into which scrambled siRNA (control) was introduced.
The result is shown in a graph in FIG.

ｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染ＳＶＧ−Ａ細胞でのＪＣウイルスの赤血球凝集活性
Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡを導入して３６時間後に細胞を回収し、１ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．２％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）で細胞を溶解し、０．０５Ｕ／ｍｌノイラミニダーゼで３７℃で一晩処理して、５６℃で３０分で不活化した後に、遠心分離を行い、上清をウイルス抽出液として用いた。このようにして得られたウイルス抽出液２５μＬを用いてヘマグルチネーションアッセイ法によりウイルス抽出液の赤血球凝集活性を測定した。
結果を図９にグラフ化して示す。JC virus hemagglutination activity in JC virus-infected SVG-A cells introduced with siRNA Ag122 (120 pmol / well), VP274 (120 pmol / well), and Ag122 and VP274 (each 60 pmol / well) to JC virus-infected cells Introduced. Cells were collected 36 hours after introduction of each siRNA, lysed with 1 mM Tris-HCl, 0.2% BSA (pH 7.5), and treated with 0.05 U / ml neuraminidase overnight at 37 ° C. After inactivation at 56 ° C. for 30 minutes, centrifugation was performed, and the supernatant was used as a virus extract. Using 25 μL of the virus extract thus obtained, the hemagglutination assay method was used to measure the hemagglutination activity of the virus extract.
The results are shown in a graph in FIG.

本発明は、有効な治療方法が開発されていないＪＣウイルスに起因する進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）や痴呆症などの疾患に有効な医薬組成物、及びその有効成分となるポリヌクレオチドを提供するものであり、疾患の治療薬や、ＪＣウイルスの増殖抑制剤として産業上、極めて有用なものである。 The present invention relates to a pharmaceutical composition effective for diseases such as progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) and dementia caused by JC virus for which no effective therapeutic method has been developed, and an active ingredient thereof. And is extremely useful industrially as a therapeutic agent for diseases and a growth inhibitor of JC virus.

配列番号１：ＶＰ−１をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２：ＶＰ−１のアミノ酸配列
配列番号３：アグノタンパク質及びＶＰ−１をコードする後期ｍＲＮＡの塩基配列
配列番号４：ＶＰ２７４ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列
5'‐UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'SEQ ID NO: 1: nucleotide sequence of DNA encoding VP-1 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of VP-1 SEQ ID NO: 3: nucleotide sequence of late mRNA encoding agnoprotein and VP-1 SEQ ID NO: 4: sense strand of VP274 siRNA Nucleotide sequence
5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3 '

Claims

センス側の塩基配列が、少なくとも５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−３’からなる塩基配列を有し、１９〜２５塩基対の長さであるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は当該ｓｉＲＮＡのセンス配列及びアンチセンス配列をコードする塩基配列の間にヘアピンループ構造を形成できる塩基配列が設けられた当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物。 A short interfering RNA (siRNA) for a gene encoding VP-1 of JC virus having a base sequence consisting of at least 5′-ugaggaucuaaccuguggga-3 ′ in the sense side and a length of 19 to 25 base pairs Or a gene capable of forming the siRNA provided with a base sequence capable of forming a hairpin loop structure between the base sequence encoding the sense sequence and the antisense sequence of the siRNA, and a pharmaceutically acceptable carrier A pharmaceutical composition for the treatment of JC virus infection.

ＪＣウイルス感染症が、進行性多巣性白質脳症である請求項１に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the JC virus infection is progressive multifocal leukoencephalopathy.

遺伝子が、プロモーターを含有するものである請求項１又は２に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the gene contains a promoter.

短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子が、当該遺伝子を生体内に導入するためのベクターに組み込まれている請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, wherein a short interfering RNA (siRNA) or a gene capable of forming the siRNA is incorporated into a vector for introducing the gene into a living body.

ベクターが、プラスミド又はウイルスである請求項４に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the vector is a plasmid or a virus.

医薬組成物が、細胞へのＲＮＡや遺伝子の導入を促進する物質を、さらに含有するものである請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the pharmaceutical composition further contains a substance that promotes introduction of RNA or a gene into a cell.

少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列及びその相補配列を有し、１９〜２５塩基の長さからなるポリヌクレオチド。 A polynucleotide having a base sequence of at least 5'-tgaggatctacactgtgga-3 'and a complementary sequence thereof and a length of 19 to 25 bases.

ポリヌクレオチドが、２本鎖のＲＮＡである請求項７に記載のポリヌクレオチド。 The polynucleotide according to claim 7, wherein the polynucleotide is a double-stranded RNA.

２本鎖のＲＮＡの両方の３’末端側に塩基対を形成していない２塩基を有する請求項８に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide according to claim 8 , which has two bases that do not form a base pair on both 3 'ends of double-stranded RNA.