JP4668191B2 - Epitope protection assay and method for detecting protein conformation - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患、例えばプリオン感染などのポリペプチド凝集と関係がある疾患の診断、予後および治療介入において使用するためのエピトープ保護アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のミスフォールディングおよび凝集
タンパク質は、複雑かつ最密な構造にフォールディングする可能性がある。フォールディングは生物活性に重要であるだけでなく、タンパク質が正確にフォールディングすることの失敗、またはタンパク質がフォールディングされた状態であることによって疾患が生じる可能性がある(Dobson CM、Methods (2004) 34 : 4〜14)。幾つかの場合、ミスフォールディングがタンパク質凝集を引き起こす可能性があり、それがさらに細胞外(例えばプラーク)または細胞内(例えばサイトゾルまたは核中の封入)の不連続な堆積を生じさせる可能性がある。
【０００３】
アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチングトン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびプリオン病などの神経変性病は、ミスフォールディングした凝集タンパク質の神経中への堆積によって特徴付けられる。II型糖尿病および癌もタンパク質のミスフォールディングと関連してきており、タンパク質のフォールディングの誤りから生じ幾つかの場合凝集などの結果をもたらす、まだ同定されていない疾患が存在する可能性がある。このような疾患におけるミスフォールディングの性質およびいかなる凝集も、典型的には充分特徴付けられていない。
【０００４】
プリオン病
プリオン病はBSEすなわち「狂牛病」の発生以来、重大な健康上の関心事となっている(前に総説された、40、41)。BSEは英国で最初に発見されたが、現在はヨーロッパ中の多くの他の国々および日本に広がっている。英国内だけで約180,000例のBSEが存在しており、これが蓄牛の全滅およびおそらく推定3〜5百万頭の感染をもたらした。英国に関して推定される全コストは25億ポンドを超えた。BSEは感染した蓄牛から与えられるプリオンを含む飼料を通じて、蓄牛間で伝播すると考えられており、感染した動物由来のビーフ製品または他の蓄牛製品を食べることによって、BSEはヒトに伝播すると考えられる。
【０００５】
新生プリオン病
プリオン病は、海綿状の変化、神経細胞の消失、グリオーシス、および異常なアミロイドポリペプチドの脳内蓄積によって神経病理学的に特徴付けられる、急速に進行する治療不能な神経変性症候群の一群である。ヒトプリオン病は古典的なクロイツフェルトヤコブ病(CJD)を含み、これには散発性、医原性、および家族性の形がある。1996年以来、CJDの「新たな変形」(vCJD)が英国、フランス、アイルランド共和国、香港、イタリア、米国、およびカナダにおいて同定されている(40、41)。変形CJDは、未知の潜伏期間で14才という若い個体を殺傷することができる。vCJDがウシ海綿状脳症(BSE)のヒト形である疑いはほとんどない(42)。汚染した蓄牛組織を消費することからの第一次伝染は、このファイリングの時点で130を超える個体に影響を与えている。
【０００６】
血液、血液製品、外科手術、歯科手術、ワクチン、および化粧品を介したvCJDの恐怖、「第二次伝染」は重大な関心事である(40、41)。マウスおよびヒツジの実験的BSE/vCJD感染(40)における血液のプリオン感染性の検出は、血液および血液製品を介したvCJDの伝播に関して特別な危険が存在することを示唆する。この疾患を発症したドナーの2人のレシピエントにおけるvCJDの最近の報告も厄介である(52、53)。カナダおよび米国は近年、vCJD血液ドナーの繰り延べを西ヨーロッパの全ての国々に広げている。
【０００７】
ヒツジスクレーピーは数世紀知られてきているが、最も重要な動物のプリオン病は現在BSEである。主に英国由来の173,000頭を超える蓄牛が症候性BSEを発症しており、3百万もの多くが飼料供給において検出されていない。BSEは現在、肉および骨粉に関する食品供給の1996年の「禁止令後に生まれた」蓄牛においてますます報告されており、伝染が容易に消失することを妨げる他の経路が存在する可能性があることを示唆する。他の厄介な問題はヒツジへのBSEの考えられる伝播であり、これは他のヒト個体群をBSE/vCJDプリオン変種に曝す可能性がある。最近の報告はプリオンはヒツジ、実験動物およびヒトの幾つかの筋肉群中で複製する可能性があることを示し(54〜57)、以前はヒトの消費に関して安全であるとみなされていた組織の潜在的な危険性を示す。
【０００８】
捕獲済みおよび野生のシカ科動物(シカおよびワビチ)の慢性消耗病(CWD)は、北アメリカにおける他の新たに新生した動物プリオン病であり、ヒトの健康に対するその影響はまだ知られていない。新たに認識されたプリオン病は食品、血液製品、および医学-外科治療の安全性に対して脅威を与えることは明らかである。
【０００９】
プリオン:異型病原体
新たに新生したプリオン病、およびプリオンのポリペプチドのみの性質は、世界中で重大な医学的、獣医学的、および経済的課題を生み出している。今日まで、プリオン感染に関する唯一の商用の試験は死後の脳サンプルに基づくものである。実験的な伝播の研究による検出が存在するにもかかわらず、感染した動物の血液中のプリオンを検出するための生化学試験は存在しない。プリオン感染用の感度の良い特異的な診断試験の開発は、部分的にはプリオン感染物質の異常な性質のために骨の折れる作業である。プリオン病を伝播させる感染物質は、核酸要素が感染物質中で検出されていない点で他の病原体と異なる(41)。ノーベル賞受賞者のDr.Stanley Prusinerによって開発されたプリオン理論によれば、周辺に偏在する正常細胞プリオンポリペプチドPrP^Cのミスフォールディングした立体配座のイソ型である、PrP^Scに感染性が存在する。実際PrP^Scはプリオン感染性の調製における最も顕著な(またはおそらく唯一の)マクロ分子であり、ほとんどプリオン感染の確かな代用であるようには思われない。PrP^Scは、プロテアーゼ感受性、可溶性のモノマーイソ型であるPrP^Cとは対照的に、プロテアーゼによる消化に対して部分的に耐性があり、可溶性が低く、凝集した状態で存在する(29、31、43〜46)。
【００１０】
PrP^Scは、立体配座の変化に関する翻訳後プロセスによってα-らせん構造が豊富である、その正常細胞のイソ型(PrP^C)に由来する。PrP^Cの一次構造はPrP^Scのそれと同一であるが、二次構造および三次構造の変化は2つのイソ型の異なる物理化学的性質を担う。
【００１１】
プリオンに感染した可能性があるヒト由来の食品または血液製品の安全性を評価する際の難点の1つは、血液または他の入手可能な生物サンプルに関する正確な診断試験の欠如である。現在、生きている動物、ヒト、血液または血液製品を初期段階でスクリーニングするために適用することができる診断試験は存在しない。これはさらに、臓器レシピエントに対する未知の危険性を加えた、臓器移植における他の問題をもたらす。したがって、予防策として、英国などの国々はその居住者由来の血漿をもはや調達していない。プリオン病が蔓延する危険性は、他の国々にも影響を与えている。例えば、米国およびカナダは、3〜6カ月より長く英国またはフランスに居住していた個体からの血液提供を認めていない。
【００１２】
現在vCJDの診断は、剖検または生検における脳の病理試験の後でのみ確認することができる。初期CJD検出における幾つかの相補的戦略には脳波検査(EEG)、磁気共鳴映像法(MRI)スキャン、および脳脊髄液(CSF)試験があり、これらは有用な「代理」または「代用」マーカーである可能性がある。プリオン感染用の「直接的試験」の不在は、ウイルスおよび細菌などの従来の感染物質と非常に対照をなす。
【００１３】
商業化の過程にある幾つかの試験は、実際の感染プリオンから「ひとたび除去された」感染の代理マーカーに基づく。
【００１４】
PrPプロテアーゼ耐性は、プリオン病に関して最も多く市販されている診断試験の基盤となるものである。現在の方法では、脳のサンプルを除去し、PrP^Cは除去するがPrP^Scのプロテアーゼ耐性の中心部分はそのままの状態にすることができるプロテアーゼで消化する。次いでPrP^Scのプロテアーゼ耐性断片を、イムノブロッティングによって(Prionics試験中と同様に)、あるいは捕捉ELISAによって(BioRadおよびEnfer試験中、ならびにPrionics由来の新試験中と同様に)検出する。しかしながら、プロテアーゼによる消化は厄介で変動的であり、偽陰性および偽陽性をもたらす。さらに、感染性であり凝集するがプロテアーゼ耐性ではないPrP^Scを含むことが報告されている、幾つかのプリオン系統が存在する。プロテアーゼ感受性PrP^Scも、疾患の感染および種間伝播の初期に優位を占める(31)。
【００１５】
プロテアーゼ耐性PrP断片の検出も、Prionicsによって商業用に開発されている尿診断試験(47)の基盤となるものである。しかしながら、尿中のプロテアーゼ耐性PrPの検出は死後脳の試験と同じ制約を受け、多量の尿からの沈殿を必要とすること、および低い感受性(例えば、前駆症状ではなく疾患の後期のPrP^Scのみを検出する)という他の欠点を有する。
【００１６】
他の神経変性病
アルツハイマー病(AD)、ハンチングトン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびパーキンソン病/レビー小体型痴呆(PD、LBD)などの神経変性病も、我々の加齢群およびヘルスケアシステムに対する重大な課題を提起する(1に総説)。推定364,000人の65才を超えるカナダ人が現在、ADまたは関連痴呆に関する診断を受けている(http://www.alzheimer.ca/)。増大する寿命と共に、神経変性病の発生率は増大すると予想される。2025年までに、ADは百万人もの多くのカナダ人に影響を与え、2050年までにはこの数字は倍になるであろう。
【００１７】
散発性AD、ALS、およびPD/LBDはいずれも、ADにおけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のアミロイド-β(Aβ)断片;ALSにおけるスーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)、およびPDおよびLBDにおけるα-シヌクレイン(1)を含めた、ミスフォールディング状態のポリペプチドの病原性マルチマーの神経蓄積と関係がある(これらはおそらくフィブリル、原繊維、および無定形凝集体であると思われる)。さらに、家族性アミロイド多発性神経炎(FAP)は、トランスサイレチンが凝集してアミロイド堆積物を形成することから発生する。プリオン病と同様に、これらのポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異は、常染色体優性の家族形のAD、ALS、およびPDと関係がある。
【００１８】
アルツハイマー病
ADは、いずれもAPPのタンパク質分解生成物である(4中に総説)Aβ(1〜40)、Aβ(1〜42)およびAβ(1〜43)ペプチドから主に構成され細胞外プラークの脳内蓄積と関係がある、一般的な痴呆性(記憶障害および認知障害)の神経変性病である。さらに、異常にリン酸化したtauタンパク質(神経の微小管結合タンパク質)から主に構成される神経原繊維濃縮体は、瀕死のニューロンでは細胞内に蓄積する(4)。家族形のADは、APP遺伝子、またはプレセニリン1または2遺伝子の突然変異によって引き起こされる可能性があり(www.websiteformutations.com)、そのタンパク質生成物はAPPからAβへのプロセシングと関係がある。アポリポタンパク質E対立遺伝子変異体も、散発性および家族形のADの発症時の年齢に影響を与える(5中に総説)。AβはAD患者の血液およびCSF中、ならびに正常な対照中で検出されてきている(6)。Aβは、トリソミー21(ダウン症候群)、アミロイドーシス(HCHWA)-オランダ型遺伝性小脳出血、および正常な脳の老化においても血管およびプラークアミロイドフィラメント中に存在する(Mori、Hら、JBC (1992) 267 : 17082〜86)。Tauおよびリン酸化tauは、AD患者および他の神経疾患を有する患者の脳脊髄液(CSF)において検出されてきている(7;8中に総説)。
【００１９】
筋萎縮性側索硬化症
ALSは致命的な神経筋疾患であり、1000人の成人中1人に発生し、進行性の衰弱、筋萎縮、および痙縮として現れ、これは脊髄および脳幹の500,000までの「下部運動ニューロン」、および大脳皮質中の無数の「上部運動ニューロン」の変性によるものである。ALSの病因に対する重要な手掛かりは、家族性ALS(fALS)の症例の約20%は、スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)(10,11)、フリーラジカル防御酵素の突然変異によるものであるという発見と共に出現した。100を超えるfALS SOD1のミスセンス、ナンセンス、およびイントロンスプライシング障害突然変異が今日まで分類されてきている(12;www.alsod.org)。突然変異ヒトSOD1(mtHuSOD1)を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトALSと臨床的および病的類似性を有する運動ニューロン症状を発症し(13、14)、野生型ヒトSOD1(wtHuSOD1)を発現するマウスは疾患を発症しない(13)。SOD1含有細胞質封入体は、家族性および散発性ALS患者由来の多くの疾患状態運動ニューロンにおいて(15)、ならびに大部分のトランスジェニックマウス(16、17)およびこの疾患の組織培養(18)モデルにおいて検出することができる。
【００２０】
パーキンソン病およびレビー小体病
PDは、罹患率がADに次いで第2位の(100,000の個体群当たり350まで;1)神経変性運動障害である。それは動きの硬さ、緩慢さ、および震えによって臨床上特徴付けられる(21中に総説)。パーキンソン病の大部分の症例は散発性であるが、散発形と家族形の両方の疾患が、PDにおいて選択的に殺傷される中脳ニューロン(60,000まで)の個体群である黒質の、瀕死のニューロン中の細胞内レビー小体によって特徴付けられる。レビー小体はα-シヌクレインから主に構成される(22)。α-シヌクレインをコードする遺伝子の突然変異は、家族性のパーキンソン病を有する患者において発見されてきている(23中に総説; www.parkinsonsmutation.com)。常染色体劣性PDと関係がある他の遺伝子は、α-シヌクレイン変性と関係があるパーキンである(22、23)。α-シヌクレインから構成されるびまん性皮質レビー小体は、パーキンソン状態の変化、幻覚、および迅速な症状の変動と関係がある痴呆症状であるレビー小体病(LBD)において観察される(24)。LBDは、60才を超える人間の間で20〜30パーセントの症例を占める、ADに次ぐ第二の最も一般的な形の神経変性痴呆である可能性がある(1、24)。
【００２１】
ハンチングトン病および関連疾患
HDは、ハンチングチンタンパク質のN末端におけるポリグルタミンをコードするCAG反復単位の伸長によって特徴付けられる、進行性の神経変性障害である(48中に総説)。36以上のポリグルタミンの伸長部が疾患を引き起こし、さらに長い反復単位はさらに早い発症を引き起こす(49、50)。
【００２２】
歯状核赤核淡そうルイ体萎縮症(DRPLA)および幾つかの形の洞-小脳性運動失調(ScA)などの他のポリグルタミン疾患も、ニューロン死の領域と大まかに関係がある細胞質封入体を有する。ScA-1遺伝子産物中の伸長ポリグルタミン反復単位の割り込みによって、疾患が存在しなくなる(51)。
【００２３】
アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびパーキンソン病/レビー小体病(PD、LBD)などの神経変性病は、我々の加齢群およびヘルスケアシステムに対する重大な課題を提起する。グループとしての神経変性病に関する、特異的な生化学試験は存在しない(1、2)。神経変性病は「診断外」とみなされるので、これらの進行性で不治の、通常は致命的な状態に関して「臨床的に確実な」診断を実施するために、非常に広範囲の調査が必要とされる。神経画像化などの高価な代理試験を使用して、診断の確実性を高める(2)。この破壊的な疾患群用の特異的で感度が良く、安価な生化学試験が入手可能になることによって、過剰負担のヘルスケアシステムに関する財源がおそらく温存されると思われる。さらに、初期の症状段階におけるこれらの疾患の安全な診断は、疾患の病理性理学が一般に治療に対してさらに効果的であるとき、高い治療有効性に関する窓口を広げる(3)。
【００２４】
ヒトの神経変性病の生前診断用の、効率の良い、有効かつ安価の診断およびスクリーニング戦略が、加齢群およびヘルスケアシステムに関する連続的な財政圧力を考慮して早急に必要とされる。
【００２５】
糖尿病
タンパク質凝集は、II型糖尿病を有する患者においても観察される。脂肪細胞由来ペプチド、レジスチンの高い発現がII型糖尿病患者において観察されてきており(Youn BSら、J Clin Endocrinol Metab.(2004); 89 : 150〜6)、高いレジスチンレベルは肥満およびインシュリン耐性において役割を果たしている可能性があることを、研究は示唆している。さらに、膵島アミロイドポリペプチド(アミリンとしても知られる)の堆積は、II型糖尿病と病理学的に関係がある。これらの堆積物は膵島アミロイドポリペプチド、特有のアミロイド性ペプチドを含み、β細胞の死と関係がある。近年の研究は、膵島アミロイド誘導型のβ細胞死を担う種は膵島アミロイド形成の初期に形成され、そのとき膵島アミロイドポリペプチドの蓄積が始まることを示唆している(Hull RLら、J Clin Endocrinol Metab.(2004) 89 : 3629〜43)。病原性膵島アミロイドポリペプチドを同定することができる診断試験は、食事および治療介入が最も有効であるその初期段階で、II型糖尿病を検出するのに非常に有用であると思われる。
【００２６】
癌
多くの形の癌も、タンパク質立体配座関連の疾患であると考えられる(Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマの部分集合は、腫瘍抑制因子p53タンパク質凝集体の異常な蓄積を示す(Butler JSら、Biochemistry (2003) 42 : 2396〜403 ; Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。この蓄積が幾つかの癌性細胞ではp53の機能の消失に貢献していると思われる(Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7)。蓄積したp53を検出することができるアッセイは診断上有用な検出システムをもたらすと思われ、治療介入を個別化することによって治療介入を高めると思われる。
【非特許文献１】
Dobson CM、Methods (2004) 34 : 4〜14
【非特許文献２】
http://www.alzheimer.ca/
【非特許文献３】
www.websiteformutations.com
【非特許文献４】
Mori、Hら、JBC (1992) 267 : 17082〜86
【非特許文献５】
www.alsod.org
【非特許文献６】
www.parkinsonsmutation.com
【非特許文献７】
Youn BSら、J Clin Endocrinol Metab.(2004); 89 : 150〜6
【非特許文献８】
Hull RLら、J Clin Endocrinol Metab.(2004) 89 : 3629〜43
【非特許文献９】
Ishimaru D.ら、Biochemistry (2003) 42 : 9022〜7
【非特許文献１０】
Butler JSら、Biochemistry (2003) 42 : 2396〜403
【非特許文献１１】
KohlerおよびMilstein (Nature 256、495〜497 (1975)
【非特許文献１２】
Kozborら、Immunol.Today 4、72 (1983)
【非特許文献１３】
Coleら、Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss、Inc、77〜96ページ
【非特許文献１４】
Huseら、Science 246、1275 (1989)
【非特許文献１５】
Morrisonら、Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81、6851 (1985)
【非特許文献１６】
Takedaら、Nature 314、452 (1985)
【特許文献１】
Cabillyら、米国特許第4,816,567号
【特許文献２】
Bossら、米国特許第4,816,397号
【特許文献３】
Tanaguchiら、欧州特許公開EP171496
【特許文献４】
欧州特許公開0173494
【特許文献５】
英国特許GB2177096B
【非特許文献１７】
Wardら、Nature 341、544〜546 : (1989)
【非特許文献１８】
Huseら、Science 246、1275〜1281 (1989)
【非特許文献１９】
McCaffertyら、Nature 348、552〜554 (1990)
【非特許文献２０】
Cerchia Lら、FEBS Letters 528 (2002) 12〜12
【非特許文献２１】
Bianchiniら、Immunol Methods (2001) 252 : 191〜97
【非特許文献２２】
Crawford Mら、Brief Funct Genomic Proteomic.2003 Apr ; 2 : 72〜9
【非特許文献２３】
Pizzano Rら、J.Agric Food Chem (2004) 52 : 649〜54
【非特許文献２４】
Elan、Jら、Nature Structural Biology (2003) 10 : 461〜67
【特許文献６】
2003年8月20日に出願された米国出願第60/496,381号(表題Methods of Detecting Prion Protein (Cashman & Lehto)
【特許文献７】
2003年8月21日に出願された米国出願第60/497,362号(表題Epitope Protection Assay (Cashman & Lehto)
【特許文献８】
カナダ出願第2,437,675号
【特許文献９】
カナダ出願第2,437,999号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らはエピトープ保護アッセイ(EPA)、血液および他の接触可能な組織および体液中の疾患関連タンパク質の感度の良い特異的な生前の検出をもたらす、新規な方法を最近開発した。本発明は、プリオン病などの疾患における凝集の役割を示し、従来技術の問題点を克服するアッセイを提供する。プリオン病では、正常細胞のモノマープリオンポリペプチドPrP^Cは、一般にPrP^Scと表される異常な凝集イソ型へのリフォールディングを経る。AD、PD、LBD、ALSおよびHDなどの疾患は、細胞タンパク質のミスフォールディングおよび/または凝集した立体配座によっても特徴付けられる。この性質を本発明の方法によって利用して、これらおよび他の疾患用の感度の良い特異的な診断試験を提供する。
【００２８】
本発明によれば、標的エピトープが非野生型タンパク質(すなわち疾患関連タンパク質)または野生型タンパク質のいずれか1つにおいて接触可能であり、他のタンパク質において接触不能である場合に、これらの方法は有用である。接触不能性は、標的エピトープを接触不能にする凝集によるものであることが多い。
【００２９】
本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが疾患(障害)関連ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドであるかどうかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドと遮断剤を接触させるステップと、
標的エピトープが遮断剤による化学的修飾と接触不能または接触可能であるかどうかを決定するステップとを含む方法を含む。
【００３０】
標的エピトープの接触可能性または接触不能性は、候補ポリペプチドが疾患(障害)関連ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドであるかどうかを示す。何故なら、疾患(障害)関連タンパク質および野生型タンパク質の1つにおいて、標的エピトープは接触可能だからである。他のポリペプチドでは、標的エピトープは接触不能である。
【００３１】
一実施形態では本発明は、プリオン病を検出する方法であって、例えば標的エピトープを含む候補ポリペプチドが野生型立体配座またはそれが凝集している非野生型立体配座であるかどうかを決定する方法であって、
ポリペプチドのサンプル(サンプルはPrP^Scおよび/またはPrP^C、ならびに多くの場合は多量の1つまたは他方を典型的には含む)と、典型的にはペルオキシ亜硝酸などのタンパク質と化学的に反応する物質であって、接触可能なエピトープ(標的エピトープ)をそれらが検出剤と結合することができないように修飾する、化学的修飾物質を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、ポリペプチドが(脱凝集および/または変性の前などに)接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む方法を提供する。
【００３２】
PrP^Cはアッセイ中「目に見えない状態」になる。何故なら、モノマー分子上のエピトープは化学的修飾物質によって抗体認識に対して遮断され、一方PrP^Scの分子は凝集体内に封鎖されること、あるいは他の場合は反応に利用できないことによって化学的修飾から「保護される」からである。あるいは、マルチマー分子上のエピトープは化学的修飾物質によって抗体認識に対して遮断され、一方PrP^Cの分子は接触可能なエピトープの違いによって化学的修飾から「保護される」。
【００３３】
他の実施形態では、アルツハイマー病の検出法は、
ポリペプチドのサンプル(サンプルは典型的には疾患状態のアミロイド前駆体ポリペプチドまたはAβまたはtauおよび/または対応する野生型ポリペプチドの全体または一部分、および多くの場合は多量の1つまたは他方を含む)と、典型的にはペルオキシ亜硝酸などのタンパク質と化学的に反応する物質であって、露出したエピトープをそれらが検出剤と結合することができないように修飾する化学的修飾物質を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む。
【００３４】
他の実施形態では本発明は、パーキンソン病(PD)、レビー小体病(LBD)、ハンチングトン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、糖尿病、および癌などの、例えばミスフォールディングおよび/または凝集タンパク質から生じる、差別的に接触可能な疾患および野生型立体配座の標的エピトープによって特徴付けられる他の疾患用の疾患検出法を提供する。これらの方法は、ポリペプチドのサンプル(例えば、本明細書に記載する疾患関連ポリペプチド)と、それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾する化学的修飾物質を反応させるステップ、次いでサンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップ、および標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップなどのステップを同様に含む。これらのステップは、血液および血液製品のスクリーニングなどの他の目的、ならびに本明細書に記載する他の使用に同様に適合する。
【００３５】
本発明の方法は、既存の技術に優る多くの利点を有する。前述のように、本発明は場合によっては「EPA」と呼ばれ、プリオンタンパク質の場合、疾患の検出は、プリオン病の感染粒子およびADと関係があるポリペプチドを構成すると考えられる病原体分子である、PrP^Scなどの凝集した疾患関連タンパク質を検出するための単純で効率の良い方法である。
【００３６】
本発明は、高スループットロボット性プラットホームにおいて有用である。例えば、EPAはPrPプロテアーゼ耐性、プリオン病用の最も多く市販されている診断試験の基礎には依存しない。エピトープ保護技術はプロテーゼによる消化ステップを必要とせず、それによってエピトープ保護技術は初期感染に対してより感度の良いものとなる。確かに、プロテーゼによる消化ステップが存在しないことによって、EPAは高スループットロボットプラットホームにさらに適合する。
【００３７】
さらに、本発明の方法を使用して、1つまたは複数の標的エピトープが少なくとも1つの立体配座に隠れている、2つ以上の立体配座で存在する任意のタンパク質を検出することができる。
【００３８】
したがって本発明は、
ポリペプチドのサンプルを、典型的にはタンパク質と化学的に反応する物質であって、それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾すると定義される化学的修飾物質と反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが化学的修飾物質と接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む検出法に関する。
【００３９】
この結果は、存在するポリペプチドの型(すなわち、野生型タンパク質または非野生型タンパク質)の指標である接触不能なエピトープを、ポリペプチドが含むかどうかを示す。
【００４０】
一実施形態では本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって(一実施形態では、非野生型立体配座で、候補ポリペプチドは凝集ポリペプチドと凝集する)、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つでは、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、転換前に候補ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドは標的エピトープが接触可能であった立体配座であったことを示し、したがってポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であったこと示すステップとを含む方法を含む。
【００４１】
本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では、標的エピトープは接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
【００４２】
本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座では、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、野生型立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応せず、未反応遮断剤は、例えば遮断剤が消費または分解される時間を与えることによって、あるいは以下に記載する物理的または化学的方法によってそれを積極的に除去することによって、ポリペプチドとの接触から除くステップと;
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
【００４３】
本発明は、遮断剤と反応した標的エピトープを含む候補ポリペプチドが、野生型立体配座または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
【００４４】
本発明の方法では、エピトープは多くの場合、ミスフォールディングまたは非野生型立体配座において接触不能である。何故ならi)野生型フォールディングポリペプチドと比較したポリペプチドの異なるミスフォールディングが、遮断剤と標的エピトープの間の反応を妨げるかあるいは低下させる、ii)ミスフォールディング状態のポリペプチドは、それ自体が凝集するかあるいはミスフォールディング状態の立体配座の他のポリペプチドと凝集して、保護/遮断剤と標的エピトープの間の反応を妨げるかあるいは低下させる、および/またはiii)ポリペプチドの翻訳後修飾が、遮断剤と標的エピトープの間の反応を妨げるかあるいは低下させるからである。
【００４５】
一例では、候補ポリペプチドはプリオンタンパク質を含み、野生型フォールディング状態の立体配座は野生型フォールディング状態のプリオンタンパク質の立体配座を含み、ミスフォールディング状態の立体配座はPrP^Scの立体配座を含む。あるいは、野生型フォールディング状態のタンパク質は、APPまたはその切断産物アミロイドβの立体配座を含み、ミスフォールディング状態の立体配座はアルツハイマー病APPまたはその切断産物アミロイドβの立体配座を含む。
【００４６】
他の例では、候補ポリペプチドはSOD1、α-シヌクレイン、膵島アミロイドポリペプチド、レジスチンまたはp53タンパク質を含む。本出願中に記載する本発明の方法およびキットは、例えばポリペプチドのβ-シートが豊富な領域の相互作用によって1つに凝集したポリペプチドの多数のコピーを含む立体配座を有する、非野生型ポリペプチドに適用するのに有用である。一実施形態ではポリペプチドは、プリオンタンパク質凝集体に凝集するポリペプチドである。他の実施形態ではポリペプチドは、アミロイドプラークに凝集するポリペプチドである。
【００４７】
本発明は、i)本明細書に列挙する遮断剤との反応によって修飾された本発明のポリペプチド、およびii)検出剤との反応によって修飾されたポリペプチドも含む。本発明は、これらの修飾ポリペプチドを含む本発明の組成物およびキットも含む。
【００４８】
遮断剤は場合によってはペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、二炭酸ジエチル(DEPC)、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)、コンジュリトール-B-エポキシドおよび1,2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンなどのエポキシド、メチレンまたはジアジリンおよび関連化合物である。本発明の方法では、例えば熱、界面活性剤および/またはカオトロピック剤によってポリペプチドを変性させることにより、ポリペプチドを場合によっては修飾する。ポリペプチドは、同型の他のポリペプチドから、および他の分子からポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によって場合によっては修飾し、脱凝集剤はカオトロピック剤(グアニジン塩、尿素またはチオ尿素を含む)、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから場合によっては選択される。
【００４９】
遮断剤の除去に関してここに列挙する本発明の方法ステップは、物理的に、化学的に、あるいは他の場合は候補ポリペプチドから遮断剤を除去してさらなる反応を妨げることを典型的には含むことは、当業者には容易に明らかである。除去は場合によっては、消費または分解されることによって候補ポリペプチドから遮断剤が除去されるように(例えば、遮断剤が不活性または酸化状態になるように)、充分な時間を経過させることを含む。除去は場合によっては、化合物を加えて任意の過剰な遮断剤と反応させてそれを不活性化させることを含む。除去は場合によっては、従来の濾過技法による遮断剤の物理的濾過、または候補ポリペプチドと遮断剤を分離するための遠心分離、例えばカラム中での遮断剤または候補ポリペプチドと固定支持体との結合などによる、遮断剤を除去するのに有用な支持体との物理的結合も含む。
【００５０】
除去とは、例えば物理的または化学的に遮断剤を不活性化させること、候補ポリペプチドを含むサンプルと遮断剤を接触させないこと、または遮断剤が消費または分解されるのに充分な量の時間を経過させることによって、遮断剤によるさらなる反応を妨げることを意味する。
【００５１】
検出剤は、プリオンポリペプチドのエピトープ、アミロイドβのエピトープ、α-シヌクレインのエピトープ、またはSOD10エピトープを対象とする抗体を場合によっては含む。抗体は抗プリオン抗体6H4および3F4、および抗アミロイドβ抗体6E10および4G8の全体または一部分を場合によっては含む。
【００５２】
本発明の方法は、ヒトなどの哺乳動物に関して使用することが好ましい。さらに本発明の方法は、家畜などの哺乳動物に関して使用することが好ましい。さらに本発明の方法は、食品、化粧品、歯科および外科手術道具、真空包装および薬剤製品に関して使用する。
【００５３】
本発明は、本明細書に記載する本発明の方法を使用して、サンプル中の非野生型立体配座の候補ポリペプチドであって、標的エピトープを含む候補ポリペプチドの存在によって特徴付けられる疾患を動物が有するかどうかを判定する、動物由来のサンプルを試験する方法も含む。このような疾患は本明細書に記載する。一実施形態では、本発明の方法は、
候補ポリペプチド中の接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とサンプルを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、候補ポリペプチドが凝集ポリペプチドと凝集し標的エピトープが遮断剤と反応することができないために、標的エピトープが接触不能であるステップと、
サンプルと転換剤を接触させて候補ポリペプチドを修飾してサンプル中の任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が候補ポリペプチドが非野生型立体配座であること、および動物が疾患を有することを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如がポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法によって、候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを判定することを含む。
【００５４】
本発明は、例えば血液または血液製品などのサンプル、および他のサンプルを試験することによってスクリーニングして、非野生型立体配座の候補ポリペプチドであって、標的エピトープを含む候補ポリペプチドをサンプルが含むかどうかを判定する、本明細書に記載する本発明の方法も含む。一実施形態では、本発明の方法は、
候補ポリペプチド中の接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とサンプルを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
サンプルと転換剤を接触させて候補ポリペプチドを修飾してサンプル中の任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったこと、およびサンプルが非野生型立体配座の候補ポリペプチドを含むことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法によって、候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを判定することを含む。
【００５５】
他の実施形態では本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座である(例えば、ポリペプチドが非野生型立体配座に凝集する)かどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、(例えば、候補ポリペプチドが凝集するために)標的エピトープが接触不能であり、標的エピトープが遮断剤と反応することができないステップと、
候補ポリペプチドを修飾して接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法に関する。未反応遮断剤も、例えばそれを消費または分解させることによって、あるいはそれを物理的または化学的方法によりそれを反応から除去することによって、ポリペプチドとの接触から除く。
【００５６】
候補ポリペプチドはプリオンタンパク質を場合によっては含み、野生型立体配座は野生型プリオンタンパク質の立体配座を含み、非野生型立体配座はPrP^Scの立体配座を含む。候補ポリペプチドはβ-アミロイドポリペプチド、tauタンパク質またはAPPタンパク質、SOD1、α-シヌクレイン、ハンチングチンタンパク質、p53または膵島アミロイドポリペプチドまたはレジスチンを場合によっては含む。遮断剤はペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から場合によっては選択される。ポリペプチドを変性させることによって、ポリペプチドを場合によっては修飾する。熱および/または界面活性剤および/またはカオトロピック剤によって、ポリペプチドをさらに場合によっては変性させる。凝集ポリペプチドからポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によって、ポリペプチドを場合によっては修飾する。脱凝集剤はカオトロピック剤、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから場合によっては選択される。界面活性剤は場合によってはSDSを含む。検出剤は、例えばプリオンポリペプチドのエピトープを対象とするアプタマーまたは抗体を場合によっては含む。抗体は6H4または3F4を場合によっては含む。アプタマーまたは抗体は、アミロイドβのエピトープを場合によっては対象とする。抗体は6E10または4G8を場合によっては含む。非野生型立体配座は幾つかの実施形態では、プリオン病(例えばBSEまたはCJD)、アルツハイマー病、パーキンソン病またはレビー小体病、ハンチングトン病、筋萎縮性側索硬化症、癌または糖尿病などのタンパク質凝集によって引き起こされる疾患を示す。
【００５７】
場合によっては、遮断剤と候補ポリペプチドを接触させる前に、以下の方法:吸着、沈殿、または遠心分離の1つまたは複数によって前処理したサンプル中に候補ポリペプチドが存在する。場合によっては、遮断剤と候補ポリペプチドを接触させる前に、標的エピトープをマッピングする(すなわち、例えば「標的エピトープ」の項で以下に記載したのと同様に、エピトープを同定する)。場合によっては、CSF、血清、血液、尿、バイオプシーサンプルまたは脳組織の群から選択される死後または生前サンプル中にポリペプチドが存在する。本発明の他の態様は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出するためのキットであって、標的エピトープを認識する検出剤、ならびにi)標的エピトープをマッピングすること、ii)候補ポリペプチドと遮断剤を接触させること、およびiii)候補ポリペプチドと検出剤を接触させることの少なくとも1つに関する指示書を含むキットに関する。このキットは、本明細書に記載する本発明の方法を実施するのに有用である。検出剤はアプタマーまたは抗体を場合によっては含む。抗体は6H4、3F4、6E10または4G8を場合によっては含み、場合によっては固相担体に固定されている。キットは例えばサンドウィッチELISA、蛍光ELISAなどのELISA用のバッファーおよび試薬を場合によってはさらに含む。キットは、遮断剤を場合によってはさらに含む。キットは、界面活性剤およびカオトロピック剤の群の少なくとも1つから選択される変性剤を場合によってはさらに含む。キットは、ポリペプチドスタンダードを場合によってはさらに含む。キットは、組換え疾患関連タンパク質、または疾患関連タンパク質を模倣した組換えタンパク質を場合によっては含む。他の実施形態では本発明は、遮断剤と接触している候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、候補ポリペプチドが少なくとも1つ標的エピトープを含み、遮断剤との接触および遮断剤の除去の後、候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換し、この方法が、接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は、候補ポリペプチドが非野生型立体配座(例えば凝集立体配座)であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如は、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップを含む方法に関する。本明細書に記載する疾患、遮断剤、標的エピトープ、検出剤および他の態様は、この方法においても有用である。本明細書に記載する疾患、遮断剤、標的エピトープ、検出剤および他の態様は前章に記載する方法、例えば動物(例えばヒト、家畜など)由来のサンプルを試験してその動物が疾患を有するかどうか判定する方法、またはサンプルをスクリーニングするための方法などにも容易に適合する。
【００５８】
前章の幾つかに記載した方法に対する逆の状況、例えば野生型立体配座が接触不能なエピトープを含み、非野生型立体配座が接触可能なエピトープを含む状況も有用に検出される。この状況も本明細書に記載する方法、疾患の診断またはサンプルのスクリーニングなどに容易に適合させる。
【００５９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら例示のみによって与えられることは理解されるはずである。何故なら、本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および変更形態が、この詳細な記載から当業者に明らかとなるからである。
【００６０】
本発明の幾つかの実施形態を、以下の図面に関して記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、凝集体を形成するかあるいは他の場合は正常または野生型ポリペプチドにおいては隠蔽されていない1つまたは複数のエピトープの隠蔽をもたらす、正常細胞ポリペプチドの疾患関連ポリペプチド相当物を検出するのに有用な方法を提供する。本発明は、プリオン病などの疾患の病理学における凝集の重要性を認識している。本発明はこの凝集効果も利用し、従来技術の検出アッセイに関する問題点を克服するアッセイを提供する。一実施形態では、本発明の方法を血漿、血清、尿または他の生物サンプル中のPrP^Scの検出に適用する。本発明の方法は他に、2つ以上の立体配座で存在し、少なくとも1つの立体配座の1つまたは複数の標的エピトープが接触不能である、任意のポリペプチドを検出するのに有用である。一実施形態では本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが、野生型または非野生型立体配座であるかどうか検出する方法を含む。
【００６２】
「エピトープ」は、抗体などの検出剤によって認識され結合される、隣接または非隣接アミノ酸(抗原)の配列の一部分を指す。好ましくはエピトープは、検出剤によって認識され結合される3〜10個または6〜10個あるいはそれより多くの隣接アミノ酸を典型的には含む、ポリペプチド上の線状エピトープである。立体配座エピトープは非隣接アミノ酸を含む。立体配座エピトープは時折、例えばイムノブロット膜上での部分的なリフォールディングによって変性後に自力で回復することができる。抗体などの検出剤は3次元構造を認識する。タンパク質分子が三次元構造にフォールディングされるとき、エピトープを形成するアミノ酸は、検出剤がアミノ酸を認識しそれらと結合することができるような形式で位置する。アンフォールディング(変性)タンパク質では、線状エピトープのみが検出剤によって認識され結合される。タンパク質は検出剤と接触する前はアンフォールディング状態なので、接触不能なエピトープは典型的には線状エピトープである。
【００６３】
「遮断剤」は、例えばエピトープと結合することによって、あるいは例えば線状エピトープ内のアミノ酸側鎖基において、エピトープが検出剤(常にではないが通常は抗体)と結合するのを妨げるように、エピトープの反応性を修飾し消失させることによって、エピトープの反応性を低下させる物質を指す。遮断剤の一例はペルオキシ亜硝酸である。他の例はメチレン、過酸化水素、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)、コンジュリトール-B-エポキシドおよび1,2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンなどのエポキシド、およびジアジリンを含むと思われる。本来の状態のエピトープ認識に重要な接触可能なアミノ酸を飽和状態にする化学的修飾物質は、エピトープ保護技術を適用する際に最も有用である。さらに遮断剤は、標的エピトープをリン酸化、グリコシル化、あるいは他の場合は修飾することができる。遮断剤は、エピトープと結合するペプチド、抗体または抗体断片を含むこともできる。遮断剤は、接触可能なアミノ酸を効率良く修飾しなければならない(例えば、接触可能なアミノ酸の少なくとも50%、75%、90%、95%または99%を修飾する)。
【００６４】
「接触可能なエピトープ」は、本発明の方法において遮断剤との反応に利用可能な標的エピトープである。例えば、遮断剤との反応に利用可能なエピトープが接触可能なエピトープである。遮断剤と反応した後、接触可能なエピトープは検出剤との結合を妨げられる(この反応ステップの後、反応したエピトープは遮断エピトープと呼ぶことができる)。
【００６５】
「抗体」は、1つまたは複数のタンパク質のエピトープ、例えば疾患関連タンパク質のエピトープなどとも特異的に反応する、完全抗体およびその断片を含むものとする。抗体は従来の技法を使用して断片化することができ、それらの断片は以下に記載したのと同じ方法で有用性に関してスクリーニングする。例えば、ペプシンで抗体を処理することによって、F(ab')2断片を生成することができる。生成したF(ab')2断片を処理して、ジスルフィド結合を還元しFab'断片を生成することができる。
【００６６】
「アプタマー」は、タンパク質またはペプチド標的と特異的に相互作用することができる、ペプチド、RNAまたはDNA分子などのマクロ分子を意味する。
【００６７】
「接触不能なエピトープ」は、化学的遮断剤による標的エピトープの修飾が、例えば野生型ポリペプチドに対して異なるミスフォールディングによって、ミスフォールディング状態のポリペプチドの凝集によって、あるいはポリペプチドの翻訳後修飾によって、妨げられるかあるいは著しく低下する(例えば、少なくとも50%、75%、90%または95%低下する)ことを意味する。幾つかの場合、遮断剤による標的エピトープの修飾を妨げるかあるいは著しく低下させる障害(例えばミスフォールディングまたは凝集)を除去することによって、接触不能なエピトープを接触可能なエピトープに転換する。接触可能なエピトープに転換される接触不能なエピトープは、「露出エピトープ」と呼ぶこともできる。
【００６８】
「検出剤」は、エピトープと結合し検出することができる物質、例えばポリペプチドを含むサンプルをプローブ処理するために使用することができるプリオンポリペプチドのエピトープに特異的な抗体などを指す。ポリペプチドがアンフォールディング状態になった後に、検出剤が非遮断、非修飾状態のエピトープと優先的に結合するように検出剤を使用する。
【００６９】
「疾患関連タンパク質または疾患関連ポリペプチド」は、ポリペプチドの調節または高次立体配座が野生型または非疾患立体配座と異なり、突然変異体、変異体およびそれらの多形型を含む疾患または障害状態と関係があるポリペプチドを指す。疾患関連タンパク質または疾患関連ポリペプチドは、非野生型立体配座タンパク質またはポリペプチドと呼ぶこともできる。調節立体配座は、1つのタンパク質分子の三次元構造の立体配座の変化を指す。高次立体配座は、1つに凝集した多数のタンパク質分子の三次元構造の立体配座の変化を指す。凝集体は1つまたは複数の異なるタンパク質からなっていてよく、非タンパク質分子と結合してよい。疾患関連タンパク質またはポリペプチドを含めた野生型および非野生型候補ポリペプチドは、細胞で発現され(すなわちバキュロウイルス系などを使用して細菌で発現され)in vitroで翻訳されたポリペプチドなどの組換えタンパク質も含む。
【００７０】
「野生型フォールディング状態の立体配座」は、非疾患または非障害状態のタンパク質の野生型のフォールディング状態の立体配座を指す。
【００７１】
「ミスフォールディング状態の立体配座」は、その立体配座が野生型立体配座と異なる、疾患または障害状態のポリペプチドのフォールディング状態の立体配座を指す。立体配座の違いは差別的なフォールディングの結果である。差別的なフォールディングは、タンパク質の凝集を引き起こす可能性がある。
【００７２】
「野生型立体配座」は、その通常または正常状態あるいは参照または所望状態のポリペプチドの立体配座を指し、非疾患または非障害状態のポリペプチドを含むことができる。
【００７３】
「非野生型立体配座」は、野生型ポリペプチドの立体配座と異なるポリペプチドの立体配座を指し、野生型立体配座と異なる疾患または障害のポリペプチドの立体配座を含むことができる。立体配座の違いは、野生型ポリペプチドと比較して差別的なフォールディング、ポリペプチド凝集または差別的な翻訳後修飾の結果である可能性がある。ポリペプチド凝集の場合、凝集は立体配座の変化ではなくエピトープの接触しやすさを妨げる可能性がある。
【００７４】
アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびパーキンソン病/レビー小体型痴呆(PD、LBD)などの神経変性病は、加齢群およびヘルスケアシステムに対する重大な課題を提起する。グループとしての神経変性病に関する、特異的な生化学試験は存在しない(1、2)。散発性AD、ALS、およびPD/LBDはいずれも、ADにおけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のAβ断片;ALSにおけるスーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)、およびPDおよびLBDにおけるα-シヌクレイン(1)を含めた、ミスフォールディング状態のポリペプチドの病原性マルチマーの神経蓄積と関係がある(フィブリル、原繊維、および無定形凝集体など)。プリオン病と同様に、これらの凝集傾向があるポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異は、常染色体優性の家族形のAD、ALS、およびPDと関係がある。疾患関連のミスフォールディング状態のポリペプチド凝集体の検出は、神経変性病用の特異的で感度の良い生前診断試験を可能にする。
【００７５】
この目的のために本発明者は、「エピトープ保護アッセイ」(EPA)、瀕死のニューロンから放出された凝集体の「シンク」として働く組織、ならびに血液およびCSFなどの接触可能な生物体液中に凝集したポリペプチドを検出するための革新的技術を発明している。この方法は場合によっては、
サンプルと化学的修飾物質を反応させるステップと、
処理したポリペプチドを脱凝集および変性させるステップと、
化学的修飾物質によって遮断された特定のエピトープに対する抗体などの検出剤でサンプルをプローブ処理するステップと、
物質と結合したポリペプチドを(例えばELISAによって)検出するステップとからなる。
【００７６】
サンプル中の正常な可溶性ポリペプチドは、アッセイ中「目に見えない状態」になる。何故なら、接触可能なエピトープは検出剤によって検出されず(例えば抗体認識に対して遮断される)、凝集体中のポリペプチドの一部分は、それらの内部封鎖による化学的修飾から「保護され」、脱凝集後に依然として検出剤によって(例えば抗体との結合によって)検出可能だからである。
【００７７】
本発明の方法は、ポリペプチドのミスフォールディングおよび/または凝集によって特徴付けられる疾患、例えば前述の疾患、あるいは他の場合差別的に接触可能な疾患および野生型タンパク質立体配座の標的エピトープを有する、ポリペプチドによって特徴付けられる疾患または障害などを診断するのに有用である。
【００７８】
本発明者は、低濃度の変性剤の存在下における低pHでの組換えマウスのプリオンポリペプチド(rmPrP)の治療は、ミスフォールディング状態の疾患関連プリオンポリペプチドのイソ型PrP^Scを暗示する、高いβ-シート含量をポリペプチドが得るのを誘導することも見出している。rmPrPのこの転換は、チロシン側鎖⁴の高い溶媒接触性と関係がある。本発明者は、酸および変性剤による正常な脳ホモジェネートの処理によって、PrPが界面活性剤不溶性になることを引き起こすことを見出している(29)。正常およびミスフォールディング状態のPrP^Cのチロシンおよび他の残基の表面接触性をプローブ処理するために、正常および酸処理したミスフォールディング状態のヒト脳組織を、化学硝酸化合物であるペルオキシ亜硝酸で処理した。脳組織のペルオキシ亜硝酸処理は、イムノブロッティング、免疫沈降およびELISAによって測定すると、抗PrP抗体3F4および6H4の結合の低下を引き起こした。ペルオキシ亜硝酸誘導型のエピトープ遮断は、ミスフォールディング状態のPrPより正常な脳のPrPにおいて顕著であり、凝集の保護効果が示された。スクレーピー感染した脳のPrPの3F4および6H4エピトープがペルオキシ亜硝酸誘導型の修飾から部分的に保護された、正常およびスクレーピー感染したハムスターの脳において、同様の発見を観察した。抗ニトロチロシン抗体を用いたペルオキシ亜硝酸処理した脳の免疫沈降は、PrPがチロシン残基において硝化されるか、あるいはPrP付近の他のポリペプチドが硝化され、PrPと同時免疫沈降することを示唆する。
【００７９】
したがって本発明は、PrP^Scだけには限らないがこれを含めたポリペプチド凝集を測定する方法であって、
サンプルと化学的修飾物質を反応させるステップであって、この場合このような物質はペルオキシ亜硝酸だけには限らないが、ペルオキシ亜硝酸であってよいと思われるステップと、
熱、界面活性剤、またはカオトロピック剤によって化学的に修飾されたサンプルを脱凝集および/または変性させるステップと、
プリオンポリペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いてプローブ処理するステップとを含む方法を含む。
【００８０】
さらに本発明者は、本発明の方法はアルツハイマー病タンパク質を検出するのに有用であることを示している。
【００８１】
一実施形態では、アルツハイマー病の検出法は、
ポリペプチドのサンプル(サンプルは典型的には、疾患関連タンパク質またはポリペプチド、例えばアミロイド前駆体ポリペプチドまたはアミロイドβまたはtauおよび/または対応する野生型ポリペプチドなどの全体または一部分、および多くの場合は多量の1つまたは他方を含む)と、それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾する化学的修飾物質、典型的にはペルオキシ亜硝酸などの遮断剤を反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップを含む。
【００８２】
Aβ含有血管またはプラークフィラメントは、トリソミー21(ダウン症候群)、遺伝性小脳出血およびアミロイドーシス(HCHWA)-オランダ型、および正常な脳の老化(Mori、Hら、JBC (1992) 267 : 17082〜86)などの状態とも関係がある。したがって、一実施形態ではAβ疾患関連タンパク質の検出は、疾患HCHWA-オランダ型または正常な脳の老化の徴候を示す。
【００８３】
さらに本発明の方法は、磁気共鳴画像法(MRI)またはコンピュータ断層撮影(CT)スキャンなどの他の診断法と組み合わせて、診断を確認することができる。
【００８４】
本発明の方法は、1つまたは複数の標的エピトープが少なくとも1つの立体配座に隠れている2つ以上の立体配座で存在する標的を含む、タンパク質またはポリペプチドを検出するのに有用である。
【００８５】
したがって本発明は、
それらが検出剤と結合することができないように露出したエピトープを修飾すると定義される化学的修飾物質（典型的には遮断剤）とポリペプチドを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、脱凝集および/または変性の前にポリペプチドが化学的修飾物質と接触不能な標的エピトープを含んでいたかどうかを決定するステップとを含む検出法に関する。
【００８６】
この結果は、存在するポリペプチドの型(すなわち、野生型タンパク質または非野生型タンパク質)の指標である接触不能なエピトープを、ポリペプチドが含むかどうかを示す。
【００８７】
本発明は、遮断剤と反応した標的エピトープを含む候補ポリペプチドが、野生型立体配座または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップとを含む方法も含む。
【００８８】
他の適用例では本発明は、固有に修飾されたポリペプチドを検出する方法であって、その修飾が検出剤との反応から標的エピトープを保護し、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つでは、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープは接触不能であり遮断剤と反応しないステップと、
固有に修飾されたポリペプチドの標的エピトープから固有の修飾を除去する物質とサンプルを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、候補ポリペプチドが固有に修飾されたポリペプチドであるかどうかを決定するステップとを含む方法も含む。
【００８９】
化学的修飾物質
本発明の化学的修飾物質は、本発明の方法によってエピトープが目に見えない状態になる(すなわち検出剤によって検出されない、あるいは検出が低下する)ように標的エピトープ残基を修飾する、任意の化学物質(生物物質を含む)を含む。例えばペルオキシ亜硝酸は、チロシン、セリン、メチオニン、ヒスチジンおよびトリプトファン、ならびにシステインおよび他のアミノ酸を優先的に修飾する(25、26)。DEPCはヒスチジンを優先的に修飾し(37)、無水コハク酸はアミンを含む残基を優先的に修飾する。コンジュリトール-B-エポキシドおよび1,2-エポキシ-3-(p-ニトロフェノキシ)プロパンを含めたエポキシドは、アスパルチルプロテアーゼの触媒残基などの、カルボキシル基側鎖の「自殺的阻害」用に広く使用されている反応基である(19、20)。過酸化水素およびメチレンも有用である。これらの化学物質はエピトープを酸化、硝化、還元、あるいは他の場合は修飾することによって標的エピトープを修飾することができる。さらにエピトープは、標的エピトープを覆い隠すリン酸基(リン酸化によって)、またはグリコシル基(グリコシル化によって)、および/または他の化学基である化学的修飾物質によって修飾することができる。
【００９０】
したがって一実施形態では、化学的修飾物質はペルオキシ亜硝酸、DEPC、過酸化水素、無水コハク酸、メチレンおよびエポキシド(コンジュリトール-B-エポキシドおよび1,2-エポキシ-3-)p-ニトロフェノキシ)プロパンおよび/またはこれらの関連変形の群から選択される。
【００９１】
候補ポリペプチドとの反応後、化学的修飾物質を除去する。遮断剤の除去に関してここに列挙する本発明の方法ステップは、物理的に、化学的に、あるいは他の場合は候補ポリペプチドから遮断剤を除去してさらなる反応を妨げることを典型的には含むことは、当業者には容易に明らかである。除去は場合によっては、消費または分解されることによって候補ポリペプチドから遮断剤が除去されるように(例えば、遮断剤が不活性または酸化状態になるように)、充分な時間を経過させることを含む。除去は場合によっては、化合物を加えて任意の過剰な遮断剤と反応させてそれを不活性化させることを含む。除去は場合によっては、従来の濾過技法による遮断剤の物理的濾過、または候補ポリペプチドと遮断剤を分離するための遠心分離、またはカラム中での遮断剤または候補ポリペプチドと固定支持体との結合などによる、遮断剤を除去するのに有用な支持体との物理的結合も含む。
【００９２】
除去とは、例えば物理的または化学的に遮断剤を不活性化させること、候補ポリペプチドを含むサンプルと遮断剤を接触させないこと、または遮断剤が消費または分解されるのに充分な量の時間を経過させることによって、遮断剤によるさらなる反応を妨げることを意味する。
【００９３】
標的エピトープの化学的修飾は、抗体認識に対するエピトープの隠蔽をもたらす。一実施形態では、ペルオキシ亜硝酸などの遮断剤を用いた処理は、非野生型ポリペプチドまたは疾患関連タンパク質などの凝集タンパク質上のエピトープではなく、モノマータンパク質上のエピトープの破壊をもたらす。
【００９４】
前処理
本発明の方法は、サンプルを前処理してEPA検出を高めることも企図する。例えば、血液または尿中においてプリオンなどの凝集タンパク質の低い検出が観察される場合、事前に清澄化する戦略を容易に使用して、界面活性剤、沈殿剤、および吸着剤、例えば当業者に知られている市販のELISAアッセイにおいて典型的に使用されているものなどを用いて検出を高める。ポリペプチドサンプルは、界面活性剤またはクアニジンなどの物質あるいは熱を用いて前処理することもできる。最終的にはサンプルを、遠心分離などの方法によって濃縮または事前にことができる。したがって一実施形態では、本発明の方法を使用する前にサンプルを前処理する。
【００９５】
ミスフォールディングまたは凝集タンパク質およびポリペプチドの検出
本発明者は、1つの立体配座が検出剤と接触可能であり他の立体配座は修飾剤による接触不能なエピトープの修飾により接触不能である標的エピトープを有する、ポリペプチドを検出する方法を発見している。本発明者は、本発明の方法において標的エピトープとして有用である、幾つかのエピトープを同定している。他の標的エピトープは、以下に記載したのと同様に同定する。
【００９６】
標的エピトープ
2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドの標的エピトープを同定し、抗体、アプタマーまたはペプチドなどの検出剤によって検出することができるエピトープは、1つの立体配座では接触可能であり他の立体配座では接触不能である。ポリペプチドの1つの立体配座でエピトープが遮断剤による検出から遮断されることが分かっている場合、そのエピトープが標的エピトープである。標的エピトープを同定するために、抗体などの検出剤を選択する。検出剤が抗体である場合、それはモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体も使用可能である。線状または非線状エピトープであってよく、抗体によって特異的に認識されるエピトープは、場合によっては知られているエピトープである。ペルオキシ亜硝酸などの候補化学的修飾物質を選択する。検出剤によって認識されるエピトープが知られている場合、候補化学的修飾物質は、標的エピトープ中のアミノ酸残基を修飾するその能力に基づいて選択することが好ましい。例えば、ペルオキシ亜硝酸はチロシンおよびヒスチジン残基を優先的に修飾し、システインおよび他のアミノ酸をある程度修飾する。チロシンおよび/またはヒスチジンが標的エピトープ中に存在する場合、化学的修飾物質としてペルオキシ亜硝酸を場合によっては選択する。野生型ポリペプチドを含むサンプルの等分試料、および非野生型ポリペプチドを含むサンプルの等分試料を、高濃度の選択した化学的修飾物質と反応させる。それぞれのサンプルは、組換えポリペプチド、細胞抽出物または野生型または非野生型立体配座のいずれかのポリペプチドを発現することが知られている組織サンプルの1つまたは複数を含む。ポリペプチドのサンプルは、同様のポリペプチド濃度を有することが好ましい。あるいは非野生型立体配座のポリペプチドサンプルは、非野生型立体配座への転換を誘導する酸などの物質で、野生型立体配座のポリペプチドを処理することによって得る。
【００９７】
ポリペプチドのそれぞれのサンプルを変性および/または脱凝集させて、任意の接触不能な推定標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換する。次いでポリペプチドのそれぞれのサンプルを、選択した検出剤と接触させる。ELISA、およびウエスタンブロッティングなどの当分野で知られている技法を使用して検出を行う。保護剤で処理した野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルの量と、保護剤で処理した非野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルの量を比較する。1つまたは複数の濃度の化学的修飾物質における検出の違いは、1つの立体配座のエピトープが保護されることを示し、そのエピトープが標的エピトープであることをさらに示す。一定範囲の化学的修飾物質濃度における違いは、標的エピトープがEPAに有用であることを示す。このプロセスは異なる遮断剤および/または検出剤を用いて繰り返し、標的エピトープを同定する。典型的には遮断剤を標準化および滴定して、メチレン^24,25などの「共通の」化学的修飾物質を使用して実験を行い、これは場合によっては標的エピトープのより均一で完全な保護を生み出す。
【００９８】
したがって一例では、2つ以上の立体配座を有するポリペプチド中の標的エピトープであって、1つの立体配座が検出剤と接触可能であり他の立体配座は接触不能である標的エピトープを同定する方法は、
野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルおよび非野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルと、典型的には1つまたは複数の濃度の化学的修飾物質を反応させるステップと、
それぞれのサンプルを変性および/または脱凝集させて、任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
サンプルを検出剤と接触させるステップと、
化学的修飾物質で処理した野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルと、化学的修飾物質で処理した非野生型立体配座のポリペプチドを含むサンプルに関して検出剤によって生成するシグナルを比較するステップであって、野生型ポリペプチドを含むサンプルと非野生型サンプルを含むサンプルの間の検出の違いが、1つの立体配座のエピトープが保護されることを示し、そのエピトープが標的エピトープであることをさらに示すステップとを含む。
【００９９】
EPAに関する条件
ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素およびメチレン(前駆体ジアジリンのUV光による光分解に基づく)または他の修飾物質を用いる滴定実験は、エピトープ保護に関する条件を改善するのに有用である。
【０１００】
疾患関連タンパク質を含む2つ以上の立体配座のポリペプチドを含むことが知られているサンプルは、場合によってはイムノブロッティングおよびELISAを使用して反応させる。それぞれの場合、サンプルを調製し、高濃度の修飾物質と場合によっては混合させ、例えばイムノブロッティング、ELISAおよび/または時間解像蛍光によって処理する。これによって化学物質の型および濃度を定義し、疾患関連タンパク質を含めてモノマータンパク質と凝集タンパク質の間の最大の対比が可能になる。他の情報を与える実験は、組換え疾患関連(非野生型)タンパク質(本出願中に列挙した酸処理したプリオンタンパク質、または突然変異p53タンパク質、および他のタンパク質など)、および疾患関連タンパク質を含むサンプルの代わりに正常(野生型)タンパク質の使用を含むことができる。
【０１０１】
幾つかの場合、疾患関連タンパク質は、化学的修飾に関して組換え疾患関連タンパク質が有するのと異なる性質を有する可能性があり、1つのサンプル型(脳組織など)の疾患関連タンパク質は、血液中を循環する疾患関連タンパク質、または尿中で検出可能な疾患関連タンパク質とは異なる化学的修飾性を示す可能性がある。知られている技法を使用して、当業者は内因性プリオンに関する最適条件を容易に確認するであろう。
【０１０２】
EPAは、生物組織および体液中の疾患関連タンパク質を検出することによって優れた商業的有用性を達成し、そのための技術は現在存在しない。幾つかの疾患関連タンパク質は非常に少量である。例えばプリオンは非常に少量であり(バイオアッセイにより10〜100プリオン/mL)、尿中のプロテアーゼ耐性PrPは多量の体液を沈殿させることによって断続的/散発的にのみ検出可能である。さらに、有望な血液試験はいずれも、高濃度の野生型タンパク質(すなわち、(典型的にはPrP^Scの10⁶倍を超える)PrP^C)、および異種血漿タンパク質による「遮断」に対処しなければならない。最適化した化学修飾法およびDELFIA-TRF系を使用して、血液および尿中におけるEPAに関する感度の閾値は、以下のものを使用して場合によっては測定する。
1.疾患関連タンパク質の滴定で「汚染された」動物およびヒトの血漿および尿;
2.疾患関連タンパク質を発現するモデル疾患動物由来の血漿および尿。
【０１０３】
非侵襲経路によって臨床的に入手可能な生物体液は、ヒトおよび動物において凝集する疾患関連タンパク質と関係がある疾患を、診断およびスクリーニングするための実際的な生前試験用の基質となる。本発明の方法は、死後試験においても有用である。当業者は、正常血液および尿において「疾患関連タンパク質汚染」滴定を用いるEPAによって、EPAがこれらの生物体液中で「遮断因子」によって影響を受けないことを示す、バッファー中での同じ疾患関連タンパク質の滴定と同等のDELFIA-TRFシグナルが明らかとなるかどうかを容易に決定する。異種タンパク質による疾患関連タンパク質の優先的「遮断」は、化学的修飾物質に対するエピトープ保護を実際に高めることができる。血液または尿中の疾患関連タンパク質の低い検出が検出される場合、事前に清澄化戦略を容易に使用して、例えば当業者に知られている市販のELISAアッセイにおいて典型的に使用されている界面活性剤、沈殿剤、および吸着剤を用いて疾患関連タンパク質の検出を高める。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の方法は、ミスフォールディングまたは凝集ポリペプチド中の標的エピトープの検出に関する。他の実施形態では本発明は、2つ以上の立体配座で存在することができるポリペプチドの検出を改善または最適化するための方法を提供する。他の実施形態では、ミスフォールディングおよび/または凝集ポリペプチドの検出は疾患(疾患関連タンパク質)を示す。他の実施形態では、化学的に修飾することができるポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体、アプタマーまたはペプチドなどの検出剤を使用してポリペプチドを検出する。他の実施形態では、これらのポリペプチドは疾患関連タンパク質である。候補タンパク質のエピトープに対する抗体は市販の抗体であるか、あるいは当業者によって容易に調製され、かつ抗体断片、および単鎖抗体を含む。前述の方法はいずれも、本出願中に記載するステップを使用して容易に実施される。
【０１０５】
抗体
本発明は、プリオン疾患関連タンパク質を認識するビオチン3F4および3F4および6H4を含めた、知られている抗体の結合剤としての使用を企図する。3F4はMKHMエピトープに対して反応し、6H4はDYEDRYYREエピトープに対して反応する。さらに、Aβを認識する6E110は、EFRHDSエピトープ(残基3〜8)に対して反応する。
【０１０６】
本発明の方法と共に場合によっては使用する、他の抗体および(知られている場合)認識されるエピトープを以下の表に列挙する。
【０１０７】
【表１】

【０１０８】
疾患関連タンパク質のエピトープに対する抗体は、当分野で知られている技法を使用して調製する。例えば、推定標的エピトープを含む疾患関連タンパク質のペプチドを使用することによって、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な方法を使用して作製する。哺乳動物(例えばマウス、ハムスター、またはウサギ)は、哺乳動物中での抗体応答を誘導する免疫原形のペプチドを用いて免疫処置することができる。免疫原性をペプチドに与えるための技法には、担体との結合または当分野でよく知られている他の技法がある。例えば、タンパク質またはペプチドをアジュバントの存在下で投与する。免疫処置の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによって調べることができる。標準的なELISAまたは他のイムノアッセイ手順を、抗原としての免疫原と共に場合によっては使用して、抗体のレベルを評価する。免疫処置の後、抗血清を得ることができ、望むならばポリクローナル抗体を血清から単離することができる。
【０１０９】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫処置した動物から場合によっては採取し、標準的な体細胞融合手順によってミエローマ細胞と融合させ、これによってこれらの細胞を不死化させ、ハイブリドーマ細胞を生成させる。このような技法は当分野ではよく知られている、(例えば、KohlerおよびMilsteinによって本来開発されたハイブリドーマ技法(Nature 256、495〜497 (1975))、およびヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら、Immunol.Today 4、72 (1983))、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技法 (Coleら、Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss、Inc、77〜96ページ)、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング(Huseら、Science 246、1275 (1989))などの他の技法)。ハイブリドーマ細胞は、ペプチドと特異的に反応する抗体の産生に関して免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体は単離することができる。
【０１１０】
キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物可変領域とヒト定常領域を組み合わせた抗体分子も、本発明の範囲内であると企図される。キメラ抗体分子は、例えばマウス、ラット、または他種の抗体由来の抗原結合ドメイン、およびヒト定常領域を含む。本発明の疾患関連タンパク質のエピトープを認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製するために使用される従来の方法(例えば、Morrisonら、Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81、6851 (1985) ; Takedaら、Nature 314、452 (1985)、Cabillyら、米国特許第4,816,567号; Bossら、米国特許第4,816,397号; Tanaguchiら、欧州特許公開EP171496 ; 欧州特許公開0173494、英国特許GB2177096Bを参照)。
【０１１１】
疾患関連タンパク質のエピトープに対して反応性がある単鎖Fvモノクローナル抗体などだけには限られないが、これらの特異的抗体、または抗体断片は、疾患関連タンパク質の核酸分子から生成されたペプチドを有する細菌内で発現される免疫グロブリン遺伝子、またはその一部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって容易に生成される。例えば、完全Fab断片、VH領域およびFV領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌内で発現される(例えばWardら、Nature 341、544〜546 : (1989) ; Huseら、Science 246、1275〜1281 (1989) ;およびMcCaffertyら、Nature 348、552〜554 (1990)を参照)。あるいはScID-huマウス、例えばGenpharmによって開発されたモデルを使用して、抗体または抗体断片を産生する。
【０１１２】
疾患関連タンパク質のエピトープ、または誘導体、例えば酵素複合体または標識誘導体などと特異的に反応する抗体は、さまざまなサンプル(例えば生物物質)中の疾患関連タンパク質のエピトープを検出するのに有用である。これらは診断または予後用試薬として有用であり、タンパク質発現のレベルの異常、または構造の異常、および/または疾患関連タンパク質のエピトープの一過性、組織、細胞、または亜細胞位置を検出するために容易に使用される。in vitroイムノアッセイも、個々の療法の有効性を評価または調査するのに有用である。本発明の抗体をin vitroで使用して、疾患関連タンパク質を生成するように遺伝子工学によって処理した細胞中の疾患関連タンパク質などの、2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドの遺伝子の発現レベルを測定することもできる。
【０１１３】
疾患関連タンパク質のエピトープの抗原決定基と抗体の間の結合相互作用に頼る、任意の知られているイムノアッセイにおいて抗体は有用である。このようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ(例えば、サンドウィッチELISAを含めたELISA)、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集反応、赤血球凝集反応、および組織化学試験である。サンプル中の疾患関連タンパク質を検出および定量化して、その役割を測定し疾患関連タンパク質によって引き起こされる疾患を診断するのに、抗体は有用である。
【０１１４】
特に本発明の抗体は、疾患関連タンパク質を検出するため、それを個々の細胞および組織、および特定の亜細胞位置に局在させるため、ならびに発現のレベルを定量化するための、例えば細胞および亜細胞レベルでの免疫組織化学分析において有用である。
【０１１５】
疾患関連タンパク質などのポリペプチドを検出するために、光学および電子顕微鏡を使用して抗原を局在させるための当分野で知られている細胞化学技法。一般には、本発明の抗体は検出可能な物質で場合によっては標識して、認識したポリペプチドは検出可能な物質の存在に基づいて組織および細胞中に局在させる。検出可能な物質の例には以下の:放射性同位体(例えば、³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、ルミノールなどの発光標識;酵素標識(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ)、ビオチニル基(標識アビジン、例えば蛍光マーカーを含むストレプトアビジン、あるいは光学または比色法によって検出することができる酵素活性によって検出することができる)、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)があるがこれらだけには限られない。幾つかの実施形態では、さまざまな長さのスペーサーアームを介して標識を結合させて、考えられる立体障害を減らす。電子顕微鏡によって容易に目に見えるフェリチンまたは金コロイドなどの高電子密度の物質と、抗体を結合させることもできる。
【０１１６】
抗体またはサンプルは、細胞、抗体などを固定することができる、担体または固相担体に固定することができる。例えば担体または固相担体は、ニトロセルロース、またはガラス、ポリアクリルアミド、はんれい岩、および磁鉄鉱であってよい。担体物質は球形(例えばビーズ)、円筒形(例えば、試験管またはウエルの内側表面、あるいはロッドの外側表面)、またはフラット(例えばシート、試験片)を含めた任意の考えられる形状を有することができる。疾患関連タンパク質のエピトープに対して反応性がある抗体に関して特異性を有する二次抗体を導入することによって一次抗原-抗体反応を増幅させる、間接的な方法を使用することもできる。例えば、疾患関連タンパク質のエピトープなどのポリペプチドエピトープに対する特異性を有する抗体がウサギIgG抗体である場合、二次抗体は本明細書に記載したのと同様の検出可能な物質で標識したヤギ抗ウサギγグロブリンであってよい。
【０１１７】
放射性標識を検出可能な物質として使用するとき、オートラジオグラフィーによって疾患関連タンパク質を位置特定することができる。オートラジオグラフィーの結果は、さまざまな光学的方法により、あるいは粒子を計数することにより、オートラジオグラフ中の粒子の密度を測定することによって定量化することができる。
【０１１８】
アプタマー
アプタマーも、疾患関連タンパク質などのポリペプチドを検出するために本発明の方法において有用である。アプタマーは、高い特異性および感受性を有するタンパク質などの標的を認識することができるマクロ分子である。
【０１１９】
核酸アプタマーは、systemic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)という名称の手順によってコンビナトリアルライブラリーから単離される小分子である(Cerchia Lら、FEBS Letters 528 (2002) 12〜12中に総説)。この技術を使用して、高い標的特異性および選択性でタンパク質と結合するアプタマーを同定することができる。その親和性は、抗体抗原相互作用と比較可能である。本来のタンパク質と変性タンパク質の間の違いが示されてきており(Bianchiniら、Immunol Methods (2001) 252 : 191〜97)、アプタマーは本発明の方法に有用な検出剤となる。
【０１２０】
パプタマーとしても知られるペプチドアプタマー、チオレドキシン挿入タンパク質またはペルチュバゲン(pertubagens)は、足場として働く構造的に安定したタンパク質の溶媒露出表面で挿入ペプチドが発現される人工タンパク質である(Crawford Mら、Brief Funct Genomic Proteomic.2003 Apr ; 2 : 72〜9)。ペプチドアプタマーは抗体と同様に働くことができ、抗体に匹敵する解離定数、時には抗体より良い解離定数を有する。それらを使用してニトロセルロース上に固定されたタンパク質をプローブ処理することができる(Crawford Mら、Brief Funct Genomic Proteomic.2003 Apr ; 2 : 72〜9)。ペプチドアプタマーは、1アミノ酸の違いなどの小さな変化に関する異なる親和性を示すことが示されてきており、ペプチドアプタマーは、異なるフォールディングまたは凝集立体配座を示す疾患関連タンパク質などの、2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドを検出するのに有用となる。
【０１２１】
したがって本発明の一実施形態では、核酸および/またはペプチドアプタマーを本発明の方法と共に使用して、野生型タンパク質と疾患関連立体配座タンパク質を区別する。一実施形態では、疾患関連タンパク質はプリオンタンパク質である。他の実施形態では、疾患関連タンパク質はアミロイド-βである。他の実施形態では、疾患関連タンパク質はtauタンパク質である。他の実施形態では、疾患関連タンパク質はα-シヌクレインである。他の実施形態では、疾患関連タンパク質はSOD-1である。
【０１２２】
変性および脱凝集
本発明の方法では、例えば熱、界面活性剤および/またはカオトロピック剤を用いてポリペプチドを変性させることによって、ポリペプチドを場合によっては修飾する。同型の他のポリペプチドから、および他の分子からポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によって、ポリペプチドを場合によっては修飾し、脱凝集剤はカオトロピック剤、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから場合によっては選択される。カオトロピック剤はグアニジン塩、尿素、およびチオ尿素などだけには限られないがこれらを含むことができる。
【０１２３】
塩酸グアニジンでタンパク質を処理することによって、検出可能な保護タンパク質の量が増大することを本発明者らは示している。
【０１２４】
組み合わせ型脱凝集法は最適な脱凝集をもたらすことができる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS;ラウリル硫酸ナトリウムとしても知られている)ローディングバッファー中でサンプルを煮沸することによって、疾患関連タンパク質などのポリペプチドの可溶性を増大させることができ、検出剤との相互作用に利用可能なエピトープを増大させることができる。例えば、SDSローディングバッファー中でサンプルを煮沸することは増大した可溶性をもたらし、サンドウィッチELISAによる保護エピトープの検出を可能にする。ペルオキシ亜硝酸処理後にサンプルをSDSローディングバッファー中で煮沸する場合、サンドウィッチELISAアッセイ系は、組織ホモジェネートサンプル中の凝集した疾患関連タンパク質を同定することができる。8mMを超えるペルオキシ亜硝酸濃度では、擬似処理サンプルと比較して、酸処理サンプル中に2.5〜3倍多くの検出済みPrPが存在する。したがって一実施形態では、修飾剤による処理後、および抗体などの検出剤による検出前に、サンプルをSDSローディング中で煮沸する。
【０１２５】
時間分解蛍光(TRF)2地点ELISAおよびDissociation Enhanced Lanthanide Fluorolmmunoassay(DELFIA)
前に述べたように、本発明の方法によってELISA技法を使用することができる。Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorolmmunassay(DELFIA)技術を使用する時間分解蛍光2地点ELISAは、従来のELISA技法より1000倍感度が良く、本発明の方法と共に使用してin vitro、神経変性のトランスジェニックマウスモデルの神経組織中、およびヒトAD、ALS、PDおよびLBD患者の脳サンプル中に凝集するポリペプチドを検出することができる。
【０１２６】
DELFIAアッセイは、ユーロピウム(Eu)および時間分解蛍光体(TRF)などのキレート化ランタニド標識トレーサーを使用して、出力シグナルを測定する(33)。ランタニドキレートの利点は、それらの蛍光は強く、従来の蛍光体より200,000倍まで長く続き、非特異的な干渉蛍光が衰えた後にシグナル捕捉を可能にすることである(その発光は比較的寿命が短い非常に固有の蛍光を有する可能性がある生物サンプルには特に重要である)。DELFIA系システムは、わずか100fmol/Euウエルを測定することができる(33)。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、化学的修飾物質および抗体を、感度の良い捕捉-検出「サンドウィッチ」96-ウエルプレートDELFIA TRF系において、Aβ、tau、SOD1、ハンチングチン、α-シヌクレイン、膵島アミロイドポリペプチド、レジスチンおよびp53などの本明細書に記載する凝集した疾患特異的タンパク質の検出で使用する。
【０１２８】
2地点EPAは、臨床サンプルの凝集体中に封鎖されたタンパク質の検出に関する特異性を増大させる。一実施形態では、2つ以上の化学的に修飾可能なエピトープがそれぞれの試験ポリペプチド中に存在し、この技術を使用する(例えば2地点ELISAにおける使用)診断試験の特異性を増大させると思われる。一実施形態では、化学的に修飾可能なエピトープは同じ化学物質によって修飾する。他の実施形態では、エピトープは2つ以上の異なる化学物質の1つによって修飾する。修飾されたエピトープは同じ抗体によって認識することができるか、あるいはそれらは2つ以上の異なる抗体によって認識することができる。臨床および商業用途に、EPAは感度が良く、in vitroおよびin vivo凝集するポリペプチドに特異的でなければならない。最適な抗体および化学修飾法を用いて、DELFIA-TRF系EPAは可溶性ポリペプチドの10⁵〜10⁶個の分子を検出することができる。これらの凝集体が疾患中のプリオンタンパク質凝集体と同様の大きさである場合、これは1つのポリペプチド凝集体に対応する可能性がある(35、36)。
【０１２９】
したがって一実施形態では、DELFIA-TRF系EPAを使用して、非常に少量である疾患関連タンパク質、1つのポリペプチド凝集体さえも同定することができる。
【０１３０】
診断およびスクリーニング適用例
ヒトの神経変性病の生前診断用の、効率の良い、有効かつ安価の診断およびスクリーニング戦略が、加齢群およびヘルスケアシステムに関する連続的な財政圧力を考慮して早急に必要とされる。EPAは関連および接触可能な生物組織および体液中のポリペプチド凝集体を検出することによって臨床的有用性を得るものであり、そのための技術は現在存在しない。一実施形態では、本発明の方法を使用して、疾患関連タンパク質関連疾患を有する個体を診断する。一実施形態では本発明を使用して、神経変性疾患を有する個体を診断する。他の実施形態では本発明を使用して、プリオン関連疾患、AD、HD、ALSおよびPDを含む群から選択される神経変性疾患を有する個体を診断する。他の実施形態では、本発明の方法を死後に使用して、個体が疾患関連タンパク質関連疾患を有していたかどうかを決定する。
【０１３１】
本発明の方法を使用して、ヒトが疾患関連タンパク質関連疾患を有するかどうかを検出する。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、非ヒト動物が疾患関連タンパク質関連疾患を有するかどうかを検出する。他の実施形態では、非ヒト動物は蓄牛、ヒツジおよびシカを含む群の1つである。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、家畜が疾患関連タンパク質関連疾患を有するかどうかを検出する。
【０１３２】
一実施形態では、本発明の方法を使用して生物試料中の疾患関連タンパク質を検出する。生物試料は生物体液、例えばCSF、血清、血液、涙、腹膜滲出液、または尿など、あるいは組織サンプル、例えばバイオプシーまたは脳組織などを含むことができる。一実施形態では、サンプルは生前サンプルである。他の実施形態では、サンプルは死後サンプルである。
【０１３３】
本発明の方法は、可溶形の疾患関連タンパク質、例えばAβ、tau、SOD1、ハンチングチン、α-シヌクレイン、膵島アミロイドポリペプチド、レジスチンおよびp53タンパク質などの検出を定量化するのに有用である。
【０１３４】
他の実施形態ではEPAを使用して、CRND8(ヒト突然変異体APP)、マウス脳およびCSF(34)、ならびにG93Aヒト突然変異体SOD1トランスジェニックマウス(13)由来のホモジェネート中の、凝集体検出の感度および特異性を測定する。
【０１３５】
他の実施形態では本発明を使用して、正常(処理および未処理、低pH)および疾患状態の凍結させたヒト脳(AD、ALS、PD、LBD)由来のホモジェネート中の、凝集体検出の感度および特異性を測定する。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の方法を使用して、哺乳動物血液または組織に由来する調製物、または調製物と接触する哺乳動物血液または組織が疾患関連タンパク質を含まない関連プロセスを確保する。一実施形態では、調製物は薬剤製品である。他の実施形態では、調製物はワクチンである。他の実施形態では、調製物は化粧品である。一実施形態では、調製物をプリオンタンパク質に関して試験する。他の実施形態では、調製物をアミロイド-βに関して試験する。他の実施形態では、調製物をtauタンパク質に関して試験する。他の実施形態では、調製物をα-シヌクレインに関して試験する。他の実施形態では、調製物をSOD-1に関して試験する。
【０１３７】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、輸血または疾患関連タンパク質に関する他の医療手順に使用する、血液および血液製品(例えば血漿などの血液分画、血液から単離または製造した化合物)をスクリーニングする。他の実施形態では、本発明を使用して、疾患関連タンパク質に関する臓器移植をスクリーニングする。一実施形態では、調製物をプリオンタンパク質に関してスクリーニングする。他の実施形態では、調製物をアミロイド-βに関してスクリーニングする。一実施形態では、調製物をtauタンパク質に関してスクリーニングする。他の一実施形態では、調製物をα-シヌクレインに関してスクリーニングする。他の実施形態では、調製物をSOD-1に関してスクリーニングする。
【０１３８】
本発明は、食品源が疾患関連タンパク質を含まないことを確かにするためにも有用である。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、肉および肉製品ならびに乳製品などの哺乳動物由来の食用品を試験する。神経組織が汚染されている可能性がある食品(「機械的に分けられた肉」、および後根神経節または他の神経組織を含む肉断片など)は、プリオン汚染に関してスクリーニングするために非常に重要である。
【０１３９】
侵襲手順用に使用される器具は、伝播する疾患の源である可能性もある。一実施形態では、医療および外科手術手順用に使用される器具は、本発明の方法を使用して疾患関連タンパク質の存在に関して試験する。他の実施形態では、歯科衛生用に使用される器具を、疾患関連タンパク質の存在に関して試験する。
【０１４０】
他の実施形態では本発明は、疾患関連タンパク質および疾患関連タンパク質含有組織を除去するための除染法が成功していることを確実にするための方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法を使用して、肉処理プラント内の除染手順を評価する。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、食品加工プラント内の除染を評価する。他の実施形態では、外科手術または歯科手術用に使用される器具を、疾患関連タンパク質の存在に関して試験する。
【０１４１】
予後判定適用例
プリオンタンパク質転換体、アルツハイマー病関連ポリペプチドまたは他の疾患/障害関連ポリペプチドは、経時的に被験体において定期的に調べて(例えば第一回目、および第一回目の少なくとも一週間または少なくとも一ヶ月後に第二回目)、例えば被験体中の高または低レベルのPrP^Cあるいは高または低レベルのPrP^Scを同定することができる。本発明の方法は、被験体のPrP^CまたはPrP^Scレベルを測定して薬剤療法に対する被験体の応答性を決定するのにも有用である。経時的な被験体中のプリオンタンパク質の低レベルは、薬剤療法に対する陽性応答を示す。同じ方法を、他の疾患または障害関連タンパク質に関して使用する。
【０１４２】
多くの神経変性病は凝集タンパク質と関係があるので、同様の方法が筋萎縮性側索硬化症(スーパーオキシドジスムターゼ1)、アルツハイマー病(アミロイドβ)、パーキンソン病(α-シヌクレイン)、ハンチングトン病(ハンチングチン)、癌(p53)、糖尿病(例えば、膵島アミロイドポリペプチドおよびレジスチン)、ならびに異常なタンパク質のフォールディング、凝集または翻訳後修飾と関係がある他の疾患だけには限られないがこれらを含めた、これらの疾患およびそれらの凝集タンパク質に有用である。このような試験は、脊髄液および他の体液、ならびに末梢血において有用である。アルツハイマー病では、アミロイドβペプチドの凝集状態は、本出願中に記載した方法を使用して、例えば当分野で知られている抗6E10または抗4G8抗体(検出剤)を用いて、モノクローナル抗体6E10および4G8によって検出される2つのエピトープ、ならびに他のアミロイドβのエピトープの接触可能性を測定することによって場合によっては調べる。
【０１４３】
プリオン転換阻害剤の同定
本発明はポリペプチド間の違いを検出するのに有用であるので、本発明はさらに、候補化合物がプリオン転換または他の疾患または障害関連ポリペプチド、例えばアルツハイマー病におけるアミロイドβ、tauおよびAPP、筋萎縮性側索硬化症におけるSOD1、パーキンソン病およびレビー小体病におけるα-シヌクレイン、ハンチングトン病におけるハンチングチン、糖尿病における膵島アミロイドポリペプチドおよびレジスチン、ならびに癌におけるp53などの形成を阻害するかあるいは安定化させることができるかどうかを評価するためのアッセイを含む。本発明はさらに、本出願中に記載した方法によって同定されるプリオン転換(あるいは他の疾患または障害関連ポリペプチドの転換)を、阻害するかあるいは安定化させるための化合物を含む。中間体プリオンタンパク質基質またはPrP^Sc(あるいは他の疾患または障害関連ポリペプチド)への低いタンパク質転換は、候補化合物がプリオン病を治療するのに有用であることを示す。
【０１４４】
本発明のアッセイは、候補化合物をスクリーニングして、それらがPrP^Sc形成(または野生型タンパク質由来の他の疾患または障害関連ポリペプチドの形成)を阻害するかどうか判定するのに有用である。タンパク質は候補化合物とin vivoまたはin vitroで接触させ、次いで本発明の方法において使用して、野生型タンパク質がPrP^Scに転換されたかどうか、あるいはPrP^Scが野生型タンパク質に転換されたかどうか判定することができる。他の疾患または障害関連ポリペプチドに関して、同様の方法を使用する。組換えタンパク質は、凝集阻害剤を同定するのに有用である。
【０１４５】
したがって本発明は、PrP^Scへの転換(例えば、野生型タンパク質または中間体からPrP^Scへのプリオンタンパク質転換)を阻害する物質を同定するための方法であって、
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、タンパク質がPrP^Scに転換されたかどうか判定するステップを含む方法も提供する。
【０１４６】
同様の方法を場合によっては実施して、野生型プリオン状態を安定化させるか、PrP^Scと結合させて、補充可能なPrPイソ型の転換を遮断する化合物を同定する。
【０１４７】
本発明は、疾患または障害関連ポリペプチドへの転換(例えば、野生型タンパク質から、本出願中に記載するアルツハイマー病および他のタンパク質および疾患関連タンパク質におけるアミロイドβ、tauまたはAPPタンパク質への転換)を阻害する物質を同定するための方法であって、
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、タンパク質がアルツハイマー病におけるアミロイドβまたはAPPタンパク質に転換されたかどうか判定するステップを含む方法も提供する。
【０１４８】
本発明の他の態様は、PrP^Sc形成を逆行させる物質を同定する方法であって、
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップ、および
本発明の方法を使用して、PrP^Scが野生型タンパク質に転換されたかどうか判定するステップを含む方法を提供する。
【０１４９】
本発明の他の態様は、アルツハイマー病におけるアミロイドβまたはAPPタンパク質形成を逆行させる物質を同定する方法であって、
ポリペプチドと候補物質を反応させるステップと、
本発明の方法を使用して、アルツハイマー病におけるアミロイドβまたはAPPタンパク質が野生型タンパク質に転換されたかどうか判定するステップとを含む方法を提供する。
【０１５０】
本出願中に記載する疾患および障害と関係がある他のポリペプチドに関して、同じ方法を使用する。
【０１５１】
生物サンプルおよび市販のライブラリーを、タンパク質などの物質またはタンパク質と結合する小さな有機分子に関して試験することができる。阻害剤は、プリオンタンパク質などの疾患関連タンパク質の特定のドメインを対象とすることが好ましい。特異性を得るために、阻害剤は疾患関連タンパク質の特有の配列およびまたは立体配座の特徴を標的としなければならない。
【０１５２】
タンパク質立体配座の検出
本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが非野生型立体配座のポリペプチドであるか、あるいは野生型立体配座のポリペプチドであるかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドと遮断剤を接触させるステップと、
標的エピトープが遮断剤による化学的修飾と接触不能であるか、あるいは接触可能であるかを判定するステップとを含む方法を含む。
【０１５３】
標的エピトープの接触可能性または接触不能性は、候補ポリペプチドが非野生型立体配座のポリペプチドであるか、あるいは野生型立体配座のポリペプチドであるかを示す。何故なら、非野生型タンパク質と野生型タンパク質の1つにおいて、標的エピトープが接触可能だからである。他のポリペプチドでは、標的エピトープは接触不能である。
【０１５４】
一実施形態では本発明は、標的エピトープを含む候補ポリペプチドが野生型立体配座、または非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つにおいては、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
未反応遮断剤をポリペプチドとの接触から除くステップと(例えば、候補ポリペプチドを含むサンプル中において遮断剤を消費または分解させることによって、あるいは物理的または化学的除去法によって)、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合が、転換前に候補ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如が、ポリペプチドは標的エピトープが接触不能であった立体配座であったことを示し、したがってポリペプチドが野生型立体配座または非野生型立体配座であったこと示すステップとを含む方法を含む。
【０１５５】
ポリペプチドは2つ以上の立体配座を有することができる。例えばポリペプチドは、疾患とは関係がない野生型立体配座、良性でミスフォールディング状態の凝集、あるいは他の場合は非野生型立体配座、および疾患関連立体配座(すなわち、高次構造で凝集する)で存在することができる。本発明の方法を適用して、1つまたは複数の化学的修飾物質および/または抗体などの1つまたは複数の検出剤を使用することによって、それぞれのこれらの状態を区別することができる。
【０１５６】
固有に修飾されたポリペプチドの検出
本発明は、立体配座の1つの標的エピトープが固有の機構によって修飾される、2つ以上の立体配座で存在するポリペプチドを検出する方法も提供する。固有の機構は、リン酸化および/またはグリコシル化などのポリペプチドの細胞内および/または翻訳後修飾、または方法中に使用される添加剤から生じる修飾を含むことができる。固有の修飾は、検出剤による検出から標的エピトープが隠れるのを妨げる。ポリペプチドのサンプルは、固有に修飾されないポリペプチド中の利用可能な標的エピトープと反応する遮断剤と反応させる。固有の修飾は次いで除去する。例えば固有の修飾がリン酸化である場合、リン酸化を除去し、以前に固有に修飾されたポリペプチド中の接触不能な標的エピトープを接触可能なエピトープに転換するホスファターゼによって、ポリペプチドを処理する。次いでポリペプチドは、抗体などの検出剤を用いて検出する。
【０１５７】
したがって、一実施形態では本発明は、2つ以上の立体配座を有するポリペプチド中の固有に修飾された標的エピトープを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、非野生型立体配座または野生型立体配座の1つにおいては、標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、他の立体配座では、標的エピトープが接触不能であり遮断剤と反応することができないステップと、
固有に修飾されたポリペプチドの標的エピトープから固有の修飾を除去する物質とサンプルを反応させるステップと、
サンプル中のポリペプチドを脱凝集および/または変性させるステップと、
標的エピトープに対する抗体などの検出剤を用いてプローブ処理して、候補ポリペプチドが固有に修飾されたポリペプチドであるかどうかを決定するステップとを含む方法を提供する。
【０１５８】
一適用例では、本発明の方法を使用して、食品中に存在するポリペプチドが製造プロセスによって化学的に修飾されたかどうかを検出することができる。例えば乳製品は、静菌薬として使用されるホルムアルデヒドの存在に関して試験することができる。ホルムアルデヒドはガンマ(2)カゼインをホルミル化し(Pizzano Rら、J.Agric Food Chem (2004) 52 : 649〜54)、検出剤による後の検出から修飾エピトープを覆い隠す。
【０１５９】
キット
本明細書に記載する方法は、必要な試薬を含む予めパッケージ化された診断キットを使用することによって場合によっては実施して、本発明の方法のいずれかを行う。例えばキットは、少なくとも1つの本明細書に記載する特異的な核酸、ペプチドまたは抗体を典型的には含み、これらは例えば患者をスクリーニングおよび診断するため、疾患関連立体配座のタンパク質を発現する個体をスクリーニングおよび同定するための臨床設定において好都合に使用される。キット抗体は完全抗体、抗体断片、単鎖抗体、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を含むことができる。キットは場合によっては、抗体またはアプタマーによって認識されるエピトープを修飾するための少なくとも1つの化学物質も含む。キットは場合によっては、サンドウィッチELISAおよびDELFIAなどのELISA技術に基づき、ELISA技術において典型的に使用され当業者に知られている、界面活性剤、沈殿剤(リンタングステン酸など)、および吸着剤を使用することができる。キットは、本発明の方法を実施するための詳細な指示書も含む。組換えタンパク質はキットの標準用に有用である。
【０１６０】
これらのアッセイはいずれも、単純な高スループット形式に適合させ最適化することができると思われる。
【０１６１】
以下の非制限的な実施例は、本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１６２】
(実施例1)
ペルオキシ亜硝酸は、正常および酸処理またはスクレーピー脳ホモジェネート中でPrPと異なる反応をする
脳ホモジェネートをグアニジンの存在下においてpH3.5でインキュベートすると、PrPは界面活性剤不溶になり、PrP^Scの存在下においてPK耐性イソ型とのミスフォールディングに対してさらに影響を受けやすくなる(29)。この酸処理PrPは、PrP^Scの特性と類似して部分的にミスフォールディングおよび/または凝集した「モデルプリオン」である。擬似(□)および酸処理(●)脳ホモジェネートを高濃度のペルオキシ亜硝酸と共にインキュベートし、次いでイムノブロッティングに施すと、酸処理脳ホモジェネート中よりも擬似処理脳ホモジェネート中に、3F4(図1AおよびC)と6H4(図1BおよびD)の両方によって認識されるPrPが少量となる。酸処理脳ホモジェネート中のPrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される。
【０１６３】
(実施例2)
スクレーピー感染したハムスター脳内のPrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される
実施例1で観察したのと同様の「モデルプリオン」に関するエピトープ保護現象を、スクレーピー感染したハムスター(Ha)脳中の真正疾患関連-ミスフォールディングプリオンタンパク質に関しても観察した(図2AおよびB)。モデルプリオンと同様に、Ha^Sc脳ホモジェネート中のPrPの3F4および6H4エピトープは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護される。「モデルプリオン」とHaPrP^Scが、差別的なミスフォールディングまたは凝集などの、ペルオキシ亜硝酸による化学的修飾からの保護をもたらす特性を共有していることは明らかである。
【０１６４】
(実施例3)
凝集はミスフォールディングPrPのペルオキシ亜硝酸誘導型のエピトープ修飾の低下の原因である
酸処理およびスクレーピー脳のエピトープ保護が凝集によるものであったことを示すために、サンプルはペルオキシ亜硝酸で処理し、次いで免疫沈降前にグアニジン有りまたは無しでインキュベートした。グアニジンを用いたサンプルの処理は、ペルオキシ亜硝酸による修飾からポリペプチドを保護するPrP(43〜45)の凝集体を解離させる。ペルオキシ亜硝酸処理後に2.5Mのグアニジンと共に擬似治療脳をインキュベーションすることによって、免疫沈降によって明らかであったように、3F4および6H4エピトープの増大が示されることはなかった(図3Aレーン1〜4)。しかしながら、ペルオキシ亜硝酸処理した酸性の脳ホモジェネートをグアニジンと共にインキュベートすると、3F4および6H4イムノビーズを用いた免疫沈降によって検出することができると思われる、PrPの増大があった(図3A、レーン5〜8)。これは、グアニジンは酸処理した脳ホモジェネートの凝集体を解離させることができ、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護されるPrPを放出させることができることを示す。PrP凝集体を溶かす他の手段を使用し、SDSローディングバッファー中でサンプルを煮沸することによって、今日まで最も観察されている可溶化をもたらした。
【０１６５】
(実施例4)
EPAパラメータの最適化
ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素およびメチレン(前駆体ジアジリンのUV光による光分解に基づく)または他の修飾物質を用いた滴定実験によって、以下のエピトープ保護に関する最適条件を同定する:
1.正常ハムスターおよびヒト脳「モデルプリオン」、イムノブロッティングおよび従来の蛍光ELISAを使用する。
2.ハムスターおよびヒト脳由来の感染プリオン、イムノブロッティング分析および時間分解蛍光を使用する。
【０１６６】
それぞれの場合、脳ホモジェネートを調製し、高濃度の修飾物質と混合させ、記載したように処理した(イムノブロッティング、および時間分解蛍光)。これによって化学物質の型および濃度を定義し、モノマータンパク質と凝集タンパク質の間の最大の対比が可能になる。他の情報を与える対照実験は、バッファーおよびPrP^-/-ノックアウトマウス脳内、およびマウスの正常およびスクレーピー感染した脳周辺での組換えハムスターPrP^Cの使用を含む(ネズミPrPは6H4+および3F4-である)。
【０１６７】
幾つかの場合、感染プリオンは、化学的修飾に関して「モデルプリオン」が有するのと異なる性質を有する可能性があり、脳プリオンは、血液中を循環する内因性プリオン、または感染動物の尿中で検出可能なPrP^Scとは異なる化学的修飾性を示す可能性がある。当業者は知られている技法を使用して、真の内因性プリオンに関する最適条件を容易に同定するであろう。
【０１６８】
(実施例5)
蛍光ELISA系に適合させたEPA
凝集PrPに関するエピトープ保護アッセイを、捕捉抗体として6H4および検出抗体として3F4を使用する蛍光サンドウィッチELISA系に適合させた(図3B)。サンドウィッチELISAアッセイ系は、ペルオキシ亜硝酸処理後にサンプルをSDSローディングバッファー中で煮沸する場合のみ、酸処理した脳ホモジェネート中の凝集PrPを同定することができる。8mMを超えるペルオキシ亜硝酸濃度では、擬似処理サンプルと比較して、酸処理サンプル中に2.5〜3倍のPrPが検出される。
【０１６９】
(実施例6)
一種の脳プリオンの検出
一種の脳プリオンは、PrP^Scの10⁵〜10⁶個の分子を含むと推定されてきている。従来の蛍光ELISAを使用する、組換えPrPの10⁸〜10⁹個の分子の検出が実施されてきている。使用するこのアッセイは一種のプリオンの検出に関して約1000倍感度が良く、必要な感度はDissociation enhanced lanthanide fiuoroimmunoassay(DELFIA)によって与えられる。DELFIAは、ユーロピウム(Eu)および時間分解蛍光体(TRF)などのキレート化ランタニド標識トレーサーを使用して、出力シグナルを測定する。ランタニドキレートの利点は、それらの蛍光時間は従来の蛍光体より200,000倍まで長く続き、非特異的な干渉蛍光が衰えた後にシグナル捕捉を可能にすることである(非常に非特異的な蛍光を有する可能性がある生物サンプルには特に重要である)。DELFIA系システムは、わずか100fmol/Euウエルを測定することができ、これは従来のELISAアッセイの1000倍感度が良く、EPAによる一種のプリオンを検出する。DELFIA系用の最適なTRF96ウエルプレートリーダーはWallac-Victor(Perkin-Elmer)によって製造され、これを使用してサンプル分析を自動化する。
【０１７０】
最適な化学的修飾物質および最適条件を使用して、DELFIA TRF系を使用してハムスターおよびヒトプリオンを検出するための、感度の良い捕捉96ウエルプレートアッセイを与える。これを使用して:
1.TRFによる組換えプリオンタンパク質の検出を特徴付け、最適化、および定量化する。
2.ハムスターおよびヒト脳プリオンに関するDELFIA-TRFの感度を測定する。
【０１７１】
(実施例7)
生物体液中のプリオンタンパク質の検出
EPAは、生物組織および体液中のPrP^Scを検出することによって商業的有用性を達成し、そのための技術は現在存在しない。血中プリオンは非常に少量であり(バイオアッセイにより10〜100プリオン/mL)、尿中のプロテアーゼ耐性PrPは多量の体液を沈殿させることによって断続的/散発的にのみ検出可能である。さらに、有望な血液試験はいずれも、高濃度のPrP^C(PrP^Scの10⁶倍を超える)、および異種血漿タンパク質による「遮断」に対処しなければならない。最適化した化学修飾法およびDELFIA-TRF系を使用して、血液および尿中におけるEPAに関する感度の閾値は、以下のものを使用して測定する。
1.263Kハムスタープリオンの滴定によって「汚染された」ハムスターおよびヒトの血漿および尿;
2.263Kプリオン病に「内因」感染したシリアンハムスター由来の血漿および尿。
【０１７２】
非侵襲経路によって臨床的に入手可能な生物体液は、ヒトおよび動物におけるプリオン感染を診断およびスクリーニングするための実際的な生前試験用の基質となる。本発明の方法は、死後試験においても有用である。当業者は、正常血液および尿において「プリオン汚染」滴定を用いるEPAによって、EPAがこれらの生物体液中で「遮断因子」によって影響を受けないことを示す、バッファー中での同じプリオン滴定と同様のDELFIA-TRFシグナルが明らかとなるかどうかを容易に決定する。興味深いことに、異種タンパク質によるPrP^Scの優先的「遮断」は、化学的修飾物質に対するエピトープ保護を実際に高めることができる。血液または尿中のプリオンの低い検出が検出される場合、事前に清澄化した戦略を容易に使用して、当業者に知られている市販のELISAアッセイにおいて典型的に使用されている界面活性剤、沈殿剤、および吸着剤を用いてPrP^Scの検出を高める。
【０１７３】
ヒトおよびウシの血清および尿ならびに他の体液は、最適なEPA条件を使用して試験し、それぞれヒト変異体CJDおよびBSE由来のサンプルと比較する。モノクローナル抗体6H4はあらゆる関連種由来のPrPを認識するが、3F4エピトープを欠く(市販の)他の抗体を蓄牛、ヒツジおよびシカ用のDELFIA TRF系に使用する。本出願中に記載する方法において有用な他の抗体およびエピトープは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１７４】
(実施例8)
EPAを使用する凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出
アミロイドβペプチド(Aβ)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解プロセシングの通常の切断産物である。Aβはアルツハイマー病の脳の感染領域中で不連続なプラークに蓄積し、この疾患で観察される神経死およびグリオーシスを誘発する。正常細胞によって発現されるAPPのAβ領域とは対照的に、プラークAβは凝集しβシート構造中で豊富である。エピトープ保護技術を使用して、APPのAβ領域中の6E10エピトープは、正常な脳と比較してアルツハイマー病の脳内ではペルオキシ亜硝酸による修飾に対して接触が少ないことを実証した(図4、パネルA)。同様に6E10エピトープは、タンパク質凝集を誘導するために低いpHで処理した脳ホモジェネート中で部分的に保護される(図4、パネルB)。水中における1mg/mlでの一晩のインキュベーションによって凝集したAβ1〜42ペプチドは、可溶性非凝集Aβ1〜42と比較して、ペルオキシ亜硝酸修飾に対する6E10エピトープの顕著なエピトープ保護を示す(図4、パネルC)。この現象の他の例は、6E10抗体を用いたイムノブロッティングを施し高濃度のペルオキシ亜硝酸で処理した、正常(○)および凝集(●)Aβ1〜42を示す図4パネルDに表す。
【０１７５】
APPの6E10エピトープは、低いpHによって凝集するAD脳ホモジェネート中および正常脳ホモジェネート中でのペルオキシ亜硝酸修飾に対して利用不可能であるが、正常な未治療脳はこの保護を示さず(図4、パネルAおよびB)、APPとAβ-ドメイン遮断分子(おそらくAβ自体;参照9)のin vivoでの分子間相互作用が示される。
【０１７６】
生物体液(血液および脊髄液など)中の凝集Aβの高感度かつ特異的なEPA検出、または細胞および組織内のAPP中のAβエピトープの保護は、アルツハイマー病用の生前診断試験をもたらす。本出願中に記載する本発明の方法は、この診断試験用に使用する。
【０１７７】
EPAによる凝集Tauタンパク質の検出
瀕死のニューロンは、tauなどの細胞内タンパク質をCSF中(39)およびおそらく最終的には血液中に放出する。Tau試験は、アルツハイマー患者サンプルおよび対照脳を含めた脳試料に直接行う。
【０１７８】
(実施例9)
EPAによる凝集スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD1)の検出
SOD1含有細胞質封入体は、家族性および散発性ALS患者由来の多くの疾患状態運動ニューロンにおいて(15)、ならびに大部分のトランスジェニックマウス(16、17)およびこの疾患の組織培養(18)モデルにおいて検出される。ヒトSOD1はin vitroで凝集することができる。他のSOD1は、無水コハク酸およびDEPCによって修飾可能である。EPA技術によってこの性質を利用して、凝集SOD1タンパク質と非凝集SOD1タンパク質を区別することができる。
【０１７９】
ヒト赤血球から精製したSOD1(Sigma)は、金属触媒酸化反応において凝集した。可溶性SOD1はさまざまな濃度のDEPCで処理し、熱で変性させ、抗SOD1抗体を用いてイムノブロッティングした。ウエスタンブロッティングは、高濃度のDEPCは可溶性SOD1中での抗体結合の低下と関係があることを示し(図5)、部位が遮断剤による修飾によって利用可能であることを示す。
【０１８０】
EPAの有用性を優先して選択したSOD1に対する抗体を使用して、疾患特異的な凝集SOD1と野生型SOD1を区別する。関連要因には以下のものがある:
1)本来の可溶状態で化学的修飾物質と接触可能な本来の二量体の分子表面上のエピトープを選択すること、
2)線状エピトープを同定して、イムノブロットおよびELISAでの変性状態における検出を最適化すること、
3)免疫原性、
4)SOD1に対する特異性、および
5)エポキシドによって容易に修飾される酸性アミノ酸(GluおよびAsp)の存在。
【０１８１】
これらの基準に見合う5つのSOD1配列は:22QKESNG27;51EDNTAGCTSA60;74PKDEERHV81;89ADKDG93;および127GKGGNEQSTK136(太字:溶媒和した側鎖)である。
【０１８２】
さらに、ヒトSOD1の静電性ループ配列および亜鉛結合ループは表面接触可能な配列であり、凝集体形成と関係がある(Elan、Jら、Nature Structural Biology (2003) 10 : 461〜67)。
【０１８３】
これらの配列は以下のものである:
ヒトSOD1の静電性ループ:Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser
ヒトSOD1の亜鉛結合ループ:Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu
【０１８４】
(実施例10)
EPAによる凝集α-シヌクレインの検出
パーキンソン病の大部分の症例は散発性であるが、散発形と家族形の両方の疾患が、PDにおいて選択的に殺傷される中脳ニューロン(60,000まで)の個体群である黒質の、瀕死のニューロン中の細胞内レビー小体によって特徴付けられる。レビー小体はα-シヌクレインから主に構成される(22)。α-シヌクレインをコードする遺伝子の突然変異は、家族性のパーキンソン病を有する患者において発見されてきている(23中に総説)。常染色体劣性PDと関係がある他の遺伝子は、α-シヌクレイン変性と関係があるパーキンである(22、23)。α-シヌクレインから構成されるびまん性皮質レビー小体は、パーキンソン状態の変化、幻覚、および迅速な症状の変動と関係がある痴呆症状であるレビー小体病(LBD)において観察される(24)。
【０１８５】
Syn-1エピトープは、DEPC(ヒスチジン反応性)を用いた組換えα-シヌクレインの化学的修飾によって場合によっては遮断され、in vitroで凝集したα-シヌクレインはDEPCエピトープ遮断から部分的に保護される(図6)。
【０１８６】
in vitroで凝集したα-シヌクレインはDEPCによる修飾から保護されるが、正常タンパク質は保護されない。3mg/mLの突然変異A53Tα-シヌクレインを、凝集させるために3日間37℃でインキュベートした。凝集反応混合物は超遠心分離した。凝集前の正常タンパク質(可溶性α-シヌクレインを含む)および超遠心分離由来のペレット再懸濁液(不溶性α-シヌクレインを含む)をさまざまな濃度のDEPCで処理し、熱で変性させ、BD BiosciencesからのSyn-1抗体を用いてブロッティングした。図6Aは、高濃度のDEPCは正常α-シヌクレインにおける抗体結合の段階的低下と関係があることを示す。不溶性α-シヌクレインは、DEPC濃度が1mMに達するまでDEPCの濃度の上昇による抗体結合の変化はほとんど示さない。これらの発見のグラフ図は図6Bに示す。DEPC処理した正常α-シヌクレイン(-)との抗体結合の程度は、全体的に徐々に低下するが、高濃度のDEPCではさらに急速に低下する。他方で不溶性α-シヌクレイン(π)は、抗体結合の程度の変化をほとんど示さない。不溶性α-シヌクレインに関する0.01MのDEPCの最後のデータ地点は、写真の不明瞭さのため上昇する。
【０１８７】
(実施例11)
CSF中の凝集タンパク質の検出
ADを有する患者のCSFおよび血液ならびに正常対照において、細胞外に堆積したAβを定量化した(6〜8)。α-シヌクレインなどの細胞内ニューロンタンパク質は、CSFおよび血液中で検出されている(37、38)。瀕死のニューロンは、細胞内タンパク質14-3-3、ニューロン特異的エノラーゼ、tau、およびα-シヌクレインをCSF中(39)およびおそらく最終的には血液中に放出する。疾患中に放出されるタンパク質の一部分は凝集形である。EPA技術を適用して、AD、ALS、PD、およびLBDを有する患者由来のCSFサンプル中のポリペプチド凝集体の比率を決定する。それぞれ「完全」および「保護」エピトープを表す、化学処理の前後の脱凝集ポリペプチドに関するシグナルを測定して、脱凝集状態のポリペプチドの比率を決定する。最適化mAbおよび化学的修飾法、ならびにDELFIA-TRF系を使用して、EPA感度を以下のものにおいて決定する:
1.in vitroで凝集したポリペプチドによって「汚染された」正常CSF。
2.AD、ALS、PD、およびLBDを有する患者由来のCSF。
【０１８８】
CSFサンプル中の凝集状態のポリペプチドの比率は、それがわずか10⁵〜10⁶個の分子で構成される場合でも決定する。関連種を増大させるために市販のELISAアッセイにおいて典型的に使用される、界面活性剤、沈殿剤(リンタングステン酸など)、および吸着剤を場合によっては使用する。非侵襲経路によって臨床的に入手可能な生物体液は、神経変性病を診断およびスクリーニングするための実際的な生前試験用の理想的な基質となる。
【０１８９】
物質および方法
物質
組換えハムスターPrP(rhaPrP)および6H4はPrionicsからのものであった。組換えヒトPrP(rhuPrP)はRoboscreenからのものであった。ビオチン-3F4および3F4はSignetからのものであった。3F4はMKHMに対して反応し、6H4はDYEDRYYREに対して反応する。(Signetからの)6E10抗Aβは、EFRHDS(残基3〜8)に対して反応する。
【０１９０】
他の抗体、および知られている場合は認識されるエピトープは前の表1に与える。
【０１９１】
酸処理したミスフォールディング状態のPrPおよびAPPの調製。
酸処理したミスフォールディング状態のPrPを、この試験において「モデルプリオン」として使用し、(29)中と同様に調製した。簡潔には、100μlの10%脳ホモジェネートを等体積の3.0MのGdnHCl(最終濃度1.5M)と、1NのHClで調節したpH7.4またはpH3.5のPBS中で混合させ、次に室温で攪拌した。5時間のインキュベーション後、サンプルは5倍体積の氷冷メタノールを用いてメタノール沈殿させ、ペレットは100μlの溶解バッファーに再懸濁した。pH7.4で処理したサンプルを、擬似処理サンプルとして表した。
【０１９２】
脳ホモジェネートのペルオキシ亜硝酸処理
正常またはミスフォールディング状態/疾患状態脳ホモジェネートの等分試料(18μl)は、2μlのペルオキシ亜硝酸を100mMのNaOH/60mMH₂O₂に溶かしたものを加えながら攪拌して、0〜15mMの最終ペルオキシ亜硝酸濃度を与えた。さらに15秒間攪拌した後、サンプルをウエスタンブロッティング、免疫沈降またはサンドウィッチELISAした。
【０１９３】
赤血球SOD1のDEPC処理
ヒト赤血球から精製したSOD1(Sigma)は、10mMのトリス-酢酸バッファー(pH7)中の40_MのSOD1、4mMのアスコルビン酸、および0.2mMのCuCl₂37℃3日間からなる金属触媒酸化反応において凝集する。(可溶性SOD1を含む)超遠心分離の上清および(不溶性SOD1を含む)ペレット再懸濁液を、さまざまな濃度のDEPC(100pM〜0.1M)で処理し、熱で変性させ、抗SOD1抗体を用いてイムノブロッティングする。
【０１９４】
ウエスタンブロッティング
サンプルはSDSローディングバッファー(62mMのトリス(pH6.8)、10%グリセロール、2%のSDS、5%のβ-メルカプトエタノールおよび0.01%のブロモフェノールブルー)中で5分間煮沸し、12%トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上に分離し、次にHybond-Pに移した。3F4(1:50000)6H4(1:10000)または6E10(1:1000)を一次抗体として、およびHRP結合ヤギ抗マウス(1:10000)を二次抗体として使用し、次にECL-Plusへの露光、およびKodak X-OMATフィルムへの露光により目に見える状態にすることによって、PrPを検出した。バンド強度はUnScan-ITソフトウェアを使用することによって定量化した。
【０１９５】
免疫沈降
サンプルは50μlの抗体結合(100μg/ml)Dynal M-280磁気ビーズと共に、1ml結合バッファー(3%のNP-40;3%のTween-20)の最終体積で3時間室温において攪拌しながらインキュベートした。ビーズは洗浄バッファー(2%のNP-40;2%のTween-20)で3回洗浄し、β-メルカプトエタノールを含まない30μlのSDSローディングバッファー中で5分間煮沸した。前に記載したのと同様にウエスタンブロッティングによって上清を分析した。
【０１９６】
サンドウィッチELISA
捕捉抗体(6H4;1:5000、50mM重炭酸結合バッファー、pH9.6中)を、4℃での一晩のインキュベーションによって不透明な96ウエルプレート(Nuns Maxisorp)と結合させた。2時間0.05%TBST中での1%BSAを用いた遮断後、プレートをTBST中で3回洗浄し、標準濃度のrhuPrPまたはrHaPrPならびに未知の脳ホモジェネートと共に4℃で一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄し、検出抗体ビオチン-3F4(1:5000)と共に室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、アビジン-HRP(1:5000)を加え、30分間室温でインキュベートした。最終洗浄ステップ(3回)の後、室温で10〜90分間Quantablu蛍光基質を用いてプレートを現像し、325nmの励起および420nmの発光で蛍光強度を測定した。
【０１９７】
好ましい実施例であると現在考えられているものを参照しながら本発明を記載してきたが、本発明は開示した実施例に限られないことは理解されよう。それとは反対に本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるさまざまな変更形態および均等物を含むものとする。
【０１９８】
2003年8月20日に出願された米国出願第60/496,381号(表題Methods of Detecting Prion Protein (Cashman & Lehto)、および2003年8月21日に出願された米国出願第60/497,362号(表題Epitope Protection Assay (Cashman & Lehto)、ならびに対応するカナダ出願第2,437,675号およびカナダ出願第2,437,999号を含めた全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が、それらの全容が参照により組み込まれていることが詳細かつ個別に示される場合と同じ程度で、それらの全容が参照により本明細書に組み込まれている。
（参考文献）

【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】酸処理によってin vitroで凝集した脳PrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護されることを示す図である。擬似または酸処理ヒト脳ホモジェネートは高いペルオキシ亜硝酸濃度(ONOO)で処理して、次いで3F4(パネルA)または6H4(パネルB)を用いるイムノブロッティングを施す。擬似(□)および酸処理(●)脳ホモジェネート中の3F4(C)および6H4(D)エピトープに対するペルオキシ亜硝酸の影響。イムノブロット写真をスキャニングし、バンド強度はUnscanitソフトウェアによって測定した。これらの結果は、3つの別個の実験を組み合わせた相対的な強度である。
【図２】スクレーピー感染したハムスター脳内のPrPは、ペルオキシ亜硝酸による修飾から保護されることを示す図である。(A)スクレーピー感染したハムスター脳内の6H4エピトープに対するペルオキシ亜硝酸の影響。(B)(A)のブロット写真をスキャニングし、相対的なバンド強度はUnscanitソフトウェアを使用して測定した。(●)スクレーピー感染したハムスター脳。(□)正常なハムスター脳。
【図３】ペルオキシ亜硝酸誘導型の修飾からの保護は、酸処理した脳内の凝集によるものであることを示す図である。(A)擬似または酸処理した脳ホモジェネート中のPrPの免疫沈降(IP)に対するペルオキシ亜硝酸の影響。脳ホモジェネートは10mMのペルオキシ亜硝酸、次に2.5Mの塩酸グアニジン(Gu)有り(+)または無し(-)での室温における2時間のインキュベーションで処理した。生成したサンプルは6H4または3F4を用いて免疫沈降させた。ペルオキシ亜硝酸+Guを用いた処理の後に酸処理サンプル中にさらなるPrPを沈降させ、一方擬似サンプル中では、Guは影響を有していない。これはGuが、ペルオキシ亜硝酸による破壊から保護される酸サンプル中の凝集したPrPを分解することができることを示唆する。(B)ELISAによって測定した、擬似および酸処理した脳ホモジェネート中のPrPに対するペルオキシ亜硝酸の影響。脳ホモジェネートは、高濃度のペルオキシ亜硝酸、次に2.5MのGuで処理した。10倍希釈の後、捕捉抗体として6H4および検出抗体として3F4を用いて、サンドウィッチELISAによってサンプルを分析した。イムノブロットおよびIPデータと同様に、これらの結果は、ミスフォールディング状態のPrPは、凝集のためペルオキシ亜硝酸による破壊から保護されることを示す。
【図４Ａ】EPAを使用する、凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出を示す図である。APPのAβ領域中の6E10エピトープは、正常な脳(パネルA)、およびタンパク質凝集を誘導するために低いpHで処理した脳ホモジェネート中(パネルB)と比較して、アルツハイマー病の脳内ではペルオキシ亜硝酸による修飾に対して影響を受けにくい。
【図４Ｂ】EPAを使用する、凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出を示す図である。APPのAβ領域中の6E10エピトープは、正常な脳(パネルA)、およびタンパク質凝集を誘導するために低いpHで処理した脳ホモジェネート中(パネルB)と比較して、アルツハイマー病の脳内ではペルオキシ亜硝酸による修飾に対して影響を受けにくい。
【図４Ｃ】EPAを使用する、凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出を示す図である。in vitroで凝集したAβ1〜42ペプチドは、可溶性非凝集Aβ1〜42と比較して、ペルオキシ亜硝酸修飾に対する6E10エピトープの顕著なエピトープ保護を示す(パネルC)。正常および高濃度のペルオキシ亜硝酸で処理し次いで6E10抗体でイムノブロッティングした凝集Aβ1〜42も、顕著なエピトープ保護を示す(パネルD)。
【図４Ｄ】EPAを使用する、凝集したアミロイドβ(Aβ)の検出を示す図である。in vitroで凝集したAβ1〜42ペプチドは、可溶性非凝集Aβ1〜42と比較して、ペルオキシ亜硝酸修飾に対する6E10エピトープの顕著なエピトープ保護を示す(パネルC)。正常および高濃度のペルオキシ亜硝酸で処理し次いで6E10抗体でイムノブロッティングした凝集Aβ1〜42も、顕著なエピトープ保護を示す(パネルD)。
【図５】SOD1においてDEPCにより修飾され得るエピトープの検出を示す図である。(A)高濃度のDEPCで処理しヒツジ抗SOD1でイムノブロッティングした可溶性SOD1を示す、ウエスウタンブロット。(B)高いDEPC濃度でのSOD1との低い抗体結合のグラフ図。
【図６】EPAを使用する、凝集したα-シヌクレインの検出を示す図である。(A)可溶性および不溶性α-シヌクレインとの抗体結合に対する高濃度のDEPCの影響を示す、ウエスウタンブロット。(B)正常(-)および不溶性(π)α-シヌクレインとの抗体結合の程度を示すグラフ図。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to epitope protection assays for use in the diagnosis, prognosis and therapeutic intervention of diseases, eg diseases associated with polypeptide aggregation such as prion infection.
[Background]
[0002]
Protein misfolding and aggregation
Proteins can fold into complex and close-packed structures. Folding is not only important for biological activity, but disease can be caused by failure of the protein to fold correctly, or by the protein being folded (Dobson CM, Methods (2004) 34: 4-14). In some cases, misfolding can cause protein aggregation, which can also result in discontinuous deposition extracellularly (e.g. plaques) or intracellularly (e.g. encapsulated in the cytosol or nucleus). is there.
[0003]
Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and prion disease, deposit misfolded aggregated proteins into the nerve. Is characterized by Type II diabetes and cancer have also been associated with protein misfolding, and there may be unidentified diseases that arise from protein folding errors and in some cases result in aggregation and the like. The nature of misfolding and any aggregation in such diseases is typically not well characterized.
[0004]
Prion disease
Prion disease has been a significant health concern since the outbreak of BSE or “mad cow disease” (reviewed previously, 40, 41). BSE was first discovered in the UK, but is now spreading to many other countries throughout Europe and Japan. There are about 180,000 cases of BSE in the UK alone, which resulted in the annihilation of cattle and possibly an estimated 3-5 million infections. The total estimated cost for the UK exceeded £ 2.5 billion. BSE is thought to be transmitted between cows through feed containing prions from infected cattle, and by eating beef products or other cattle products from infected animals, BSE is transmitted to humans. Conceivable.
[0005]
Newborn prion disease
Prion disease is a group of rapidly progressing untreatable neurodegenerative syndromes characterized by neuropathology by spongy changes, neuronal loss, gliosis, and abnormal amyloid polypeptide accumulation in the brain . Human prion diseases include classic Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), which has sporadic, iatrogenic, and familial forms. Since 1996, a “new variant” of CJD (vCJD) has been identified in the United Kingdom, France, Republic of Ireland, Hong Kong, Italy, the United States, and Canada (40, 41). Modified CJD can kill a young individual who is 14 years old with an unknown incubation period. There is little suspicion that vCJD is a human form of bovine spongiform encephalopathy (BSE) (42). The primary transmission from consuming contaminated cattle tissue has affected over 130 individuals at the time of this filing.
[0006]
The fear of vCJD through blood, blood products, surgery, dental surgery, vaccines, and cosmetics, “secondary transmission” is a major concern (40, 41). Detection of blood prion infectivity in experimental BSE / vCJD infections in mice and sheep (40) suggests that there is a particular risk regarding the transmission of vCJD through blood and blood products. Recent reports of vCJD in two recipients of donors who developed the disease are also cumbersome (52, 53). Canada and the United States have recently extended vCJD blood donor deferrals to all countries in Western Europe.
[0007]
Although sheep scrapie has been known for centuries, the most important animal prion disease is now BSE. Over 173,000 cattle, mainly from the UK, develop symptomatic BSE, as many as 3 million have not been detected in feed supply. BSE is now increasingly reported in cattle "born after the ban" in 1996 on food supply for meat and bone meal, and there may be other pathways that prevent the transmission of infection easily I suggest that. Another annoying problem is the possible transmission of BSE to sheep, which may expose other human populations to BSE / vCJD prion variants. Recent reports show that prions can replicate in sheep, laboratory animals, and several muscle groups in humans (54-57), and tissues previously considered safe for human consumption Indicates a potential danger.
[0008]
Chronic wasting disease (CWD) in captive and wild deer (deer and wabiti) is another newly born animal prion disease in North America, whose effects on human health are not yet known. Clearly, the newly recognized prion disease poses a threat to the safety of food, blood products, and medical-surgical treatments.
[0009]
Prion: Atypical pathogen
The newly emerging prion disease and the nature of prion polypeptides alone have created significant medical, veterinary and economic challenges worldwide. To date, the only commercial test for prion infection is based on postmortem brain samples. Despite the presence of detection by experimental transmission studies, there are no biochemical tests to detect prions in the blood of infected animals. The development of sensitive and specific diagnostic tests for prion infection is a laborious task, in part due to the unusual nature of prion infectious agents. Infectious agents that transmit prion diseases differ from other pathogens in that no nucleic acid elements are detected in the infectious agent (41). According to the prion theory developed by Nobel Prize winner Dr. Stanley Prusiner, the normal cell prion polypeptide PrP ubiquitous in the vicinity ^C PrP, a misfolded conformational isoform of ^Sc Is infectious. Actual PrP ^Sc Is the most prominent (or perhaps the only) macromolecule in the preparation of prion infectivity and hardly appears to be a reliable substitute for prion infection. PrP ^Sc Is a protease-sensitive, soluble monomeric isoform, PrP ^C In contrast, it is partially resistant to protease digestion, is less soluble and exists in an aggregated state (29, 31, 43-46).
[0010]
PrP ^Sc Is a normal cell isoform (PrP) that is rich in α-helical structure by a post-translational process for conformational changes. ^C ) PrP ^C Primary structure of PrP ^Sc The secondary and tertiary structure changes are responsible for the different physicochemical properties of the two isoforms.
[0011]
One of the difficulties in assessing the safety of human food or blood products that may have been infected with prions is the lack of accurate diagnostic tests on blood or other available biological samples. Currently, there are no diagnostic tests that can be applied to screen live animals, humans, blood or blood products at an early stage. This further poses other problems in organ transplantation, adding an unknown risk to organ recipients. Thus, as a precaution, countries such as the UK no longer source plasma from their residents. The risk of prion disease spreading has also affected other countries. For example, the United States and Canada do not allow blood donation from individuals who have lived in the UK or France for more than 3-6 months.
[0012]
Currently, the diagnosis of vCJD can only be confirmed after brain pathology tests at autopsy or biopsy. Some complementary strategies for early CJD detection include electroencephalography (EEG), magnetic resonance imaging (MRI) scanning, and cerebrospinal fluid (CSF) testing, which are useful "surrogate" or "surrogate" markers There is a possibility. The absence of “direct tests” for prion infection is in sharp contrast to traditional infectious agents such as viruses and bacteria.
[0013]
Some tests in the process of commercialization are based on surrogate markers of infection that have been “removed once” from the actual infection prion.
[0014]
PrP protease resistance is the basis for the most commercially available diagnostic tests for prion diseases. The current method is to remove brain samples and PrP ^C Removes PrP ^Sc The protease-resistant central part is digested with a protease that can be left intact. Then PrP ^Sc Protease resistant fragments of are detected by immunoblotting (as in the Prionics test) or by capture ELISA (as in the BioRad and Enfer tests, as well as in new tests from Prionics). However, digestion with proteases is cumbersome and variable, leading to false negatives and false positives. In addition, PrP is infectious and aggregates but is not protease resistant ^Sc There are several prion lines that have been reported to contain. Protease sensitive PrP ^Sc Also dominate early in disease transmission and interspecies transmission (31).
[0015]
The detection of protease resistant PrP fragments is also the basis for a urine diagnostic test (47) developed commercially by Prionics. However, detection of protease-resistant PrP in urine is subject to the same limitations as postmortem brain testing, requiring high amounts of urine precipitation, and low sensitivity (e.g., late-stage PrP rather than prodromal symptoms) ^Sc Only other detection).
[0016]
Other neurodegenerative diseases
Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD), Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and Parkinson's disease / Lewy body dementia (PD, LBD) are also associated with our aging group and healthcare system. Poses significant challenges (reviewed in 1). An estimated 364,000 Canadians over the age of 65 are currently diagnosed with AD or related dementia (http://www.alzheimer.ca/). With increasing life expectancy, the incidence of neurodegenerative diseases is expected to increase. By 2025, AD will affect as many as one million Canadians, and by 2050 this number will double.
[0017]
Sporadic AD, ALS, and PD / LBD are all amyloid-β (Aβ) fragments of amyloid precursor protein (APP) in AD; superoxide dismutase-1 (SOD1) in ALS, and α- in PD and LBD It is associated with neuropathic accumulation of pathogenic multimers of misfolded polypeptides, including synuclein (1) (these are probably fibrils, fibrils, and amorphous aggregates). Furthermore, familial amyloid polyneuropathy (FAP) arises from the aggregation of transthyretin to form amyloid deposits. Similar to prion disease, mutations in the genes encoding these polypeptides are associated with autosomal dominant familial forms of AD, ALS, and PD.
[0018]
Alzheimer's disease
AD is a proteolytic product of APP (reviewed in 4) and consists mainly of Aβ (1-40), Aβ (1-42) and Aβ (1-43) peptides. It is a general dementia (memory and cognitive impairment) neurodegenerative disease associated with internal accumulation. Furthermore, neurofibrillary tangles mainly composed of abnormally phosphorylated tau protein (neural microtubule binding protein) accumulate in cells in dying neurons (4). Familial forms of AD can be caused by mutations in the APP gene, or presenilin 1 or 2 gene (www.websiteformutations.com), and the protein product is associated with APP to Aβ processing. Apolipoprotein E allelic variants also affect the age at onset of sporadic and familial AD (reviewed in 5). Aβ has been detected in the blood and CSF of AD patients and in normal controls (6). Aβ is also present in vascular and plaque amyloid filaments in trisomy 21 (Down syndrome), amyloidosis (HCHWA) -Dutch hereditary cerebellar hemorrhage, and normal brain aging (Mori, H et al., JBC (1992) 267 : 17082-86). Tau and phosphorylated tau have been detected in cerebrospinal fluid (CSF) of AD patients and patients with other neurological diseases (reviewed in 7; 8).
[0019]
Amyotrophic lateral sclerosis
ALS is a fatal neuromuscular disease that occurs in 1 in 1000 adults and manifests as progressive weakness, muscle atrophy, and spasticity up to 500,000 “lower motor neurons” in the spinal cord and brainstem, And by the degeneration of countless “upper motor neurons” in the cerebral cortex. An important clue to the pathogenesis of ALS is that about 20% of cases of familial ALS (fALS) are due to mutations in superoxide dismutase-1 (SOD1) (10,11), a free radical defense enzyme Appeared together. Over 100 fALS SOD1 missense, nonsense, and intron splicing mutations have been classified to date (12; www.alsod.org). Transgenic mice expressing mutant human SOD1 (mtHuSOD1) develop motor neuron symptoms with clinical and pathological similarities to human ALS (13, 14) and mice expressing wild type human SOD1 (wtHuSOD1) Does not develop disease (13). SOD1-containing cytoplasmic inclusions are found in many disease state motor neurons from familial and sporadic ALS patients (15), and in most transgenic mice (16, 17) and tissue culture (18) models of this disease Can be detected.
[0020]
Parkinson's disease and Lewy body disease
PD is the second most prevalent AD (up to 350 per 100,000 population; 1), a neurodegenerative movement disorder. It is clinically characterized by movement stiffness, slowness, and tremor (reviewed in 21). Most cases of Parkinson's disease are sporadic, but the substantia nigra is a population of midbrain neurons (up to 60,000) in which both sporadic and familial diseases are selectively killed in PD Characterized by intracellular Lewy bodies in neurons. Lewy bodies are mainly composed of α-synuclein (22). Mutations in the gene encoding α-synuclein have been found in patients with familial Parkinson's disease (reviewed in 23; www.parkinsonsmutation.com). Another gene associated with autosomal recessive PD is parkin associated with α-synuclein degeneration (22, 23). A diffuse cortical Lewy body composed of α-synuclein is observed in Lewy body disease (LBD), a dementia symptom associated with Parkinsonian changes, hallucinations, and rapid symptom variation (24) . LBD may be the second most common form of neurodegenerative dementia after AD, accounting for 20-30 percent of cases among people over the age of 60 (1, 24).
[0021]
Huntington's disease and related diseases
HD is a progressive neurodegenerative disorder characterized by extension of CAG repeat units encoding polyglutamine at the N-terminus of huntingtin protein (reviewed in 48). More than 36 polyglutamine stretches cause disease, and longer repeat units cause earlier onset (49, 50).
[0022]
Other polyglutamine diseases, such as the dentate nucleus red nucleus paleoid atrophy (DRPLA) and some forms of sinus-cerebellar ataxia (ScA), are also cytoplasmic inclusions that are loosely related to the area of neuronal death Have a body. Interruption of extended polyglutamine repeat units in the ScA-1 gene product eliminates the disease (51).
[0023]
Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and Parkinson's disease / Lewy body disease (PD, LBD) present significant challenges to our aging group and healthcare system. To raise. There are no specific biochemical tests for neurodegenerative diseases as a group (1, 2). Because neurodegenerative diseases are considered “out-of-diagnosis”, a very extensive study is needed to make a “clinically reliable” diagnosis for these progressive, incurable, and usually fatal conditions. Is done. Use expensive surrogate tests such as neuroimaging to increase diagnostic certainty (2). The availability of specific, sensitive and inexpensive biochemical tests for this devastating disease group is likely to preserve resources for overburdened healthcare systems. Furthermore, the safe diagnosis of these diseases at an early symptom stage opens a window for high therapeutic efficacy when the pathological physiology of the disease is generally more effective for treatment (3).
[0024]
Efficient, effective and inexpensive diagnostic and screening strategies for prenatal diagnosis of human neurodegenerative diseases are urgently needed in view of continuous financial pressure on the aging group and healthcare systems.
[0025]
Diabetes mellitus
Protein aggregation is also observed in patients with type II diabetes. High expression of an adipocyte-derived peptide, resistin, has been observed in type II diabetic patients (Youn BS et al., J Clin Endocrinol Metab. (2004); 89: 150-6), with high resistin levels in obesity and insulin resistance Studies suggest that it may play a role. Furthermore, the accumulation of islet amyloid polypeptide (also known as amylin) is pathologically related to type II diabetes. These deposits contain islet amyloid polypeptide, a unique amyloid peptide, and are associated with beta cell death. Recent studies suggest that the species responsible for islet amyloid-induced β-cell death is formed early in the islet amyloid formation, at which time the accumulation of islet amyloid polypeptide begins (Hull RL et al., J Clin Endocrinol Metab. (2004) 89: 3629-43). Diagnostic tests that can identify pathogenic islet amyloid polypeptides appear to be very useful in detecting type II diabetes at an early stage where diet and therapeutic intervention are most effective.
[0026]
cancer
Many forms of cancer are also considered to be protein conformation related diseases (Ishimaru D. et al., Biochemistry (2003) 42: 9022-7). Neuroblastoma, carcinoma and melanoma subsets show abnormal accumulation of tumor suppressor p53 protein aggregates (Butler JS et al., Biochemistry (2003) 42: 2396-403; Ishimaru D. et al., Biochemistry (2003) 42: 9022-7). This accumulation appears to contribute to the loss of p53 function in some cancerous cells (Ishimaru D. et al., Biochemistry (2003) 42: 9022-7). An assay capable of detecting accumulated p53 would provide a diagnostically useful detection system and would enhance therapeutic intervention by individualizing the therapeutic intervention.
[Non-Patent Document 1]
Dobson CM, Methods (2004) 34: 4-14
[Non-Patent Document 2]
http://www.alzheimer.ca/
[Non-Patent Document 3]
www.websiteformutations.com
[Non-Patent Document 4]
Mori, H, et al., JBC (1992) 267: 17082-86
[Non-Patent Document 5]
www.alsod.org
[Non-Patent Document 6]
www.parkinsonsmutation.com
[Non-Patent Document 7]
Youn BS et al., J Clin Endocrinol Metab. (2004); 89: 150-6
[Non-Patent Document 8]
Hull RL et al., J Clin Endocrinol Metab. (2004) 89: 3629-43
[Non-patent document 9]
Ishimaru D. et al., Biochemistry (2003) 42: 9022-7
[Non-Patent Document 10]
Butler JS et al., Biochemistry (2003) 42: 2396-403
[Non-Patent Document 11]
Kohler and Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)
[Non-Patent Document 12]
Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)
[Non-Patent Document 13]
Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc, pp. 77-96
[Non-Patent Document 14]
Huse et al., Science 246, 1275 (1989)
[Non-Patent Document 15]
Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985)
[Non-Patent Document 16]
Takeda et al., Nature 314, 452 (1985)
[Patent Document 1]
Cabilly et al., U.S. Pat.No. 4,816,567
[Patent Document 2]
Boss et al., U.S. Pat.No. 4,816,397
[Patent Document 3]
Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496
[Patent Document 4]
European Patent Publication 0173494
[Patent Document 5]
British patent GB2177096B
[Non-Patent Document 17]
Ward et al., Nature 341, 544-546: (1989)
[Non-Patent Document 18]
Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989)
[Non-Patent Document 19]
McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)
[Non-Patent Document 20]
Cerchia L et al., FEBS Letters 528 (2002) 12-12
[Non-patent document 21]
Bianchini et al., Immunol Methods (2001) 252: 191-97
[Non-Patent Document 22]
Crawford M et al., Brief Funct Genomic Proteomic. 2003 Apr; 2: 72-9
[Non-Patent Document 23]
Pizzano R et al., J. Agric Food Chem (2004) 52: 649-54
[Non-patent Document 24]
Elan, J et al., Nature Structural Biology (2003) 10: 461-67
[Patent Document 6]
U.S. Application No. 60 / 496,381, filed August 20, 2003 (titled Methods of Detecting Prion Protein (Cashman & Lehto))
[Patent Document 7]
U.S. Application No. 60 / 497,362, filed August 21, 2003 (Title Epitope Protection Assay (Cashman & Lehto))
[Patent Document 8]
Canadian Application No. 2,437,675
[Patent Document 9]
Canadian Application No. 2,437,999
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0027]
We have recently developed a novel method that results in an epitope protection assay (EPA), sensitive and specific prenatal detection of disease-related proteins in blood and other accessible tissues and fluids. The present invention provides an assay that demonstrates the role of aggregation in diseases such as prion disease and overcomes the problems of the prior art. In prion disease, normal cell monomer prion polypeptide PrP ^C Generally PrP ^Sc It undergoes refolding to an abnormal aggregation isoform expressed as Diseases such as AD, PD, LBD, ALS and HD are also characterized by cellular protein misfolding and / or aggregated conformations. This property is exploited by the methods of the present invention to provide sensitive and specific diagnostic tests for these and other diseases.
[0028]
According to the present invention, these methods are useful when the target epitope is accessible on either one of the non-wild type protein (i.e. disease related protein) or the wild type protein and not accessible on the other protein. It is. Inaccessibility is often due to aggregation that renders the target epitope inaccessible.
[0029]
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is a disease (disorder) -related polypeptide or a wild-type polypeptide, comprising:
Contacting the candidate polypeptide with a blocking agent;
Determining whether the target epitope is chemically modified with a blocking agent and determining whether the target epitope is inaccessible or accessible.
[0030]
The accessibility or inaccessibility of the target epitope indicates whether the candidate polypeptide is a disease (disorder) -related polypeptide or a wild-type polypeptide. This is because the target epitope is accessible in one of the disease (disorder) related protein and the wild type protein. For other polypeptides, the target epitope is inaccessible.
[0031]
In one embodiment, the present invention is a method for detecting prion disease, for example, whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is a wild-type conformation or a non-wild-type conformation in which it is aggregated. A method of determining,
Polypeptide sample (sample is PrP ^Sc And / or PrP ^C As well as in many cases typically containing a large amount of one or the other), and typically a substance that chemically reacts with proteins such as peroxynitrite and is accessible epitope (target epitope) Reacting chemically modified substances that modify them so that they cannot bind to the detection agent;
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the polypeptide contained an inaccessible target epitope (such as before disaggregation and / or denaturation). I will provide a.
[0032]
PrP ^C Becomes “invisible” during the assay. This is because epitopes on monomer molecules are blocked against antibody recognition by chemical modifiers, whereas PrP ^Sc This is because these molecules are “protected” from chemical modification by being sequestered in aggregates or otherwise not available for reaction. Alternatively, epitopes on multimeric molecules are blocked against antibody recognition by chemical modifiers, while PrP ^C This molecule is “protected” from chemical modification by differences in accessible epitopes.
[0033]
In other embodiments, the method of detecting Alzheimer's disease comprises:
A sample of the polypeptide (the sample typically contains all or part of the diseased amyloid precursor polypeptide or Aβ or tau and / or the corresponding wild-type polypeptide, and often a large amount of one or the other. ) And typically chemically reacting with a protein such as peroxynitrite, which modifies exposed epitopes so that they cannot bind to the detection agent. When,
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the polypeptide contained an inaccessible target epitope prior to disaggregation and / or denaturation.
[0034]
In other embodiments, the invention relates to, for example, mistakes such as Parkinson's disease (PD), Lewy body disease (LBD), Huntington's disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), diabetes, and cancer. Provided are disease detection methods for differentially accessible diseases and other diseases characterized by target epitopes of wild-type conformation resulting from folding and / or aggregated proteins. These methods react a sample of a polypeptide (e.g., a disease-related polypeptide described herein) with a chemical modifier that modifies the exposed epitope so that they cannot bind to the detection agent. Step, then deaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample, and probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope so that the polypeptide cannot be contacted prior to deaggregation and / or denaturation Also included are steps such as determining whether the target epitope was included. These steps are equally suitable for other purposes such as blood and blood product screening, as well as other uses described herein.
[0035]
The method of the present invention has many advantages over existing techniques. As noted above, the present invention is sometimes referred to as “EPA”, and in the case of prion proteins, disease detection is a pathogen molecule that is thought to constitute a polypeptide associated with prion disease infectious particles and AD. , PrP ^Sc It is a simple and efficient method for detecting aggregated disease-related proteins such as.
[0036]
The present invention is useful in high throughput robotic platforms. For example, EPA does not rely on PrP protease resistance, the basis of most commercially available diagnostic tests for prion diseases. Epitope protection technology does not require a prosthetic digestion step, which makes the epitope protection technology more sensitive to initial infection. Indeed, the absence of a prosthetic digestion step makes EPA more compatible with high-throughput robotic platforms.
[0037]
Furthermore, the methods of the invention can be used to detect any protein present in more than one conformation in which one or more target epitopes are hidden in at least one conformation.
[0038]
Therefore, the present invention
A sample of a polypeptide is reacted with a chemical modifier that is typically defined as a substance that chemically reacts with the protein and modifies the exposed epitope so that they cannot bind to the detection agent. Steps,
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the polypeptide contained a target epitope that was inaccessible to the chemical modifier prior to disaggregation and / or denaturation. Including detection methods.
[0039]
This result indicates whether the polypeptide contains an inaccessible epitope that is indicative of the type of polypeptide present (ie, wild type protein or non-wild type protein).
[0040]
In one embodiment, the invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation (in one embodiment, a non-wild-type conformation). At the locus, the candidate polypeptide aggregates with the aggregated polypeptide),
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein the target epitope is accessible and blocking agent in one of the non-wild type conformation or the wild type conformation In other conformations, the target epitope is inaccessible and does not react with the blocking agent, and unreacted blocking agent is described, for example, by giving time for the blocking agent to be consumed or degraded, or as described below Removing it from contact with the polypeptide by actively removing it by physical or chemical methods;
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from a non-contactable target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is converted Previously, the candidate polypeptide indicated that the target epitope was in a conformation that the target epitope was inaccessible, and the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide has a conformation in which the target epitope was accessible. Indicating that the polypeptide was in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation.
[0041]
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation, comprising:
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein in the wild-type conformation, the target epitope is accessible and reacts with the blocking agent to form a non-wild-type conformation In which the target epitope is inaccessible and does not react with the blocking agent, and unreacted blocking agent can be obtained, for example, by providing time for the blocking agent to be consumed or degraded, or by physical or chemical methods as described below. Removing from contact with the polypeptide by actively removing the; and
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate poly Including the step of indicating that the peptide was in a non-wild type conformation and wherein the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in the wild type conformation.
[0042]
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation, comprising:
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein in a non-wild type conformation, the target epitope is accessible and reacts with the blocking agent to form a wild type conformation. In which the target epitope is inaccessible and does not react with the blocking agent, and unreacted blocking agent can be obtained, for example, by providing time for the blocking agent to be consumed or degraded, or by physical or chemical methods as described below. Removing from contact with the polypeptide by actively removing the; and
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate poly Including the step of indicating that the peptide was in a wild-type conformation and wherein the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in a non-wild-type conformation.
[0043]
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope reacted with a blocking agent is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation,
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting the polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate Including the step of indicating that the polypeptide was in a non-wild type conformation and wherein the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in the wild type conformation. .
[0044]
In the methods of the present invention, epitopes are often inaccessible in misfolded or non-wild type conformations. Because i) a different misfolding of the polypeptide compared to the wild-type folding polypeptide prevents or reduces the reaction between the blocking agent and the target epitope, ii) the misfolded polypeptide itself aggregates Or aggregate with other polypeptides in a misfolded conformation to prevent or reduce the reaction between the protective / blocking agent and the target epitope, and / or iii) post-translational modification of the polypeptide Because it interferes with or reduces the reaction between the blocking agent and the target epitope.
[0045]
In one example, the candidate polypeptide comprises a prion protein, the wild-type folded state conformation comprises a wild-type folded state prion protein conformation, and the misfolded state conformation is PrP. ^Sc Conformation of Alternatively, the wild-type folded protein comprises the conformation of APP or its cleavage product amyloid β, and the misfolded conformation comprises the conformation of Alzheimer's disease APP or its cleavage product amyloid β.
[0046]
In other examples, candidate polypeptides include SOD1, α-synuclein, islet amyloid polypeptide, resistin or p53 protein. The methods and kits of the invention described in this application have a conformation comprising multiple copies of a polypeptide aggregated together, for example, by interaction of regions rich in β-sheets of the polypeptide. Useful for type polypeptides. In one embodiment, the polypeptide is a polypeptide that aggregates into prion protein aggregates. In other embodiments, the polypeptide is a polypeptide that aggregates into amyloid plaques.
[0047]
The invention also includes i) a polypeptide of the invention modified by reaction with a blocking agent listed herein, and ii) a polypeptide modified by reaction with a detection agent. The present invention also includes compositions and kits of the invention comprising these modified polypeptides.
[0048]
Blockers are optionally peroxynitrite, hydrogen peroxide, diethyl dicarbonate (DEPC), 4-hydroxynonenal (4HNE), conjugitol-B-epoxide and 1,2-epoxy-3- (p-nitrophenoxy) ) Epoxides such as propane, methylene or diazirine and related compounds. In the methods of the invention, the polypeptide is optionally modified, for example, by denaturing the polypeptide with heat, surfactants and / or chaotropic agents. The polypeptide is optionally modified by treatment with a disaggregating agent to disaggregate the polypeptide from other polypeptides of the same type and from other molecules, the disaggregating agent being a chaotropic agent (guanidine salt, urea Or thiourea), optionally selected from at least one of the group consisting of surfactants and heat.
[0049]
The method steps of the invention listed herein with respect to removal of the blocking agent typically include physically, chemically, or otherwise removing the blocking agent from the candidate polypeptide to prevent further reaction. This will be readily apparent to those skilled in the art. Removal may optionally be allowed to elapse for a sufficient amount of time so that the blocking agent is removed from the candidate polypeptide by consumption or degradation (e.g., so that the blocking agent is in an inactive or oxidized state). Including. Removal optionally includes adding a compound to react with any excess blocking agent to inactivate it. Removal may optionally be achieved by physical filtration of the blocking agent using conventional filtration techniques, or centrifugation to separate the candidate polypeptide and blocking agent, e.g., the blocking agent or candidate polypeptide and immobilized support in a column. Also included is physical association with a support useful for removing the blocking agent, such as by attachment.
[0050]
Removal includes, for example, physically or chemically inactivating the blocking agent, not contacting the blocking agent with the sample containing the candidate polypeptide, or a sufficient amount of time for the blocking agent to be consumed or degraded. By passing, it is meant to prevent further reaction by the blocking agent.
[0051]
The detection agent optionally comprises an antibody directed against an epitope of a prion polypeptide, an epitope of amyloid β, an epitope of α-synuclein, or a SOD10 epitope. The antibody optionally includes anti-prion antibodies 6H4 and 3F4 and anti-amyloid β antibodies 6E10 and 4G8 in whole or in part.
[0052]
The method of the present invention is preferably used with mammals such as humans. Furthermore, the method of the present invention is preferably used for mammals such as livestock. Furthermore, the method of the invention is used for food, cosmetics, dental and surgical tools, vacuum packaging and pharmaceutical products.
[0053]
The invention relates to a disease characterized by the presence of a candidate polypeptide comprising a target epitope in a non-wild type conformation in a sample using the methods of the invention described herein. Also included is a method of testing a sample derived from an animal that determines whether the animal has an. Such diseases are described herein. In one embodiment, the method of the invention comprises:
Contacting the sample with a blocking agent that selectively blocks accessible target epitopes in the candidate polypeptide, wherein the target epitope is accessible in the wild-type conformation and reacts with the blocking agent to form a non-wild type In conformation, the target epitope cannot be contacted because the candidate polypeptide aggregates with the aggregated polypeptide and the target epitope cannot react with the blocking agent; and
Contacting the sample with a conversion agent to modify the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope in the sample to a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate poly Indicating that the peptide is in a non-wild type conformation, and that the animal has a disease, and that the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in the wild type conformation; Determining whether the candidate polypeptide is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation.
[0054]
The present invention screens for example by testing samples such as blood or blood products, and other samples, wherein the candidate polypeptide is a non-wild type conformation candidate polypeptide comprising a target epitope. Also included is a method of the invention as described herein for determining whether to contain. In one embodiment, the method of the invention comprises:
Contacting the sample with a blocking agent that selectively blocks accessible target epitopes in the candidate polypeptide, wherein the target epitope is accessible in the wild-type conformation and reacts with the blocking agent to form a non-wild type In the conformation, the target epitope is inaccessible and cannot react with the blocking agent;
Contacting the sample with a conversion agent to modify the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope in the sample to a accessible target epitope;
Contacting the polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate Indicates that the polypeptide was in a non-wild type conformation and that the sample contains a candidate polypeptide in a non-wild type conformation, and the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide is wild Determining whether the candidate polypeptide is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation.
[0055]
In other embodiments, the invention provides that the candidate polypeptide comprising the target epitope is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation (eg, the polypeptides aggregate into a non-wild-type conformation). ) Whether or not
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, in the wild-type conformation the target epitope is accessible and reacts with the blocking agent, and in the non-wild-type conformation The target epitope is inaccessible (e.g., because the candidate polypeptide aggregates) and the target epitope cannot react with the blocking agent;
Modifying the candidate polypeptide to convert a non-contactable target epitope into a accessible target epitope;
Contacting the polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate Indicating that the polypeptide was in a non-wild type conformation and wherein the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in the wild type conformation. Unreacted blocking agent is also removed from contact with the polypeptide, for example, by consuming or degrading it or by removing it from the reaction by physical or chemical methods.
[0056]
The candidate polypeptide optionally includes a prion protein, the wild type conformation includes the wild type prion protein conformation, and the non-wild type conformation is PrP ^Sc Conformation of Candidate polypeptides optionally include β-amyloid polypeptide, tau protein or APP protein, SOD1, α-synuclein, huntingtin protein, p53 or islet amyloid polypeptide or resistin. The blocking agent is optionally selected from the group consisting of peroxynitrite, hydrogen peroxide, methylene compounds, succinic anhydride, epoxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE) and diazirine. The polypeptide is optionally modified by denaturing the polypeptide. The polypeptide is further optionally denatured by heat and / or surfactant and / or chaotropic agents. The polypeptide is optionally modified by treatment with a disaggregation agent to disaggregate the polypeptide from the aggregated polypeptide. The deagglomerating agent is optionally selected from at least one of the group consisting of chaotropic agents, surfactants and heat. The surfactant optionally includes SDS. The detection agent optionally includes, for example, an aptamer or antibody directed to an epitope of the prion polypeptide. The antibody optionally includes 6H4 or 3F4. Aptamers or antibodies are sometimes directed to epitopes of amyloid β. The antibody optionally includes 6E10 or 4G8. The non-wild type conformation is in some embodiments a prion disease (e.g. BSE or CJD), Alzheimer's disease, Parkinson's disease or Lewy body disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, cancer or diabetes, etc. The disease caused by protein aggregation is shown.
[0057]
In some cases, prior to contacting the blocking agent with the candidate polypeptide, the candidate polypeptide is present in the sample that has been pretreated by one or more of the following methods: adsorption, precipitation, or centrifugation. In some cases, the target epitope is mapped prior to contacting the blocking agent with the candidate polypeptide (ie, identifying the epitope, eg, as described below in the “Target Epitope” section). In some cases, the polypeptide is present in a postmortem or prenatal sample selected from the group of CSF, serum, blood, urine, biopsy sample or brain tissue. Another aspect of the invention is a kit for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation, which recognizes the target epitope A kit comprising: i) a mapping of the target epitope; ii) contacting the candidate polypeptide with a blocking agent; and iii) contacting the candidate polypeptide with the detection agent. About. This kit is useful for carrying out the methods of the invention described herein. The detection agent optionally includes an aptamer or antibody. The antibody optionally includes 6H4, 3F4, 6E10 or 4G8 and is optionally immobilized on a solid support. The kit optionally further comprises ELISA buffers and reagents such as, for example, a sandwich ELISA, a fluorescent ELISA. The kit optionally further comprises a blocking agent. The kit optionally further comprises a denaturing agent selected from at least one of the group of surfactants and chaotropic agents. The kit optionally further comprises a polypeptide standard. The kit optionally includes a recombinant disease-related protein or a recombinant protein that mimics a disease-related protein. In another embodiment, the invention provides a method for detecting whether a candidate polypeptide in contact with a blocking agent is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation, comprising: The peptide contains at least one target epitope, and after contact with the blocking agent and removal of the blocking agent, the candidate polypeptide is modified to convert any inaccessible target epitope to a accessible target epitope, the method comprising: Contacting the polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is: Indicates that the candidate polypeptide has a non-wild type conformation (e.g., an aggregated conformation), and the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide Said method comprising the step of indicating that had been in. The diseases, blocking agents, target epitopes, detection agents and other embodiments described herein are also useful in this method. The diseases, blocking agents, target epitopes, detection agents and other embodiments described herein can be obtained from the methods described in the previous section, e.g., testing a sample from an animal (e.g., human, domestic animal, etc.) to determine if the animal has the disease It is easily adapted to a method for determining whether or not, a method for screening a sample, and the like.
[0058]
Opposite situations for the methods described in some of the previous chapters are also usefully detected, for example, situations where the wild-type conformation contains inaccessible epitopes and the non-wild-type conformation contains accessible epitopes. This situation is also readily adapted to the methods described herein, disease diagnosis or sample screening, and the like.
[0059]
Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, it should be understood that the detailed description and specific examples are given by way of illustration only, while illustrating preferred embodiments of the invention. This is because various changes and modifications within the spirit and scope of the present invention will become apparent to those skilled in the art from this detailed description.
[0060]
Several embodiments of the invention are described with reference to the following drawings.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0061]
The present invention relates to disease-related polypeptide equivalents of normal cell polypeptides that form aggregates or result in masking one or more epitopes that are otherwise not masked in normal or wild-type polypeptides. Provides a useful method for detection. The present invention recognizes the importance of aggregation in the pathology of diseases such as prion disease. The present invention also takes advantage of this agglutination effect to provide an assay that overcomes the problems associated with prior art detection assays. In one embodiment, the method of the invention is performed with PrP in plasma, serum, urine or other biological sample. ^Sc Applies to detection. The methods of the present invention are also useful for detecting any polypeptide that is present in more than one conformation and in which one or more target epitopes of at least one conformation are inaccessible. is there. In one embodiment, the invention includes a method of detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is in a wild type or non-wild type conformation.
[0062]
“Epitope” refers to a portion of a sequence of contiguous or non-contiguous amino acids (antigens) that is recognized and bound by a detection agent such as an antibody. Preferably, the epitope is a linear epitope on the polypeptide that typically comprises 3-10 or 6-10 or more contiguous amino acids that are recognized and bound by the detection agent. Conformational epitopes include non-contiguous amino acids. Conformational epitopes can sometimes be recovered on their own after denaturation, for example by partial refolding on an immunoblot membrane. Detection agents such as antibodies recognize three-dimensional structures. When the protein molecule is folded into a three-dimensional structure, the amino acids that form the epitope are positioned in such a way that the detection agent can recognize and bind to the amino acids. In unfolded (denatured) proteins, only linear epitopes are recognized and bound by the detection agent. Since the protein is in an unfolded state before contacting the detection agent, the non-contactable epitope is typically a linear epitope.
[0063]
A “blocker” is an epitope that prevents the epitope from binding to a detection agent (but not always an antibody, for example) by binding to the epitope, for example, or at an amino acid side chain group within a linear epitope. Refers to a substance that reduces the reactivity of the epitope by modifying and eliminating the reactivity of. An example of a blocking agent is peroxynitrite. Other examples are methylene, hydrogen peroxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE), epoxides such as conjugitol-B-epoxide and 1,2-epoxy-3- (p-nitrophenoxy) propane, and It seems to contain diazirine. Chemical modifiers that saturate accessible amino acids important for native epitope recognition are most useful in applying epitope protection techniques. Further, the blocking agent can phosphorylate, glycosylate, or otherwise modify the target epitope. Blocking agents can also include peptides, antibodies or antibody fragments that bind to the epitope. The blocking agent must efficiently modify accessible amino acids (eg, modify at least 50%, 75%, 90%, 95% or 99% of accessible amino acids).
[0064]
A “contactable epitope” is a target epitope available for reaction with a blocking agent in the methods of the invention. For example, an epitope that can be contacted is an epitope that can be used for reaction with a blocking agent. After reacting with the blocking agent, the accessible epitope is prevented from binding to the detection agent (after this reaction step, the reacted epitope can be referred to as the blocking epitope).
[0065]
“Antibodies” are intended to include intact antibodies and fragments thereof that specifically react with one or more protein epitopes, such as those of disease-related proteins. Antibodies can be fragmented using conventional techniques, and the fragments are screened for utility in the same manner as described below. For example, F (ab ′) 2 fragments can be generated by treating antibody with pepsin. The produced F (ab ′) 2 fragment can be treated to reduce disulfide bonds to produce Fab ′ fragments.
[0066]
“Aptamer” means a macromolecule, such as a peptide, RNA or DNA molecule, that can specifically interact with a protein or peptide target.
[0067]
An “inaccessible epitope” is a modification of a target epitope by a chemical blocking agent, for example by different misfolding relative to the wild-type polypeptide, by aggregation of misfolded polypeptides, or by post-translational modification of the polypeptide. Impeded or significantly reduced (eg, reduced by at least 50%, 75%, 90% or 95%). In some cases, inaccessible epitopes are converted to accessible epitopes by removing obstacles (eg, misfolding or aggregation) that prevent or significantly reduce the modification of the target epitope by the blocking agent. Inaccessible epitopes that are converted to accessible epitopes can also be referred to as “exposed epitopes”.
[0068]
“Detection agent” refers to a substance that binds to and can be detected by an epitope, such as an antibody specific for an epitope of a prion polypeptide that can be used to probe a sample containing the polypeptide. After the polypeptide is in an unfolded state, the detection agent is used such that the detection agent preferentially binds to an unblocked, unmodified epitope.
[0069]
A “disease-related protein or disease-related polypeptide” is a disease or disorder that differs from the wild-type or non-disease conformation in the regulation or higher order conformation of the polypeptide, including mutants, variants, and polymorphic forms thereof. A polypeptide that is associated with a disordered condition. A disease-related protein or disease-related polypeptide can also be referred to as a non-wild type conformational protein or polypeptide. A regulatory conformation refers to a change in the conformation of the three-dimensional structure of a protein molecule. Higher order conformation refers to a conformational change in the three-dimensional structure of a number of protein molecules aggregated together. Aggregates may consist of one or more different proteins and may bind to non-protein molecules. Wild-type and non-wild-type candidate polypeptides, including disease-related proteins or polypeptides, are expressed in cells (i.e., expressed in bacteria using baculovirus systems, etc.) and in vitro translated sets of polypeptides, etc. Also includes replacement proteins.
[0070]
“Wild-type folded state conformation” refers to the wild-type folded state conformation of a non-disease or non-disordered protein.
[0071]
A “misfolded conformation” refers to the folded conformation of a diseased or disordered polypeptide whose conformation is different from the wild-type conformation. Conformational differences are the result of differential folding. Differential folding can cause protein aggregation.
[0072]
“Wild-type conformation” refers to the conformation of a polypeptide in its normal or normal state or reference or desired state, and can include a non-disease or non-disordered polypeptide.
[0073]
“Non-wild-type conformation” refers to a conformation of a polypeptide that is different from that of a wild-type polypeptide, and may include a conformation of a polypeptide of a disease or disorder that differs from the wild-type conformation. it can. Conformational differences may be the result of differential folding, polypeptide aggregation or differential post-translational modifications compared to the wild-type polypeptide. In the case of polypeptide aggregation, aggregation may interfere with the accessibility of epitopes rather than conformational changes.
[0074]
Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and Parkinson's disease / Lewy body dementia (PD, LBD) pose significant challenges to the aging group and healthcare systems . There are no specific biochemical tests for neurodegenerative diseases as a group (1, 2). Sporadic AD, ALS, and PD / LBD all have an Aβ fragment of amyloid precursor protein (APP) in AD; superoxide dismutase-1 (SOD1) in ALS, and α-synuclein (1) in PD and LBD. Involved in the pathogenic multimer neuronal accumulation of misfolded polypeptides, including fibrils, fibrils, and amorphous aggregates. Similar to prion disease, mutations in genes encoding these agglutinating polypeptides are associated with autosomal dominant familial forms of AD, ALS, and PD. The detection of disease-related misfolded polypeptide aggregates enables specific and sensitive prenatal diagnostic tests for neurodegenerative diseases.
[0075]
For this purpose, the inventors have aggregated in "epitope protection assays" (EPA), tissues that act as "sinks" for aggregates released from dying neurons, and accessible biological fluids such as blood and CSF. Has invented an innovative technique for detecting the polypeptides. In some cases, this method
Reacting the sample with the chemical modifier;
Disaggregating and denaturing the treated polypeptide;
Probing the sample with a detection agent such as an antibody against a specific epitope blocked by a chemical modifier;
Detecting the polypeptide bound to the substance (eg by ELISA).
[0076]
Normal soluble polypeptide in the sample becomes “invisible” during the assay. Because accessible epitopes are not detected by the detection agent (e.g., blocked against antibody recognition), portions of the polypeptides in the aggregate are "protected" from chemical modification by their internal blockade, This is because it can still be detected by a detection agent (for example, by binding to an antibody) after disaggregation.
[0077]
The methods of the present invention have diseases characterized by polypeptide misfolding and / or aggregation, such as those described above, or in other cases that are differentially accessible and have target epitopes in the wild-type protein conformation, It is useful for diagnosing a disease or disorder characterized by a polypeptide.
[0078]
The inventors have shown that treatment of recombinant mouse prion polypeptide (rmPrP) at low pH in the presence of a low concentration of denaturing agent is a misfolded disease-related prion polypeptide isoform PrP. ^Sc We have also found that the polypeptide induces high β-sheet content, implying This transformation of rmPrP is a tyrosine side chain ^Four High solvent accessibility. The inventor has found that treatment of normal brain homogenate with acids and denaturing agents causes PrP to become surfactant insoluble (29). Normal and misfolded PrP ^C In order to probe the surface contact of tyrosine and other residues, normal and acid-treated misfolded human brain tissue was treated with the chemical nitrate compound peroxynitrite. Peroxynitrite treatment of brain tissue caused a decrease in binding of anti-PrP antibodies 3F4 and 6H4 as measured by immunoblotting, immunoprecipitation and ELISA. Peroxynitrite-induced epitope blockade was more pronounced in normal brain PrP than in misfolded PrP, indicating a protective effect on aggregation. Similar findings were observed in normal and scrapie-infected hamster brains where the 3F4 and 6H4 epitopes of PrP in scrapie-infected brain were partially protected from peroxynitrite-induced modification. Immunoprecipitation of peroxynitrite-treated brains with anti-nitrotyrosine antibodies suggests that PrP is nitrified at tyrosine residues or other polypeptides near PrP are nitrified and co-immunoprecipitated with PrP To do.
[0079]
Therefore, the present invention provides PrP ^Sc A method for measuring polypeptide aggregation including but not limited to,
Reacting the sample with a chemically modified substance, where such substance is not limited to peroxynitrite, but may be peroxynitrite;
Deaggregating and / or denaturing a sample chemically modified by heat, surfactant, or chaotropic agent;
And probing with an antibody specific for the epitope of the prion polypeptide.
[0080]
Furthermore, the inventor has shown that the method of the present invention is useful for detecting Alzheimer's disease protein.
[0081]
In one embodiment, the method of detecting Alzheimer's disease comprises:
Samples of polypeptides (samples are typically all or part of a disease-related protein or polypeptide, such as amyloid precursor polypeptide or amyloid β or tau and / or the corresponding wild-type polypeptide, and often Reacting with a chemical modifier that modifies the exposed epitope, typically a blocking agent such as peroxynitrite, so that they cannot bind to the detection agent. ,
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the polypeptide contained an inaccessible target epitope prior to disaggregation and / or denaturation.
[0082]
Aβ-containing blood vessels or plaque filaments are trisomy 21 (Down syndrome), hereditary cerebellar hemorrhage and amyloidosis (HCHWA) -Dutch type, and normal brain aging (Mori, H et al., JBC (1992) 267: 17082-86) It is also related to the state. Thus, in one embodiment, detection of Aβ disease-related protein is indicative of disease HCHWA-Dutch type or normal brain aging.
[0083]
Furthermore, the methods of the present invention can be confirmed in combination with other diagnostic methods such as magnetic resonance imaging (MRI) or computed tomography (CT) scans.
[0084]
The methods of the invention are useful for detecting proteins or polypeptides comprising targets that exist in more than one conformation in which one or more target epitopes are hidden in at least one conformation .
[0085]
Therefore, the present invention
Reacting the polypeptide with a chemical modifier (typically a blocking agent) defined to modify exposed epitopes such that they cannot bind to the detection agent;
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the polypeptide contained a target epitope that was inaccessible to the chemical modifier prior to disaggregation and / or denaturation. Including detection methods.
[0086]
This result indicates whether the polypeptide contains an inaccessible epitope that is indicative of the type of polypeptide present (ie, wild type protein or non-wild type protein).
[0087]
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope reacted with a blocking agent is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation,
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting the polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate Including the step of indicating that the polypeptide was in a non-wild type conformation and wherein the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicates that the polypeptide was in the wild type conformation. .
[0088]
In another application, the invention is a method of detecting a uniquely modified polypeptide, wherein the modification protects a target epitope from reaction with a detection agent,
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein the target epitope is accessible and blocking agent in one of the non-wild type conformation or the wild type conformation In other conformations, the target epitope is inaccessible and does not react with the blocking agent;
Reacting the sample with a substance that removes the unique modification from the target epitope of the uniquely modified polypeptide;
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
And probing with a detection agent such as an antibody against the target epitope to determine whether the candidate polypeptide is a uniquely modified polypeptide.
[0089]
Chemical modifier
The chemical modifiers of the present invention can be any chemistry that modifies the target epitope residues so that the epitope is invisible (i.e., not detected by the detection agent or decreased detection) by the method of the present invention. Contains substances (including biological substances). For example, peroxynitrite preferentially modifies tyrosine, serine, methionine, histidine and tryptophan, and cysteine and other amino acids (25, 26). DEPC preferentially modifies histidine (37) and succinic anhydride preferentially modifies residues containing amines. Epoxides, including conjugitol-B-epoxide and 1,2-epoxy-3- (p-nitrophenoxy) propane, are used for “suicidal inhibition” of carboxyl side chains such as catalytic residues of aspartyl protease It is a reactive group widely used in (19, 20). Hydrogen peroxide and methylene are also useful. These chemicals can modify the target epitope by oxidizing, nitrifying, reducing, or otherwise modifying the epitope. In addition, the epitope can be modified by chemical modifiers that are phosphate groups (by phosphorylation) or glycosyl groups (by glycosylation) and / or other chemical groups that mask the target epitope.
[0090]
Thus, in one embodiment, the chemical modifier is peroxynitrite, DEPC, hydrogen peroxide, succinic anhydride, methylene and epoxide (conjugitol-B-epoxide and 1,2-epoxy-3-) p-nitrophenoxy. ) Selected from the group of propane and / or related variants thereof.
[0091]
After reaction with the candidate polypeptide, the chemical modifier is removed. The method steps of the invention listed herein with respect to removal of the blocking agent typically include physically, chemically, or otherwise removing the blocking agent from the candidate polypeptide to prevent further reaction. This will be readily apparent to those skilled in the art. Removal may optionally be allowed to elapse for a sufficient amount of time so that the blocking agent is removed from the candidate polypeptide by consumption or degradation (e.g., so that the blocking agent is in an inactive or oxidized state). Including. Removal optionally includes adding a compound to react with any excess blocking agent to inactivate it. Removal may optionally be physical filtration of the blocking agent by conventional filtration techniques, or centrifugation to separate the candidate polypeptide and blocking agent, or the blocking agent or candidate polypeptide and the immobilized support in the column. Also included is physical association with a support useful for removing the blocking agent, such as by attachment.
[0092]
Removal includes, for example, physically or chemically inactivating the blocking agent, not contacting the blocking agent with the sample containing the candidate polypeptide, or a sufficient amount of time for the blocking agent to be consumed or degraded. By passing, it is meant to prevent further reaction by the blocking agent.
[0093]
Chemical modification of the target epitope results in masking of the epitope for antibody recognition. In one embodiment, treatment with a blocking agent, such as peroxynitrite, results in the destruction of the epitope on the monomeric protein rather than on an aggregated protein, such as a non-wild type polypeptide or disease associated protein.
[0094]
Preprocessing
The method of the present invention also contemplates pre-treating the sample to enhance EPA detection. For example, if low detection of aggregated proteins such as prions is observed in blood or urine, a pre-clarification strategy is readily used to obtain detergents, precipitants, and adsorbents, e.g. Detection is enhanced using those typically used in commercially available ELISA assays. Polypeptide samples can also be pretreated with substances such as surfactants or guanidine or heat. Eventually, the sample can be concentrated or preliminarily by methods such as centrifugation. Thus, in one embodiment, the sample is pretreated before using the method of the present invention.
[0095]
Detection of misfolded or aggregated proteins and polypeptides
The inventor has developed a method for detecting a polypeptide having a target epitope in which one conformation is accessible to a detection agent and the other conformation is inaccessible by modification of the inaccessible epitope by a modifying agent. Have discovered. The inventor has identified several epitopes that are useful as target epitopes in the methods of the invention. Other target epitopes are identified as described below.
[0096]
Target epitope
Epitopes that can identify target epitopes of polypeptides that exist in more than one conformation and can be detected by detection agents such as antibodies, aptamers, or peptides are accessible in one conformation and other conformations Contact is impossible in the conformation. An epitope is a target epitope if it is known that the epitope is blocked from detection by the blocking agent in one conformation of the polypeptide. To identify the target epitope, a detection agent such as an antibody is selected. Where the detection agent is an antibody, it is preferably a monoclonal antibody, although polyclonal antibodies can also be used. Epitopes that can be linear or non-linear epitopes and are specifically recognized by antibodies are epitopes that are known in some cases. Select candidate chemical modifiers such as peroxynitrite. If the epitope recognized by the detection agent is known, the candidate chemical modifier is preferably selected based on its ability to modify amino acid residues in the target epitope. For example, peroxynitrite preferentially modifies tyrosine and histidine residues and modifies cysteine and other amino acids to some extent. If tyrosine and / or histidine is present in the target epitope, peroxynitrite is optionally selected as a chemical modifier. An aliquot of the sample containing the wild-type polypeptide and an aliquot of the sample containing the non-wild-type polypeptide are reacted with a high concentration of the selected chemical modifier. Each sample includes one or more of a recombinant polypeptide, a cell extract or a tissue sample known to express a polypeptide in either a wild type or non-wild type conformation. Polypeptide samples preferably have similar polypeptide concentrations. Alternatively, a non-wild-type conformation polypeptide sample is obtained by treating a wild-type conformation polypeptide with a substance such as an acid that induces conversion to the non-wild-type conformation.
[0097]
Each sample of polypeptide is denatured and / or disaggregated to convert any inaccessible putative target epitope into a accessible target epitope. Each sample of the polypeptide is then contacted with a selected detection agent. Detection is performed using techniques known in the art such as ELISA and Western blotting. The amount of signal generated by the detection agent for a sample containing a wild-type conformation polypeptide treated with a protective agent and the detection agent for a sample containing a non-wild-type conformation polypeptide treated with a protection agent Compare the amount of signal. The difference in detection at one or more concentrations of chemically modified substances indicates that one conformational epitope is protected, further indicating that the epitope is the target epitope. Differences in a range of chemical modifier concentrations indicate that the target epitope is useful for EPA. This process is repeated using different blocking and / or detection agents to identify the target epitope. Typically, the blocker is standardized and titrated to produce methylene ^24,25 Experiments are performed using “common” chemical modifiers such as, which in some cases produce more uniform and complete protection of the target epitope.
[0098]
Thus, in one example, identifying a target epitope in a polypeptide having two or more conformations, one conformation being accessible to the detection agent and the other conformation being inaccessible How to
Reacting a sample comprising a polypeptide in a wild-type conformation and a sample comprising a polypeptide in a non-wild-type conformation, typically with one or more concentrations of a chemical modifier;
Denaturing and / or disaggregating each sample to convert any inaccessible target epitope to a accessible target epitope;
Contacting the sample with a detection agent;
The signal generated by the detection agent for a sample containing a wild-type conformation polypeptide treated with a chemical modifier and the detection agent for a sample containing a non-wild-type conformation polypeptide treated with a chemical modifier The step of comparing the signal produced, wherein the difference in detection between the sample containing the wild-type polypeptide and the sample containing the non-wild-type sample indicates that one conformational epitope is protected, Further indicating that the epitope is a target epitope.
[0099]
EPA requirements
Titration experiments using peroxynitrite, hydrogen peroxide and methylene (based on photodegradation of the precursor diazirine with UV light) or other modifiers are useful to improve the conditions for epitope protection.
[0100]
Samples known to contain two or more conformational polypeptides containing disease-related proteins are optionally reacted using immunoblotting and ELISA. In each case, a sample is prepared, optionally mixed with a high concentration of modifier and processed, for example, by immunoblotting, ELISA and / or time-resolved fluorescence. This defines the type and concentration of chemicals and allows the greatest contrast between monomeric proteins and aggregated proteins, including disease-related proteins. Other information-providing experiments include recombinant disease-related (non-wild type) proteins (such as acid-treated prion proteins listed in this application, or mutant p53 proteins, and other proteins), and disease-related proteins The use of normal (wild type) protein instead of sample can be included.
[0101]
In some cases, disease-related proteins may have different properties with respect to chemical modification than do recombinant disease-related proteins, and one sample type (such as brain tissue) of disease-related proteins It may exhibit different chemical modification properties than circulating disease-related proteins or disease-related proteins detectable in urine. Using known techniques, one skilled in the art will readily ascertain the optimal conditions for endogenous prions.
[0102]
EPA achieves excellent commercial utility by detecting disease-related proteins in biological tissues and body fluids, and there is currently no technology for that. Some disease-related proteins are very small. For example, prions are very small (10-100 prions / mL by bioassay), and protease-resistant PrP in urine can only be detected intermittently / sporadicly by precipitating large amounts of body fluid. In addition, all promising blood tests have high concentrations of wild-type proteins (i.e. (typically PrP ^Sc Of 10 ⁶ (PrP) ^C ), And “blocking” by heterologous plasma proteins must be addressed. Using an optimized chemical modification method and the DELFIA-TRF system, the threshold of sensitivity for EPA in blood and urine is optionally measured using:
1. Plasma and urine of “contaminated” animals and humans by titration of disease-related proteins;
2. Plasma and urine from model disease animals that express disease-related proteins.
[0103]
Biological fluids that are clinically available by non-invasive routes provide a substrate for practical prenatal testing to diagnose and screen for diseases associated with disease-related proteins that aggregate in humans and animals. The method of the present invention is also useful in postmortem testing. Those skilled in the art will recognize the same disease-related protein in the buffer by EPA using “disease-related protein contamination” titration in normal blood and urine, indicating that EPA is not affected by “blocking factors” in these biological fluids. Easily determine whether a DELFIA-TRF signal equivalent to the titration of is evident. Preferential “blocking” of disease-related proteins by heterologous proteins can actually increase epitope protection against chemical modifiers. If low detection of disease-related proteins in the blood or urine is detected, an interface typically used in, for example, commercially available ELISA assays known to those skilled in the art can be used easily in advance. Activators, precipitants, and adsorbents are used to enhance detection of disease-related proteins.
[0104]
In one embodiment, the methods of the invention relate to the detection of target epitopes in misfolded or aggregated polypeptides. In other embodiments, the invention provides methods for improving or optimizing the detection of polypeptides that can exist in more than one conformation. In other embodiments, detection of misfolded and / or aggregated polypeptides indicates a disease (disease associated protein). In other embodiments, the polypeptide is detected using a detection agent such as an antibody, aptamer or peptide that specifically binds to an epitope of the polypeptide that can be chemically modified. In other embodiments, these polypeptides are disease-related proteins. Antibodies against epitopes of candidate proteins are commercially available antibodies or are readily prepared by those skilled in the art and include antibody fragments and single chain antibodies. Any of the foregoing methods are readily implemented using the steps described in this application.
[0105]
antibody
The present invention contemplates the use of known antibodies as binding agents, including biotin 3F4 and 3F4 and 6H4, which recognize prion disease associated proteins. 3F4 is MKH M Reacts to the epitope and 6H4 reacts to the DYEDRYYRE epitope. Furthermore, 6E110 that recognizes Aβ reacts to the EFRHDS epitope (residues 3-8).
[0106]
Other antibodies and recognized epitopes (if known) that are optionally used with the methods of the invention are listed in the following table.
[0107]
[Table 1]

[0108]
Antibodies against epitopes of disease associated proteins are prepared using techniques known in the art. For example, polyclonal antisera or monoclonal antibodies are made using standard methods by using a peptide of a disease associated protein containing a putative target epitope. A mammal (eg, a mouse, hamster, or rabbit) can be immunized with an immunogenic peptide that induces an antibody response in the mammal. Techniques for conferring immunogenicity to peptides include conjugation with carriers or other techniques well known in the art. For example, the protein or peptide is administered in the presence of an adjuvant. The progress of immunization can be examined by detecting antibody titers in plasma or serum. Standard ELISA or other immunoassay procedures are optionally used with the immunogen as the antigen to assess antibody levels. After immunization, antisera can be obtained and polyclonal antibodies can be isolated from the serum if desired.
[0109]
To produce monoclonal antibodies, antibody-producing cells (lymphocytes) are sometimes collected from the immunized animal and fused with myeloma cells by standard somatic cell fusion procedures, thereby immortalizing these cells. To generate hybridoma cells. Such techniques are well known in the art (e.g., the hybridoma technique originally developed by Kohler and Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)), and the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., Immunol Today 4, 72 (1983)), EBV-hybridoma technique for producing human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc, pages 77-96), and combinatorial antibodies Library screening (other techniques such as Huse et al., Science 246, 1275 (1989)). Hybridoma cells can be screened immunochemically for the production of antibodies that react specifically with the peptide, and monoclonal antibodies can be isolated.
[0110]
Chimeric antibody derivatives, ie, antibody molecules that combine a non-human animal variable region and a human constant region are also contemplated as being within the scope of the present invention. A chimeric antibody molecule comprises, for example, an antigen binding domain from a mouse, rat, or other type of antibody, and a human constant region. Conventional methods used to generate chimeric antibodies comprising immunoglobulin variable regions that recognize epitopes of the disease-related proteins of the present invention (eg, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567; Boss et al., US Pat. No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496; European Patent Publication 0173494, British Patent GB2177096B).
[0111]
These specific antibodies, or antibody fragments, have peptides generated from nucleic acid molecules of disease-related proteins, including but not limited to single chain Fv monoclonal antibodies reactive to epitopes of disease-related proteins It is readily generated by screening an expression library that encodes an immunoglobulin gene expressed in bacteria, or a portion thereof. For example, complete Fab fragments, VH regions and FV regions are expressed in bacteria using phage expression libraries (eg Ward et al., Nature 341, 544-546: (1989); Huse et al., Science 246, 1275 ~ 1281 (1989); and McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)). Alternatively, ScID-hu mice, such as models developed by Genpharm, are used to produce antibodies or antibody fragments.
[0112]
Antibodies that react specifically with epitopes or derivatives of disease-related proteins, such as enzyme conjugates or labeled derivatives, are useful for detecting epitopes of disease-related proteins in various samples (eg, biological materials). These are useful as diagnostic or prognostic reagents to detect abnormal levels of protein expression, or structural abnormalities, and / or transient, tissue, cell, or subcellular locations of disease-associated protein epitopes Easy to use. In vitro immunoassays are also useful for evaluating or investigating the effectiveness of individual therapies. Expression of genes for polypeptides present in more than one conformation, such as disease-related proteins in cells engineered to produce disease-related proteins using the antibodies of the invention in vitro. The level can also be measured.
[0113]
Antibodies are useful in any known immunoassay that relies on binding interactions between antigenic determinants of disease-associated protein epitopes and antibodies. Examples of such assays are radioimmunoassays, enzyme immunoassays (eg, ELISA including sandwich ELISA), immunofluorescence, immunoprecipitation, latex agglutination, hemagglutination, and histochemical tests. Antibodies are useful for detecting and quantifying disease-related proteins in a sample, measuring their role, and diagnosing diseases caused by disease-related proteins.
[0114]
In particular, the antibodies of the present invention may be used to detect disease-related proteins, to localize them to individual cells and tissues, and to specific subcellular locations, and to quantify the level of expression, such as cells and sub- Useful in immunohistochemical analysis at the cellular level.
[0115]
Cytochemical techniques known in the art for localizing antigens using light and electron microscopy to detect polypeptides such as disease-related proteins. In general, the antibodies of the present invention are optionally labeled with a detectable substance, and the recognized polypeptide is localized in tissues and cells based on the presence of the detectable substance. Examples of detectable substances include: Radioisotopes (e.g., ^Three H, ¹⁴ C, ³⁵ S, ¹²⁵ I, ¹³¹ I), fluorescent labels (e.g. FITC, rhodamine, lanthanide phosphors), luminescent labels such as luminol; enzyme labels (e.g. horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase), biotinyl groups (labeled avidin, For example, streptavidin containing a fluorescent marker, or enzymatic activity that can be detected optically or colorimetrically), a predetermined polypeptide epitope recognized by a secondary reporter (e.g., leucine zipper pair sequence, Secondary antibody binding sites, metal binding domains, epitope tags), but are not limited to these. In some embodiments, labels are attached through spacer arms of various lengths to reduce possible steric hindrance. The antibody can also be bound to a high electron density material such as ferritin or gold colloid that is readily visible by electron microscopy.
[0116]
The antibody or sample can be immobilized on a carrier or solid phase carrier that can immobilize cells, antibodies, and the like. For example, the carrier or solid phase carrier can be nitrocellulose or glass, polyacrylamide, gabbro, and magnetite. The carrier material may have any conceivable shape including a sphere (e.g., a bead), a cylinder (e.g., the inner surface of a test tube or well, or the outer surface of a rod), or a flat (e.g., a sheet, a specimen). it can. Indirect methods of amplifying the primary antigen-antibody reaction by introducing a secondary antibody that has specificity for an antibody that is reactive against an epitope of a disease-related protein can also be used. For example, if the antibody having specificity for a polypeptide epitope such as an epitope of a disease-related protein is a rabbit IgG antibody, the secondary antibody is a goat anti-rabbit labeled with a detectable substance similar to that described herein. It may be gamma globulin.
[0117]
When radiolabels are used as detectable substances, disease associated proteins can be located by autoradiography. Autoradiographic results can be quantified by measuring the density of the particles in the autoradiograph by various optical methods or by counting the particles.
[0118]
Aptamer
Aptamers are also useful in the methods of the invention to detect polypeptides such as disease-related proteins. Aptamers are macromolecules that can recognize targets such as proteins with high specificity and sensitivity.
[0119]
Nucleic acid aptamers are small molecules isolated from combinatorial libraries by a procedure named systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) (reviewed in Cerchia L et al., FEBS Letters 528 (2002) 12-12). This technique can be used to identify aptamers that bind to proteins with high target specificity and selectivity. Its affinity is comparable to antibody-antigen interaction. Differences between native and denatured proteins have been shown (Bianchini et al., Immunol Methods (2001) 252: 191-97), and aptamers are useful detection agents for the methods of the present invention.
[0120]
Peptide aptamers, also known as paptamers, thioredoxin insertion proteins or pertubagens, are artificial proteins whose insertion peptides are expressed on solvent-exposed surfaces of structurally stable proteins that act as scaffolds (Crawford M et al., Brief Funct Genomic Proteomic.2003 Apr; 2: 72-9). Peptide aptamers can work in the same way as antibodies and have dissociation constants comparable to antibodies, sometimes better than antibodies. They can be used to probe proteins immobilized on nitrocellulose (Crawford M et al., Brief Funct Genomic Proteomic. 2003 Apr; 2: 72-9). Peptide aptamers have been shown to exhibit different affinities for small changes, such as differences in one amino acid, and peptide aptamers have two or more conformations, such as disease-related proteins that exhibit different folding or aggregation conformations. It is useful for detecting polypeptides present in conformation.
[0121]
Thus, in one embodiment of the invention, nucleic acids and / or peptide aptamers are used with the methods of the invention to distinguish between wild type and disease-related conformational proteins. In one embodiment, the disease associated protein is a prion protein. In other embodiments, the disease associated protein is amyloid-β. In other embodiments, the disease associated protein is a tau protein. In other embodiments, the disease associated protein is α-synuclein. In other embodiments, the disease associated protein is SOD-1.
[0122]
Denaturation and disaggregation
In the methods of the invention, the polypeptide is optionally modified, for example, by denaturing the polypeptide using heat, surfactants and / or chaotropic agents. The polypeptide is optionally modified by treatment with a disaggregating agent to disaggregate the polypeptide from other polypeptides of the same type and from other molecules, the disaggregating agent comprising chaotropic agents, surfactants and Optionally selected from at least one of the group consisting of heat. Chaotropic agents can include, but are not limited to, guanidine salts, urea, thiourea and the like.
[0123]
We have shown that treating proteins with guanidine hydrochloride increases the amount of detectable protected protein.
[0124]
A combined deagglomeration method can result in optimal deagglomeration. For example, by boiling a sample in sodium dodecyl sulfate (SDS; also known as sodium lauryl sulfate) loading buffer, the solubility of polypeptides such as disease-related proteins can be increased and interact with detection agents. The epitopes available for action can be increased. For example, boiling a sample in SDS loading buffer results in increased solubility and allows detection of protected epitopes by sandwich ELISA. When samples are boiled in SDS loading buffer after peroxynitrite treatment, the sandwich ELISA assay system can identify aggregated disease-related proteins in tissue homogenate samples. At peroxynitrite concentrations above 8 mM, there is 2.5 to 3 times more detected PrP in the acid-treated sample compared to the mock-treated sample. Thus, in one embodiment, the sample is boiled in SDS loading after treatment with the modifying agent and before detection with a detection agent such as an antibody.
[0125]
Time-resolved fluorescence (TRF) two-point ELISA and Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorolmmunoassay (DELFIA)
As previously mentioned, ELISA techniques can be used with the method of the present invention. The time-resolved fluorescence two-point ELISA using Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorolmmunassay (DELFIA) technology is 1000 times more sensitive than conventional ELISA techniques and can be used in conjunction with the method of the present invention to generate neurons in an in vitro, neurodegenerative transgenic mouse model. Polypeptides that aggregate in tissues and in brain samples of human AD, ALS, PD and LBD patients can be detected.
[0126]
The DELFIA assay measures the output signal using chelated lanthanide labeled tracers such as europium (Eu) and time-resolved fluorophore (TRF) (33). The advantage of lanthanide chelates is that their fluorescence is strong, lasts up to 200,000 times longer than conventional phosphors, and allows signal capture after non-specific interfering fluorescence decays (its luminescence is relatively long-lived). This is especially important for biological samples that may have a short and very unique fluorescence). The DELFIA-based system can measure as little as 100 fmol / Eu well (33).
[0127]
In one embodiment of the present invention, chemically modified substances and antibodies are combined in a sensitive capture-detection “sandwich” 96-well plate DELFIA TRF system with Aβ, tau, SOD1, huntingtin, α-synuclein, islet amyloid poly Used in the detection of aggregated disease-specific proteins described herein such as peptides, resistin and p53.
[0128]
Two-point EPA increases specificity for the detection of proteins sequestered in aggregates of clinical samples. In one embodiment, two or more chemically modifiable epitopes are present in each test polypeptide, which would increase the specificity of diagnostic tests using this technique (e.g., use in a two-point ELISA). It is. In one embodiment, the chemically modifiable epitope is modified by the same chemical entity. In other embodiments, the epitope is modified by one of two or more different chemical entities. The modified epitopes can be recognized by the same antibody, or they can be recognized by two or more different antibodies. For clinical and commercial applications, EPA must be sensitive and specific for polypeptides that aggregate in vitro and in vivo. Using optimal antibodies and chemical modification methods, the DELFIA-TRF system EPA ^Five ~Ten ⁶ Individual molecules can be detected. If these aggregates are similar in size to the prion protein aggregates in the disease, this may correspond to a single polypeptide aggregate (35, 36).
[0129]
Thus, in one embodiment, the DELFIA-TRF system EPA can be used to identify even very small amounts of disease associated proteins, even one polypeptide aggregate.
[0130]
Diagnostic and screening applications
Efficient, effective and inexpensive diagnostic and screening strategies for prenatal diagnosis of human neurodegenerative diseases are urgently needed in view of continuous financial pressure on the aging group and healthcare systems. EPA gains clinical utility by detecting polypeptide aggregates in relevant and accessible biological tissues and fluids, and there is currently no technology for that. In one embodiment, the method of the invention is used to diagnose an individual having a disease-related protein-related disease. In one embodiment, the invention is used to diagnose an individual having a neurodegenerative disease. In another embodiment, the invention is used to diagnose an individual having a neurodegenerative disease selected from the group comprising prion related diseases, AD, HD, ALS and PD. In other embodiments, the methods of the invention are used postmortem to determine whether an individual had a disease-related protein-related disease.
[0131]
The method of the invention is used to detect whether a human has a disease-related protein-related disease. In other embodiments, the methods of the invention are used to detect whether a non-human animal has a disease-related protein-related disease. In other embodiments, the non-human animal is one of a group comprising cattle, sheep and deer. In other embodiments, the methods of the invention are used to detect whether a livestock has a disease-related protein-related disease.
[0132]
In one embodiment, the methods of the invention are used to detect disease associated proteins in a biological sample. Biological samples can include biological fluids such as CSF, serum, blood, tears, peritoneal exudate, or urine, or tissue samples such as biopsy or brain tissue. In one embodiment, the sample is a prenatal sample. In other embodiments, the sample is a post-mortem sample.
[0133]
The methods of the present invention are useful for quantifying the detection of soluble forms of disease associated proteins such as Aβ, tau, SOD1, huntingtin, α-synuclein, islet amyloid polypeptide, resistin and p53 protein.
[0134]
In other embodiments, EPA is used to detect aggregates in homogenates from CRND8 (human mutant APP), mouse brain and CSF (34), and G93A human mutant SOD1 transgenic mice (13). Measure the sensitivity and specificity.
[0135]
In other embodiments, the present invention is used to detect aggregates in homogenates from normal (treated and untreated, low pH) and frozen human brain in disease states (AD, ALS, PD, LBD). Measure sensitivity and specificity.
[0136]
In one embodiment, the methods of the invention are used to ensure a preparation from mammalian blood or tissue, or a related process in which mammalian blood or tissue in contact with the preparation does not contain disease-related proteins. In one embodiment, the preparation is a pharmaceutical product. In other embodiments, the preparation is a vaccine. In other embodiments, the preparation is a cosmetic product. In one embodiment, the preparation is tested for prion protein. In other embodiments, the preparation is tested for amyloid-β. In other embodiments, the preparation is tested for tau protein. In other embodiments, the preparation is tested for α-synuclein. In other embodiments, the preparation is tested for SOD-1.
[0137]
In other embodiments, blood and blood products (e.g. blood fractions such as plasma, compounds isolated or manufactured from blood) for use in blood transfusions or other medical procedures related to disease-related proteins using the methods of the invention. ). In other embodiments, the invention is used to screen organ transplants for disease-related proteins. In one embodiment, the preparation is screened for prion protein. In other embodiments, the preparation is screened for amyloid-β. In one embodiment, the preparation is screened for tau protein. In another embodiment, the preparation is screened for α-synuclein. In other embodiments, the preparation is screened for SOD-1.
[0138]
The present invention is also useful to ensure that the food source does not contain disease-related proteins. In other embodiments, the methods of the invention are used to test food products from mammals such as meat and meat products and dairy products. Foods that may have contaminated nerve tissue (such as `` mechanically separated meat '' and meat fragments containing dorsal root ganglia or other nerve tissue) are very suitable for screening for prion contamination. is important.
[0139]
Instruments used for invasive procedures can also be a source of transmitted disease. In one embodiment, instruments used for medical and surgical procedures are tested for the presence of disease-related proteins using the methods of the invention. In other embodiments, instruments used for dental hygiene are tested for the presence of disease-related proteins.
[0140]
In other embodiments, the present invention provides methods for ensuring that decontamination methods for removing disease-related proteins and disease-related protein-containing tissues are successful. In one embodiment, the method of the present invention is used to evaluate a decontamination procedure within a meat processing plant. In other embodiments, the methods of the present invention are used to assess decontamination within a food processing plant. In other embodiments, instruments used for surgery or dental surgery are tested for the presence of disease-related proteins.
[0141]
Application example of prognosis
Prion protein converters, Alzheimer's disease-related polypeptides or other disease / disorder-related polypeptides are regularly examined in subjects over time (e.g., first time, and at least one week or at least one month of the first time). (Second time later), e.g. high or low levels of PrP in the subject ^C Or high or low level PrP ^Sc Can be identified. The method of the present invention comprises subject PrP ^C Or PrP ^Sc It is also useful to measure levels to determine a subject's responsiveness to drug therapy. A low level of prion protein in the subject over time indicates a positive response to drug therapy. The same method is used for other disease or disorder related proteins.
[0142]
Since many neurodegenerative diseases are associated with aggregated proteins, similar methods are used for amyotrophic lateral sclerosis (superoxide dismutase 1), Alzheimer's disease (amyloid β), Parkinson's disease (α-synuclein), Huntington's disease. (Huntingtin), cancer (p53), diabetes (e.g., islet amyloid polypeptide and resistin), and other diseases associated with abnormal protein folding, aggregation or post-translational modifications Useful for these diseases and their aggregated proteins. Such tests are useful in spinal fluid and other body fluids and peripheral blood. In Alzheimer's disease, the aggregation state of amyloid β peptide is determined using monoclonal antibody 6E10 and anti-6E10 or anti-4G8 antibody (detection agent) known in the art, for example, using the methods described in this application. It is optionally examined by measuring the accessibility of two epitopes detected by 4G8, as well as other amyloid β epitopes.
[0143]
Identification of prion conversion inhibitors
Since the present invention is useful for detecting differences between polypeptides, the present invention further provides that candidate compounds may be a prion conversion or other disease or disorder related polypeptide, such as amyloid β, tau and APP, muscle in Alzheimer's disease, Inhibits or stabilizes formation of SOD1 in amyotrophic lateral sclerosis, α-synuclein in Parkinson's disease and Lewy body disease, huntingtin in Huntington's disease, islet amyloid polypeptide and resistin in diabetes, and p53 in cancer An assay for assessing whether or not The invention further includes compounds for inhibiting or stabilizing prion conversion (or conversion of other disease or disorder related polypeptides) identified by the methods described in this application. Intermediate prion protein substrate or PrP ^Sc Low protein conversion to (or other disease or disorder-related polypeptide) indicates that the candidate compound is useful for treating prion disease.
[0144]
The assay of the present invention screens candidate compounds so that they are PrP ^Sc It is useful to determine whether to inhibit formation (or formation of other disease or disorder related polypeptides from wild type protein). The protein is contacted with the candidate compound in vivo or in vitro and then used in the methods of the present invention so that the wild type protein is PrP ^Sc Or PrP ^Sc Can be determined whether has been converted to a wild-type protein. Similar methods are used for other disease or disorder related polypeptides. Recombinant proteins are useful for identifying aggregation inhibitors.
[0145]
Therefore, the present invention provides PrP ^Sc (E.g., from wild-type protein or intermediate to PrP ^Sc A method for identifying a substance that inhibits prion protein conversion)
Reacting the polypeptide with a candidate substance; and
Using the method of the present invention, the protein is PrP ^Sc There is also provided a method comprising the step of determining whether or not
[0146]
A similar method is sometimes performed to stabilize the wild-type prion state or PrP ^Sc To identify compounds that block reversible PrP isoform conversion.
[0147]
The present invention provides for conversion to a disease or disorder related polypeptide (e.g., conversion from a wild-type protein to amyloid β, tau or APP protein in Alzheimer's disease and other proteins and disease related proteins described in this application). A method for identifying an inhibitory substance, comprising:
Reacting the polypeptide with a candidate substance; and
Also provided is a method comprising determining whether the protein of the present invention has been converted to amyloid β or APP protein in Alzheimer's disease.
[0148]
Another aspect of the present invention is PrP ^Sc A method of identifying a substance that reverses formation,
Reacting the polypeptide with a candidate substance; and
Using the method of the present invention, PrP ^Sc Determining whether or not has been converted to a wild-type protein.
[0149]
Another aspect of the invention is a method for identifying a substance that reverses amyloid β or APP protein formation in Alzheimer's disease, comprising:
Reacting a polypeptide with a candidate substance;
Using the method of the present invention to determine whether the amyloid β or APP protein in Alzheimer's disease has been converted to a wild type protein.
[0150]
The same method is used for other polypeptides related to the diseases and disorders described in this application.
[0151]
Biological samples and commercial libraries can be tested for substances such as proteins or small organic molecules that bind to proteins. The inhibitor is preferably directed to a specific domain of a disease-related protein such as a prion protein. In order to obtain specificity, inhibitors must target the unique sequence and / or conformational characteristics of disease-related proteins.
[0152]
Protein conformation detection
The present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is a non-wild-type conformation polypeptide or a wild-type conformation polypeptide,
Contacting the candidate polypeptide with a blocking agent;
Determining whether the target epitope is inaccessible or accessible to chemical modification with a blocking agent.
[0153]
The accessibility or inaccessibility of the target epitope indicates whether the candidate polypeptide is a non-wild-type conformation polypeptide or a wild-type conformation polypeptide. This is because the target epitope can be contacted in one of the non-wild type protein and the wild type protein. For other polypeptides, the target epitope is inaccessible.
[0154]
In one embodiment, the present invention is a method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation comprising:
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein the target epitope is accessible and blocked in one of the non-wild type or wild type conformations Reacting with the agent, and in other conformations, the target epitope is inaccessible and cannot react with the blocking agent;
Removing unreacted blocker from contact with the polypeptide (e.g., by consuming or degrading the blocker in a sample containing the candidate polypeptide, or by physical or chemical removal methods);
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is converted Previously, the candidate polypeptide indicated that the target epitope was in a conformation where the target epitope was inaccessible, and the lack of binding between the detection agent and the target epitope indicated that the polypeptide had a conformation in which the target epitope was inaccessible. Indicating that the polypeptide was in a wild-type conformation or a non-wild-type conformation.
[0155]
A polypeptide can have more than one conformation. For example, a polypeptide may have a wild-type conformation that is unrelated to disease, benign, misfolded aggregation, or otherwise non-wild-type conformation, and disease-related conformation (i.e. Agglomerate). The methods of the invention can be applied to distinguish each of these conditions by using one or more chemical modifiers and / or one or more detection agents such as antibodies.
[0156]
Detection of uniquely modified polypeptides
The invention also provides a method for detecting a polypeptide present in more than one conformation, wherein one target epitope of the conformation is modified by a unique mechanism. Intrinsic mechanisms can include intracellular and / or post-translational modifications of the polypeptide, such as phosphorylation and / or glycosylation, or modifications resulting from additives used in the method. Intrinsic modifications prevent the target epitope from being hidden from detection by the detection agent. A sample of the polypeptide is reacted with a blocking agent that reacts with an available target epitope in the polypeptide that is not inherently modified. Intrinsic modifications are then removed. For example, if the intrinsic modification is phosphorylation, the polypeptide is treated with a phosphatase that removes phosphorylation and converts an inaccessible target epitope in the previously inherently modified polypeptide to an accessible epitope. The polypeptide is then detected using a detection agent such as an antibody.
[0157]
Thus, in one embodiment, the invention is a method for detecting a uniquely modified target epitope in a polypeptide having more than one conformation, comprising:
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, wherein the target epitope is accessible and blocked in one of the non-wild type or wild type conformations Reacting with the agent, and in other conformations, the target epitope is inaccessible and cannot react with the blocking agent;
Reacting the sample with a substance that removes the unique modification from the target epitope of the uniquely modified polypeptide;
Disaggregating and / or denaturing the polypeptide in the sample;
Probing with a detection agent, such as an antibody against the target epitope, to determine whether the candidate polypeptide is a uniquely modified polypeptide.
[0158]
In one application, the method of the invention can be used to detect whether a polypeptide present in a food product has been chemically modified by a manufacturing process. For example, dairy products can be tested for the presence of formaldehyde used as a bacteriostatic agent. Formaldehyde formylates gamma (2) casein (Pizzano R et al., J. Agric Food Chem (2004) 52: 649-54), obscuring the modified epitope from subsequent detection by detection agents.
[0159]
kit
The methods described herein are optionally performed by using a prepackaged diagnostic kit containing the necessary reagents to perform any of the methods of the invention. For example, a kit typically includes at least one specific nucleic acid, peptide or antibody described herein, which is an individual expressing a protein in a disease-related conformation, eg, for screening and diagnosing a patient. Is advantageously used in a clinical setting for screening and identification. Kit antibodies can include complete antibodies, antibody fragments, single chain antibodies, monoclonal antibodies and / or polyclonal antibodies. The kit optionally also includes at least one chemical for modifying an epitope recognized by the antibody or aptamer. The kit is optionally based on ELISA techniques such as sandwich ELISA and DELFIA, and includes surfactants, precipitating agents (such as phosphotungstic acid), and adsorbents typically used in ELISA techniques and known to those skilled in the art. Can be used. The kit also includes detailed instructions for performing the method of the present invention. The recombinant protein is useful for kit standards.
[0160]
Both of these assays could be adapted and optimized for simple high-throughput formats.
[0161]
The following non-limiting examples are illustrative of the invention.
【Example】
[0162]
(Example 1)
Peroxynitrite reacts differently from PrP in normal and acid-treated or scrapie brain homogenates
When brain homogenate is incubated at pH 3.5 in the presence of guanidine, PrP becomes detergent insoluble and PrP ^Sc Is more susceptible to misfolding with PK resistant isoforms in the presence of (29). This acid-treated PrP is PrP ^Sc It is a “model prion” that is partially misfolded and / or aggregated similar to the properties of When mock (□) and acid-treated (●) brain homogenates were incubated with high concentrations of peroxynitrite and then subjected to immunoblotting, 3F4 (Figs. ) And 6H4 (FIGS. 1B and D) are low in PrP. PrP in acid-treated brain homogenates is protected from modification by peroxynitrite.
[0163]
(Example 2)
PrP in scrapie-infected hamster brain is protected from modification by peroxynitrite
Similar epitope protection phenomena for “model prions” as observed in Example 1 were also observed for authentic disease associated-misfolded prion proteins in scrapie-infected hamster (Ha) brains (FIGS. 2A and B). Like the model prion, Ha ^Sc PrP 3F4 and 6H4 epitopes in brain homogenates are protected from modification by peroxynitrite. "Model Prion" and HaPrP ^Sc It is clear that they share properties that provide protection from chemical modification with peroxynitrite, such as differential misfolding or aggregation.
[0164]
(Example 3)
Aggregation is responsible for reduced peroxynitrite-induced epitope modification of misfolded PrP
To show that acid treatment and scrapie brain epitope protection were due to aggregation, samples were treated with peroxynitrite and then incubated with or without guanidine prior to immunoprecipitation. Treatment of the sample with guanidine dissociates aggregates of PrP (43-45) that protect the polypeptide from modification with peroxynitrite. Incubation of sham-treated brains with 2.5 M guanidine after peroxynitrite treatment did not show an increase in 3F4 and 6H4 epitopes as revealed by immunoprecipitation (Figure 3A lanes 1-4). . However, incubation of peroxynitrite-treated acidic brain homogenate with guanidine resulted in an increase in PrP that could be detected by immunoprecipitation using 3F4 and 6H4 immunobeads (Figure 3A, lanes 5-5). 8). This indicates that guanidine can dissociate acid-treated brain homogenate aggregates and release PrP protected from modification by peroxynitrite. Using other means of dissolving PrP aggregates, boiling the sample in SDS loading buffer resulted in the most observed solubilization to date.
[0165]
(Example 4)
EPA parameter optimization
Titration experiments with peroxynitrite, hydrogen peroxide and methylene (based on photolysis of the precursor diazirine with UV light) or other modifiers identify the following optimal conditions for epitope protection:
1. Use normal hamster and human brain “model prion”, immunoblotting and conventional fluorescence ELISA.
2. Use infectious prions from hamster and human brain, immunoblotting analysis and time-resolved fluorescence.
[0166]
In each case, brain homogenates were prepared, mixed with high concentrations of modifiers and processed as described (immunoblotting and time-resolved fluorescence). This defines the type and concentration of the chemical and allows maximum contrast between monomeric and aggregated proteins. Other informative control experiments include buffer and PrP ^-/- Recombinant hamster PrP in the brain of knockout mice and around normal and scrapie infected brains of mice ^C (Murine PrP is 6H4 + and 3F4-).
[0167]
In some cases, infectious prions may have different properties than “model prions” have in terms of chemical modification, and brain prions are either endogenous prions that circulate in the blood, or in the urine of infected animals. Detectable PrP ^Sc May have different chemical modification properties. Those skilled in the art will readily identify optimal conditions for a true endogenous prion using known techniques.
[0168]
(Example 5)
EPA adapted to fluorescent ELISA system
The epitope protection assay for aggregated PrP was adapted to a fluorescent sandwich ELISA system using 6H4 as capture antibody and 3F4 as detection antibody (FIG. 3B). The sandwich ELISA assay system can identify aggregated PrP in acid-treated brain homogenates only when samples are boiled in SDS loading buffer after peroxynitrite treatment. At peroxynitrite concentrations above 8 mM, 2.5 to 3 times more PrP is detected in the acid-treated sample compared to the sham-treated sample.
[0169]
(Example 6)
Detection of a kind of brain prion
A kind of brain prion is PrP ^Sc Of 10 ^Five ~Ten ⁶ It has been estimated to contain molecules. Recombinant PrP 10 using conventional fluorescence ELISA ⁸ ~Ten ⁹ Detection of individual molecules has been performed. The assay used is about 1000 times more sensitive for the detection of a kind of prion, and the required sensitivity is given by Dissociation enhanced lanthanide fiuoroimmunoassay (DELFIA). DELFIA measures the output signal using chelated lanthanide labeled tracers such as europium (Eu) and time-resolved fluorophore (TRF). The advantage of lanthanide chelates is that their fluorescence time lasts up to 200,000 times longer than conventional phosphors, allowing signal capture after non-specific interfering fluorescence decays (very non-specific fluorescence Particularly important for biological samples that may have). The DELFIA-based system can measure as little as 100 fmol / Eu well, which is 1000 times more sensitive than conventional ELISA assays and detects a kind of prion by EPA. The optimal TRF 96 well plate reader for the DELFIA system is manufactured by Wallac-Victor (Perkin-Elmer) and is used to automate sample analysis.
[0170]
Optimal chemical modifiers and conditions are used to provide a sensitive capture 96-well plate assay for detecting hamsters and human prions using the DELFIA TRF system. Using this:
1. Characterize, optimize, and quantify detection of recombinant prion protein by TRF.
2. Measure the sensitivity of DELFIA-TRF for hamsters and human brain prions.
[0171]
(Example 7)
Detection of prion protein in biological fluids
EPA is a PrP in biological tissues and fluids ^Sc Commercial utility is achieved by detecting and there is currently no technology for that. Blood prions are very small (10-100 prion / mL by bioassay) and protease-resistant PrP in urine can only be detected intermittently / sporadicly by precipitating large amounts of body fluid. In addition, all promising blood tests have high concentrations of PrP. ^C (PrP ^Sc Of 10 ⁶ More than double), and “blocking” by heterologous plasma proteins must be addressed. Using an optimized chemical modification method and the DELFIA-TRF system, the sensitivity threshold for EPA in blood and urine is measured using:
Plasma and urine of “contaminated” hamsters and humans by titration of 1.263K hamster prions;
Plasma and urine from Syrian hamsters infected “endogenous” with 2.263K prion disease.
[0172]
Biological fluids that are clinically available by non-invasive routes provide a practical pre-natal test substrate for diagnosing and screening prion infections in humans and animals. The method of the present invention is also useful in postmortem testing. Those skilled in the art will recognize that EPA using “prion contamination” titration in normal blood and urine is similar to the same prion titration in buffer, indicating that EPA is not affected by “blocking factors” in these biological fluids. Easily determine whether a DELFIA-TRF signal is evident. Interestingly, PrP with heterologous proteins ^Sc The preferential “blocking” of can actually increase epitope protection against chemical modifiers. Detergents typically used in commercially available ELISA assays known to those skilled in the art, if a low detection of prions in blood or urine is detected, easily using a pre-clarified strategy PrP using precipitating agent, and adsorbent ^Sc Increase detection.
[0173]
Human and bovine serum and urine and other body fluids are tested using optimal EPA conditions and compared to samples from human mutants CJD and BSE, respectively. Monoclonal antibody 6H4 recognizes PrP from all related species, but other (commercially available) antibodies lacking the 3F4 epitope are used in the DELFIA TRF system for cattle, sheep and deer. Other antibodies and epitopes useful in the methods described in this application will be readily apparent to those skilled in the art.
[0174]
(Example 8)
Detection of aggregated amyloid β (Aβ) using EPA
Amyloid β peptide (Aβ) is the normal cleavage product of proteolytic processing of amyloid precursor protein (APP). Aβ accumulates in discontinuous plaques in the infected area of the Alzheimer's disease brain and induces neuronal death and gliosis observed in this disease. In contrast to the Aβ region of APP expressed by normal cells, plaque Aβ aggregates and is abundant in the β-sheet structure. Using epitope protection technology, we demonstrated that the 6E10 epitope in the Aβ region of APP has less contact with peroxynitrite modification in Alzheimer's disease brain compared to normal brain (Figure 4, Panel A). Similarly, the 6E10 epitope is partially protected in brain homogenates treated at low pH to induce protein aggregation (Figure 4, Panel B). Aβ1-42 peptides aggregated by overnight incubation at 1 mg / ml in water show significant epitope protection of the 6E10 epitope against peroxynitrite modification compared to soluble non-aggregated Aβ1-42 (Figure 4, Panel) C). Another example of this phenomenon is shown in FIG. 4, panel D, showing normal (◯) and aggregated (●) Aβ1-42, immunoblotted with 6E10 antibody and treated with high concentrations of peroxynitrite.
[0175]
The 6E10 epitope of APP is not available for peroxynitrite modification in AD brain homogenates and normal brain homogenates that aggregate by low pH, but normal untreated brains do not show this protection (Figure 4). , Panels A and B), shows the in vivo intermolecular interactions of APP and Aβ-domain blocking molecules (probably Aβ itself; see 9).
[0176]
Sensitive and specific EPA detection of aggregated Aβ in biological fluids (such as blood and spinal fluid), or protection of Aβ epitopes in APP in cells and tissues, provides a prenatal diagnostic test for Alzheimer's disease. The methods of the invention described in this application are used for this diagnostic test.
[0177]
Detection of aggregated Tau protein by EPA
Dying neurons release intracellular proteins such as tau into the CSF (39) and possibly ultimately into the blood. The Tau test is performed directly on brain samples including Alzheimer patient samples and control brains.
[0178]
(Example 9)
Detection of aggregated superoxide dismutase-1 (SOD1) by EPA
SOD1-containing cytoplasmic inclusions are found in many disease state motor neurons from familial and sporadic ALS patients (15), and in most transgenic mice (16, 17) and tissue culture (18) models of this disease Detected. Human SOD1 can aggregate in vitro. Other SOD1 can be modified by succinic anhydride and DEPC. This property can be exploited by EPA technology to distinguish between aggregated and non-aggregated SOD1 proteins.
[0179]
SOD1 (Sigma) purified from human erythrocytes aggregated in a metal-catalyzed oxidation reaction. Soluble SOD1 was treated with various concentrations of DEPC, denatured with heat, and immunoblotted with anti-SOD1 antibody. Western blotting shows that high concentrations of DEPC are associated with decreased antibody binding in soluble SOD1 (FIG. 5), indicating that the site is available by modification with a blocking agent.
[0180]
Differentiating between disease-specific aggregated SOD1 and wild-type SOD1 using antibodies against SOD1 selected in favor of the usefulness of EPA. Related factors include:
1) selecting an epitope on the surface of the molecule of the original dimer that can be contacted with the chemical modifier in its original soluble state;
2) identify linear epitopes and optimize detection in the denatured state in immunoblots and ELISAs,
3) immunogenicity,
4) specificity for SOD1, and
5) Presence of acidic amino acids (Glu and Asp) that are easily modified by epoxides.
[0181]
Five SOD1 sequences that meet these criteria are: 22QKESNG27; 51EDNTAGCTSA60; 74PKDEERHV81; 89ADKDG93; and 127GKGGNEQSTK136 (bold: solvated side chain).
[0182]
Furthermore, the electrostatic loop sequence and zinc binding loop of human SOD1 are surface accessible sequences and are associated with aggregate formation (Elan, J et al., Nature Structural Biology (2003) 10: 461-67).
[0183]
These sequences are:
Electrostatic loop of human SOD1: Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser
Zinc binding loop of human SOD1: Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu
[0184]
(Example 10)
Detection of aggregated α-synuclein by EPA
Most cases of Parkinson's disease are sporadic, but the substantia nigra is a population of midbrain neurons (up to 60,000) in which both sporadic and familial diseases are selectively killed in PD Characterized by intracellular Lewy bodies in neurons. Lewy bodies are mainly composed of α-synuclein (22). Mutations in the gene encoding α-synuclein have been found in patients with familial Parkinson's disease (reviewed in 23). Another gene associated with autosomal recessive PD is parkin associated with α-synuclein degeneration (22, 23). A diffuse cortical Lewy body composed of α-synuclein is observed in Lewy body disease (LBD), a dementia symptom associated with Parkinsonian changes, hallucinations, and rapid symptom variation (24) .
[0185]
Syn-1 epitopes are optionally blocked by chemical modification of recombinant α-synuclein with DEPC (histidine reactivity), and α-synuclein aggregated in vitro is partially protected from DEPC epitope blockade (Figure 6).
[0186]
α-synuclein aggregated in vitro is protected from modification by DEPC, but normal protein is not. 3 mg / mL mutant A53Tα-synuclein was incubated at 37 ° C. for 3 days to aggregate. The agglutination reaction mixture was ultracentrifuged. Preaggregated normal protein (containing soluble α-synuclein) and pellet resuspension from ultracentrifugation (containing insoluble α-synuclein) treated with various concentrations of DEPC, heat denatured, from BD Biosciences Blotting was performed using Syn-1 antibody. FIG. 6A shows that high concentrations of DEPC are associated with a gradual decrease in antibody binding in normal α-synuclein. Insoluble α-synuclein shows little change in antibody binding with increasing DEPC concentration until the DEPC concentration reaches 1 mM. A graphical representation of these findings is shown in FIG. 6B. The degree of antibody binding with DEPC-treated normal α-synuclein (−) gradually decreases overall, but more rapidly with high concentrations of DEPC. On the other hand, insoluble α-synuclein (π) shows little change in the degree of antibody binding. The final data point of 0.01 M DEPC for insoluble α-synuclein is elevated due to photographic ambiguity.
[0187]
(Example 11)
Detection of aggregated proteins in CSF
Extracellularly deposited Aβ was quantified in CSF and blood of patients with AD and normal controls (6-8). Intracellular neuronal proteins such as α-synuclein have been detected in CSF and blood (37, 38). Dying neurons release intracellular proteins 14-3-3, neuron-specific enolase, tau, and α-synuclein into the CSF (39) and possibly eventually into the blood. A portion of the protein released during the disease is in aggregated form. EPA technology is applied to determine the ratio of polypeptide aggregates in CSF samples from patients with AD, ALS, PD, and LBD. Signals for disaggregated polypeptides before and after chemical treatment, representing “complete” and “protected” epitopes, respectively, are measured to determine the proportion of disaggregated polypeptides. Using optimized mAbs and chemical modification methods, and the DELFIA-TRF system, EPA sensitivity is determined in:
1. Normal CSF “contaminated” by polypeptides aggregated in vitro.
2. CSF from patients with AD, ALS, PD, and LBD.
[0188]
The proportion of aggregated polypeptide in a CSF sample is only 10 ^Five ~Ten ⁶ It is determined even if it is composed of individual molecules. Surfactants, precipitating agents (such as phosphotungstic acid), and adsorbents, which are typically used in commercial ELISA assays to augment related species, are optionally used. Biological fluids that are clinically available by non-invasive routes are ideal substrates for practical prenatal testing for diagnosing and screening for neurodegenerative diseases.
[0189]
Substances and methods
material
Recombinant hamster PrP (rhaPrP) and 6H4 were from Prionics. Recombinant human PrP (rhuPrP) was from Roboscreen. Biotin-3F4 and 3F4 were from Signet. 3F4 is MKH M 6H4 reacts to DYEDRYYRE. 6E10 anti-Aβ (from Signet) reacts to EFRHDS (residues 3-8).
[0190]
Other antibodies, and known epitopes, if known, are given in Table 1 above.
[0191]
Preparation of acid-treated misfolded PrP and APP.
Acid treated misfolded PrP was used in this study as a “model prion” and was prepared as in (29). Briefly, 100 μl of 10% brain homogenate is mixed with an equal volume of 3.0 M GdnHCl (final concentration 1.5 M) in PBS pH 7.4 or pH 3.5 adjusted with 1 N HCl, then at room temperature. Stir. After 5 hours of incubation, the sample was methanol precipitated with 5 volumes of ice-cold methanol and the pellet was resuspended in 100 μl lysis buffer. Samples treated at pH 7.4 were represented as simulated treated samples.
[0192]
Peroxynitrite treatment of brain homogenate
Normal or misfolded / disease state brain homogenate aliquots (18 μl) were prepared by adding 2 μl peroxynitrite to 100 mM NaOH / 60 mM H ₂ O ₂ Stirring while adding in solution gave a final peroxynitrite concentration of 0-15 mM. After stirring for an additional 15 seconds, the samples were subjected to Western blotting, immunoprecipitation or sandwich ELISA.
[0193]
DEPC treatment of erythrocyte SOD1
SOD1 (Sigma) purified from human erythrocytes is 40_M SOD1, 4 mM ascorbic acid, and 0.2 mM CuCl in 10 mM Tris-acetate buffer (pH 7). ₂ Aggregates in a metal-catalyzed oxidation reaction consisting of 3 days at 37 ° C. Ultracentrifugation supernatant (containing soluble SOD1) and pellet resuspension (containing insoluble SOD1) are treated with various concentrations of DEPC (100 pM-0.1 M), heat denatured, and anti-SOD1 antibody Use for immunoblotting.
[0194]
Western blotting
Samples were boiled in SDS loading buffer (62 mM Tris (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol and 0.01% bromophenol blue) for 5 minutes, 12% Tris They were separated on a glycine polyacrylamide gel and then transferred to Hybond-P. Use 3F4 (1: 50000) 6H4 (1: 10000) or 6E10 (1: 1000) as the primary antibody and HRP-conjugated goat anti-mouse (1: 10000) as the secondary antibody, then to ECL-Plus PrP was detected by making it visible by exposure and exposure to Kodak X-OMAT film. Band intensity was quantified by using UnScan-IT software.
[0195]
Immunoprecipitation
Samples were incubated with 50 μl antibody-bound (100 μg / ml) Dynal M-280 magnetic beads for 3 hours at room temperature with agitation in a final volume of 1 ml binding buffer (3% NP-40; 3% Tween-20) . The beads were washed 3 times with wash buffer (2% NP-40; 2% Tween-20) and boiled for 5 minutes in 30 μl SDS loading buffer without β-mercaptoethanol. The supernatant was analyzed by Western blotting as described previously.
[0196]
Sandwich ELISA
Capture antibody (6H4; 1: 5000 in 50 mM bicarbonate binding buffer, pH 9.6) was bound to an opaque 96 well plate (Nuns Maxisorp) by overnight incubation at 4 ° C. After blocking with 1% BSA in 0.05% TBST for 2 hours, the plates were washed 3 times in TBST and incubated overnight at 4 ° C. with standard concentrations of rhuPrP or rHaPrP and an unknown brain homogenate. The plate was washed 3 times and incubated with detection antibody biotin-3F4 (1: 5000) for 1 hour at room temperature. After three washes, avidin-HRP (1: 5000) was added and incubated for 30 minutes at room temperature. After the final wash step (3 times), the plate was developed with Quantablu fluorescent substrate for 10-90 minutes at room temperature and the fluorescence intensity measured with 325 nm excitation and 420 nm emission.
[0197]
Although the invention has been described with reference to what are presently considered to be the preferred embodiments, it will be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments. On the contrary, the invention is intended to cover various modifications and equivalents falling within the spirit and scope of the appended claims.
[0198]
U.S. Application No. 60 / 496,381 (Title Methods of Detecting Prion Protein (Cashman & Lehto), filed Aug. 20, 2003, and U.S. Application No. 60 / 497,362, filed Aug. 21, 2003 (Title) Epitope Protection Assay (Cashman & Lehto) and all publications, patents and patent applications, including corresponding Canadian application No. 2,437,675 and Canadian application No. 2,437,999, each of which is a separate publication, patent or patent application. The entire contents of which are incorporated herein by reference to the same extent as if they were specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
(References)

[Brief description of the drawings]
[0199]
FIG. 1 shows that brain PrP aggregated in vitro by acid treatment is protected from modification by peroxynitrite. Mock or acid treated human brain homogenates are treated with high peroxynitrite concentration (ONOO) and then immunoblotted with 3F4 (panel A) or 6H4 (panel B). Effect of peroxynitrite on 3F4 (C) and 6H4 (D) epitopes in sham (□) and acid-treated (●) brain homogenates. Immunoblot photographs were scanned and band intensity was measured by Unscanit software. These results are relative intensities combining three separate experiments.
FIG. 2 shows that PrP in scrapie-infected hamster brain is protected from modification by peroxynitrite. (A) Effect of peroxynitrite on 6H4 epitopes in scrapie-infected hamster brain. (B) Blot pictures of (A) were scanned and relative band intensities were measured using Unscanit software. (●) Scrapie-infected hamster brain. (□) Normal hamster brain.
FIG. 3 shows that protection from peroxynitrite-induced modification is due to aggregation in acid-treated brain. (A) Effect of peroxynitrite on immunoprecipitation (IP) of PrP in simulated or acid treated brain homogenates. Brain homogenates were treated with 2 mM incubation at room temperature with (+) or without (-) 10 mM peroxynitrite followed by 2.5 M guanidine hydrochloride (Gu). Generated samples were immunoprecipitated using 6H4 or 3F4. After treatment with peroxynitrite + Gu, additional PrP is precipitated in the acid-treated sample, whereas in the quasi sample, Gu has no effect. This suggests that Gu can degrade aggregated PrP in acid samples that are protected from destruction by peroxynitrite. (B) Effect of peroxynitrite on PrP in mock and acid treated brain homogenates as measured by ELISA. Brain homogenates were treated with high concentrations of peroxynitrite followed by 2.5M Gu. After 10-fold dilution, samples were analyzed by sandwich ELISA using 6H4 as capture antibody and 3F4 as detection antibody. Similar to the immunoblot and IP data, these results indicate that misfolded PrP is protected from destruction by peroxynitrite due to aggregation.
FIG. 4A shows detection of aggregated amyloid β (Aβ) using EPA. The 6E10 epitope in the Aβ region of APP is not Less susceptible to modification with nitrous acid.
FIG. 4B shows detection of aggregated amyloid β (Aβ) using EPA. The 6E10 epitope in the Aβ region of APP is peroxygenated in Alzheimer's disease brain compared to normal brain (panel A) and brain homogenate treated at low pH to induce protein aggregation (panel B). Less susceptible to modification with nitrous acid.
FIG. 4C shows detection of aggregated amyloid β (Aβ) using EPA. Aβ1-42 peptides aggregated in vitro show significant epitope protection of the 6E10 epitope against peroxynitrite modification compared to soluble non-aggregated Aβ1-42 (panel C). Aggregated Aβ1-42 treated with normal and high concentrations of peroxynitrite and then immunoblotted with 6E10 antibody also shows significant epitope protection (Panel D).
FIG. 4D shows detection of aggregated amyloid β (Aβ) using EPA. Aβ1-42 peptides aggregated in vitro show significant epitope protection of the 6E10 epitope against peroxynitrite modification compared to soluble non-aggregated Aβ1-42 (panel C). Aggregated Aβ1-42 treated with normal and high concentrations of peroxynitrite and then immunoblotted with 6E10 antibody also shows significant epitope protection (Panel D).
FIG. 5 shows the detection of epitopes that can be modified by DEPC in SOD1. (A) A western blot showing soluble SOD1 treated with high concentrations of DEPC and immunoblotted with sheep anti-SOD1. (B) Graphic representation of low antibody binding to SOD1 at high DEPC concentrations.
FIG. 6 shows detection of aggregated α-synuclein using EPA. (A) Western blot showing the effect of high concentrations of DEPC on antibody binding to soluble and insoluble α-synuclein. (B) A graph showing the degree of antibody binding to normal (−) and insoluble (π) α-synuclein.

Claims (35)

標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
接触可能な標的エピトープを選択的に遮断する遮断剤とポリペプチドを接触させるステップであって、野生型立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、非野生型立体配座では、標的エピトープが接触不能であり、標的エピトープが遮断剤と反応することができないステップと、
未反応遮断剤をポリペプチドとの接触から除くステップと、
候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップを含み、
さらに遮断剤はペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から選択される、方法。A method for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation, comprising:
Contacting the polypeptide with a blocking agent that selectively blocks the accessible target epitope, in the wild-type conformation the target epitope is accessible and reacts with the blocking agent, and in the non-wild-type conformation The target epitope is inaccessible and the target epitope cannot react with the blocking agent;
Removing unreacted blocking agent from contact with the polypeptide;
Modifying the candidate polypeptide to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate poly Indicating that the peptide was in a non-wild type conformation, and the lack of binding between the detection agent and the target epitope comprises indicating that the polypeptide was in a wild type conformation;
Further, the blocking agent is selected from the group consisting of peroxynitrite, hydrogen peroxide, methylene compounds, succinic anhydride, epoxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE) and diazirine. 候補ポリペプチドがプリオンタンパク質を含み、野生型立体配座が野生型プリオンタンパク質の立体配座を含み、非野生型立体配座がPrP^Scの立体配座を含む、請求項1に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the candidate polypeptide comprises a prion protein, the wild type conformation comprises a wild type prion protein conformation, and the non-wild type conformation comprises a PrP ^Sc conformation. 候補ポリペプチドがβ-アミロイドポリペプチド、tauタンパク質、APPタンパク質、SOD1、α-シヌクレイン、ハンチングチンタンパク質、p53、膵島アミロイドポリペプチドおよびレジスチンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the candidate polypeptide is selected from the group consisting of β-amyloid polypeptide, tau protein, APP protein, SOD1, α-synuclein, huntingtin protein, p53, islet amyloid polypeptide and resistin. 候補ポリペプチドがβ-アミロイドポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the candidate polypeptide comprises a β-amyloid polypeptide. ポリペプチドを変性させることによってポリペプチドを修飾する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。  5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the polypeptide is modified by denaturing the polypeptide. 熱および/または界面活性剤および/またはカオトロピック剤によってポリペプチドを変性させる、請求項5に記載の方法。  6. The method according to claim 5, wherein the polypeptide is denatured by heat and / or surfactant and / or chaotropic agent. 凝集ポリペプチドからポリペプチドを脱凝集させるための脱凝集剤を用いた処理によってポリペプチドを修飾する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。  5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the polypeptide is modified by treatment with a disaggregation agent to disaggregate the polypeptide from the aggregated polypeptide. 脱凝集剤がカオトロピック剤、界面活性剤および熱からなる群の少なくとも1つから選択される、請求項7に記載の方法。  8. The method of claim 7, wherein the deaggregating agent is selected from at least one of the group consisting of chaotropic agents, surfactants and heat. 界面活性剤がSDSを含む、請求項8に記載の方法。  9. The method of claim 8, wherein the surfactant comprises SDS. 検出剤が抗体を含む、請求項1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the detection agent comprises an antibody. 抗体がプリオンポリペプチドのエピトープを対象とする、請求項10に記載の方法。  11. The method of claim 10, wherein the antibody is directed against an epitope of a prion polypeptide. 抗体が6H4または3F4を含む、請求項11に記載の方法。  12. The method of claim 11, wherein the antibody comprises 6H4 or 3F4. 抗体がアミロイドβのエピトープを対象とする、請求項10に記載の方法。  11. The method of claim 10, wherein the antibody is directed against an epitope of amyloid β. 抗体が6E10または4G8を含む、請求項13に記載の方法。  14. The method of claim 13, wherein the antibody comprises 6E10 or 4G8. 非野生型立体配座がタンパク質凝集によって引き起こされる疾患を示す、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。  15. A method according to any one of claims 1 to 14, wherein the non-wild type conformation indicates a disease caused by protein aggregation. 疾患がプリオン病を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises prion disease. 疾患がBSEまたはCJDを含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises BSE or CJD. 疾患がアルツハイマー病を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises Alzheimer's disease. 疾患がパーキンソン病またはレビー小体病を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises Parkinson's disease or Lewy body disease. 疾患がハンチングトン病を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises Huntington's disease. 疾患が筋萎縮性側索硬化症を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises amyotrophic lateral sclerosis. 疾患が癌を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises cancer. 疾患が糖尿病を含む、請求項15に記載の方法。  16. The method of claim 15, wherein the disease comprises diabetes. 遮断剤と候補ポリペプチドを接触させる前に、以下の方法:吸着、沈殿、または遠心分離の1つまたは複数によって前処理したサンプル中に候補ポリペプチドが存在する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。  Before contacting the candidate polypeptide with the blocking agent, the candidate polypeptide is present in a sample pretreated by one or more of the following methods: adsorption, precipitation, or centrifugation. The method according to one item. CSF、血清、血液、尿、バイオプシーサンプルまたは脳組織からなる群から選択される死後または生前サンプル中にポリペプチドが存在する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。  15. The method according to any one of claims 1 to 14, wherein the polypeptide is present in a postmortem or prenatal sample selected from the group consisting of CSF, serum, blood, urine, biopsy sample or brain tissue. 標的エピトープを含む候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出するためのキットであって、標的エピトープを認識する検出剤、ならびにi)標的エピトープをマッピングすること、ii)候補ポリペプチドと、ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から選択される遮断剤を接触させること、およびiii)候補ポリペプチドと検出剤を接触させることに関する指示書を含むキット。  A kit for detecting whether a candidate polypeptide comprising a target epitope is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation, the detection agent recognizing the target epitope, and i) a target Mapping the epitope, ii) selected from the group consisting of a candidate polypeptide and peroxynitrite, hydrogen peroxide, methylene compound, succinic anhydride, epoxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE) and diazirine A kit comprising instructions for contacting the blocking agent and iii) contacting the candidate polypeptide with the detection agent. 検出剤が抗体を含む、請求項26に記載のキット。  27. The kit according to claim 26, wherein the detection agent comprises an antibody. 抗体が6H4、3F4、6E10または4G8を含み、場合によっては固相担体に固定されている、請求項27に記載のキット。  28. A kit according to claim 27, wherein the antibody comprises 6H4, 3F4, 6E10 or 4G8, optionally immobilized on a solid support. ペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から選択される遮断剤をさらに含む、請求項26に記載のキット。  27. The kit of claim 26, further comprising a blocking agent selected from the group consisting of peroxynitrite, hydrogen peroxide, methylene compounds, succinic anhydride, epoxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE) and diazirine. . ポリペプチドスタンダードをさらに含む、請求項26に記載のキット。  27. The kit of claim 26, further comprising a polypeptide standard. 遮断剤と接触している候補ポリペプチドがi)野生型立体配座またはii)非野生型立体配座であるかどうかを検出する方法であって、
候補ポリペプチドが少なくとも1つ標的エピトープを含み、遮断剤との接触および遮断剤の除去の後、候補ポリペプチドを修飾して任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換し、
接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する検出剤とポリペプチドを接触させるステップであって、検出剤と転換型標的エピトープの間の結合は候補ポリペプチドが非野生型立体配座であったことを示し、検出剤と標的エピトープの間の結合の欠如はポリペプチドが野生型立体配座であったことを示すステップを含み、
さらに遮断剤はペルオキシ亜硝酸、過酸化水素、メチレン化合物、無水コハク酸、エポキシド、二炭酸ジエチル、4-ヒドロキシノネナール(4HNE)およびジアジリンからなる群から選択される、方法。A method for detecting whether a candidate polypeptide in contact with a blocking agent is i) a wild-type conformation or ii) a non-wild-type conformation, comprising:
The candidate polypeptide contains at least one target epitope, and after contact with the blocking agent and removal of the blocking agent, the candidate polypeptide is modified to convert any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Contacting a polypeptide with a detection agent that selectively binds to a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the detection agent and the converted target epitope is a candidate poly Indicating that the peptide was in a non-wild type conformation, and the lack of binding between the detection agent and the target epitope comprises indicating that the polypeptide was in a wild type conformation;
Further, the blocking agent is selected from the group consisting of peroxynitrite, hydrogen peroxide, methylene compounds, succinic anhydride, epoxide, diethyl dicarbonate, 4-hydroxynonenal (4HNE) and diazirine. 検出剤と転換型標的エピトープの間の結合を、解離促進化ランタニドフルオロイムノアッセイ及び時間解像蛍光を使用して検出する、請求項1から25及び31のいずれか一項に記載の方法。  32. The method of any one of claims 1-25 and 31, wherein binding between the detection agent and the converted target epitope is detected using a dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay and time-resolved fluorescence. 候補ポリペプチドが凝集しているため、標的エピトープが接触不能である、請求項1から25、31及び32のいずれか一項に記載の方法。  33. The method of any one of claims 1 to 25, 31 and 32, wherein the target epitope is inaccessible because the candidate polypeptide is aggregated. 候補ポリペプチドが野生型立体配座と比較して異なる立体配座で存在するため、標的エピトープが接触不能である、請求項1から25及び31から33のいずれか一項に記載の方法。  34. The method of any one of claims 1 to 25 and 31 to 33, wherein the target epitope is inaccessible because the candidate polypeptide exists in a different conformation compared to the wild type conformation. サンプルが非凝集または凝集立体配座のタンパク質を含むかどうかを検出する方法であって、
タンパク質の接触可能な標的エピトープを遮断するために、ペルオキシ亜硝酸とサンプル中のポリペプチドを反応させるステップであって、非凝集立体配座では標的エピトープが接触可能であり遮断剤と反応し、凝集立体配座では、標的エピトープが接触不能であり、標的エピトープが遮断剤と反応することができないステップと、
未反応ペルオキシ亜硝酸を前記タンパク質との接触から除くステップと、
反応したタンパク質を変性または解離するためにサンプル中の前記タンパク質を処理し、その結果、任意の接触不能な標的エピトープを接触可能な標的エピトープに転換するステップと、
サンプルを、接触不能な標的エピトープから接触可能な標的エピトープに転換された標的エピトープと選択的に結合する抗体を用いてプローブ処理するステップであって、抗体と転換型標的エピトープの間の結合はタンパク質が凝集立体配座であったことを示し、抗体と標的エピトープの間の結合の欠如はタンパク質が非凝集立体配座であったことを示すステップを含み、
さらに前記タンパク質はβ-アミロイドポリペプチドである、方法。 A method for detecting whether a sample contains non-aggregated or aggregated conformational protein comprising:
A step of reacting peroxynitrite with a polypeptide in a sample to block a protein accessible target epitope, in a non-aggregated conformation, the target epitope is accessible and reacts with a blocking agent to aggregate In the conformation, the target epitope is inaccessible and the target epitope cannot react with the blocking agent;
Removing unreacted peroxynitrite from contact with the protein;
Treating the protein in the sample to denature or dissociate the reacted protein, thereby converting any inaccessible target epitope into a accessible target epitope;
Probing a sample with an antibody that selectively binds a target epitope converted from an inaccessible target epitope to a accessible target epitope, wherein the binding between the antibody and the converted target epitope is a protein The absence of binding between the antibody and the target epitope comprises indicating that the protein was in a non-aggregated conformation;
Furthermore, the protein is a β-amyloid polypeptide .

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