JP4667372B2 - 血管障害の程度の判定方法 - Google Patents
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Description
Breviorio et al.:J.Biol.Chem., 267(31),22190−7(1992) J.Biol.Chem.,267(31),22190−7(1992);Domyaku Koka(Arteriosclerosis),24(7−8),375−80(1996) Arthritis and Rheumatism,44/12 (2841−50),2001、Circulation,102,636−41(2000)、Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002;22:e10−e14
従って本発明の目的は、心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症の危険因子としての血管障害の程度を判定する方法および血管障害治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
一方、PTX3と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクであるCRPが感冒の診断として使用されていることから、感冒患者における血液中PTX3濃度を検討した。その結果、CRPとは異なり血中濃度の上昇は認められなかった。これらのことから、PTX3が全身性の炎症反応の診断マーカーではなく、血管に特異性の高い、障害の程度を知るに有用な診断マーカーであることを見出した。またこの方法が血管障害治療薬のスクリーニング方法として使用できることを見出し、本発明を完成した。
また、本発明は、抗PTX3抗体を含有する血管障害の程度の診断薬を提供するものである。
さらに本発明は、動物または細胞に被験物質を投与または接触させ、PTX3タンパク質又はPTX3遺伝子量の変化を測定することを特徴とする血管障害治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
すなわち、本発明における血管障害には、高脂血症および脳疾患の他に高血圧症、糖尿病、肥満および喫煙が原因として生ずる血管障害が含まれる。
また、本発明における血管障害の程度とは上記血管障害の進行過程に伴う障害の程度を言う。すなわち、上記進行過程をたどる血管障害は最終的なプラークの破裂に至る程度の尺度として病理組織的に次のように示される。(a)lipid coreの大きさ、(b)fibrous cap の厚さ、(c)shear stressの強さ、(d)炎症細胞の浸潤の程度の具合であり、(a)は大きければ大きいほど、(b)は薄ければ薄いほど、(c)は強ければ強いほど、(d)は強ければ強いほどプラーク破裂のしやすさは増す。したがって本発明における血管障害の程度は上記の(a)〜(d)の程度を言う。
1.抗PTX3抗体の作製
本発明で用いられる抗PTX3抗体はPTX3タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類(モノクローナル、ポリクローナル)および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
又、支持体に固定される抗PTX3抗体と標識物質で標識される抗PTX3抗体はPTX3分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるPTX3を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表2002−503642に開示された方法に従い得ることも出来る。
次に、この精製PTX3タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、PTX3の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトPTX3のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、PTX3遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のPTX3をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるPTX3の部分および大きさは限られない。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでPTX3に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久***能を有するミエローマ細胞と融合させ、PTX3への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1−59878号公報参照)。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるPTX3を投与して抗PTX3抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からPTX3に対するヒト抗体を取得してもよい(国際特許出願公開番号WO94/25585号公報、WO93/12227号公報、WO92/03918号公報、WO94/02602号公報参照)。
具体的には、抗PTX3抗体を産生するハイブリドーマから、抗PTX3抗体の可変(V)領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製)等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
本発明において測定するPTX3は、特に限定されず、全長PTX3でも、その断片でもよい。
被検試料に含まれるPTX3タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗PTX3抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme−linked immunosorbent assay:ELISA)(例えば、sandwich ELISA)である。ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
PTX3の全長ORF領域を含む配列のクローニングを実施した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の1本鎖cDNAを上記(0034)記載の方法により調製し、それを鋳型としてGenBank番号(NM_002852)よりデザインしたプライマーPTX3−F(KpnI)(配列番号:3)とPTX3−R(BamHI)(配列番号:4)を用いて、PCR法にて、全長ORF遺伝子の単離を行った。PCR法により得られたフラグメントをZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを用いベクター挿入し、塩基配列解析を定法にて実施した後、KpnIサイトおよびBamHIサイトにて切断したフラグメントをphCMVベクター(Stratagene社)へ挿入し、トランスファーベクターphCMV−PTX3を作製した。
FuGENE 6(Roche Molecular Biochemicals社)のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に6ウェルデイッシュに1x105cellのCHO細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に8μgの発現ベクターphCMV−PTX3と16μLのFuGENE 6 reagentを無血清DMEM培地100μLに混合し、20分間の室温におけるインキュベーション後、細胞に添加した。トランスフェクション翌日に限外希釈法および選択試薬であるG418を用いてクローニングを実施した。各クローンの培養上清を回収し、PTX3タンパク質発現細胞のスクリーニングを行った。その結果、約2〜3μg/mLのPTX3タンパク質を恒常的に発現するクローン(以後、CHO−PTX3)を選択することが出来た。
蛋白質の精製はBottazziらの方法(Bottazzi B,Vouret−Craviari,et al.,J Biol Chem.1997;272(52):32817−23.)に準じて実施した。具体的にはCHO−PTX3を150cm2のフラスコにて培養の後、ローラーボトル(BD Bioscience社)を用い1ボトル当たり300mLの無血清培地(S−SFM−II,GIBCO/Invitrogen社)用い、1分間当たり1回転になるようにローリングのスピードの調節を行い4日間培養し、培養上清を回収した。1Lの培養上清を、限外濾過膜濃縮装置、pellicon XLデバイス バイオマックス100(MILLIPORE社)を用いて50mLまで濃縮を行った。濃縮液を50mM Imidaole,pH6.6の緩衝液5Lに対し透析した。透析操作は同緩衝液に対し、2度実施した。次いで、HiPrep 16/10 Q XL(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。バックグランドレベルが低くなるまで洗浄した後、NaClの濃度を0から0.58Mに35分間かけて増加させ、その後1MのNaClにてPTX3の溶出を行った。尚、溶出のモニターは280nmの吸光度にて行った。PTX3蛋白質を含むフラクションを集め、Sephacryl S−300によるゲル濾過クロマトグラフィーをPBSにて展開した。さらにPTX3のうち多量体PTX3のみを得るためにSuperose 6 column(Pharmacia Biotech)を使用して精製した。すなわち、分子量スタンダードを用いキャリブレーションを行った後にPTX3をカラムへアプライし、流速0.4mL/minにてPBSにより溶出を行った。各溶出フラクションをSDS−PAGEにより解析を行い、精製リコンビナント多量体PTX3タンパク質を得た。
HUVECの培養上清からPTX3タンパク質の取得を試みた。すなわち、175cm2フラスコを用い、5% FBSを含むEGM−2培地にて37℃、3日培養後、培養液を回収した。蛋白質の精製はBottazziらの方法(Bottazzi B,Vouret−Craviari,et al.,J Biol Chem.1997;272(52):32817−23.)に準じて、具体的には上記実施例3と同様な操作にて天然PTX3を取得した。
天然より得たPTX3とリコンビナントPTX3の比較をウエスタンブロティングにより行った。すなわち、天然PTX3とリコンビナントPTX3の0.5μg/mL溶液10μLを還元状態でSDS−PAGEし、泳動後のゲルをPVDF膜に転写した。転写した膜上のPTX3を抗PTX3ポリクローナル抗体(ALEXIS社)と反応させた。その後、抗PTX3ポリクローナル抗体はHRP標識抗ウサギIgG抗体と反応させ、PTX3のバンドを検出した。その結果を図1に示した。図1に示すように両者は分子量の上でほぼ一致した。若干の差は糖鎖の違いに基づくものと推察した。
モノクローナル抗体は下記の操作により作製した。すなわち、Balb/Cマウス (CRL)あるいはPTX3ノックアウトマウスにPTX3を免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を10あるいは100μg/匹となるように調製し、FCA(フロイント完全アジュバント(H37 Ra)、Difco(3113−60)、ベクトンディッキンソン(cat#231131))を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に5あるいは50μg/匹となるように調製したものをFIA(フロイント不完全アジュバント、Difco(0639−60)、ベクトンディッキンソン(cat#263910))でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降1週間間隔で追加免疫を合計2回行った。最終免疫については5あるいは50μg/匹となるようにPBSに希釈し尾静脈内に投与した。PTX3タンパク質をコートしたイムノプレートを用いたELISAによりPTX3に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティック、cat#783 641)により細胞融合を行った。96穴培養プレートに播種し、翌日よりHAT培地で選択後培養上清をELISAでスクリーニングした。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養を行い培養上清を回収した。ELISAによるスクリーニングは、PTX3タンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗PTX3抗体を多数得た。
抗体濃度はヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED CAT# 62−6600)とアルカリホスファターゼ−ヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED CAT#62−6622)を用いたマウスIgGサンドイッチELISAを行い、市販の精製マウスIgG1抗体(ZYMED CAT# 02−6100)をスタンダードとして定量した。抗PTX3抗体のアイソタイピングは、ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II(PIERCE CAT# 37502)を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果、IgG1、IgG2a、IgMクラスの抗体が得られた。
10週令、体重2kgのニュージーランドホワイトウサギに免疫を行った。初回免疫にはPTX3蛋白質を100μg/匹となるように調製し、FCA(フロイント完全アジュバント(H37 Ra)、Difco(3113−60)、ベクトンディッキンソン(cat#231131))を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に100μg/匹となるように調製したものをFIA(フロイント不完全アジュバント、Difco(0639−60)、ベクトンディッキンソン(cat#263910))でエマルジョン化したものを皮下に投与した。その後も2週間間隔で100μg/匹のFIAエマルジョンを皮下投与し、合計5回免疫を行った。5回免疫後に部分採血を行い、ウサギ血清中の抗体価を、96ウェルプレートに抗原をコートしたELISA法にて評価した。その後全採血を行い、血清分離した後、ProteinGカラム精製により抗体を分画した。0.02%となるようにNaN3を添加し4℃で保管した。
血中のPTX3を検出するため、PTX3のサンドイッチELISA系を以下のように構築した。すなわち、96ウェルプレートにコートする抗体にはPPMX0101(FERM P−19697)、PPMX0102、PPMX0112、PPMX0148等のモノクローナル抗体を、これらに結合したPTX3を検出する抗体としてビオチンで標識したポリクローナル抗体(ALEXIS社または実施例7で作製した抗体)を用いた。尚、抗体のビオチン化にはPierce社のSulfo−NHS−LC−Biotin (CAT# 21335)を用いておこなった。
ELISAの標準曲線は濃度検定されたPTX3タンパク質標準品(ALEXIS社)を用いて、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01ng/mLの標準品希釈液をもちいて作製した。さらに、ELISAの感度比較のために非特許文献3の抗体すなわちALEXIS社より購入のMNB4抗体を用いて上記と同様に標準曲線を求めた。今回作製した測定系と非特許文献3の抗体による測定(図3)との比較において、明らかに新規測定系の感度がすぐれていることが確認できた。
スタチン投与開始前に採血を行い、次にアトロバスタチンを1日1回夕食後に1週間投与した後に採血を行った。採血した血液サンプルは、37℃、2時間のインキュベーションの後、1000rpm、10分間の血清分離を行った。血清上清成分を回収し−80℃にて保存した。これらの血清を用いて新規に構築したELISA系にて血清中PTX3タンパク質濃度の測定を行った。その結果6例中6例にて血清中PTX3蛋白濃度の減少が認められた(表1)。さらにt検定の結果、アトロバスタチン1週間投与後のPTX3濃度が有意に(p<0.01)下がる結果となった。
従来、血液成分の測定における血液サンプルとして、血清および血漿(クエン酸、EDTA、ヘパリン)が使用されている。本特許においては、最も一般的な採血方法である血清を用いて検討した。今回、採血方法による血中PTX3濃度の差異をPPMX0112モノクローナル抗体を用いたELISA系にて標準品のPTX3の添加試験にて検討したところ、表2に示すようにEDTAによる採血方法が最適であることが明らかとなった。
多くの血液成分は凍結保存において安定である。しかしながら、物質によっては安定性が確保できない場合もあることから、−80℃における血漿中PTX3の安定性をPPMX0112モノクローナル抗体使用ELISA系にて標準品のPTX3の添加試験にて検討した。その結果、表3に示すように保存により測定値の低下が確認された。
実施例12にて、−80℃におけるPTX3の保存性が確保できないことが判明したが、その原因としてPTX3の劣化のみならず他の血漿成分の変化に基づくことが推察された。後者の解決のため、PPMX0112モノクローナル抗体を用いたELISA系にて測定時使用緩衝液へのEDTAあるいはプロテアーゼ阻害剤の添加を検討した。その結果、EDTAの添加により測定値の改善が認められた(表4)。さらに、EDTA存在下Tween20およびBridje等の各種界面活性剤を血漿サンプルに添加した。表5に示すように、EDTAのみでは不十分であった改善効果がTween20により充分な改善効果を得ることができた。
この結果から、保存期間中のPTX3含量の低下は、PTX3以外の血漿成分の変化によるものと推察された。
実施例6で作製したモノクローナル抗体およびビオチン標識ポリクローナル抗体を用いて、実施例13の改良測定条件下における最適の抗体の選択を行った。すなわち、EDTAおよび界面活性剤を添加した緩衝液でEDTA採血血漿を希釈する。次いで、各種モノクローナル抗体をプレコートしたプレートに希釈検体を添加する。洗浄後、ビオチン標識ポリクローナル抗体を添加する方法によりモノクローナル抗体を選択した。その結果、最適な抗体としてPPMX0102が選択されたことから、そのモノクローナル抗体をFERM AP−20395として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6)へ寄託した。
従来測定系であるALEXIS社より購入のMNB4を用いた測定系、PPMX0112を用いた測定系および新規作製PPMX0102(FERM AP−20395)を用いた測定系を用いて、健常者血漿によるPTX3の添加回収試験を実施した。すなわち、5ng/mLのPTX3を健常者ボランテアEDTA採血血漿に添加、混和後の濃度を測定した。その結果は表6に示すように、PPMX0112において86%の回収率であるのに対し、他の測定系においてはほぼ添加量にあった測定結果であった。一方、PTX3添加血漿を−80℃、1日保存後解凍後の測定値は、新規作製PPMX0102(FERM AP−20395)を用いた測定系では、ほぼ100%の回収が得られたのに対し、MNB4を用いた測定系では添加したPTX3の回収が87%に過ぎなかった(表7)。
各種心疾患患者から採血をし、PPMX0102(FERM AP−20395) を用いたELISAにてPTX3濃度を測定することにより、病態によるPTX3の変動を検討した。すなわち、冠動脈(CA)での正常冠動脈群(ANCA)25名、安定狭心症群(AP)9名、不安定狭心症群(UAP)3名、心筋梗塞群(AMI)3名の4群に分け、血漿中PTX3濃度を測定し、群間比較を行った。その結果、UAP CA群ではANCA CA群に比べ、PTX3値は有意に増加し、またAMI CA群ではANCA CA群、AP CA群に比べ、PTX3値は有意に増加した。図4に示すように、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞と病態の悪化につれPTX3の濃度が増加することが明らかとなった。このことから、心疾患の悪化の程度は血管障害の悪化の程度に比例しているものと思われる。従って、血漿中PTX3濃度を測定することにより血管障害の結果として生ずると考えられる心疾患のモニター、病態の管理、治療方針策定に役立つことが期待出来る。
PTX3と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクであるCRPが感冒の診断として使用されている。PTX3の産生細胞がCRPの肝細胞と異なり、内皮および平滑筋細胞等の血管構成細胞に限局されており、PTX3の血管特異性を証明するため、感冒患者3名における血液中濃度を測定した。その結果、表8に示すように発症前値0.67〜1.15、平均で0.92ng/mLであるのに対し、発症後は0.79〜1.06、平均で0.90ng/mLであり、ほぼ同様の測定値であった。この結果より、PTX3が全身性の炎症反応の診断マーカーではなく、血管に特異性の高いマーカーであり、血管の障害の程度を知るに有用であることを確認した。
Claims (9)
- 被検試料中のPTX3濃度を測定することを特徴とする血管障害の程度の検出方法。
- 血管障害の程度が、心疾患の程度または脳血管疾患の程度である請求項1記載の検出方法。
- 被検試料が、血液、血清または血漿である請求項1または2記載の検出方法。
- 抗PTX3抗体を用いて被検試料中のPTX3タンパク質濃度を測定するものである請求項1〜3のいずれか1項記載の検出方法。
- 支持体に固定した抗PTX3抗体と標識物質で標識された抗PTX3抗体を用いる請求項4記載の検出方法。
- 標識物質がビオチンである請求項5記載の検出方法。
- 抗PTX3抗体が全長PTX3およびそのペプチド断片を認識する抗体である請求項4〜6のいずれかの1項記載の検出方法。
- 抗PTX3抗体を含有する血管障害の程度の診断薬。
- 支持体に固定した抗PTX3抗体と、標識物質で標識された抗PTX3抗体を含むものである請求項8記載の診断薬。
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