JP4666335B2 - 機械的振動による生物機能の制御方法とその装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、機械的振動による生物機能の制御方法とその装置に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、機械的振動を加えることによって、人為的に細胞または組織等の機能制御を可能とする生物機能の制御方法とそのための装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術と発明の課題】
従来より生物材料としての培養細胞の細胞機能を制御する方法について、数多くの研究や検討がなされてきているが、その大部分のものは、蛋白質等の液性因子の添加をともなうものである。また遺伝子の導入や高分子物質添加についても報告されている。しかしながら、これら外来の外来物質の添加をともなう方法では、添加される液性因子の由来が問題になる場合が多い。たとえば、動物由来のものでも、ウサギ由来なのか、ヒツジ由来なのか、あるいはヒト由来なのか等が問題となる。また、価格に関しても問題になる場合が多々ある。さらに、遺伝子の導入についても、電気穿孔方法やウイルスをベクターとして遺伝子を導入する方法、合成物質等を利用した導入促進剤を使用する方法、あるいはマイクロシリンジを用いて直接導入する方法等が検討されているが、いずれも十分な効果が得られていないのが実情である。さらにまた、ウイルスを用いる方法は、研究レベルでは非常に有効であるが、治療方法として人体に適用するとなると、どうしても病因性や安全性等に関して問題がある。
【0003】
また、物理的手法に関しては、静水圧、細胞伸展、超音波等の手法を用いて、細胞機能の制御を行うことが検討されている。これらの物理的手法による刺激は、インターロイキン、サイトカインやTNF−α等、種々の生体因子の活性化をはじめ、抑制や分泌等の制御機構を働かせることによって、細胞または組織の増殖や分化等の成長に寄与する効果をもたらすことが知られている。
【0004】
しかしながら、従来の物理的な刺激付与の方法については、刺激と細胞への作用の相関性が必ずしも明白でなく、刺激付与の方法の選択や、条件の制御等をどのように行うべきかについての指針も定められていないのが現状である。このため、実用的な手法としての簡便で、効率的な態様として確立されていない。
【0005】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来技術の問題点を解決し、従来のような由来が問題となる液性因子や合成高分子物質等を使用せず、もしくは大幅にその使用量を減らすことができ、しかも物理的手法としての刺激付与性の特徴を生かして、より実際的に簡便、かつ効率的に、細胞の増殖や細胞または組織内の反応を促進して分化を誘導し、さらには新しい遺伝子導入の方法をも可能とするという、各種の生物機能の制御のための新しい方法とそのための装置を提供することを課題としている。
【0006】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、前記の課題を解決するものとして、第1には、哺乳動物細胞の培養細胞が播種された固体基板に対して、振幅が100μm以下(0μmを除く)、周波数1〜10000Hzの振動を付加することによって、固体基板と接する培養細胞に機械的振動刺激を与え、以下のいずれかの生物機能の制御を行うことを特徴とする生物機能の制御方法を提供する。
1)細胞の初期接着能の増大
2)細胞の増殖
3)細胞融合の促進
4)細胞への外来物質の導入
【0007】
この方法について、第2には、振幅が20μm以下(0μmを除く)で、周波数が1Hz〜10000Hzの範囲の機械的振動により刺激を与えることを特徴とする請求項1に記載の生物機能の制御方法を提供する。
【0008】
また、この出願の発明は、第6には、上記いずれかの方法によって細胞または組織に刺激を与えながら培養することを特徴とする培養方法を提供する。
【0009】
第7には、培養細胞の初期接着能を増大させることを特徴とする方法を、第8には、培養細胞の増殖を促すことを特徴とする方法を提供する。
【0010】
そして、この出願の発明は、第9には、前記の方法によって、細胞融合を促すことを特徴とする細胞融合方法を、第10には、細胞に外来物質を導入する方法を、第11には、外来物質として遺伝子、タンパク質または薬物を導入することを特徴とする方法を提供する。
【0011】
さらに、第12に、この出願の発明は、生物の組織、細胞、細菌またはウイルスに対して機械的振動により刺激を与えて生物機能を制御する装置であって、機械的振動を発生させる手段を備え、発生させた機械的振動を刺激として与えるための振動伝達付与手段を有することを特徴とする生物機能の制御装置を提供し、第13には、振動伝達付与手段が、組織、細胞、細菌またはウイルスが接触する固体基板を備えていることを特徴とする生物機能の制御装置を提供する。
【0012】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【0013】
まず、この出願が対象とする生物の組織や細胞、細菌、そしてウイルスは、いかなる種類や由来のものでもよく、たとえば、細胞であれば、植物細胞や昆虫細胞、哺乳類細胞、そしてそれらの組織としての構成の各種のものであってよい。
また哺乳類細胞においては、ヒト由来、マウス由来、ヒツジ由来、ウサギ由来あるいはサル由来等が例示できる。そして、細胞は接着性細胞あるいは浮遊性細胞でもよい。
【0014】
このような各種の対象に対しての適用が考慮されているこの出願の発明の生物機能の制御方法においては、適用の場面や実際上の目的としては、たとえば、組織培養、細胞培養、発酵、植物の出芽、育成、結実、除草、そして保存等や、動物やヒトの治療、除菌、滅菌やウイルスの不活化等が例示される。
【0015】
そして、より具体的な制御されるべき機能については、主として細胞の内部で起こる事象に関連するものとして、たとえば、接着、増殖、分化、生合成、遊走、形態変化、代謝、アポトーシス、形質転換、ネクローシス、不活化、酵母の出芽等が例示される。一方、細胞が外部環境と関連する事象に関しては、細胞融合、遺伝やタンパク質、あるいは薬物の導入、さらには破壊等が例示される。
【0016】
以上のような生物機能の制御方法として機械的振動によって刺激を与えるとのことはこれまで全く報告されていないものであって、その適用範囲の広さや目的の多様性、そして顕著な作用効果の点において画期的なものである。
【0017】
細胞や組織等に対して振動を加えて生物機能の制御を行うこの出願の発明においては、「機械的振動」は、一般的にはその振幅が100μm以下とすることが考慮される。目安としての細胞の浮遊時のサイズの観点からは20μm以下が好適であるが、線維芽細胞では100μm程度まで伸展することを考慮すると、振幅は最大でも100μmまでとするのが実際的である。そして、この振幅については、周波数の大きさにも関係して、対象とする組織、細胞等が物理的に破砕されることがないように振幅と周波数が選択されるのが好ましい。
【0018】
周波数については、その限定については、この観点から選択されるが、一般的には、100MHz以下とするのが実際的であって好ましい。
【0019】
さらには、細胞に対しては、振幅が20μm以下、周期が1Hzから10MHzの範囲のものとすること、さらには、培養する細胞や組織の種類、その由来によっても異なるが、一般的には周波数は10Hzから1MHzが好適である。
【0020】
細胞に対しては、周波数が1Hz未満の場合には実際的な効果は小さく、他方、10MHzを超える場合には細胞や組織の損傷も考慮されねばならない。
【0021】
そして、振動の負荷対象としての細胞や組織の細胞骨格、細胞膜、膜蛋白質、そして細菌やウイルスの生体機能や役割を考慮して、それぞれについて、適用する波形が異なるものとすることが好ましいことも考慮される。また、振動は前記のとおり連続的または間欠的であってよく、定常波だけでなく、パルス波をはじめとして非定常波であってもよい。
【0022】
この出願の発明の「機械的振動」は、媒質が振動する(疎密波による縦波)超音波照射による振動とはその作用において本質的に相違している。組織、細胞、細菌あるいはウイルスが接している固体基板が振動する。この際には、振動方向による横揺れと縦揺れとが区別可能となる。
【0023】
もちろん、振動を与える場合の細胞または組織等の存在形態としては、支持固体基板上に搭載して平面状に、あるいは三次元的に塊状となって存在してもよいし、微粒子状で存在してもよいし、さらには、液体が共存していてもよい。機械的振動は、生体内および生体外のいずれにおいても効果を発揮する。
【0024】
この出願の発明の装置では、「振動発生手段」と「振動伝達付与手段」とを備えているが、これらの各手段の構成が特定のものに限定されることはない。たとえば、その代表的な例としては、図1に例示したような、圧電素子(1)によって、土台部(3)にスライド可能とされたシャーレ置板(4)を振動させ、この振動によってシャーレ設置部(5)に置いた培養シャーレを振動するようにした構成の細胞培養装置が考慮される。この図1の装置では、検定用過電流センサー(6)も備えている。圧電素子(1)は矢印の振動方向(2)の振動を発生するようにしている。
【0025】
対象する組織や細胞、そして細菌、ウイルス等の種類や性質、制御目的とする生物機能等に応じてこの出願の発明の装置は構成されてよく、たとえば図1に例示した横方向振動の装置だけでなく、縦方向への振動素子の配置による縦方向振動装置をはじめ、外部磁場を利用して振動させるようにしたものや、振動子のパターン配列によるアレイ型の振動装置等であってもよい。また、振動伝達付与手段としては、組織、細胞、細菌またはウイルスが接触する固体基板の各種のものが考慮される。この際の「基板」は平板状でなくてもよく、曲面状、異形状のもの、さらには粒状、繊維状等のものでもよい。また、硬質固体だけでなく、粘性体、ジェリー、ゲル、スポンジ、ゴム状等の軟質の固体であってもよい。
【0026】
以上のようなこの出願の発明によって、従来のような由来が問題となる液性因子や合成高分子物質等を使用せず、もしくは大幅にその使用量を減らすことができ、しかも物理的手法としての刺激付与性の特徴を生かして、より実際的に簡便、かつ効率的に、細胞の接着や増殖、細胞または組織内の反応を促進して分化を誘導し、さらには新しい遺伝子等の外来物質の導入をも容易とする等の、細胞または組織等の生物機能を制御することのできる、新しい刺激付与方法とそのための装置が実現される。
【0027】
そこで以下に実施例を説明し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。
【0028】
【実施例】
「生物機能の制御装置」として、図1の構成を有し、変位範囲0から15μm、使用周波数1Hzから10kHz、歪みゲージ位置センサー内蔵、歪みゲージ分解能1nmの装置を用いた。また、振動対象は、直径50mmのシャーレとした。
【0029】
図2は、振動装置を用いた実験システムの全体構成を概略的に例示したものである。
【0030】
振動装置(11)は外気遮断ボックス(12)内に配置され、温度調節装置(13)により温度コントロール可能とされ、培養の状態は顕微鏡(14)で観察でき、この際の観察源はデジタルカメラ(15)またはCCDカメラ(16)により撮影されて、たとえばアナログ信号として、細胞変化記録録画用装置(17)や記録媒体(18)に記録されるとともに、あるいは直接的に確認用モニター(19)にて確認モニターできるようにしている。
【0031】
振動負荷装置(11)の装置駆動電圧信号(22)は、ファンクションジェネレータ(7)およびドライバ(8)により伝送される。この信号(22)については、たとえばオシロスコープ(9)およびノートパソコン(10)により記録・モニターできるようにしている。
<実施例1> 初期接着への作用
実施例1では、振動を加えない通常の培養と振動を加えた培養における、培養細胞の初期接着への作用を比較検討した。その結果を図3および図4に示した。
【0032】
図3では、振動負荷による培養細胞の初期接着能力の計測を顕微鏡による観察図を示した。培養細胞としては、マウス由来の線維芽細胞(L929細胞)を用いた。このL929細胞を振動無負荷用と振動負荷用を用意し、直径6cmの培養シャーレにそれぞれ播種した。振動負荷による場合には、この播種時に周波数100Hz、振幅9μmの振動負荷を1時間行った。1時間後、振動無負荷のL929細胞(A)は、球状を呈し、未だ培養シャーレ面に接着していなかった。
一方、振動負荷のL929細胞(B)は、細胞が活性化され、既に培養シャーレ面に接着し、***開始の兆候が見られ、これは従来の初期接着能よりも約4倍に相当した。
【0033】
次に、細胞数の計測を、人工血管等に使用されるヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて行った。開始細胞数としてそれぞれ5×105細胞/6cmシャーレを用意し、播種した。細胞播種1時間後、振動を負荷し、1時間培養した。振動の周波数は0から10000Hz、または振幅は0から15μmとし、それぞれの振動条件における培養シャーレ面に接着している細胞数を計測した。その結果、振幅5μmにおいて、図4に示したように、振動を負荷していない場合は、約20%の培養細胞が培養シャーレ面に接着し、振動を負荷した場合においては、その比率は増大し、約4倍の約80%まで接着することが確認された。
<実施例2> 培養細胞の増殖への作用
振動による培養細胞の増殖に対しての作用を検討した。その結果を図5に示した。
【0034】
ヒト臍帯静脈内皮細胞を用意し、培養シャーレに播種した。播種18時間後に振動を1時間負荷させ、その後さらに48時間培養し、細胞数の計測を行った。
振動の周波数(Hz)は、0、10、100、1000、10000とした。また振幅数(μm)は、5とし、開始細胞数は、0.5×105細胞/6cmシャーレとした。
【0035】
その結果は、図5に示したように、振動を負荷していない場合よりも、振動を負荷した場合のほうが顕著な増殖率が得られた。
<実施例3> 培養融合への作用
振動による細胞融合への作用を評価した。
【0036】
細胞としては前述のL929細胞を用い、開始細胞数として5×105細胞/6cmシャーレを用意した。振動は、周波数500Hz、振幅5μmで、振動負荷時間を1時間、そして培養時間は、振動負荷後48時間とし、この後に細胞数を計測した。その結果を図6に示した。図中の「Fusion Index」とは、直径6cmシャーレにおいて、顕微鏡の倍率×40における視野20ヶ所中の多核細胞を検視し、その平均数を表したものである。
【0037】
まず、L929細胞を密に播種し、多核細胞を形成させた。コントロール(CONT)である振動無負荷においては、多核細胞の平均数は2であったが、振動負荷の場合では多核細胞の平均数は2.5であり、またその中央部における多核細胞数は4であった。これは、中央部においては、約2倍の融合率となった。また、これら振動無負荷の細胞と振動負荷の細胞との間における相違は、顕微鏡下でも明瞭に識別できた。
<実施例4> 細胞への遺伝子導入
振動による外来遺伝子の導入について検討した。
【0038】
培養細胞には、ヒト臍帯血静脈内皮細胞を用いた。外来遺伝子として、緑蛍光発色能を有するpCMV−GFP(2μg/mL)を使用した。まず、4×105個の細胞を蒔き6cmのシャーレに蒔き1日置き、振動をかける1時間前に培養液を交換した。1時間後、培養液にGFPの遺伝子を含むプラスミドDNAを2μg/mLとなるように加え、30分のインキュベーション後、実施例2と同様に、振動刺激を与えた。48時間後、位相差顕微鏡で血球計算版を用いて全生細胞を数え、同じ試料を蛍光顕微鏡で緑色に光る細胞の数を数えた。振動は、周波数(Hz)は、100、1000、10000、振幅数5μmで1時間負荷した。また、振動を与えない比較対照も用意した。その結果、比較対照群においては、蛍光度が0に対して、振動周波数100Hzおよび10000Hzにおいては蛍光度1から2の中程度、1000Hzにおいては蛍光度3の強い度合いを示した。これによって、振動による刺激によって、特に周波数が1000Hzの場合に強く、外来遺伝子が効果的導入されることが確認された。
【0039】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、細胞または組織の生物試料に機械的振動による刺激を加えることによって、人為的に細胞または組織等の生物機能の制御が可能となる。
【0040】
培養細胞の活性化および増殖が促進され、新しい外来遺伝子の導入方法も提供される。
【0041】
この出願の発明により、病理診断、遺伝子治療、再生医学、生殖医療、安全評価、低侵襲治療、遺伝子解析、生体シュミレーター等多くの分野において革新的な技術が提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】この出願の発明の装置の概要を模式的に例示した斜視図である。
【図2】実験システムの全体構成を例示した構成図である。
【図3】実施例1の結果を例した顕微鏡観察の像である。(A)振動無負荷、(B)振動負荷した場合を示している。
【図4】実施例1における細胞計測の推移を例示した図である。
【図5】実施例2の結果として細胞増殖への作用を例示した図である。
【図6】実施例3における細胞融合への作用を例示した図である。
【符号の説明】
1 圧電素子(振動子)
2 振動方向
3 土台部
4 シャーレ置板
5 シャーレ設置部
6 検定用過電流センサー
7 ファンクションジェネレータ
8 ドライバ
9 オシロスコープ
10 ノートパソコン
11 振動負荷装置
12 外気遮断ボックス
13 温度調節装置
14 顕微鏡
15 デジタルカメラ
16 CCDカメラ
17 細胞変化記録録画用装置
18 記録媒体
19 確認用モニター
20 入力電圧信号
21 波形データ
22 装置駆動電圧信号
23 アナログ信号
Claims (2)
- 哺乳動物細胞の培養細胞が播種された固体基板に対して、振幅が100μm以下(0μmを除く)、周波数1〜10000Hzの振動を付加することによって、固体基板と接する培養細胞に機械的振動刺激を与え、以下のいずれかの生物機能の制御を行うことを特徴とする生物機能の制御方法。
1)細胞の初期接着能の増大
2)細胞の増殖
3)細胞融合の促進
4)細胞への外来物質の導入 - 振幅が20μm以下(0μmを除く)で、周波数が1Hz〜10000Hzの範囲の機械的振動により刺激を与えることを特徴とする請求項1に記載の生物機能の制御方法。
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