JP4663267B2 - レーザー光を用いた血液中のヒドロキシルラジカル量の測定装置 - Google Patents

Description

この出願の発明は、レーザー光を用いて血液中のヒドロキシルラジカル量をリアルタイムで測定することができる測定方法及び測定装置に関するものである。

従来、血液中の酸素量の測定する方法としては、いわゆる血液採取法と透過率法と称される2つの方法があった。

血液採取法は、血液中の酸素量を測定するために血液を採取し、酸化しないようにして実験チャンバーに移し変え、その中でガスイオン化状にし、その中の酸素成分を質量分析器で測定する方法である。

透過率法は、指に赤外光線照射手段を設けたキャップを差込んで赤外線を照射し、その赤外線の透過率の変化により酸素量を測定する方法である（非特許文献１）。
立石哲也編著「メディカルエンジニアリング」米田出版、（２０００年４月）、ｐ．３９−４７

しかしながら、上記のような従来の血液中の酸素量測定方法のうち、血液採取法は酸素量（濃度）の測定を間接的に行う手法であり、しかも時間がかかり、また測定時間が遅れると化学変化が進む等、本質的な欠点を持っている。一方、透過率法は個人的にばらつきのある筋肉、特に筋肉中の赤外光吸収率が高い水分の含有率や、汗の量、あるいは指の太さの違いなどにより、データの補正をしなければならない複雑さがある。

さらに最近では、ヒドロキシルラジカルが活性酸素類の中で生体の老化や癌の発生に最も強い影響力があるとして話題となっており、血液中のヒドロキシルラジカル量を測定する必要性は高いと考えられるが、ヒドロキシルラジカルの寿命は１秒程度と短く血液採取法など通常の方法は取れず、新しい測定技術の開発が求められていた。

そこで、以上のとおりの事情に鑑み、この出願の発明は、血液中のヒドロキシルラジカル量を直接的に、かつリアルタイムでしかも簡易に測定することができる新規な測定方法及び測定装置を提供することを課題とする。

この出願の発明は、上記課題を解決するものとして、第１には、２台のレーザー光を発生するレーザー発生装置と、先端に開口が形成され、それ以外の部分には光を遮断する被覆が施された先鋭部を有し、２台のレーザー発生装置からのレーザー光を入射し、開口からエバネッセント光を発生するファイバープローブと、エバネッセント光と、血液中のヒドロキシルラジカルとの相互作用により発生した蛍光を検出する検出手段と、検出手段からの検出結果に基づいて血液中のヒドロキシルラジカル量を演算する演算手段とからなることを特徴とする、レーザー光を用いた血液中のヒドロキシルラジカル量の測定装置を提供する。

また、第２には、上記第１の発明において、エバネッセント光を発生したファイバープローブが、蛍光の取り込みを行うように構成されていることを特徴とする測定装置を提供する。

また、第３には、上記第１又は第２の発明において、２台のレーザー光を発生させるレーザー装置において、一方のレーザー装置から発生させるレーザー光の波長が３５０ｎｍ、強度が１０〜１０００ｍＷであり、もう一方のレーザー装置から発生させるレーザー光の波長が２．９μｍ、強度が１０〜１０００ｍＷであることを特徴とする測定装置を提供する。

また、第４には、上記第１から第３の発明において、蛍光を取り込むための別のファイバープローブを有することを特徴とする測定装置を提供する。

この出願の発明によれば、血液中のヒドロキシルラジカル量を血液を採取することなく、直接的に、かつリアルタイムでしかも簡易に測定することが可能となる。また、この出願の発明による測定では、水分や筋肉などの存在から生ずる問題はなく、エバネッセント光は境界面から波長程度のごく短い距離だけ滲みだすというナノの量であるため血液をほとんど壊すことはない。

さらにこの出願の発明によれば、血液中の最も重要な活性酸素であるヒドロキシルラジカルの量がリアルタイムで分かり、癌の発生や皮膚の老化を防止することに役立つことが期待される。また、ビタミンＣ等のサプリメントが活性酸素を減らすとして知られているが、そのようなサプリメントや同様の薬剤の効能について、投薬前後の変化によるリアルタイムの臨床実験データが得られる。

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

この出願の発明の参考技術としては、レーザー光を用いて血液中の酸素量を測定するものであって、先端に開口が形成されそれ以外の部分には光を遮断する被覆が施された先鋭部を有するファイバープローブを用い、ファイバープローブの先鋭部先端の開口を血液中に入れ、ファイバープローブにレーザー発生装置からのレーザー光を入射して、ファイバープローブの先鋭部先端の開口からエバネッセント光を発生させ、エバネッセント光と血液中の酸素との相互作用により発生したラマン散乱光を検出し、その検出結果に基づいて血液中の酸素量を測定するものがある。

以下、この出願の発明の参考技術を、図面を参照しながら説明する。

図１は、この参考技術について、１台のレーザー発生装置を適用した、血液中の酸素量を測定するための装置を模式的に示したものである。

レーザー発生装置（１）は、血液中の酸素量を測定するために用いるレーザー光（２）を発生させるものである。レーザー光（２）としては、たとえば、波長が３００〜２０００ｎｍ、強度が１０〜１０００ｍＷの範囲のものを用いることができる。またナノ秒程度のシングルパルスレーザーでは１ＭＷ程度までパワーを上げることができる。レーザー光（２）は、穴開き反射ミラー（３）の穴を通過しファイバープローブ（５）に入る。

ファイバープローブ（５）は、レーザー光入射側とは反対側に円錐形の先鋭部（６）を有し、その先端に円形開口（７）が形成され、それ以外の部分は光を遮断するように被覆が設けられている。この被覆は、例えば金やアルミニウムをコーティングして設けることができる。円形開口（７）の直径は５〜１００μｍ程度（ファイバー径の１／１０程度）とすることができ、その直径を可変させることでエバネッセント光と相互作用する血液量を制御することができる。ファイバープローブ（５）の直径は０．０５〜１ｍｍ程度のものが好ましい。

「エバネッセント光」は、光を異なる屈折率の媒質による界面（例えばガラスと溶液）にある値以上の入射角で入射させると、光は全反射するが、その際、反射光線のほかに、入射側とは反対側の媒質に、界面からの距離に関して指数関数的［ｅｘｐ（−ｘ／λ）（ｘ：先端から外部への距離、λ：光の波長）］に強度が減少する伝播しないタイプの光のことである。

この出願の発明の参考技術では、レーザー光（２）により発生したエバネッセント光を血液中の酸素と相互作用させる。その際に、ラマン散乱光が得られる（酸素がラマン活性な分子のため）。エバネッセント光と血液中の酸素との相互作用領域は先端から波長領域と限定されるため、相互作用する光の体積Ｖ（ここで血液の屈折率を１．４とすれば、体積は真空中の約７０％となる）がわかる。

発生したラマン散乱光は、ファイバープローブ（５）の円形開口（７）から取り込まれ、反射ミラー（３）で反射した戻り光（８）のうち散乱光信号だけ、雑音となる光を除去するための干渉フィルター（９）を通した後、超高感度検出器（１０）によりその強度が検出される。超高感度検出器（１０）としては、たとえば、光電子増倍管（ＭＣＰ（マルチチャンネル・プレート）付き）や背面照射型超高感度ＣＣＤカメラなどを用いることができる。なお、ラマン散乱光の取り込みは、別のファイバープローブを平行して配置して行ってもよい。ここで、例えばラマン散乱光として、１５５２ｃｍ^−１のストークス線を用いて検出を行う。

ここで超高感度検出器（１０）で検出したラマン散乱光の測定値Ｐカウントは下記式［１］で表される。

Ｐ＝Ｉ・Ｖ・σ・ｎ・Δｔ・Ｋ／（ｈν・Ａ）・・・・・［１］
（ところで、Ｉ：レーザー強度、Ｖ：相互作用領域の体積、σ：ラマン散乱断面積、ｎ：酸素の分子密度、Δｔ：測定時間、Ｋ：光学系の透過率、ｈν：光子１個のエネルギー、Ａ：検出器の１光子当たりのカウント、つまり電気信号への変換係数である）
従って、パソコン等の演算装置に、上記［１］式に基づく演算を行わせることにより、超高感度検出器（１０）による測定値Ｐカウントから血液中の酸素の分子密度ｎ、すなわち酸素量を求めることができる。

この出願の発明は、レーザー光を用いて血液中のヒドロキシルラジカル量を測定するものであって、先端に開口が形成されそれ以外の部分には光を遮断する被覆が施された先鋭部を有するファイバープローブを用い、ファイバープローブの先鋭部先端の開口を血液中に入れ、ファイバープローブに２台のレーザー発生装置からのレーザー光を入射して、ファイバープローブの先鋭部先端の開口からエバネッセント光を発生させ、エバネッセント光と血液中のヒドロキシルラジカルとの相互作用により発生した蛍光を検出し、その検出結果に基づいて血液中のヒドロキシルラジカル量を測定することを特徴とする。いわゆるレーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）法を利用したものである。

以下、この出願の発明を、図面を参照しながら説明する。

図２は、この出願の発明を適用した、血液中のヒドロキシルラジカル量を測定するための装置を模式的に示したものである。

この出願の発明では、入射光と測定光（蛍光）が同じ波長になるのを避け、所要の信号強度が得られるならば１台のレーザー装置の使用でもよいが、波長が異なるレーザー光を発生させる２台のレーザー発生装置を用いて、２つのレーザー光を合成させて２段励起（２光子吸収）させるようにする。

１台のレーザー発生装置を用いる場合、そのレーザー光は、たとえば、波長が２８０ｎｍ、強度が１０〜１０００ｍＷの範囲のものを用いることができ、この場合、３１０ｎｍの蛍光が得られる（ヒドロキシルラジカルは非ラマン活性な分子であり、エネルギー準位間での共鳴吸収励起が起こるため）。

また、２台のレーザー発生装置を用いる場合、たとえば、一方のレーザー発生装置からのレーザー光は、波長が３５０ｎｍ、強度が１０〜１０００ｍＷのものとすることができる。もう一方のレーザー発生装置からのレーザー光は、波長が２．９μｍ、強度が１０〜１０００ｍＷのものとすることができる。両レーザー光を合成することにより、２段励起（２光子吸収）が行なわれ、この場合、３１０ｎｍの蛍光が得られる。

１台のレーザー発生装置を使用するか、２台のレーザー発生装置を使用して２段励起（２光子吸収）を得るかの違いは、［２］式の吸収断面積σの大きさに影響し、雑音としての光も考慮して採用する。

以下、２台のレーザー発生装置（１１−１）、（１１−２）を用いる場合を例に説明を行う。

レーザー発生装置（１１−１）からのレーザー光（１２−１）は、穴開き反射ミラー（１３）の穴を通した後、ブリュースター角入射用ガラス板（１４）を通過させる。一方、レーザー発生装置（１１−２）からのレーザー光（１２−２）は、反射ミラー（２１）で反射した後、ブリュースター角入射用ガラス（反射ミラーの役割も兼ねる）（１４）により反射し、レーザー光（１２−１）と合流して、レーザー光（１２）としてファイバープローブ（１５）に入射させる。これにより、レーザー光（１２）が、ファイバープローブ（１５）に入射してその中を伝播した後、先鋭部（１６）先端の円形開口（１７）のところで、全反射を起こすとともにエバネッセント光を発生するようになる。ブリュースター角入射用ガラス板（１４）は、Ｐ偏光（レーザー光の偏光面が法線と光路のなす面内にある光）のレーザー光（１２−１）を通過させて、Ｓ偏光（レーザー光の偏光面が法線と光路のなす面に垂直な光）のレーザー光（１２−２）を反射させる役割を行うもので、ＢＫ−７ガラス板や石英ガラス板などを使用することができる。

ファイバープローブ（１５）の構造はファイバープローブ（５）と同様であるので、重複を避けるためその説明は省略する。

この出願の発明では、レーザー光（１２）により発生したエバネッセント光を血液中のヒドロキシルラジカルと相互作用させる。その際に、エバネッセント光と血液中のヒドロキシルラジカルとの相互作用領域も、上記と同様、先端から波長領域と限定されるため、相互作用する光の体積Ｖがわかる。

蛍光は、ファイバープローブ（１５）の円形開口（１７）から取り込まれ、ブリュースター角入射用ガラス板（１４）を通過し、反射ミラー（１３）で反射した戻り光（１８）のうち蛍光信号だけ干渉フィルター（１９）を通した後、超高感度検出器（２０）によりその強度が検出される。超高感度検出器（２０）も上記の超高感度検出器（１０）と同様なものを用いることができる。

ここで超高感度検出器（２０）で検出した蛍光の測定値Ｑカウントは下記式［２］で表される。

Ｑ＝Ｉ・Ｖ・σ’・ｎ’・Δｔ・Ｋ／（ｈν・Ａ）・・・・・［２］
（ところで、Ｉ：レーザー強度、Ｖ：相互作用領域の体積、σ’：ＬＩＦ吸収断面積、ｎ’：ヒドロキシルラジカルの分子密度、Δｔ：測定時間、Ｋ：光学系の透過率、ｈν：光子１個のエネルギー、Ａ：検出器の１光子当たりのカウント、つまり電気信号への変換係数である）
従って、パソコン等の演算装置に、上記［２］式に基づく演算を行わせることにより、超高感度検出器（２０）による測定値Ｑカウントから血液中のヒドロキシルラジカルの分子密度ｎ’、すなわちヒドロキシルラジカル量を求めることができる。

次に、この出願の発明の参考例及び実施例を述べる。
[参考例１]

図１に示す構成の装置を用いて血液中の酸素量測定を行った。レーザー発生装置（１）により波長６９４ｎｍ、強度約１ｋＷの１パルスレーザー光（２）を発生させ、直径２ｍｍφの穴開き反射ミラー（金コートミラー）（３）の穴を通して、ファイバープローブ（５）に入射させた。ファイバープローブ（５）は石英タイプのもので、ファイバー径が１ｍｍ、先端部（６）の円形開口（７）の直径は１００μｍとした。ファイバープローブ（５）の先端を血液中に入れておき、レーザー光（２）を照射するとラマン散乱光（ストークス線：１５５２ｃｍ^−１）が発生した。それをファイバープローブ（５）の円形開口（７）から取り込み、反射ミラー（３）で反射させて、戻り光（８）のうち散乱光信号だけ干渉フィルター（９）を通した後、超高感度検出器（１０）で検出した。あらかじめ上記［１］式により演算を行い酸素量が算出できるようにプログラムしておいたパソコンに、高感度検出器（１０）で検出した測定値を入力して酸素量を求めた。その生データを図３に示す。

図２に示す構成の装置を用いて血液中のヒドロキシルラジカル量測定を行った。レーザー発生装置（１１−１）により波長３５０ｎｍ、強度３００ｍＷのレーザー光（１２−１）を発生させ、直径２ｍｍφの穴開き反射ミラー（金コートミラー）（１３）の穴を通して、ブリュースター角入射用ガラス板（１４）を通過させた。一方、もう一つのレーザー発生装置（１１−２）により波長２．９μｍ、強度３００ｍＷのレーザー光（１２−２）を発生させ、反射ミラー（金コートミラー）（２１）で反射させ、ブリュースター角入射用ガラス板（レーザー光（１２−２）に対して入射角５７度（ブリュースター角）で反射ミラーの役割をする）（１４）で反射させ、レーザー光（１２−１）と合流させ、レーザー光（１２）とした。そしてレーザー光（１２）をファイバープローブ（１５）に入射させた。ファイバープローブ（１５）は石英タイプのもので、ファイバー径が５００μｍ、先鋭部（１６）の円形開口（１７）の直径は５０μｍとした。ファイバープローブ（１５）の先端を血液中に入れておき、レーザー光（１２）を照射すると、蛍光（波長３１０ｎｍ）が発生した。それをファイバープローブ（１５）の円形開口（１７）から取り込み、ガラス板（１４）を通過させ、反射ミラー（１３）で反射させて、戻り光（１８）のうち蛍光信号だけ干渉フィルター（１９）を通過させ雑音を除去した後、信号を超高感度検出器（２０）で検出した。あらかじめ上記［２］式により演算を行いヒドロキシルラジカル量が算出できるようにプログラムしておいたパソコンに、高感度検出器（２０）で検出した測定値を入力してヒドロキシルラジカル量も参考例１と同様に求めることができた。

この出願の発明の参考技術である血液中の酸素量を測定するための装置を模式的に示した図である。 この出願の発明による血液中のヒドロキシルラジカル量を測定するための装置を模式的に示した図である。 この出願の発明の参考技術の参考例１で求めた生データを示した図である。

１、１１−１、１１−２ レーザー発生装置
２、１２、１２−１（Ｐ偏光レーザー光）、１２−２（Ｓ偏光レーザー光） レーザー光
３、１３ 穴開き反射ミラー
１４ ブリュースター角入射用ガラス板
５、１５ ファイバープローブ
６、１６ 円錐形の先鋭部
７、１７ 円形開口
８、１８ 戻り光（散乱光信号または蛍光信号）、雑音信号（入射光の戻り光、周囲の光など）
９、１９ 干渉フィルター
１０、２０ 超高感度検出器
２１ 反射ミラー

Claims (4)

1. ２台のレーザー光を発生するレーザー発生装置と、
   先端に開口が形成され、それ以外の部分には光を遮断する被覆が施された先鋭部を有し、２台のレーザー発生装置からのレーザー光を入射し、開口からエバネッセント光を発生するファイバープローブと、
   エバネッセント光と、血液中のヒドロキシルラジカルとの相互作用により発生した蛍光を検出する検出手段と、
   検出手段からの検出結果に基づいて血液中のヒドロキシルラジカル量を演算する演算手段とからなることを特徴とする、レーザー光を用いた血液中のヒドロキシルラジカル量の測定装置。
2. エバネッセント光を発生したファイバープローブが、蛍光の取り込みを行うように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
3. ２台のレーザー光を発生させるレーザー装置において、
   一方のレーザー装置から発生させるレーザー光の波長が３５０ｎｍ、強度が１０〜１０００ｍＷであり、もう一方のレーザー装置から発生させるレーザー光の波長が２．９μｍ、強度が１０〜１０００ｍＷであることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定装置。
4. 蛍光を取り込むための別のファイバープローブを有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定装置。

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