JP4647456B2 - Screening method for TTK activity inhibitor using novel substrate - Google Patents
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本発明は、ＴＴＫ（ＴＴＫプロテインキナーゼ）活性抑制剤のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、ＴＴＫプロテインキナーゼの新規基質であるｐ３８ＭＡＰＫ（p38 Mitogen-activated protein kinase）又はその断片を用いたスクリーニング法に関する。 The present invention relates to a screening method for a TTK (TTK protein kinase) activity inhibitor. More specifically, the present invention relates to a screening method using p38 MAPK (p38 Mitogen-activated protein kinase) or a fragment thereof, which is a novel substrate of TTK protein kinase.
タンパク質キナーゼとは、他のタンパク質分子にリン酸基を付加する（リン酸化する）酵素である。タンパク質キナーゼは、ＡＴＰからタンパク質分子内のアミノ酸残基にある水酸基にリン酸基を移し共有結合させる活性を有する。多くのタンパク質キナーゼはタンパク質分子中のセリンとスレオニンの水酸基に反応するもの（セリン／スレオニンキナーゼ）、チロシンの水酸基に反応するもの（チロシンキナーゼ）、これら３種類全てに反応するもの（二重特異性キナーゼ）がある。タンパク質キナーゼの活性は精密に調節されており、タンパク質キナーゼ自身もリン酸化によって調節を受けることもある。これらの調節は他の活性化（又は抑制）タンパク質や低分子化合物の結合、細胞内での局在変化等によって起きる。 キナーゼの機能異常は病気の原因になることも多い。 Protein kinases are enzymes that add (phosphorylate) phosphate groups to other protein molecules. Protein kinases have an activity of transferring a phosphate group from ATP to a hydroxyl group at an amino acid residue in a protein molecule to covalently bond it. Many protein kinases react with hydroxyl groups of serine and threonine in protein molecules (serine / threonine kinase), react with hydroxyl groups of tyrosine (tyrosine kinase), react with all three types (dual specificity) Kinase). The activity of protein kinases is precisely regulated, and protein kinases themselves may be regulated by phosphorylation. These modulations are caused by binding of other activating (or suppressing) proteins and low molecular weight compounds, changes in localization within cells, and the like. Kinase dysfunction often causes illness.
ＴＴＫプロテインキナーゼ（配列番号：７）は、基質となるタンパク質中のセリン、スレオニン及びチロシン残基をリン酸化する（例えば、非特許文献１参照）二重特異性キナーゼである。キナーゼ活性を発現するのに必要とされるキナーゼドメインとして配列番号：５が知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。内因性の基質として、Mad1（例えば、非特許文献３参照）、Spcl10p（Nuflp）（例えば、非特許文献４参照）、CHK2（例えば、非特許文献５参照）等が知られている。ＴＴＫ発現は、細胞増殖と相関し、そして細胞周期の制御において役割を果たす。また、特許文献１には、ＴＴＫが悪性卵巣癌で発現していること、ＴＴＫの発現量を測定する工程を含むスクリーニング方法が記載されている。また、特許文献２には、ＴＴＫ活性の検出による癌細胞の特定方法、腫瘍成長を抑制する薬剤の特定に関する出願であり、スクリーニング方法としてtau、cdc25及びそれらの部分ペプチドを基質として利用したＴＴＫ活性測定方法が記載されている。
TTK protein kinase (SEQ ID NO: 7) is a bispecific kinase that phosphorylates serine, threonine, and tyrosine residues in a protein serving as a substrate (see, for example, Non-Patent Document 1). SEQ ID NO: 5 is known as a kinase domain required for expressing kinase activity (see, for example, Non-Patent
しかし、従来報告されている基質では、試験管内の酵素アッセイ系において、非常に弱い活性しか示さないために、ＴＴＫ活性抑制剤のスクリーニング方法には使用することが困難な状態にあった。
本発明の目的は、ＴＴＫプロテインキナーゼを用いた実験系において、新規基質を用いて、より効率的にＴＴＫ活性抑制剤をスクリーニングすることができる方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method capable of more efficiently screening for a TTK activity inhibitor using a novel substrate in an experimental system using TTK protein kinase.
本発明者らは、鋭意研究の結果、セリン/スレオニンキナーゼ基質スクリーニングキット（セルシグナリングテクノロジー社）を用いて、癌関連遺伝子であるＴＴＫプロテインキナーゼの新規基質であるｐ３８ＭＡＰＫを見出した。該ｐ３８ＭＡＰＫは、公知のＴＴＫ活性測定用基質であるcdc25と比較して約４倍のＴＴＫ活性を示した。
さらに、本研究者らは該ｐ３８ＭＡＰＫを用いる際に、標識としてビオチン誘導体である15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社）を用いることにより、基質の溶解度を改善した。該ビオチン誘導体で標識された新規基質は、cdc25と比べて約５倍のＴＴＫ活性を示した。
As a result of intensive studies, the present inventors have found p38MAPK, a novel substrate for TTK protein kinase, which is a cancer-related gene, using a serine / threonine kinase substrate screening kit (Cell Signaling Technology). The p38 MAPK showed a TTK activity about 4 times that of cdc25, which is a known substrate for measuring TTK activity.
Furthermore, when using the p38 MAPK, the present researchers use 15-([biotinoyl] amino) -4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid (Pierce) as a biotin derivative as a label. Improved solubility. The novel substrate labeled with the biotin derivative showed TTK activity about 5 times that of cdc25.
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）被検物質の存在下、
ＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法、
（２）該ＴＴＫ活性測定用基質が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなる、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）該ＴＴＫ活性測定用基質が、ビオチン、ビオチン誘導体、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれた一つで標識されたものである、（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法、
（４）該ＴＴＫプロテインキナーゼが、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、（１）〜（３）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）該ポリペプチドが、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつＴＴＫ活性を有するものであるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４）記載のスクリーニング方法、
（６）該ポリペプチドが、配列番号：９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４）記載のスクリーニング方法、
（７）該リン酸基供与体が、ＡＴＰである、（１）〜（６）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）該リン酸基供与体が放射性標識されたものであり、該ＴＴＫ活性用基質に転移したリン酸基の放射能を測定することにより該ＴＴＫ活性を測定する、（１）〜（７）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（９）リン酸化部位に特異的な抗体を使用することにより、該ＴＴＫ活性を免疫学的に測定する、（１）〜（７）いずれかに記載のスクリーニング方法。、に関する。
That is, the present invention
(1) (A) In the presence of a test substance,
TTK protein kinase,
A full-length or partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and one or several amino acids in the amino acid sequence other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 Incubating a substrate for measuring TTK activity comprising a polypeptide which may be deleted, added, inserted or substituted, and a phosphate group donor, and measuring TTK activity; and
(B) a method for screening a compound having a TTK activity inhibitory action or a salt thereof, comprising a step of selecting a test substance that decreases the TTK activity in the absence of the test substance,
(2) The substrate for measuring TTK activity is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. The screening method according to (1), comprising a polypeptide in which one or several amino acids in the amino acid sequence may be deleted, added, inserted or substituted,
(3) The substrate for measuring TTK activity is labeled with one selected from the group consisting of biotin, biotin derivative, peroxidase, β-D-galactosidase, alkaline phosphatase and microperoxidase, (1) or The screening method according to (2),
(4) An amino acid wherein the TTK protein kinase may have one or several amino acids deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and has kinase activity A screening method according to any one of (1) to (3), which is a polypeptide containing a sequence,
(5) An amino acid sequence wherein the polypeptide may have one or several amino acids deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and has TTK activity A screening method according to (4), which is a polypeptide comprising:
(6) The screening method according to (4), wherein the polypeptide is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 10.
(7) The screening method according to any one of (1) to (6), wherein the phosphate group donor is ATP,
(8) The phosphate group donor is radioactively labeled, and the TTK activity is measured by measuring the radioactivity of the phosphate group transferred to the substrate for TTK activity. (1) to (7 ) The screening method according to any of the above,
(9) The screening method according to any one of (1) to (7), wherein the TTK activity is immunologically measured by using an antibody specific for a phosphorylation site. , Regarding.
本発明のスクリーニング方法によって、ＴＴＫ活性抑制剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、ＴＴＫ活性抑制剤は、癌、免疫疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。 By the screening method of the present invention, a TTK activity inhibitor can be efficiently screened. The TTK activity inhibitor can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer, immune diseases and the like.
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。 The terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. In the following, the terms used in this specification will be explained.
「ＴＴＫプロテインキナーゼ」とは、配列番号：５記載のアミノ酸配列（配列番号：７記載のアミノ酸配列において５２５番目のTyrから７９１番目のValに相当する）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、例えば、配列番号：７記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつＴＴＫ活性を有するものであるアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。より詳しくは、配列番号：９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。 “TTK protein kinase” is a deletion of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (corresponding to the 791st Val from the 525th Tyr in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7). A polypeptide containing an amino acid sequence which may be added, inserted or substituted and has kinase activity, for example, in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, wherein one or several amino acids are deleted, Examples thereof include a polypeptide comprising an amino acid sequence which may be added, inserted or substituted and has TTK activity. More specifically, examples include a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 10.
本発明は新規ＴＴＫ活性測定用基質を用いることでＴＴＫプロテインキナーゼの活性を測定することである。そのため、ＴＴＫプロテインキナーゼは、ＴＴＫプロテインキナーゼ活性を有するポリペプチドであればよく、つまり、キナーゼ活性ドメインとして公知である配列番号：５記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであればよい。ポリペプチドの全長や修飾基の付加、アミノ酸残基の改変等は必要に応じて適宜選択され、本明細書に記載の配列のみに限定されない。 The present invention is to measure the activity of TTK protein kinase by using a novel substrate for measuring TTK activity. Therefore, TTK protein kinase may be a polypeptide having TTK protein kinase activity, that is, one or several amino acids are deleted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 known as a kinase activity domain. Any polypeptide that contains an amino acid sequence that may be inserted or substituted and that has kinase activity may be used. The total length of the polypeptide, addition of modifying groups, alteration of amino acid residues, and the like are appropriately selected as necessary, and are not limited to the sequences described herein.
また、以下の「タンパク質の製造方法」に記載のように、ＴＴＫプロテインキナーゼを単離・精製する際に、タンパク質単離・精製に利用されることが公知であるタグやペプチド等を用いることができる。該タグやペプチド等がＴＴＫプロテインキナーゼに付加したままでもＴＴＫプロテインキナーゼ活性に影響が少ない又は影響が無い場合には、該タグやペプチドが付加した状態でＴＴＫプロテインキナーゼを本発明のスクリーニング方法に利用することができる。例えば、実施例３において、本発明者らは、タンパク質の精製時に利用するＨｉｓタグ又はＧＳＴタグが付加したＴＴＫプロテインキナーゼを、ＴＴＫ活性測定に用いている。 In addition, as described in “Protein Production Method” below, when isolating and purifying TTK protein kinase, it is possible to use a tag or peptide that is known to be used for protein isolation and purification. it can. When the tag or peptide is still added to the TTK protein kinase, the TTK protein kinase is used in the screening method of the present invention when the tag or peptide is added when the TTK protein kinase activity is little or not affected. can do. For example, in Example 3, the present inventors use TTK protein kinase to which a His tag or GST tag used for protein purification is added for measuring TTK activity.
本発明において「ＴＴＫプロテインキナーゼの活性」及び「ＴＴＫ活性」とは、スレオニン及び／又はセリン及び／又はチロシンのリン酸化を意味する。特に、ｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）における１８０番目のスレオニン及び／又は１８２番目のチロシンのリン酸化を意味する。ＴＴＫ活性は、本発明のスクリーニング方法に使用する測定方法を用いて測定することが可能である。該測定方法に関しては、後述する。 In the present invention, “activity of TTK protein kinase” and “TTK activity” mean phosphorylation of threonine and / or serine and / or tyrosine. In particular, it means phosphorylation of threonine at position 180 and / or tyrosine at position 182 in p38 MAPK (SEQ ID NO: 1). TTK activity can be measured using the measurement method used in the screening method of the present invention. The measurement method will be described later.
該ポリペプチドがキナーゼ活性を有するか否かは、例えば、ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体を接触させ、ＴＴＫ活性を測定し、同一の条件における野生型ＴＴＫプロテインキナーゼのＴＴＫ活性と比較することにより、調べることができる。公知のＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸供与体を利用することができる。また、本発明記載の新規ＴＴＫ活性測定用基質を用いてもよい。具体的には、公知のＴＴＫ活性測定用基質又は本発明のＴＴＫ活性測定用基質を用いて、実施例３に記載の方法等に従ってＴＴＫ活性を測定・比較し、該ポリペプチドがキナーゼ活性を有するか否かを決定することができる。 Whether the polypeptide has kinase activity is determined by, for example, contacting the polypeptide, a substrate for measuring TTK activity, and a phosphate group donor, measuring TTK activity, and TTK of wild-type TTK protein kinase under the same conditions. It can be examined by comparing with activity. A known substrate for measuring TTK activity and a phosphate donor can be used. Further, the novel substrate for measuring TTK activity described in the present invention may be used. Specifically, using a known substrate for measuring TTK activity or the substrate for measuring TTK activity of the present invention, TTK activity is measured and compared according to the method described in Example 3, etc., and the polypeptide has kinase activity. Or not.
本発明において使用される新規「ＴＴＫ活性測定用基質」とは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドを意味する。例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド等が挙げられる。また、市販されているnonphospho-ｐ３８ＭＡＰＫ断片（セルシグナリングテクノロジー社）を用いることもできる。 The novel “substrate for measuring TTK activity” used in the present invention is the full-length or partial sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, A polypeptide in which one or several amino acids in the amino acid sequence other than the amino acid sequence described in 3 may be deleted, added, inserted or substituted. For example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is included. A commercially available nonphospho-p38 MAPK fragment (Cell Signaling Technology) can also be used.
ｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）は、MKK３やMKK６によって１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシンが共にリン酸化を受けることにより活性化することが知られている（J. Biol. Chem. 270(1995) 7420-7426）。そこで、本発明のＴＴＫ活性測定用基質として使用される「ｐ３８ＭＡＰＫ又はその断片」は、キナーゼによってリン酸化されることが知られている１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシン、さらにその前後のポリペプチドを含む断片であればよい。詳しくは、配列番号：３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるｐ３８ＭＡＰＫ若しくはその断片又はそれらの誘導体を意味する。「ｐ３８ＭＡＰＫの断片」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列の一部を意味する。「ｐ３８ＭＡＰＫ又はその断片の誘導体」とは、配列番号：１記載のアミノ酸配列又はその一部において、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。さらに詳しくは、例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、１位のＭｅｔから１７７位のＡｓｐまでのアミノ酸及び１８５位のＴｈｒから３６０位のＳｅｒまでのアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
p38MAPK (SEQ ID NO: 1) is known to be activated by phosphorylation of both the threonine at position 180 and tyrosine at position 182 by MKK3 and MKK6 (J. Biol. Chem. 270 (1995)). 7420-7426). Therefore, the “p38 MAPK or a fragment thereof” used as a substrate for measuring TTK activity of the present invention is the 180 th threonine and 182 th tyrosine, which are known to be phosphorylated by a kinase, and polypeptides before and after that. As long as it contains fragments. Specifically, it means p38MAPK consisting of a polypeptide containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a fragment thereof, or a derivative thereof. “A fragment of p38 MAPK” means a part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. “A derivative of p38 MAPK or a fragment thereof” means a modified polypeptide obtained by adding a modifying group in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or a part thereof, a variant obtained by altering an amino acid residue Examples thereof include polypeptides. More specifically, for example, in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, one or several amino acids of Met at
また、実施例３で得られた新規のＴＴＫ活性測定用基質であるｐ３８ＭＡＰＫペプチドはコア・シークエンスとして配列番号：３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであることがキット添付の説明書に記載されている。また、通常、あるキナーゼの基質として働くためには、約１０アミノ酸以上は必要であり、かつ、該キナーゼによりリン酸化される部位及びその前後の配列を持つポリペプチドであればよいと考えられる。そのため、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、１０アミノ酸以上の配列であれば、ポリペプチドの長さは適宜選択され、本明細書に記載の配列のみに限定されない。詳しくは、配列番号：１記載のアミノ酸配列において、配列番号：３に記載のアミノ酸配列以外の部分の何れかを欠失した断片、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列のN端側及び／又はＣ端側のアミノ酸が、５０〜１７５個、または１００〜１７５個、または１５０〜１７５個欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。つまり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含み、１０〜３６０アミノ酸残基からなる配列番号：１に記載のアミノ酸配列の断片、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む１０〜３６０個、または１０〜２６０個、または１０〜１６０個、または１０〜６０個のアミノ酸からなる配列番号：１に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド等を意味する。 In addition, the p38 MAPK peptide, which is a novel substrate for measuring TTK activity obtained in Example 3, is described in the instructions attached to the kit as a polypeptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 as a core sequence. Yes. In general, in order to act as a substrate for a certain kinase, about 10 amino acids or more are necessary, and it is considered that any polypeptide having a site that is phosphorylated by the kinase and sequences before and after the site is considered. Therefore, it is a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the length of the polypeptide is appropriately selected as long as it is a sequence of 10 amino acids or more, and is not limited to only the sequence described herein. Specifically, in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a fragment obtained by deleting any part other than the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, such as the N-terminal side of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and And / or a polypeptide having an amino acid sequence in which 50 to 175, 100 to 175, or 150 to 175 amino acids on the C-terminal side are deleted. That is, the fragment of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and consisting of 10 to 360 amino acid residues, for example, 10 to 360 including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3. Or a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, consisting of 10 or 260, 10 to 160, or 10 to 60 amino acids.
該ＴＴＫ活性測定用基質には、ラベルが付加していてもよい。ラベルとしては、ビオチン、ビオチン誘導体、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。好ましくは、ビオチン又はビオチン誘導体を用いることができる。ビオチン誘導体としては、例えば、15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社）等が挙げられる。 A label may be attached to the substrate for measuring TTK activity. Examples of the label include biotin, biotin derivative, peroxidase, β-D-galactosidase, alkaline phosphatase, microperoxidase and the like. Preferably, biotin or a biotin derivative can be used. Examples of biotin derivatives include 15-([biotinoyl] amino) -4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid (Pierce).
「リン酸基供与体」としては、ＡＴＰ及びその標識ラベル体等が挙げられる。該リン酸基供与体は、放射性標識（例えば、33P、32P、35S等）で標識されていてもよい。 Examples of the “phosphate group donor” include ATP and a labeled label thereof. The phosphate group donor may be labeled with a radioactive label (for example, 33 P, 32 P, 35 S, etc.).
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列」とは、例えば、（A）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（B）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（C）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（D）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（E）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有す
るタンパク質が挙げられる。
“Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, added, inserted or substituted” means, for example, (A) one or two or more (preferably about 1 to 30 in the amino acid sequence, preferably An amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably (1 to 5) amino acids have been deleted, and (B) one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 30, preferably 1) About 10 to 10 amino acids, more preferably a number (1-5) amino acids added, (C) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 10) amino acid sequences An amino acid sequence into which about (1 to 5) amino acids have been inserted, or (D) one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 10) About one, more preferably a number (1 (5) A protein containing an amino acid sequence in which amino acids are substituted with other amino acids, or (E) an amino acid sequence combining them.
上記「欠失」とは、１つ以上のアミノ酸残基が、それぞれ、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に存在していない、アミノ酸配列のいずれかにおける変化として規定される。 The above “deletion” is defined as a change in any of the amino acid sequences in which one or more amino acid residues are not present when compared to the reference amino acid sequence (amino acid sequence of the wild type protein), respectively. The
上記「挿入」又は「付加」とは、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、１つ以上のアミノ酸残基の付加を生じた、アミノ酸配列中又はアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端における変化である。 The above “insertion” or “addition” means that in the amino acid sequence or in the amino acid sequence that resulted in the addition of one or more amino acid residues, respectively, when compared to the reference amino acid sequence (amino acid sequence of the wild-type protein) Changes at the N-terminus or C-terminus.
上記「置換」とは、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、異なるアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換から生じる。 The above “substitution” results from substitution of one or more amino acids by different amino acids, respectively, when compared to a reference amino acid sequence (amino acid sequence of a wild-type protein).
アミノ酸配列が欠失、付加、挿入又は置換されている場合、明細書中に各別の規定がある場合を除き、その欠失、付加、挿入又は置換の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用されるＴＴＫプロテインキナーゼは、欠失、付加、挿入又は置換によっても、キナーゼ活性を有するポリペプチドである。例えば、配列番号：５、７及び９に記載のアミノ酸配列と少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％（約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はより上であり得る）、配列類似性又は配列同一性を有する部分ペプチドを挙げることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の欠失、付加、挿入又は置換は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。 When the amino acid sequence is deleted, added, inserted or substituted, the position of the deleted, added, inserted or substituted is not particularly limited unless otherwise specified in the specification. However, the TTK protein kinase used in the present invention is a polypeptide having kinase activity even by deletion, addition, insertion or substitution. For example, at least about 65%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 85% (about 90%, about 91%, about 92%, about 93) with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 5, 7, and 9. %, About 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99% or higher), partial peptides having sequence similarity or sequence identity. Deletion, addition, insertion or substitution of the amino acid sequence of the polypeptide can be carried out by site-directed mutagenesis which is a well-known technique before filing.
ＴＴＫプロテインキナーゼ、ｐ３８ＭＡＰＫ、それらの断片及び誘導体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、作製することができる。 TTK protein kinase, p38 MAPK, fragments and derivatives thereof are described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) (Current Protocol in Bio94) For example, it can be manufactured by the following method.
ヒトの脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを取得する。また、オリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。こうして得られたＤＮＡを適切な制限酵素で切断することにより、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。 Proteins of interest by constructing cDNA libraries from human brain, heart, skeletal muscle, spleen, kidney, liver, small intestine, placenta, human normal cells derived from these tissues, and human umbilical vein endothelial cells by conventional methods DNA encoding is obtained. The target protein can also be encoded by performing PCR using oligonucleotides as sense and antisense primers and cDNA prepared from mRNA of cells expressing mRNA complementary to these DNAs as a template. DNA can be prepared. A DNA encoding the target protein can be obtained by cleaving the thus obtained DNA with an appropriate restriction enzyme.
さらに、アミノ酸配列に基づいて、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを化学合成することによって、調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。 Furthermore, it can be prepared by chemically synthesizing DNA encoding the target protein based on the amino acid sequence. The chemical synthesis of DNA can be performed using a Shimadzu DNA synthesizer using the thiophosphite method, a Perkin Elmer DNA synthesizer model 392 using the phosphoramidite method, or the like.
上記の方法で得られた目的のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、目的のタンパク質を生産する形質転換体を得ることができる。 Recombinant DNA (expression plasmid) is prepared by inserting the DNA encoding the target protein obtained by the above method downstream of the promoter of an appropriate expression vector. A transformant producing the target protein can be obtained by introducing the expression plasmid into a host cell suitable for the expression vector.
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、目的のタンパク質をコードする遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 Any host cell can be used as long as it can express the target gene, such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells. As the expression vector, a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position suitable for transcription of a gene encoding the protein of interest is used.
（ｉ）細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合
目的のタンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、目的のタンパク質、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもロシュダイアグノスティックス社より市販）、pKK233-2（アマシャムバイオサイエンス社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社製〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、pTrs30（FERM BP-5407）、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM B-6798)、pTerm2（特開平3-22979、US4686191、US4939094、US5160735）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pGEX（アマシャムバイオサイエンス社製）、p ETシステム（ノバジェン社製）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus（インビトロジェン社製）、pMAL-c2（New England Biolabs社製）、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる 。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp x2）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。目的のタンパク質の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
(I) When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell An expression vector for a target protein is capable of autonomous replication in a prokaryote, and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a target protein, and a transcription termination sequence. It is preferable that A gene that controls the promoter may also be included.
Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all available from Roche Diagnostics), pKK233-2 (Amersham Biosciences), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega) PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (JP-A 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK + (Stratagene), pBluescript II SK (-) (Stratagene) ), PTrs30 (FERM BP-5407), pTrs32 (FERM BP-5408), pGHA2 (FERM BP-400), pGKA2 (FERM B-6798), pTerm2 (JP 3-22979, US4686191, US4939094, US5160735), pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (manufactured by Amersham Biosciences), pET system (manufactured by Novagen), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pTrxFus (in vitro Emissions Co.), pMAL-c2 (manufactured by New England Biolabs, Inc.), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Bio Inc.), pUC118 (Takara Bio Inc.), pPA1 (JP 63 -233798) and the like.
Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host cell such as Escherichia coli. For example, trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, such as PSE promoter, promoter derived from E. coli, phage and the like, can be mentioned SPO1 promoter, SPO2 promoter, the penP promoter, and the like. An artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp x2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases). Although the transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the gene of the target protein, it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
Examples of host cells include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and other microorganisms such as Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 (DEcher3a BL21DE ) pLysS, Escherichia coli HMS174 (DE3), Escherichia coli HMS174 (DE3) pLysS, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ameviliquemevici Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacteriu Examples thereof include m glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Pseudomonas sp. D-0110 and the like.
As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, electroporation [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (JP 63-2483942), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) and the like.
（ｉｉ）酵母を宿主細胞として用いる場合
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
(Ii) When yeast is used as a host cell When a yeast strain is used as a host cell, examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like. Can do. Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.For example, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter,
Examples of host cells include yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, etc., specifically, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, , Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris and the like. As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, electroporation method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)], spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978) and the like.
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主細胞として用いる場合
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ３, １３３ (１９９０)〕、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平05-336963）〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標） ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標） ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）等を例示することができる。使用されるベクターとしては、前記遺伝子を組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよい。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Long Terminal Repeat Promoter）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞又はNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637（特開昭63−299）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7、ヒト大腸癌細胞株としてはHCT-15等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
In (iii) where the animal cells used if animal cells used as host cells as the host cell, the expression vector, for example, (commercially available from Funakoshi Co.) pcDNAI / Amp, pcDNAI, pCDM8, pAGE107 [JP-3- 22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pCR-BluntII-TOPO, pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAMo, pAMoA [J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 (1993), also known as pAMoPRSA (Japanese Patent Laid-Open No. 05-336963)], pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pHM6, pHB6 (manufactured by Roche Diagnostics), pKK223-3, pGEX (Amersham Bioscience), pET-3, pET-11, pBluees scriptII (registered trademark) SK (+), pBluescript II (registered trademark) SK (-) (manufactured by Stratagene), pUC19, pTrxFus (manufactured by Invitrogen), pUC118, pSTV28 (manufactured by Takara Bio), pMAL-c2X (new) England Biolabs) and the like. The vector used may be any vector as long as it can be expressed in animal cells by incorporating the gene.
Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells. For example, cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, Moloney Mullin Leukemia Examples thereof include a virus (Moloney Murine Leukemia Virus) long terminal repeat promoter, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, an SRα promoter, and a metallothionein promoter. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
Host cells include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, Chinese hamster cells, CHO cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, human cells, Namalwa cells or Namalwa KJM-1. Examples thereof include cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299), and human colon cancer cell lines. As mouse myeloma cells, SP2 / 0, NSO, etc., as rat myeloma cells, YB2 / 0, etc., as human fetal kidney cells, as HEK293 (ATCC: CRL-1573), as human leukemia cells, as BALL-1 etc. Examples of African green monkey kidney cells include COS-1 and COS-7, and examples of human colon cancer cell lines include HCT-15.
As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells. For example, electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 2). -227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], virology, 52, 456 (1973), and the like.
（ｉｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる場合
植物細胞又は植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕に準じてタンパク質を生産することができる。発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
(Iv) When plant cells are used as host cells When plant cells or plant individuals are used as hosts, known methods [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] can be produced. Examples of the expression vector include Ti plasmid and tobacco mosaic virus vector.
Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, for example, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter,
Examples of host cells include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, carrot, wheat, barley, rye, alfalfa and flax.
As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells. For example, Agrobacterium (JP 59-140885, JP 60-70080, WO94 / 00977), electroporation method (Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887), a method using a particle gun (gene gun) (Patent No. 2606856, Patent No. 2517813), and the like.
（ｖ）昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork (1992)〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Current Protocols in Molecular Biology）、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
(V) When insect cells are used as host cells When insect cells are used as hosts, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, NewYork ( 1992)], Molecular Biology, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology Supplements 1-38 (Current Protocols in Molecular Biology), Bio / Technology, 6 , 47 (1988), etc., can be used to express the protein.
That is, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into the insect cells to express the protein. it can. Examples of gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
As the baculovirus, for example, an autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects the night stealing insects, can be used.
As insect cells, Spodoptera frugiperda ovary cells, Trichoplusia ni ovary cells, silkworm ovary-derived cultured cells, and the like can be used. Spodoptera frugiperda ovarian cells include Sf9, Sf21 (Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual), Trichoplusia ni ovarian cells High 5, BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen), etc. Examples of cultured cells derived from the ovary include Bombyx mori N4.
Examples of the method for co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-27075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84,7413 (1987)].
In addition, DNA can be introduced into insect cells using a method similar to the method for introducing DNA into animal cells. For example, electroporation (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), calcium phosphate method (special Kaihei 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
（ｖi）培養方法
目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする目的のタンパク質を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、目的のタンパク質を製造することができる。
(Vi) Culture method When the transformant having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the target protein is a cell such as Escherichia coli, yeast, animal cell or plant cell, normal culture suitable for various hosts The protein can be produced by culturing according to the method, producing and accumulating the protein, and recovering the protein from the transformant or the culture solution. When the transformant is an individual animal or plant individual, it is bred or cultivated according to a normal growth method suitable for various hosts, the protein is produced and accumulated, and the protein is recovered from the animal individual or plant individual. The protein can be produced.
When the host is an animal individual, for example, a non-human transgenic animal carrying DNA encoding the target protein is bred, and the target protein encoded by the recombinant DNA is produced and accumulated in the animal, By recovering the protein from the animal individual, the target protein can be produced. Examples of the production / accumulation location in an animal individual include milk, saliva, eggs and the like of the animal.
When the host is a plant individual, for example, a transgenic plant having a DNA encoding the target protein is cultivated, and the target protein encoded by the recombinant DNA is produced and accumulated in the plant individual. By recovering the protein from the inside, the target protein can be produced.
When the host is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, for example, a transformant having a DNA encoding the target protein is cultured in a medium, and the target encoded by the recombinant DNA A target protein can be produced by producing and accumulating protein in a culture solution and recovering the protein from the culture solution.
目的のタンパク質の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
The method of culturing a transformant of the target protein in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
As a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the organism. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently be cultured.
When the transformant is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the medium for culturing the obtained transformant contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host. As long as the medium can efficiently culture the transformant, either a natural medium or a synthetic medium may be used. As a medium for culturing a transformant whose host is Escherichia coli, for example, a YT medium containing bactotryptone, yeast extract and sodium chloride is preferable.
Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by each microorganism. Glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol Alcohols such as propanol can be used.
As the nitrogen source, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of various inorganic and organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing substances, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used. The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
目的のタンパク質製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122,501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的のタンパク質製造用形質転換体が昆虫細胞である場合、該細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Grace's InsectMedium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, indole acrylic in the case of a microorganism transformed with an expression vector using isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or the like, the trp promoter in the case of a microorganism transformed with an expression vector using lac promoter An acid or the like may be added to the medium. Plant cells and organs into which a gene has been introduced can be cultured in large quantities using a jar fermenter. As a medium for culturing, generally used Murashige and Skoog (MS) medium, White medium, or a medium obtained by adding plant hormones such as auxin and cytokinin to these mediums can be used.
When the target transformant for protein production is an animal cell, the culture medium for culturing the cell is a commonly used RPMI1640 medium (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle's MEM Medium (Science, 122,501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) or fetal calf serum etc. A medium or the like to which is added is used.
The culture is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as
When the target transformant for protein production is an insect cell, the culture medium for cultivating the cell includes a commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BRL). ExCell400, ExCell405 [all manufactured by JRH Biosciences], Grace's InsectMedium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
（ｖｉｉ）タンパク質の製造方法
目的のタンパク質製造用形質転換体の培養物から、目的のタンパク質を単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、目的のタンパク質が目的のタンパク質製造用形質転換体の細胞外に該タンパク質が分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
目的のタンパク質が目的のタンパク質製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
(Vii) Protein Production Method To isolate and purify the target protein from the culture of the target protein-producing transformant, a normal enzyme isolation / purification method can be used. For example, when the target protein is secreted outside the target protein-producing transformant, the culture is treated by a method such as centrifugation to obtain a soluble fraction. From the soluble fraction, solvent extraction, desalting with ammonium sulfate or the like, precipitation with an organic solvent, (DEAE) - Sepharose, anion using DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei Corporation Co., Ltd.) Resin Exchange chromatography method, cation exchange chromatography method using resin such as SP-Sepharose FF (Amersham Biosciences), hydrophobic chromatography method using resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose, molecular sieve A purified preparation can be obtained by using a gel filtration method, an affinity chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
When the target protein accumulates in the dissolved state in the cells of the target protein-producing transformant, the culture is centrifuged to collect the cells in the culture, wash the cells, and then A cell-free extract is obtained by crushing cells with a sonicator, French press, Manton Gaurin homogenizer, Dynomill or the like. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei Co., Ltd.) Anion exchange chromatography using resin, SP-Sepharose FF (Amersham Biosciences) cation exchange chromatography, resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose Purified preparations can be obtained using techniques such as hydrophobic chromatography using gel, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoretic methods such as isoelectric focusing .
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法〔J. Evan. Sadler ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymology)，83,458〕に準じて精製できる。また、目的のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性を持つ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，13, 469-474(1995)〕。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86, 8227 (1989)、GenesDevelop., 4, 1288 （1990)〕に記載の方法に準じて、目的のタンパク質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
In addition, when the protein is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the protein is recovered by a conventional method from the precipitate fraction obtained by crushing the cell and then performing centrifugation in the same manner. Thereafter, the insoluble material of the protein is solubilized with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution that does not contain a protein denaturant or the protein denaturant has such a concentration that the protein is not denatured. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method.
Further, the protein can be purified according to a conventional protein purification method [J. Evan. Sadler et al .: Methods in Enzymology, 83,458]. In addition, the target protein can be produced as a fusion protein with other proteins and purified using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)]. For example, according to the method described in the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), GenesDevelop., 4, 1288 (1990)], the target protein is protein A. And can be purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
また、目的のタンパク質をＨｉｓタグ又はＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、金属キレート又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Methods Enzymol., 326, 245 (2000)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)〕。
更に、目的のタンパク質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。目的のタンパク質は、公知の方法〔J. Biomolecular NMR, 6, 129-134、Science, 242, 1162-1164、J.Biochem., 110, 166-168 (1991)〕に準じて、in vitro転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたタンパク質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても目的のタンパク質を製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Advanced ChemTech ）社、パーキン・エルマー社、アマシャムバイオサイエンス社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Protein Technology Instrument）社、シンセセル・ベガ（Synthecell−Vega）社、パーセプティブ（PerSeptive）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した目的のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
In addition, the target protein can be produced as a fusion protein with a His tag or a FLAG peptide, and purified by affinity chromatography using a metal chelate or an anti-FLAG antibody [Methods Enzymol., 326, 245 (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].
Furthermore, it can also be purified by affinity chromatography using an antibody against the target protein itself. The target protein can be transcribed in vitro according to known methods (J. Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166-168 (1991)). Can be produced using a translation system.
Based on the amino acid information of the protein obtained above, the target protein can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). it can. Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Amersham Biosciences, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive It can also be chemically synthesized using a peptide synthesizer such as Shimadzu Corporation.
The structure analysis of the purified target protein can be performed by a method usually used in protein chemistry, for example, a method described in Protein structure analysis for gene cloning (Hirano Hisashi, published by Tokyo Kagaku Dojin, 1993).
「部分ペプチド」は、上記タンパク質の合成法に従って、あるいは目的のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。 The “partial peptide” can be produced according to the above protein synthesis method or by cleaving the target protein with an appropriate peptidase.
「誘導体」は、上記タンパク質の合成法に従って、あるいは目的タンパク質を用いて出願前周知技術である部位特異的変異誘発法等により製造することができる。 The “derivative” can be produced according to the above-described protein synthesis method, or using the target protein by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique before filing.
本発明は、ＴＴＫ活性抑制剤のスクリーニング方法に関する。該スクリーニング方法は、被検物質である化合物又はその塩の存在下、新規ＴＴＫ活性測定用基質であるｐ３８ＭＡＰＫを用いることにより、ＴＴＫプロテインキナーゼによる基質のスレオニン及び／又はチロシンのリン酸化を検出又は測定することを１つの特徴とする。例えば、被検物質である化合物又はその塩の存在下、ＴＴＫプロテインキナーゼによるｐ３８ＭＡＰＫ（配列番号：１）の１８０番目のスレオニン及び／又は１８２番目のチロシンのリン酸化を検出又は測定することによって本発明を利用することができる。ＴＴＫ活性に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における活性を対照として調べるのが好適である。 The present invention relates to a screening method for a TTK activity inhibitor. The screening method detects or measures phosphorylation of threonine and / or tyrosine of a substrate by TTK protein kinase by using p38MAPK, which is a novel substrate for measuring TTK activity, in the presence of a compound as a test substance or a salt thereof. One feature is to do this. For example, the present invention detects or measures phosphorylation of the 180th threonine and / or the 182th tyrosine of p38MAPK (SEQ ID NO: 1) by TTK protein kinase in the presence of a compound to be tested or a salt thereof. Can be used. The influence of the test substance on the TTK activity is preferably examined using the activity in the absence of the test substance as a control.
また、本発明のスクリーニング方法は、ＴＴＫ活性抑制剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。 In addition, the screening method of the present invention can be used for pharmacological evaluation of candidate compounds for TTK activity inhibitors.
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（Ａ）被検物質の存在下、
ＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長又は部分配列であって、配列番号：３を含み、配列番号：３以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
As a screening method of the present invention, specifically,
(A) In the presence of the test substance,
TTK protein kinase,
A full-length or partial sequence of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, comprising SEQ ID NO: 3, wherein one or several amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence other than SEQ ID NO: 3. A step of measuring a TTK activity by incubating a substrate for measuring TTK activity comprising a polypeptide which may be optionally present, and a phosphate group donor; and
(B) A method for screening a compound having a TTK activity-inhibiting action or a salt thereof, comprising a step of selecting a test substance that reduces the activity of TTK in the absence of the test substance.
前記工程（Ａ）の「インキュベーション」は、ＴＴＫプロテインキナーゼ、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体の、それぞれキナーゼ、基質、供与体としての本来の機能を妨げない溶液中において、被験物質、ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体とを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持する（すなわち、反応させる）ことによって行われ得る。 The “incubation” in the step (A) includes a test substance, a solution of TTK protein kinase, a substrate for measuring TTK activity, and a phosphate group donor that does not interfere with the original functions of the kinase, substrate, and donor, respectively. It can be carried out by mixing the polypeptide, the substrate for measuring TTK activity, and the phosphate group donor, and maintaining (ie, reacting) them under appropriate reaction conditions, for example, under an appropriate reaction temperature and reaction time.
前記「ポリペプチド、ＴＴＫ活性測定用基質及びリン酸基供与体の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液が挙げられる。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが挙げられる。 Examples of the “solution that does not interfere with the original functions of the polypeptide, the substrate for measuring TTK activity, and the phosphate group donor” include solutions such as HEPES buffer and Tris buffer. Preferably, a Tris buffer is used.
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、前記溶液中、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ６．５〜８．５、さらに好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ７．５で、通常、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃、さらに好ましくは３０℃、通常、１分間〜２４時間、好ましくは３分間〜８時間、より好ましくは５分間〜３時間、さらに好ましくは１時間維持すること等が挙げられる。 Further, the “appropriate reaction conditions” are not particularly limited. For example, in the solution, the pH is 5.0 to 10.0, preferably 6.5 to 8.5, and more preferably 7.0 to pH 7.0. 8.0, more preferably pH 7.5, usually 10 ° C to 50 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, more preferably 25 ° C to 37 ° C, more preferably 30 ° C, usually 1 minute to 24 hours. And preferably 3 minutes to 8 hours, more preferably 5 minutes to 3 hours, and still more preferably 1 hour.
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、ＴＴＫプロテインキナーゼをコードする遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。 Examples of the test substance include a compound or a salt thereof. In addition, in this specification, the said compound or its salt contains a low molecular compound, a high molecular compound, polypeptide or its derivative (s), a nucleic acid or its derivative (s), etc. Such a test substance may be a natural substance or a non-natural substance. Examples of polypeptide derivatives include modified polypeptides obtained by adding modifying groups, variant polypeptides obtained by altering amino acid residues, and the like. Examples of nucleic acid derivatives include modified nucleic acids obtained by adding modifying groups, variant nucleic acids obtained by modifying bases, peptide nucleic acids, and the like. Nucleic acids also include siRNA, antisense strand RNA, ribozymes and the like that can induce RNAi against a gene encoding TTK protein kinase.
また、上記スクリーニング方法でＴＴＫ活性を測定する際、工程（Ａ）において、金属イオンを共にインキュベーションすることが好ましい。「金属イオン」としては、２価金属イオンが好ましく、例えば、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、 Co2+ 等が挙げられる。特に、Mg2+及びMn2+が好ましい。 Moreover, when measuring TTK activity by the said screening method, it is preferable to incubate a metal ion together in a process (A). The “metal ion” is preferably a divalent metal ion, and examples thereof include Mg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , and Co 2+ . In particular, Mg 2+ and Mn 2+ are preferable.
本発明において、ＴＴＫ活性を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、ＴＴＫ活性を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、（１）標識されたリン酸基供与体を使用する方法、（２）リン酸化部位に特異的な抗体を使用する方法等が挙げられる。 In the present invention, the method for measuring TTK activity is not particularly limited, and methods generally known in the art as methods for measuring TTK activity can be used. For example, (1) a method using a labeled phosphate group donor, (2) a method using an antibody specific for the phosphorylation site, and the like can be mentioned.
（１）標識されたリン酸基供与体を使用する方法は、検出可能なラベル、例えば、放射活性又は発色性ラベルで標識されたリン酸基供与体を使用し、リン酸基の基質への移行時に該標識を定量することによって行うことができる。
放射活性ラベルとしては、33P、32P、35S等が挙げられる。放射活性ラベルで標識されたリン酸基供与体を使用する場合、リン酸基を基質に移行させ、直接定量することができる。定量法としては、シンチレーション計数法又はオートラジオグラフィー法等が挙げられる。
(1) The method using a labeled phosphate group donor uses a phosphate group donor labeled with a detectable label, for example, a radioactive or chromogenic label, and the phosphate group to the substrate This can be done by quantifying the label at the time of transition.
Examples of radioactive labels include 33 P, 32 P, and 35 S. When a phosphate group donor labeled with a radioactive label is used, the phosphate group can be transferred to a substrate and directly quantified. Examples of the quantitative method include a scintillation counting method and an autoradiography method.
（２）リン酸化部位に特異的な抗体を使用する方法は、ＴＴＫ活性測定用基質を、ポリペプチドによるリン酸化時に、特異的抗体によって認識し得るエピトープとして使用し、リン酸化を定量することによって行うことができる。
該方法に有用な抗体としては、例えば、Phospho-ｐ３８ＭＡＰＫ(Thr180)(Tyr182)(28B10)MAb（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号9216）p-p38(Thr180/Tyr182)-R（サンタクルーズ社、カタログ番号 sc-23763-R）、rabbit anti-phospho-p38 MAPK (THR180/TYR182)（ケミコン社、カタログ番号 AB3828）等が挙げられる。また、該抗体は、ＴＴＫ活性測定用基質、例えばｐ３８ＭＡＰＫの１８０番目のスレオニン及び１８２番目のチロシンを含むペプチド断片を抗原として使用し、標準方法に従ってポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することによって得ることができる。かかる抗体は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。定量法としては、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、Harlow及びLane，Anti bodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載の方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
(2) A method of using an antibody specific for a phosphorylation site uses a substrate for measuring TTK activity as an epitope that can be recognized by a specific antibody at the time of phosphorylation with a polypeptide, and quantifies phosphorylation. It can be carried out.
Examples of antibodies useful for the method include Phospho-p38MAPK (Thr180) (Tyr182) (28B10) MAb (Cell Signaling Technology, catalog number 9216) p-p38 (Thr180 / Tyr182) -R (Santa Cruz, catalog) No. sc-23763-R), rabbit anti-phospho-p38 MAPK (THR180 / TYR182) (Chemicon, catalog number AB3828) and the like. The antibody can be obtained by preparing a polyclonal or monoclonal antibody according to a standard method using a substrate for measuring TTK activity, for example, a peptide fragment containing the threonine at position 180 and tyrosine at 182 of p38 MAPK as an antigen. . Such an antibody may be labeled with a conventional enzyme (for example, peroxidase), a fluorescent dye, a radioactive substance, avidin or biotin. There are various assay formats known to those skilled in the art for quantification. For example, the method described in Harlow and Lane, Anti bodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 can be used. For example, an ELISA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, an immunohistochemical staining method and the like can be mentioned.
その他、蛍光消光（Fluorescence Re sonance Energy Transfer、"FRET"）アッセイを使用してＴＴＫ活性を測定することもできる。ドナーを上記リン酸化部位に特異的な抗体に結合させ、アクセプターを、上記リン酸化部位を含まない部分を認識する抗体又は基質に付加されたタグを認識するタンパク質と結合させる。ドナー及びアクセプターの組み合わせとしては、ユウロピウム（Eu）とアロフィコシアニン（APC）、EuとCy5等が挙げられる。蛍光をフルオロメーター内で、励起波長及び発出波長で測定する。被検物質がＴＴＫ活性を調節（抑制または亢進）する作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが変化する。例えば、被検物質がＴＴＫ活性抑制作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが低下する。 In addition, TTK activity can also be measured using a Fluorescence Resonance Energy Transfer (“FRET”) assay. A donor is bound to an antibody specific for the phosphorylation site, and an acceptor is bound to an antibody that recognizes a portion that does not include the phosphorylation site or a protein that recognizes a tag attached to a substrate. Examples of donor and acceptor combinations include europium (Eu) and allophycocyanin (APC), Eu and Cy5, and the like. Fluorescence is measured at the excitation and emission wavelengths in a fluorometer. When the test substance has an effect of regulating (suppressing or enhancing) TTK activity, the detectable signal is changed as compared with a control sample in which no test substance is present. For example, when the test substance has a TTK activity inhibitory action, the detectable signal is reduced as compared to a control sample in which no test substance is present.
上記方法により、種々の被験物質の存在下におけるポリペプチドのＴＴＫ活性を測定することによって、ＴＴＫ活性抑制能を有する物質を選抜するスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質下における活性が、被検物質非存在下における活性より有意な減少を示す物質を、ＴＴＫ抑制能を有する物質として選抜することができる。このように選抜された物質はＴＴＫ活性抑制剤の有効成分として使用され得る。 By the method described above, screening for selecting a substance having the ability to suppress TTK activity can be performed by measuring the TTK activity of the polypeptide in the presence of various test substances. For example, a substance that shows a significant decrease in activity under the test substance as compared with the activity in the absence of the test substance can be selected as a substance having TTK inhibitory ability. The substance thus selected can be used as an active ingredient of a TTK activity inhibitor.
本発明は、新規ＴＴＫ活性測定用基質としてｐ３８ＭＡＰＫ及びその断片を使用するという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、効果的にＴＴＫ活性抑制剤の候補化合物を選択することができる。 The present invention relates to a screening method characterized by using p38MAPK and a fragment thereof as a novel substrate for measuring TTK activity, and known methods can be used as detection methods. It is useful in screening to assay compounds, particularly in high throughput screening (HTS). If this invention is implemented, the candidate compound of a TTK activity inhibitor can be selected effectively.
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、ＴＴＫ活性の上昇に関連して発症する疾患に対する治療又は予防作用を発揮し得る。例えば、本発明のスクリニーング方法によれば、ＴＴＫ活性の上昇が関与して発症する癌、免疫疾患等に有効な治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。 The compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can exert a therapeutic or preventive action against a disease that develops in association with an increase in TTK activity. For example, according to the screening method of the present invention, it is possible to screen candidate compounds for therapeutic or prophylactic agents effective for cancers, immune diseases and the like that develop due to an increase in TTK activity.
上記「癌」としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍等の種々の悪性新生物が例示され、大腸癌及び肝癌等が包含され、さらにこれら癌の転移をも包含する。 Examples of the “cancer” include various malignant neoplasms such as solid cancer, hemangioma, hemangioendothelioma, sarcoma, Kaposi sarcoma, and hematopoietic tumor, and include colon cancer, liver cancer, etc., and metastasis of these cancers Is also included.
「免疫疾患」としては、例えば、アトピー、喘息、リウマチ、膠原病、アレルギー等が例示される。 Examples of the “immune disease” include atopy, asthma, rheumatism, collagen disease, allergy and the like.
また、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、ＴＴＫプロテインキナーゼに関連する疾患、例えば、ＴＴＫプロテインキナーゼが関与する癌、免疫疾患等の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。 In addition, the compound obtained by the screening method or a salt thereof provides a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of diseases related to TTK protein kinase, for example, cancer, immune disease and the like involving TTK protein kinase. The
上記医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、該医薬組成物は、ＴＴＫプロテインキナーゼに関連して発症する疾患に対して、該酵素の活性の抑制を介して作用し得るという優れた効果を発揮する。例えば、本発明の医薬組成物は、癌、免疫疾患等、特に、ＴＴＫ活性に関連して発症する癌、免疫疾患等に対して、該酵素活性の抑制を介して作用し得るという優れた効果を発揮する。該医薬組成物を癌の治療又は予防に用いる場合は、通常の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、とりわけ腫瘍細胞を事前感応化するためのDNA劣化剤を施すのと同時に、又はその前でも使用できる。 The pharmaceutical composition is characterized by containing the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof as an active ingredient. Therefore, the pharmaceutical composition exhibits an excellent effect of being able to act on the disease that develops in connection with TTK protein kinase through suppression of the activity of the enzyme. For example, the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent effect that it can act on cancers, immune diseases, etc., particularly cancers, immune diseases, etc. that develop in relation to TTK activity, through suppression of the enzyme activity. Demonstrate. When the pharmaceutical composition is used for the treatment or prevention of cancer, conventional cancer therapy, for example, radiation therapy, chemotherapy, especially at the same time as or before applying a DNA-degrading agent for presensitizing tumor cells. But you can use it.
上記医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。 The content of the compound or salt thereof in the pharmaceutical composition can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, and may be a therapeutically effective amount. In the case of a compound, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.001 to 100 mg. In the case of a polypeptide or a derivative thereof, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.001 to 100 mg, a nucleic acid or a derivative thereof. In this case, for example, 0.00001 to 100 mg, preferably 0.0001 to 10 mg is desirable.
上記医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持し得る種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。 The pharmaceutical composition may further contain various auxiliaries that can stably hold the compound or a salt thereof. Specifically, pharmaceutically acceptable auxiliaries, excipients, binders, and stabilizers that exhibit the property of inhibiting the active ingredient from degrading before reaching the site where the active ingredient is to be delivered. Agents, buffers, solubilizers, isotonic agents and the like.
上記医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。 The dosage form of the pharmaceutical composition is appropriately selected according to the type of active ingredient; individual, organ, local site, tissue to be administered; age, weight, etc. of the individual to be administered. Examples of the administration form include subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, and local administration.
また、上記医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。 The dosage of the above pharmaceutical composition is also appropriately selected according to the type of active ingredient; individual, organ, local site, tissue to be administered; age, weight, etc. of the individual to be administered. Although it does not specifically limit as administration, When an active ingredient is a low molecular compound or a high molecular compound, as an amount of the said active ingredient, it is 0.0001-1000 mg / kg body weight, Preferably, it is 0.001-100 mg. / Kg body weight, in the case of a polypeptide or a derivative thereof, for example, 0.0001 to 1000 mg / kg body weight, preferably 0.001 to 100 mg / kg body weight, in the case of a nucleic acid or a derivative thereof, for example, 0.00001 to 100 mg / kg Administration may be performed a plurality of times, for example, 1 to 3 times per day so as to obtain a single dose of kg body weight, preferably 0.0001 to 10 mg / kg body weight.
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。 The present invention will be described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to such examples. In the following Examples, the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) was used as a genetic manipulation technique unless otherwise specified.
バキュロウイルス発現系を用いた組換えTTKの発現と精製
TTK発現ベクターを鋳型として、プライマー（配列番号：１１及び配列番号：１２）を用いたPCR反応によりDNA断片を増幅し、pCR-BluntII-TOPOベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。得られたベクターをBamHI、XhoI制限酵素で切断し、TTKを含む断片をpFastBac HT Bベクター（インビトロジェン社）のBamHI、XhoI制限酵素切断部位に挿入した。得られたベクターとBac-to-Bac Baculovirus Expression System（インビトロジェン社）を用いて、大腸菌株DH10BACをトランスフォームした。LB/kanamycin/gentamicin/tetracyclin/X-gal/IPTGプレートで得られたコロニーを培養し、S.N.A.P. Midiprep（インビトロジェン社）のプロトコルに従って、組換えバクミドDNAを精製した。Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systemのマニュアルに従って、得られた組換えバクミドDNAをSf9細胞（インビトロジェン社）に導入し、P1ウイルスを得た。次いで、P1ウイルスをSf9細胞に感染させてウイルスを増幅し、1.7x109 pfuのP2ウイルスを得た。Sf9細胞をSf-900II SFM培地（インビトロジェン社）中、27℃、135 rpmで培養し、2x106 cells/mlに増殖したところでP2ウイルスをMOI 1で添加した。引き続き72時間培養した後、500 x gで５分間遠心し培地を取り除いて細胞を回収した。次いで適量のPBS(-)を加えて細胞を洗浄、500 x gで5分間遠心し洗浄液を取り除いた。回収した細胞は精製操作を行うまで-80℃で凍結保存した。
Expression and purification of recombinant TTK using baculovirus expression system
Using the TTK expression vector as a template, the DNA fragment was amplified by PCR reaction using primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) and cloned into the pCR-BluntII-TOPO vector (Invitrogen). The obtained vector was cleaved with BamHI and XhoI restriction enzymes, and a fragment containing TTK was inserted into the BamHI and XhoI restriction sites of pFastBac HT B vector (Invitrogen). The obtained vector and Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen) were used to transform E. coli strain DH10BAC. Culturing LB / kanamycin / gentamicin / tetracyclin / X-gal / IPTG plates obtained colonies, according to the protocol SNAP Midiprep (Invitrogen) and purified recombinant bacmid DNA. According to the manual of Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, the obtained recombinant bacmid DNA was introduced into Sf9 cells (Invitrogen) to obtain P1 virus. The P1 virus was then infected into Sf9 cells to amplify the virus, yielding 1.7 × 10 9 pfu of P2 virus. Sf9 cells were cultured in Sf-900II SFM medium (Invitrogen) at 27 ° C. and 135 rpm, and grown to 2 × 10 6 cells / ml, P2 virus was added at
以降の操作は4℃あるいは氷上で行った。解凍した細胞に培養量の1/10容の細胞破砕液（0.1mM Na3VO4、1mMNaF、 1xCompleteTM (EDTA free)（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を含むT-PER（ピアス社））を加え懸濁後、ローテーターで30分攪拌した。46,000 x gで15分間遠心した後、上清をポリプロピレン製チューブに回収し、1M イミダゾールを加えて15mMに調整した。この溶液を結合バッファー（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5）で平衡化したHisTrap HP 1ml カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に付した。次いでカラムを結合バッファーで洗浄し、溶出バッファー（20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.3M イミダゾール, pH 7.5）とのリニアグラジエントにより溶出を行った。TTKタンパク質を含むフラクションを回収し、分子量カットオフ10,000Daの遠心式濃縮器（Amicon Ultra、ミリポア社）で約2mlにまで濃縮した。これを20mM Tris-HCl 、pH7.5、0.15M NaCl、1mM DTTで平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200 pg（アマシャムバイオサイエンス社）に付し、TTKタンパク質を含むフラクションを回収した。精製の確認は、8% SDS-PAGE用均一ゲルを用いるSDS-PAGE（図１）と、HRP結合抗His抗体（His-probe HRP、サンタクルーズ社）を用いるWestern ブロットにより行った。Sf9細胞0.4L培養分から0.2 mgの6xHis-TTK(2-851)（TTK(2-851)は、配列番号：７記載のアミノ酸配列の２番目のアミノ酸から８５１番目のアミノ酸、つまり配列番号：９を意味する）を得た。
Subsequent operations were performed at 4 ° C. or on ice. Cell lysate of 1/10 volume of culture volume to thawed cell (0.1mM Na 3 VO 4, 1mMNaF , 1xComplete TM (EDTA free) (T-PER including Roche Diagnostics) (Pierce)) to After suspension, the mixture was stirred with a rotator for 30 minutes. After centrifugation at 46,000 xg for 15 minutes, the supernatant was collected in a polypropylene tube and adjusted to 15 mM by adding 1 M imidazole. This solution was applied to a
大腸菌を用いた組換えGST-TTK(257-820)の発現と精製
TTK発現ベクターを鋳型として、プライマー(配列番号：１３及び配列番号：１４)を用いたPCR反応により、Asn257からAsn820領域のDNA断片を増幅した。PCR産物をEcoRI及びNotIで消化したのち、同酵素で消化したpGEX-4T-3(アマシャムバイオサイエンス社)ベクターに連結させた。塩基配列を確認した後、大腸菌株BL21(DE3)（タカラバイオ社）に形質導入した。100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中OD600が0.4-0.7に達するまで37℃で振とう培養を行なった後、最終濃度0.1mMの IPTGを加えて発現誘導を行い、更に28℃で２時間培養した。7,700 x gで５分間遠心し培地を除去した後、適量のPBS(-)を加えて菌体を洗浄、再び7,700 x gで5分間遠心し集菌した。回収した菌体は精製操作を行うまで-80℃で凍結保存した。
Expression and purification of recombinant GST-TTK (257-820) using E. coli
A DNA fragment from Asn257 to Asn820 region was amplified by a PCR reaction using a TTK expression vector as a template and primers (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14). The PCR product was digested with EcoRI and NotI, and then ligated to a pGEX-4T-3 (Amersham Bioscience) vector digested with the same enzymes. After confirming the nucleotide sequence, E. coli strain BL21 (DE3) (Takara Bio Inc.) was transduced. Shake culture at 37 ° C until OD 600 reaches 0.4-0.7 in LB medium containing 100 µg / ml ampicillin, then induce expression by adding IPTG at a final concentration of 0.1 mM, and further culture at 28 ° C for 2 hours did. After centrifuging at 7,700 xg for 5 minutes to remove the medium, an appropriate amount of PBS (-) was added to wash the cells, and the cells were collected again by centrifugation at 7,700 xg for 5 minutes. The collected cells were stored frozen at −80 ° C. until purification.
以降の操作は4℃あるいは氷上で行った。菌体を解凍し培養量の1/10容の細胞破砕液（50mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM Na3VO4、1mMNaF、 1xCompleteTM (EDTA free))を加え、懸濁後、超音波処理した。次いで、11,000 x gで10分間遠心し、上清をポリプロピレン製チューブに回収した。結合バッファー（20mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1M NaCl, 0.1mM Na3VO4, 1mM NaF）で平衡化したGlutathione Sepharose 4Bビーズ（アマシャムバイオサイエンス社）に得られた上清を加え、ローテーターで1時間攪拌した。Glutathione Sepharose 4Bビーズは、使用した細胞破砕液の1/10容を使用した。1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を除去した。ビーズ体積の10倍容の結合バッファーでビーズを再検濁し、1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を除去する操作を3回繰り返すことにより、ビーズを洗浄した。ビーズ体積の2倍容の溶出バッファー（20mM HEPES-NaOH, pH 8.0, 0.1M NaCl, 0.1mM Na3VO4, 1mM NaF, 10mM 還元型グルタチオン）を加え、ローテーターで10分攪拌した。1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を回収した。再度ビーズ体積の2倍容の溶出バッファーをビーズに加え、ローテーターで10分攪拌後、1,500 x gで1分遠心してビーズを沈め、上清を回収した。精製の確認は、8% SDS-PAGE用均一ゲルを用いるSDS-PAGE（図2）と、H RP結合抗GST抗体（サンタクルーズ社）を用いるWestern ブロットにより行った。50ml培養分から56 μgのGST-TTK(257-820) （TTK(257-820)は、配列番号：７記載のアミノ酸配列の257番目のアミノ酸から820番目のアミノ酸、つまり配列番号：１０を意味する）を得た。
Subsequent operations were performed at 4 ° C. or on ice. Thawed cells and 1/10 volume of cell lysate (50 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM Na 3 VO 4 , 1 mMNaF, 1xComplete TM (EDTA free) ) Was added, suspended, and then sonicated. Subsequently, the mixture was centrifuged at 11,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was collected in a polypropylene tube. Add the supernatant obtained to Glutathione Sepharose 4B beads (Amersham Biosciences) equilibrated with binding buffer (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 0.1 M NaCl, 0.1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM NaF) and rotate with a rotator. Stir for 1 hour. As Glutathione Sepharose 4B beads, 1/10 volume of the cell disruption solution used was used. The beads were submerged by centrifugation at 1,500 xg for 1 minute, and the supernatant was removed. The beads were washed again by repeating the operation of resuspending the beads with a binding buffer having a
TTKの基質探索
基質ペプチドおよび検出用一次抗体はSerine/Threonine Kinase Substrate Screening Kit（セルシグナリングテクノロジー社）を使用した。TTK（実施例１で得られた6xHis-TTK (2-851) (80μg/ml)、あるいは実施例２で得られたGST-TTK(257-820) (56μg/ml)) 2μl、10mM ATP 0.5μl、10mg/ml BSA 2.5μlおよび12.5μM 基質ペプチド溶液20μl（バッファー組成：25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2）をポリプロピレン製96穴マイクロタイタープレート中で混和した。１種類の基質ペプチドにつき、精製酵素存在下と非存在下（ネガティブコントロール）およびポジティブコントロール（酵素非存在下で基質ペプチドの代わりに対応するリン酸化ペプチドを用いる）の3ウェルを調製した。プレートにシールをし、室温下一晩インキュベートした。反応停止液（4% BSA, 100mM EDTA, 0.05% Tween20を含むTBS）を100μl加えて混和した後、100μlを96ウェルNeutrAvidinプレート（ピアス社）に移した。室温下30分インキュベート後、反応液を捨て、0. 05% Tween20を含むTBS（TBST） 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を3回繰り返した。一次抗体溶液100μlを加え、室温下2時間インキュベートした。反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を3回繰り返した。DELFIA Europium-labeled Anti-rabbit IgG（パーキンエルマー社）の1000倍希釈液あるいはDELFIA Europium-label Anti-mouse IgG（パーキンエルマー社）の100倍希釈液を100μl加え、室温下1時間インキュベートした。抗体の希釈は0.2% BSA、0.01% Tween20を含むTBSで行った。反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を5回繰り返した。DELFIA Enhancement Solution 100μlを加え、室温下5分インキュベート後、マルチラベルプレートリーダー（ARVO、パーキンエルマー社）で時間分解蛍光を測定した（励起波長340nm、蛍光波長615nm）。結果を図３〜図５に示す。酵素反応ウェルの測定値をネガティブコントロールおよびポジティブコントロールと比較し、有意なシグナルの増大を与えるペプチドを基質候補とした。擬陽性を避けるために、6xHis-TTK(2-851)を用いた場合とGST-TTK(257-820)を用いた場合の両方で有意なシグナルの増大を与えたペプチドを選別した。その結果、p44/42 MAPKペプチド（図４ PLATE2の19）、p38 MAPKペプチド（図５ PLATE3の10）、およびFKHR/FKHRL1ペプチド（図４ PLATE2の28）を基質候補として得た。
Substrate Search for TTK The substrate peptide and primary antibody for detection used Serine / Threonine Kinase Substrate Screening Kit (Cell Signaling Technology). TTK (6xHis-TTK obtained in Example 1 (2-851) (80μg / ml), or in Example 2 resulting GST-TTK (257-820) (56μg / ml)) 2μl, 10mM ATP 0.5 μl, 10 mg / ml BSA 2.5 μl and 12.5 μM
基質候補ペプチドを用いたTTKキナーゼ活性の定量
実施例３で得られた3種類のペプチド及び公知基質であるcdc25ペプチドを基質としてTTKキナーゼ活性の定量を行った。アッセイバッファー12.5μl（組成：50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM β-glycerophosphate, 4mM DTT, 0.2mM Na3VO4、10mM MgCl2、2mg/ml BSA)、20μg/ml TTK（実施例１参照）2.5μl、50μM ペプチド（cdc25ビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、p44/42 MAPKビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、p38 MAPKビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B）、FKHR/FKHR1ビオチン化ペプチド（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号900B））5μl（溶媒：2.5%(v/v) DMSO）をポリプロピレン製96穴マイクロタイタープレート中で混和した。次いで0.2mM ATP（0.08mCi/ml [33P]γATPを含む）5μlを添加した。プレートにシールをし、室温下インキュベートした。0.5, 1, 1.5, 2時間後に反応停止液（組成：50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1M EDTA）を100μl加えて混和し、その内100μlを96ウェルNeutrAvidinプレート（ピアス社）に移した。室温下30分インキュベート後、反応液を捨て、TBST 100μlで洗浄した。同様の洗浄操作を4回繰り返した。液体シンチレーションカクテル溶液（MicroScint 20、パーキンエルマー社）100μlを加え、シールをして室温下一晩インキュベートした。マイクロプレートシンチレーションカウンター（TopCount、パーキンエルマー社）によりcpm値を測定し、相対的な反応速度を求めた。結果を図６に示す。cdc25ペプチド、p44/42 MAPKペプチド、p38 MAPKペプチド、FKHR/FKHR1ペプチドの順に182、52、694、87 cpm/hであり、p38 MAPKペプチドが最も高い反応速度を与えた。cdc25ペプチドと比較すると、3.8倍高い活性を示した。ビオチンの代わりに15-([biotinoyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid（ピアス社、カタログ番号21330）を結合したp38 MAPKペプチド（図６中の(PEO4)p38）ではcdc25ペプチドの5.2倍となり、TTKキナーゼ活性測定のための非常に有用な基質となることが示された。
Quantification of TTK kinase activity using a substrate candidate peptide TTK kinase activity was quantified using the three types of peptides obtained in Example 3 and the known substrate cdc25 peptide as a substrate. Assay buffer 12.5 μl (Composition: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM β-glycerophosphate, 4 mM DTT, 0.2 mM Na 3 VO 4 , 10 mM MgCl 2 , 2 mg / ml BSA), 20 μg / ml TTK (see Example 1) ) 2.5 μl, 50 μM peptide (cdc25 biotinylated peptide (Cell Signaling Technology, catalog number 900B), p44 / 42 MAPK biotinylated peptide (Cell Signaling Technology, catalog number 900B), p38 MAPK biotinylated peptide (Cell Signaling Technology) , Catalog number 900B), FKHR / FKHR1 biotinylated peptide (Cell Signaling Technology, catalog number 900B)) 5 μl (solvent: 2.5% (v / v) DMSO) was mixed in a 96-well polypropylene microtiter plate. Then 5 μl of 0.2 mM ATP (containing 0.08 mMi / ml [ 33 P] γATP) was added. The plate was sealed and incubated at room temperature. After 0.5, 1, 1.5 and 2 hours, 100 μl of the reaction stop solution (composition: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M EDTA) was added and mixed, and 100 μl of this was transferred to a 96-well NeutrAvidin plate (Pierce). . After incubation at room temperature for 30 minutes, the reaction mixture was discarded and washed with 100 μl of TBST. The same washing operation was repeated 4 times. 100 μl of liquid scintillation cocktail solution (
p38 MAPKペプチドの合成
Fmoc-L-Ala-HMP Resin（Applied Biosystems Inc.）0.25 mmolを出発原料としてペプチド自動合成装置（Applied Biosystems社、ABI-431型）を用いたFmoc固相合成法を利用し、その後、フェノール、エタンジチオール及びチオアニソール含有95 vol% TFA水溶液で脱保護することによって、p38ＭＡＰＫペプチド約412 mgを得た。該ペプチドにつき逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm I.D. 、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：1 mL/min、検出：220 nm）を行って純度検定したところ、約85％（保持時間：6.4 min）であった。
Synthesis of p38 MAPK peptide
Fmoc- L -Ala-HMP Resin (Applied Biosystems Inc.) 0.25 mmol automated peptide synthesizer as a starting material (Applied Biosystems, Inc., ABI-431 type) using Fmoc solid phase synthesis method using, then phenol, About 412 mg of p38 MAPK peptide was obtained by deprotection with 95 vol% TFA aqueous solution containing ethanedithiol and thioanisole. Reverse phase HPLC (column: YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm ID, YMC, mobile phase: acetonitrile / purified water mixture containing 0.1% TFA, 20%-40% acetonitrile linear A purity test was performed using a concentration gradient, 10 minutes, flow rate: 1 mL / min, detection: 220 nm), and the purity was about 85% (retention time: 6.4 min).
得られたペプチドのビオチン化は分子内に唯一存在するN末端のアミノ基を介して導入することにし、溶解性及びスペーサーの長さなどを考慮して15-([biotinyl]amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid, N-hydroxysuccinimidyl ester（NHS-PEO4-Biotin, Pierce社）をビオチン化試薬として選択した。上記ペプチド20 mg（10.9 オmol）をジメチルホルムアミド1 mLに溶解し、0.05 mol/Lリン酸緩衝液（pH 7.4）0.5 mLを加え混和した。NHS-PEO4-Biotin 12.8 mg（21.7 オmol）は、精製水1 mL及び0.05 mol/Lリン酸緩衝液（pH 7.4）0.5 mLに溶解した。これを上記ペプチド溶液に撹拌下に加え、さらに室温で2時間撹拌した。反応液0.3 mLにつき、逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-322, 150 x 10.0 mm I.D.、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：3 mL/min、検出：280 nm）を行ってビオチン化ペプチドと推定される画分を分取した。この操作を繰り返し10回行って反応液全量中のビオチン化ペプチド画分を分取してプールした。50ーC水浴中で減圧下にアセトニトリルを留去し、次いでガラスバイアル瓶に数mLずつ分注して凍結乾燥した。凍結乾燥物の一部をジメチルホルムアミドに溶解して逆相HPLC（カラム：YMC社製YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm I.D. 、移動相：0.1% TFA含有アセトニトリル／精製水混液、20% - 40%アセトニトリル直線濃度勾配、10分間、流速：1 mL/min、検出：220 nm）を行ったところ、単一のピーク（保持時間：8.8 min）を示した。さらに質量分析（Micromass社，Q-Tof Ultima API）で検定した結果、分子量（2308）から予測されるビオチン化ペプチド基質の1, 2及び3価イオン（[M+H]+ : 2309, [M+2H]2+ : 1155, [M+3H]3+ : 770.3）がマススペクトル上に観察され、当該画分がbiotin(PEO4)-p38MAPKペプチドと確認された。 Biotinylation of the obtained peptide is introduced through the N-terminal amino group present only in the molecule, and 15-([biotinyl] amino) -4, 7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid, N-hydroxysuccinimidyl ester (NHS-PEO4-Biotin, Pierce) was selected as a biotinylation reagent. 20 mg (10.9 mol) of the above peptide was dissolved in 1 mL of dimethylformamide, and 0.5 mL of 0.05 mol / L phosphate buffer (pH 7.4) was added and mixed. NHS-PEO4-Biotin 12.8 mg (21.7 mol) was dissolved in 1 mL of purified water and 0.5 mL of 0.05 mol / L phosphate buffer (pH 7.4). This was added to the above peptide solution with stirring, and further stirred at room temperature for 2 hours. Reverse phase HPLC (column: YMC-Pack, ODS-A, A-322, 150 x 10.0 mm ID, manufactured by YMC, mobile phase: acetonitrile / purified water mixture containing 0.1% TFA, 20%-40 mL per 0.3 mL of the reaction solution % Linear acetonitrile gradient, 10 minutes, flow rate: 3 mL / min, detection: 280 nm), and fractions estimated to be biotinylated peptides were collected. This operation was repeated 10 times to fractionate and pool the biotinylated peptide fractions in the total amount of the reaction solution. Acetonitrile was distilled off under reduced pressure in a 50-C water bath, and then aliquoted into glass vials and lyophilized. Dissolve a portion of the lyophilizate in dimethylformamide and reverse-phase HPLC (column: YMC YMC-Pack, ODS-A, A-302, 150 x 4.6 mm ID, mobile phase: acetonitrile containing 0.1% TFA / purification A water mixture, 20% -40% acetonitrile linear gradient, 10 minutes, flow rate: 1 mL / min, detection: 220 nm) showed a single peak (retention time: 8.8 min). Furthermore, as a result of testing by mass spectrometry (Micromass, Q-Tof Ultima API), 1, 2 and trivalent ions of biotinylated peptide substrate predicted from molecular weight (2308) ([M + H] + : 2309, [M + 2H] 2+ : 1155, [M + 3H] 3+ : 770.3) were observed on the mass spectrum, and the fraction was identified as biotin (PEO4) -p38MAPK peptide.
p38 MAPKペプチドを用いたTTKキナーゼ活性抑制作用を有する化合物のスクリーニング
被検物質1.5μl（溶媒：10%(v/v) DMSO）、TTK溶液5μl（組成：4μg/ml TTK, 25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2, 1mg/ml BSA)、基質溶液5μl（組成：60μM p38 MAPKペプチド, 60μM ATP, 16μCi/ml 33P-γATP, 25mM Tris-HCl, pH7.5, 5mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5mM MgCl2, 1mg/ml BSA)をポリプロピレン製384穴マイクロタイタープレート中で混和し、恒温湿潤器に入れた。温度25℃、湿度95%で一晩静置した後、反応停止液（組成：25mM Tris-HCl, pH 7.5, 20mM EDTA, 0.01% TritonX-100, 1mg/ml BSA）50μlを加え混和した。ここから4μl抜き取り、384穴白色ローボリュームプレート（コーニング社）中で6.25mg/ml Streptavidin Coupled Polystyrene Imaging Beads（アマシャムバイオサイエンス社、溶媒：反応停止液）16μlと混和し、プレートにシールをして室温下1時間インキュベートした。プレートを遠心し（1000rpm、3分）ビーズを十分に沈降させた後、CCDイメージングシステム（LEADseeker、アマシャムバイオサイエンス社）によりIOD値を測定した。被検物質なしの場合のIOD値を基準に、被検物質の抑制活性を算定し、TTKキナーゼ活性抑制作用を示した化合物をTTK活性抑制剤の候補化合物として得た。
Screening test substance 1.5μl of compounds with TTK kinase activity inhibition using p38 MAPK peptide (solvent: 10% (v / v) DMSO), TTK solution 5 [mu] l (composition: 4μg / ml TTK, 25mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM β-glycerophosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na 3 VO 4 , 5 mM MgCl 2 , 1 mg / ml BSA),
本発明のスクリーニング方法によって、ＴＴＫ活性抑制剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、該ＴＴＫ抑制剤は、癌疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。 By the screening method of the present invention, a TTK activity inhibitor can be efficiently screened. The TTK inhibitor can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer diseases and the like.
配列番号：１は、野生型ｐ３８ＭＡＰＫのアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of wild type p38 MAPK.
配列番号：２は、野生型ｐ３８ＭＡＰＫをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type p38 MAPK.
配列番号：３は、ｐ３８ＭＡＰＫのコア配列のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of the core sequence of p38 MAPK.
配列番号：４は、ｐ３８ＭＡＰＫのコア配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the core sequence of p38 MAPK.
配列番号：５は、ＴＴＫプロテインキナーゼのキナーゼドメインのアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the kinase domain of TTK protein kinase.
配列番号：６は、ＴＴＫプロテインキナーゼのキナーゼドメインをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the kinase domain of TTK protein kinase.
配列番号：７は、野生型ＴＴＫプロテインキナーゼのアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of wild-type TTK protein kinase.
配列番号：８は、野生型ＴＴＫプロテインキナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type TTK protein kinase.
配列番号：９は、実施例３で使用した6xHis-TTK (2-851)のTTK(2-851)部分のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of the TTK (2-851) portion of 6xHis-TTK (2-851) used in Example 3.
配列番号：１０は、実施例３で使用したGST-TTK(257-820)のTTK(257-820)部分のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of the TTK (257-820) portion of GST-TTK (257-820) used in Example 3.
配列番号：１１は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマーを示す。 SEQ ID NO: 11 shows the RT-PCR forward primer of SEQ ID NO: 8.
配列番号：１２は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲリバースプライマーを示す。 SEQ ID NO: 12 shows the RT-PCR reverse primer of SEQ ID NO: 8.
配列番号：１３は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマーを示す。 SEQ ID NO: 13 shows the RT-PCR forward primer of SEQ ID NO: 8.
配列番号：１４は、配列番号：８のＲＴ−ＰＣＲリバースプライマーを示す。 SEQ ID NO: 14 shows the RT-PCR reverse primer of SEQ ID NO: 8.
Claims (7)
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよく、かつキナーゼ活性を有するものであるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるＴＴＫプロテインキナーゼ、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の全長からなるTTK活性測定用基質、又は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１０アミノ酸以上の部分配列からなるＴＴＫ活性測定用基質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるＴＴＫ活性測定用基質、及び
リン酸基供与体
をインキュベーションし、ＴＴＫ活性を測定する工程、並びに、
（Ｂ）被検物質非存在下のＴＴＫ活性と比較して、該活性を減少させる被検物質を選択する工程を含む、ＴＴＫ活性抑制作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法。 (A) In the presence of the test substance,
SEQ ID NO: in the amino acid sequence set forth in 5, one or a few amino acids are deleted, added, better be inserted or substituted, and the amino acid sequence is one having kinase activity from including polypeptides TTK Protein kinase,
SEQ ID NO: TTK activity measurement matrix consisting of the full-length amino acid sequence as set forth in 1, or SEQ ID NO: A TTK activity measurement matrix consisting of 10 amino acids or more partial sequence of the amino acid sequence described in 1, SEQ ID NO: : TTK activity measuring substrate comprising the amino acid sequence as set forth including polypeptide 3, and incubating the phosphate group donor, the step of measuring the TTK activity, and,
(B) A screening method for a compound having an inhibitory action on TTK activity or a salt thereof, comprising a step of selecting a test substance that reduces the activity of TTK in the absence of the test substance.
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Cited By (1)
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