JP4645912B2

JP4645912B2 - 生体試料操作方法

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Publication number: JP4645912B2
Application number: JP2006519168A
Authority: JP
Inventors: 俊彦長村
Original assignee: UNISOKU CO., LTD.
Current assignee: UNISOKU CO., LTD.
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2024-05-26
Also published as: JPWO2005116184A1; WO2005116184A1; CN1954064B; CN1954064A; US20080014573A1

Description

本発明は、細胞等の生体試料に対して、遺伝子、蛋白質、又は酵素等を含む薬液を注入又は滴下する生体試料操作方法に関し、特に、カンチレバーを用いた生体試料操作方法に関する。

従来、生物研究や病理研究等の分野においては、細胞の内部に遺伝子等を注入して発現させることが行われる。ここで、細胞等の生体試料の内部に遺伝子等を注入する手段としては、走査型プローブ顕微鏡に備えられたカンチレバーを用いる方法が従来提唱されている（特許文献１参照）。図８は、従来の生体試料操作装置の一例を示す図である。図に示すように、生体試料操作装置は８０、図示しない走査型プローブ顕微鏡に備えられ先端部に先鋭な形状の探針８１が突設されたカンチレバー８２と、該カンチレバー８２の先端に取り付けられカーボンナノチューブ等からなる針状物８３と、を具備してなるものである。本生体試料操作装置８０の使用に際しては、針状物８３の先端に遺伝子等を固定化し、カンチレバー８２を走査して針状物８３を細胞８４内へ挿入することにより遺伝子等を細胞８４内に導入し、この状態で保持して遺伝子の発現を行う。

一方、本出願人は、カンチレバーを用いた微細加工装置を従来提唱している（特許文献２参照）。この微細加工装置は、片持ち支持されたカンチレバー部と、該カンチレバー部の先端に突設された突出部とを備えてなるものであり、突出部には空洞が形成されるとともに、該空洞から突出部の外部へと通じる微細孔が突出部を貫通して形成されている。ここで、突出部の空洞の内部には、インジウム、ガリウム、又はインジウムとガリウムの合金等の流体が充填されている。微細加工装置の使用に際しては、カンチレバーに対してパルス電圧を印加することにより、流体が微細孔を通じて外部へ流出し、試料の表面にＩｎやＧａ等の超微小ドットや超微細線が形成される。このようにして、高速光通信用の半導体発光素子等が作製されるものとなっている。

しかし、従来の生体試料操作装置８０では、細胞８４内に導入すべき遺伝子等を針状物８３の先端に固定化する必要があるため、遺伝子や薬品等が溶け込んだ薬液や反応性ガス等の流体を、細胞８４に対して注入又は滴下することができない、という問題がある。

また、直径が１０ｎｍ〜３０μｍ程度の針状物８３を細胞内に挿入するので、細胞膜８５にはこの針状物８３の径より大きい孔８６が開き、また、針状物８３で細胞核８７を傷付けてしまう場合もある。これにより、細胞８４が大きなダメージを受けて死滅してしまったり、細胞８４の自己修復機能により孔８６や傷が修復されるとしても、その修復に長時間を要する、という問題もある。

日本国特許出願公開番号特開２００３−３２５１６１号公報日本国特許出願公開番号特開２００４−３４２７７号公報

本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、遺伝子等が溶け込んだ薬液等の流体を、生体試料に注入又は滴下することを可能とし、且つ、その際に生体試料に与えるダメージを最小限とする手段を提供することを目的とする。

本発明に係る生体試料操作方法は、生理活性物質又は化学反応を励起する物質を、生体試料に注入する生体試料操作方法において、基端が片持ち支持された梁部と、該梁部に突設され内部に空洞が設けられた探針と、前記空洞から前記探針の外部へ前記探針を貫通して形成された微細孔と、前記探針の先端部の外壁面に固着されて、前記微細孔の下方かつその延長線上に先鋭な角部を探針点として位置させる突起部と、前記空洞内に設けられた第１電極と、を具備してなるカンチレバーの前記空洞内に、生理活性物質又は化学反応を励起する物質を包含し導電性を有する流体を充填し、生体試料を透明な導電性薄膜からなる第２電極上に載置するとともに、該生体試料に前記カンチレバーの探針点を近接させ、前記第１電極と前記第２電極との間にパルス電圧を印加することにより、前記流体を前記微細孔から流出させ且つ生体試料に注入し、前記生体試料の操作及び操作後の前記生体試料の内部変化を、前記第２電極を通じて光学顕微鏡で観測することを特徴とするものである。本発明によれば、流体にパルス電圧が印加されることで、流体を構成する各粒子間に作用する結合力が切断され、凝集力を失った流体が微細孔から流出する。また、生体試料に対してパルス電圧が印加されることにより、一過性の絶縁破壊で生体試料の表面に孔が開き、流体は電気泳動により孔を通って生体試料内に取り込まれる。また、この孔は非常に微小なものであり、生体試料の自己修復機能ですぐに修復されるので、生体試料に大きなダメージを与えることもない。これにより、生体試料に与えるダメージを極力低減しつつ、生体試料内に流体を注入することができる。更に、本発明によれば、複数個並べた生体試料の中から、操作すべき生体試料を容易に選択することができ、且つ、操作観測手段で観測しながらより正確に生体試料を操作することができる。また、操作後の生体試料に生じる内部変化を観測することもできる。

また、本発明は、前記カンチレバーが、走査型プローブ顕微鏡に装備され、前記流体を生体試料に注入又は滴下した後に、生体試料の表面の形状変化を前記走査型プローブ顕微鏡で観測することを特徴とするものである。本発明によれば、生体試料の操作後に、薬液等が確実に生体試料内に注入又は滴下されたか、また、パルス電圧を印加したことによる生体試料の壊れ具合はどの程度か等を確認することができる。

本発明の実施形態に係る生体試料操作装置１，３０，４０，５０，６０を示す模式図。図１において細胞２の近傍を拡大した部分拡大断面図。第１の実施形態に係るカンチレバー９の構成を示す概略斜視図。第２の実施形態に係るカンチレバー３１の構成を示す概略斜視図。第３の実施形態に係るカンチレバー４１の構成を示す概略斜視図。第４の実施形態に係るカンチレバー５１の構成を示す概略斜視図。第５の実施形態に係るカンチレバー６１の構成を示す概略斜視図。従来例に係る生体試料操作装置８０を示す概略側面図。各図に用いた引用符号を説明する別紙。

以下、本発明の第１の実施形態を図面に基づいて説明する。図１は、本実施形態に係る生体試料操作方法に使用する生体試料操作装置１を示す模式図である。図に示すように、生体試料操作装置１は、操作対象である細胞（生体試料）２を操作すると共に該細胞２の表面の変化を観測するための原子間力顕微鏡（以下、「ＡＦＭ」という）３と、該ＡＦＭ３に対してパルス電圧を印加するパルス電源４と、ＡＦＭ３及びパルス電源４の動作を制御する制御部５と、該制御部５の入出力部であるコンピュータ６と、細胞操作及び操作後の細胞２の内部変化を観測するための光学顕微鏡（操作観測手段）７と、を具備してなるものである。尚、本実施形態では、生体試料の一例として細胞２を用いて説明するが、これ以外にも、例えば、生物の組織片や、蛋白・酵素等の生体高分子を用いることも可能である。

ＡＦＭ３は、走査型プローブ顕微鏡の一種であり、細胞２の表面形状を観測するとともに、該細胞２を操作するためのものである。該ＡＦＭ３は、図１に示すように、細胞２が載置される走査ステージ８と、該走査ステージ８上の細胞２の表面をスキャンするカンチレバー９と、を備えている。

図２は、図１において細胞２の近傍を拡大した部分拡大断面図である。図１及び図２に示すように、走査ステージ８は、図示しない圧電素子アクチュエータを内蔵したステージ本体１０と、該ステージ本体１０の最上部に配設されたガラス板１１と、該ガラス板１１の上面に貼設された透明な導電性薄膜（第２電極）１２と、を有している。走査ステージ８は、導電性薄膜１２上に細胞２が載置された状態で、圧電素子アクチュエータに電圧を印加して伸縮させることにより、細胞２をＸＹＺ軸方向に移動させることが可能となっている。また、図１に示すように、ステージ本体１０には、該ステージ本体１０を上下方向に貫通する空隙１３が形成され、該空隙１３の下方に前記光学顕微鏡７が配置されている。これにより、ガラス板１１と導電性薄膜１２を通して、細胞２を操作する様子及び細胞２内に生じる変化等を光学顕微鏡７で観測できるものとなっている。

図３は、カンチレバー９の構成を示す概略斜視図である。図１乃至図３に示すように、カンチレバー９は、基端がホルダ１４によって片持ち支持された梁部１５と、該梁部１５の先端に突設され空洞１６が設けられてなる探針１７と、該探針１７の内壁面に塗布されたマスク１８と、空洞１６内に充填された薬液１９と、梁部１５の表面から探針１７の内壁面へと配設された導電性薄膜（第１電極）２０と、空洞１６から探針１７の外部へと探針１７を貫通して形成された微細孔２１と、を有している。

探針１７は、細胞２の表面と極微接近してその表面形状を検出するものである。この探針１７は、図３に示すように、四角錐形状を有し、該四角錐の底面側から頂点側へ向かって四角錐形状の空洞１６が形成されている。また、マスク１８は、前記薬液１９の表面張力を低減させることにより、薬液１９が微細孔２１から外部へ流出しやすくするものである。本実施形態では、探針１７の内壁面に金を塗布して薄膜を形成している。尚、本発明においてマスク１８は任意の構成であり、その成分や膜厚等は適宜設計変更が可能である。また、薬液１９は、ＤＮＡ等の核酸物質、又は抗原・酵素・ホルモン等の蛋白物質（以下、これらを「生理活性物質」という）を緩衝液に溶かしたものであり、導電性を有している。この薬液１９は、微細孔２１の開口径が超微小であること、加えて、薬液１９を構成する各粒子は原子間力等の作用によって互いに結合していることにより、微細孔２１を通じて探針１７の外部に流出することなく探針１７内に保持されている。尚、薬液１９は、本実施形態の他にも例えば、細胞２に微小量滴下することにより化学反応を励起するようなものであってもよい。また、微細孔２１は、空洞１６内に充填された薬液１９を探針１７の外部へ流出させる流出口の役割を果たすものである。該微細孔２１は、横断面が円形であって、その開口径が２０〜５００ｎｍの超微小な孔である。この微細孔２１は、図３に示すように、空洞１６の頂点から探針１７の頂点に向かって形成されている。従って、探針１７はその頂点が欠落し、その先端は微細孔２１の断面により構成されており、この断面を細胞２の表面に極微接近させることによりその形状をスキャンするものとなっている。尚、微細孔２１の横断面の大きさを変えることで薬液１９の流出量を調節することができる。また、導電性薄膜２０は、薬液１９及び細胞２に対してパルス電圧を印加するためのものである。この導電性薄膜２０は、図２及び図３に示すように、梁部１５の上面にその長手方向に沿って貼設され、その先端部は下方に曲折されて探針１７の内壁面に沿って貼設されている。従って、空洞１６内に薬液１９を充填した時に、導電性薄膜２０の先端部が薬液１９と接触した状態となっている。

パルス電源４は、薬液１９及び細胞２に対してパルス電圧を印加するものである。このパルス電源４は、図１及び図２に示すように、カンチレバー９の導電性薄膜２０、及び走査ステージ８の導電性薄膜１２にそれぞれ接続され、導電性薄膜２０と導電性薄膜１２との間にパルス電圧を印加するものとなっている。ここで、薬液１９は導電性を有するものであり、また、細胞２を構成する細胞膜２２及び細胞液２３もまた導電性を有するものなので、導電性薄膜２０と導電性薄膜１２の間には電流が流れる。この時、薬液１９を構成する各粒子間に作用する結合力が、電気的なショックを受けることで切断され、凝集力を失った薬液１９は微細孔２１を通って探針１７の外部へと流出する。この薬液１９の流出量は、パルス電圧の大きさを制御することにより調節することができる。更に、細胞２にも電流が流れるため、一過性の絶縁破壊で細胞膜２２には微細な破壊孔２４が開き、パルス電圧により電気泳動する薬液１９は、細胞膜２２の破壊孔２４を通って細胞２内に取り込まれる。この細胞膜２２に生じた破壊孔２４は、非常に微細なものなので、細胞２の自己修復機能によりすぐに塞がれ、細胞２は大きなダメージを受けないものとなっている。このようにして、空洞１６内に充填された薬液１９が細胞２内に注入されるものとなっている。尚、本実施形態では、微細孔２１から流出させた薬液１９を細胞２に注入しているが、これに限られず、流出させた薬液１９を細胞２上に滴下することも可能である。この場合、図に詳細は示さないが、一対の電極を共に薬液１９に接触させて設け、該各電極間にパルス電圧を印加すれば、細胞２には絶縁破壊が起こらず、流出した薬液１９は細胞２内に取り込まれることなく細胞２上に滴下される。また、薬液１９の各粒子間に作用する結合力を切断する手段としては、本実施形態のように薬液１９に電気的なショックを与える以外にも、例えば、パルスレーザにより機械的なショックを与える方法を用いることもできる。

制御部５は、前記ＡＦＭ３と前記パルス電源４の動作を制御するものである。この制御部５は、走査ステージ８を水平方向すなわちＸＹ軸方向に走査し、この間、カンチレバー９の探針１７と細胞２との間に作用する原子間力が一定となるように、Ｚ軸方向すなわち垂直方向への走査を制御する。この時、走査ステージ８のＸＹ軸方向の位置に対応したＺ軸方向のフィードバック量を制御部５の出力電圧として検出し、これをコンピュータ６の図示しない演算装置を介して画面上に３次元画像として出力することにより、細胞２の表面の形状を超精密に測定することが可能となっている。尚、本実施形態では、カンチレバー９を位置固定して走査ステージ８を移動させることで細胞２の表面をスキャンしているが、これとは逆に、走査ステージ８を位置固定してカンチレバー９を移動させることで細胞２の表面をスキャンすることも可能であり、この場合、制御部５でカンチレバー９の動作を制御すればよい。また、制御部５は、前記パルス電源４の動作も制御しており、走査ステージ８を走査して細胞２の表面を観測しながら、カンチレバー９が所望の位置に達した時に、電圧パルスを印加して薬液１９を細胞２に注入又は滴下することが可能となっている。尚、本実施形態では、走査ステージ８上に１個の細胞２を載置した場合を例にして説明しているが、走査ステージ８上に複数個の細胞２を並べて、その中から選択した任意の細胞２のみに対して薬液１９を注入又は滴下するものとしてもよい。このように、薬液１９を細胞２に注入した後、ＡＦＭ３で細胞２の表面の形状を観測して、薬液１９が確実に細胞２内に注入されたか、また、パルス電圧を印加したことによる細胞２の壊れ具合はどの程度か等を確認することができ、より正確な細胞操作を行うことが可能となっている。

以下、生体試料操作装置１を使用して細胞操作を行う手順について説明する。まず、細胞２内に注入又は滴下する所定の薬液１９をカンチレバー９の空洞１６内に充填しておく。次に、操作対象となる細胞２を走査ステージ８上に載置し、光学顕微鏡７で観測しながら、カンチレバー９の探針１７が細胞２の真上にくるように位置合わせを行う。次に、走査ステージ８をＺ軸方向に走査して探針１７を細胞２に近接させた後、走査ステージ８をＸＹ軸方向に走査し、探針１７が所望の位置に達した時に、パルス電源４を操作して各導電性薄膜１２,２０の間に所定の大きさのパルス電圧を印加する。これにより、カンチレバー９の微細孔２１から薬液１９が流出し、細胞２に注入又は滴下される。その後、細胞２の表面の形状変化をＡＦＭ３で観測すると共に、細胞２内に生じる変化、例えば、細胞２内に注入した遺伝子が発現する様子を光学顕微鏡７で観測する。

次に、本発明の第２の実施形態を図面に基づいて説明する。本実施形態に係る生体試料操作方法に使用する生体試料操作装置３０は、第１の実施形態の生体試料操作装置１と比較してカンチレバー３１の構成が異なることを特徴とし、それ以外の構成については第１の実施形態と同じ構成であり、ここでは詳細な説明は省略する。図４は、本実施形態に係るカンチレバー３１の構成を示す概略斜視図である。尚、図４において図３と同じ構成に付いては同じ符号を付している。図４に示すように、カンチレバー３１は、基端がホルダ１４によって片持ち支持された梁部１５と、該梁部１５の先端に突設され空洞１６が設けられてなる探針１７と、探針１７の内壁面に塗布されたマスク１８と、空洞１６の内部に充填された薬液１９と、梁部１５の表面から探針１７の内壁面へと配設された導電性薄膜２０と、空洞１６と探針１７の外部とを連通する微細孔３２と、を有している。

該カンチレバー９では、微細孔３２が、空洞１６の頂点と探針１７の頂点とを結ぶ線上には位置せず、若干位置ズレして形成されている。これにより、探針１７の頂点は欠落することなく先鋭な形状の探針点３３として残存している。この探針点３３は、曲率半径が略１０ｎｍ程度に形成されているため、探針１７の先端が２０〜５００ｎｍ程度の開口径を有する微細孔２１で構成される前記カンチレバー９と比較して、細胞２の表面をより高分解能にスキャンすることが可能となっている。ここで、探針点３３で指定した所定位置に対して、より正確に薬液１９を流出させるためには、微細孔３２をより探針点３３に近い位置に形成することが好適である。

次に、本発明の第３の実施形態を図面に基づいて説明する。本実施形態に係る生体試料操作方法に使用する生体試料操作装置４０も、第１の実施形態の生体試料操作装置１と比較してカンチレバー４１の構成が異なることを特徴とし、それ以外の構成については第１の実施形態と同じ構成であり、ここでは詳細な説明は省略する。図５は、本実施形態に係るカンチレバー４１の構成を示す概略斜視図である。尚、図５において図３と同じ構成に付いては同じ符号を付している。図５に示すように、カンチレバー４１は、基端がホルダ１４によって片持ち支持された梁部１５と、該梁部１５の先端に突設され空洞１６が設けられてなる探針１７と、該探針１７の内壁面に塗布されたマスク１８と、空洞１６の内部に充填された薬液１９と、梁部１５の表面から探針１７の内壁面へと配設された導電性薄膜２０と、空洞１６と探針１７の外部とを連通する微細孔２１と、探針１７の先端部に設けられ探針点として機能する突起部４２と、を有している。

該カンチレバー４１では、微細孔２１は、第１の実施形態のカンチレバー９と同様に、空洞１６の頂点から探針１７の頂点に向かって形成されており、探針１７はその頂点が欠落している。一方、突起部４２は、先鋭な角部４３を有する三角形状に形成され、該先鋭な角部４３を微細孔２１の下方に位置させるようにして、その一端縁が探針１７の外壁面に固着されている。この突起部４２の先鋭な角部４３を細胞２の表面に極微接近させることにより、第１の実施形態のカンチレバー９と比較して、細胞２の表面をより高分解能にスキャンすることが可能となっている。尚、突起部４２は先鋭な角部４３を有していればよく、その形状は三角形に限られず適宜設計変更が可能である。

次に、本発明の第４の実施形態を図面に基づいて説明する。本実施形態に係る生体試料操作方法に使用する生体試料操作装置５０も、第１の実施形態の生体試料操作装置１と比較してカンチレバー５１の構成が異なることを特徴とし、それ以外の構成については第１の実施形態と同じ構成であり、ここでは詳細な説明は省略する。図６は、本実施形態に係るカンチレバー５１の構成を示す概略斜視図である。尚、図６において図３と同じ構成に付いては同じ符号を付している。図６に示すように、カンチレバー５１は、基端がホルダ１４によって片持ち支持された梁部１５と、該梁部１５の先端に突設され空洞１６が設けられてなる探針１７と、該探針１７の内壁面に塗布されたマスク１８と、空洞１６の内部に充填された薬液１９と、梁部１５の表面から探針１７の内壁面へと配設された導電性薄膜２０と、空洞１６と探針１７の外部とを連通する微細孔２１と、探針１７の先端部に取り付けられたナノチューブ５２と、を有している。

該カンチレバー５１では、微細孔２１は、第１の実施形態に係るカンチレバー９と同様に、空洞１６の頂点から探針１７の頂点に向かって形成されており、探針１７はその頂点が欠落している。一方、ナノチューブ５２は、カーボン等からなり、その基端部は探針１７の外壁面に固着され、その先端部は探針１７の先端よりも下方に突出して設けられている。このナノチューブ５２の開口径は極めて微小であり、その先端を細胞２の表面に極微接近させることにより、第１の実施形態のカンチレバー９と比較して、細胞２の表面をより高分解能にスキャンすることが可能となっている。

次に、本発明の第５の実施形態を図面に基づいて説明する。本実施形態に係る生体試料操作方法に使用する生体試料操作装置６０も、第１の実施形態の生体試料操作装置１と比較してカンチレバー６１の構成が異なることを特徴とし、それ以外の構成については第１の実施形態と同じ構成であり、ここでは詳細な説明は省略する。図７は、本実施形態に係るカンチレバー６１の構成を示す概略斜視図である。尚、図７において図３と同じ構成に付いては同じ符号を付している。図７に示すように、カンチレバー６１は、基端がホルダ１４によって片持ち支持された梁部１５と、該梁部１５の先端に突設され空洞１６が設けられてなる探針１７と、該探針１７の内壁面に塗布されたマスク１８と、図示しないタンク内に充填された反応性ガス（流体）６２と、該反応性ガス６２をカンチレバー６１に給送する給送ノズル６３と、梁部１５の表面から探針１７の内壁面へと配設された導電性薄膜２０と、空洞１６と探針１７の外部とを連通する微細孔２１と、を有している。

反応性ガス６２は、真空中でも蒸発せず、物質の表面と種々の化学反応を励起する気体状の物質の総称であり、単体は勿論のこと化合物や混合物等も包含している。この反応性ガス６２としては、例えば、ＨＦまたはＨＣｌに代表されるハロゲンガスや、Ｃ４Ｈ５ＮまたはＣＨ３ＣＨ２ＣＮに代表されるシアン化ガス等を用いることが可能であり、その他にも、常温で固体や液体であるものは加熱する等して気化した上で用いることが可能である。この反応性ガス６２は、図に詳細は示さないが、真空チャンバーである前記タンク内に充填されている。一方、給送ノズル６３は、その一端が前記タンクに接続されると共に、他端は細く絞られてカンチレバー６１の空洞１６内に差し込まれている。この給送ノズル６３から噴射された反応性ガス６２は、前記薬液１９と同様に、微細孔２１の開口径が超微小であること、且つ、反応性ガス６２を構成する各粒子は原子間力等の作用により互いに結合していることにより、微細孔２１を通じて探針１７の外部には噴出せず空洞１６内に滞留するものとなっている。また、この反応性ガス６２に対して、導電性薄膜２０からパルス電圧が印加されることにより、各粒子間の結合力が切断され、反応性ガス６２は探針１７の外部に流出するものとなっている。このようにして微細孔２１から反応性ガス６２を流出させて、細胞２の表面に付着させることにより、細胞２と反応性ガス６２との間に種々の化学反応が励起され、この変化をＡＦＭ３や光学顕微鏡７により観測する。

本発明では、原子間力顕微鏡に限られず、他の走査型プローブ顕微鏡に備えられたカンチレバーを使用することも可能である。

Claims

生理活性物質又は化学反応を励起する物質を、生体試料に注入する生体試料操作方法において、
基端が片持ち支持された梁部と、該梁部に突設され内部に空洞が設けられた探針と、前記空洞から前記探針の外部へ前記探針を貫通して形成された微細孔と、前記探針の先端部の外壁面に固着されて、前記微細孔の下方かつその延長線上に先鋭な角部を探針点として位置させる突起部と、前記空洞内に設けられた第１電極と、を具備してなるカンチレバーの前記空洞内に、生理活性物質又は化学反応を励起する物質を包含し導電性を有する流体を充填し、
生体試料を透明な導電性薄膜からなる第２電極上に載置するとともに、該生体試料に前記カンチレバーの探針点を近接させ、
前記第１電極と前記第２電極との間にパルス電圧を印加することにより、前記流体を前記微細孔から流出させ且つ生体試料に注入し、
前記生体試料の操作及び操作後の前記生体試料の内部変化を、前記第２電極を通して光学顕微鏡で観測することを特徴とする生体試料操作方法。
前記カンチレバーが、走査型プローブ顕微鏡に装備され、前記流体を生体試料に注入又は滴下した後に、生体試料の表面の形状変化を前記走査型プローブ顕微鏡で観測することを特徴とする請求項１に記載の生体試料操作方法。