JP4644944B2 - 標的核酸検出法およびそのための試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的および臨床的試料中の特定の核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を高感度で検出する標的核酸検出方法およびそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、試料中の標的核酸配列の検出は、医学的分野における感染症の診断、微生物の同定あるいは遺伝性疾患の診断などのほか、生物種の同定、生物の進化図の作成、遺伝子の機能解析、食物の検査など、種々の分野で利用されている。
目下、試料中の標的核酸配列を含む核酸を２種の核酸プライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを使用して、指数関数的に核酸を増幅させる方法（ＰＣＲ法など）が主に用いられている。増幅した核酸に標的核酸配列を認識する相補的な標識核酸プローブを反応させ、増幅した核酸配列と相補的な標識核酸プローブを１：１でハイブリッドさせ、結合した標識核酸プローブの標識をもとに標的核酸を検出する方法が実用化されている。
【０００３】
しかし、上記標的核酸配列と検出される標識核酸プローブは１：１であるため検出感度上、前以て核酸の多数の増幅を必要としている。また、プローブの特異性が低く、核酸の非特異的検出を抑えるためにも、標的核酸を増幅し、非特異的検出を希釈しておく必要があった。
【０００４】
このような核酸の増幅工程を必要とせず、試料核酸から直接的に標的核酸配列を検出できる方法として、相補的な核酸プローブの開裂を利用し、標的核酸配列を複数回、相補的な核酸プローブとハイブリッド結合させることにより、開裂した核酸プローブを検出して標的核酸配列の有無を検出する方法（特許2856804号）が提案されている。この方法を具体的に実現する手段として、サイクリング・プローブ・テクノロジー法（ＣＰＴ法）（特許第2839608号）およびインベーダー法（米国特許第5846717号）が報告されている。
【０００５】
ＣＰＴ法は、相補的な核酸プローブとしてＤＮＡとＲＮＡからなるキメラプローブを使用し、該プローブのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨで切断することを特徴としている。ＣＰＴ法においては、核酸プローブのＲＮＡ部分が標的核酸のＤＮＡと二本鎖を形成した場合にのみ、リボヌクレアーゼＨの消化を受ける。標的核酸がＲＮＡの場合には、プローブと結合した標的自身がリボヌクレアーゼＨにより切断され、その後の反応に利用できなくなるため、ＣＰＴ法により直接検出を行うことはできない。このためＣＰＴ法の対象となる核酸は基本的にはＤＮＡであり、ＲＮＡの検出を行う場合には、事前にＲＮＡから逆転写を行ったcＤＮＡを準備しておく必要がある。
【０００６】
また、ＣＰＴ法を用いて一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism：以下、ＳＮＰとよぶ）のような１塩基のみ異なる核酸配列を選択的に検出する場合には、作成するプローブのＲＮＡ部分を短くする必要がある。なぜなら、ＣＰＴ法では、プローブのＲＮＡ部分とＳＮＰにおける置換塩基部分（以下、ＳＮＰ部位とよぶ）が対になるようプローブをデザインするが、プローブのＲＮＡ部分と標的ＤＮＡがハイブリッドした場合に、リボヌクレアーゼが不特定の開始位置からＲＮＡを消化するため、プローブのＲＮＡ部分が長いと、ＳＮＰ部位以外でＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖が形成されてしまい、ＳＮＰの区別なくリボヌクレアーゼＨがＲＮＡを消化してしまうからである。
【０００７】
また、インベーダー法は、標的核酸（Ａ）に、該標的核酸の一部と相補的な部分を持つ核酸プローブ（Ｂ）と該標的核酸の他の部分に相補的であり、一部プローブ（Ｂ）と重複する核酸プローブ（Ｃ）（以下インベーダープローブと呼ぶ）を反応させ、部分的に３本鎖核酸を形成した場合にのみ、その部分が酵素Cleavaseによって消化され、前記核酸プローブ（Ｂ）が開裂することを特徴としている。核酸プローブ（Ｂ）が開裂し、生成した核酸配列を、続く２段階目反応のインベーダープローブ（Ｄ）として、標識されたプローブ（Ｅ）を開裂し、プローブＥの標識を基に検出を行う。該方法は、複数のＳＮＰを同時に解析するなどの用途に適しているが、１つの目的核酸配列に複数のプローブ（Ｂ、ＣおよびＥ）を必要とし、また該反応のために見いだされた特別な酵素Cleavaseを利用するため、汎用性が低く、簡便に実施できる方法ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる事情を背景になされたものであって、その課題はＳＮＰのような１塩基しか異ならない核酸配列の存在下においても、高い感度でもって標的核酸配列を検出でき、かつ、複数の標的核酸配列を効率よく検出でき、さらに、一連の検出反応の条件設定を簡便に行える方法および標的核酸検出試薬を提供することにある。また、本発明の課題は、対象となる核酸がＤＮＡに限らず、ＲＮＡであっても前処理を必要とせずに検出できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、種々鋭意検討したところ、特定のエキソデオキシリボヌクレアーゼ（以下、エキソデオキシリボヌクレアーゼと呼ぶ）が核酸の二本鎖に特異的に反応して、ＤＮＡ部分を３’側または５’側から消化することに着目し、該酵素を用いて、標的核酸配列にハイブリッド結合した相補的な核酸プローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡからなる）のうち、ＤＮＡ部分を消化し、次いで、消化後の核酸プローブの非消化部分（ＲＮＡを含む部分）を遊離させ、もとの標的核酸を得て、複数回、上記反応を繰り返して非消化部分を蓄積し、該非消化部分を検出することにより、標的核酸を検出することを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせ（工程１）、次いで、エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させ（工程２）、次いで、ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブの非消化部分を遊離させ（工程３）、該遊離した非消化部分を検出する（工程４）ことを特徴とする標的核酸検出方法である。
【００１１】
また、本発明は下記工程１、２および３を複数回繰り返し、遊離したキメラ核酸プローブの非消化部分を検出することを特徴とする標的核酸検出方法である。
工程１：標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせる；
工程２：エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させる；
工程３：ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させて、標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する。
【００１２】
さらに、本発明はＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブおよびエキソデオキシリボヌクレアーゼを含む標的核酸検出用試薬である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明において、エキソデオキシリボヌクレアーゼとは、ＤＮＡ：ＤＮＡもしくはＤＮＡ：ＲＮＡからなる二本鎖核酸のＤＮＡ部分の３’末端または５’末端の塩基から順に塩基を消化する酵素である。このため、例えば、一本鎖核酸とその一部と相補的なプローブが、該一本鎖核酸の両端以外にハイブリッドした場合には、プローブのみが消化され、一本鎖核酸部分は消化されない。また、該酵素は標的核酸配列の３’または５’末端以外の核酸配列を消化するエンドヌクレアーゼ活性をほとんど有しないものである。該酵素の一例を挙げるならば、エキソヌクレアーゼIII、ラムダエキソヌクレアーゼなどであり、同様の活性を有する他の酵素であっても使用可能である。
【００１４】
また、本発明において、ＤＮＡとＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとは、エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性が二本鎖の５’末端に対して作用する場合、該プローブの５’側はＤＮＡ部分であり、同活性が３’末端に対して作用する場合、３’側はＤＮＡ部分である。該ＤＮＡ部分の長さは約１〜２０塩基であり、そこに続く部分に任意な長さを有するＲＮＡ部分が存在する。キメラ核酸プローブ全体の長さは約１０〜１００塩基であることが好ましく、ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を繰り返して有していてもよい。具体例としては、エキソヌクレアーゼIIIを用いる場合、3'側には5'-ＲＮＡ(1塩基以上)-ＤＮＡ(1〜20塩基)-3'の配列を有していればよく、5'-ＲＮＡより上流の塩基配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでも良い。ラムダエキソヌクレアーゼを用いる場合、5'-ＤＮＡ(1〜20塩基)-ＲＮＡ(1塩基以上)-3'の配列を有していれば、3'−ＲＮＡより下流の塩基配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであっても良い。
【００１５】
本発明において標識とは、放射性、螢光性、電気化学的、発光性若しくは酵素性の標識、又は他のリポーター指示基などを含む核酸の標識に利用可能なあらゆる物質を意味する。核酸の標識に利用可能な物質としては、色素や蛍光色素のような直接検出可能なもの、アルカリフォスファターゼなど基質を与えることで検出可能な酵素などの他、ビオチン、ジゴキシゲニンの様に特定の物質と高い結合性を有したものを用いて、間接的に検出可能なものを含む。
【００１６】
本発明の検出方法は下記工程１〜４を含む。なお、図１は本発明の下記工程１〜３を具体的に示す。図１においてキメラ核酸プローブは、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡであり、エキソデオキシリボヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを３’末端から消化するエキソヌクレアーゼIIIを示す。エキソヌクレアーゼIIIに代えて、ラムダエキソヌクレアーゼを使用してもよい。
【００１７】
工程１：標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（図１中、▲１▼）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせる（図１中、▲２▼）。
試料となる標的核酸は、採取した試料から常法に従い、精製し、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬになるようＴＥ緩衝液（ｐＨ７〜８）もしくは精製水に溶解する。
試料核酸は緩衝液、プローブと共に９０〜９５℃、３〜１０分加温し、一本鎖核酸に変性する。この際の試料核酸を好ましくは５〜１５０μｇ／ｍＬ、プローブを好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように調製する。
ハイブリダイゼーション条件は、用いるエキソデオキシリボヌクレアーゼの至適条件および用いるプローブのＴｍにあわせる。一例としてエキソヌクレアーゼIIIを用いる場合５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）ｐＨ７．６、温度はプローブのＴｍの上下１０℃以内とする。
【００１８】
工程２：エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させる（図１中、▲３▼）。
消化は、ハイブリダイゼーション条件下の反応液にエキソデオキシリボヌクレアーゼを加えることで起こる。加える酵素量は１〜１００単位／μＬの範囲で、反応温度と酵素の至適温度との差が大きい場合は１０〜１００単位／μＬの範囲が望ましい。
【００１９】
工程３：ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させる（図１中、▲４▼）。
遊離はプローブのＤＮＡ部分が消化されることによりプローブのＴｍ（融解温度）が下がるために起こる。従って、ハイブリダイズあるいは消化の条件を維持すれば良い。
【００２０】
工程４：該遊離した非消化部分を検出する。
検出には、電気泳動、核酸染色または標識核酸プローブにより検出する。 標識核酸プローブは、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスビーズ、セルロース、あるいはテフロンまたはナイロンの膜に固相してもよい。
【００２１】
本発明方法は、さらに、上記工程１、２および３を実施して、キメラ核酸プローブの非消化部分が遊離した後の標的核酸を、工程１の標的核酸配列として複数回、使用することができる。工程１、２および３を繰り返して実施することにより、検出すべきキメラ核酸プローブの非消化部分が多数、蓄積されるため、高い検出感度が得られる。
【００２２】
本発明の工程に用いる酵素は、容易に入手可能な市販のエキソデオキシリボヌクレアーゼであり、標的核酸を一本鎖に変成する工程および酵素を失活する工程を除き、一定温度で検出反応が進み、比較的、緩慢な温度制御でよいため、簡便で汎用的な検出方法である。
【００２３】
本発明の標的核酸検出用試薬は、キメラ核酸プローブおよび緩衝液、エキソデオキシリボヌクレアーゼ、必要によりコントロールＤＮＡを含む。さらに、検出のために必要な電気泳動用ゲルなどを含む
【００２４】
【実施例】
次に、実施例により本発明を詳細に説明する。
なお、対象となる核酸、核酸プローブ配列、使用される酵素および反応条件などは、適宜必要により変更できるものであり、本発明はこれらの実施例で限定されるものではない。
【００２５】
本発明を用いて、ＳＮＰ解析を行う場合、 ＳＮＰ箇所とプローブの3'又は5'末端に位置するＤＮＡとが相補的となるように、プローブの合成が行われる。このとき、ＳＮＰ箇所に対応するプローブの塩基が、エキソデオキシリボヌクレアーゼの消化開始部位から約５塩基以内に位置していれば、ＳＮＰ特異的な検出が可能である。なぜなら、標的核酸以外のＳＮＰに対して、このようなプローブのエキソデオキシリボヌクレアーゼ消化開始部位は２本鎖を形成しないため、エキソデオキシリボヌクレアーゼによる消化が起こらないからである。
【００２６】
このため、プローブのＤＮＡ部分の長さは特に制限されず、使用目的に応じたプローブ選択を行うことができる。疾患との関連調査や体質決定因子の検索などの複数の検査目的で行われる実際のＳＮＰ解析においては、約１００〜約１０００種のＳＮＰを同時に検出する必要があり、検出する複数の核酸配列に対し、ほぼ同じ温度で特異的に反応するプローブを設計する必要がある。このような場合には、プローブ選択の自由度が高いことは、プローブ設計を容易にする。
【００２７】
なお、ＳＮＰとは一塩基多型を意味し、例えば、骨粗鬆症診断におけるビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲ）をコードする遺伝子において、制限酵素BsmIにて消化される部位、gaatgcgを有する遺伝子および該遺伝子を有さない遺伝子が存在し、通常、ｂ型およびＢ型と呼ばれている。
【００２８】
実施例１
ヒト血液由来ＤＮＡ中のＶＤＲ遺伝子において、イントロンに存在する制限酵素ＢｓｍＩで切断される型（ｂ型）および切断されない型（Ｂ型）、２種のタイプがあるＳＮＰ分析を実施した。
（キメラ核酸プローブの調製）
使用したプローブ１および２の配列は、以下の通りである。
プローブ１ 「 5’-ｇｃｃｃａｃａｇａｃ ａｇｇｃｃｔｇｃｇ-3’ 」
プローブ２ 「 5’-ｇｇｇｃｃａｃａｇａ ｃａｇｇｃｃｔｇｃａ-3’ 」
（下線部はＲＮＡを表す。）
プローブ１はＶＤＲ遺伝子ｂ型とハイブリッドし（Ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）、プローブ２はＶＤＲ遺伝子Ｂ型とハイブリッドする（ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）。
【００２９】
（反応溶液の調製）
下記３種類の溶液を調製した。
【００３０】
（試料の調製）
ヒト血液から核酸抽出キット（ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製）を用い抽出した試料をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法と呼ばれる、従来のＰＣＲ法（試料１μＬ、トリス−塩酸緩衝液 １０ｍＭ、プライマー１：5’-ｇｔｃ ａｇｇ ｃｇａ ｔｔｃ ｇｇｔ ａｇｇ ｇ-3’ ０．５μＭ、プライマー２：5'-ｃｃａ ｇｃｇ ｇａａ ｇａｇ ｇｔｃ ａａｇ ｇｇ-3’ ０．５μＭ、塩化マグネシウム １．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ各２００μＭ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製、Ｔａq Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５単位／μＬ）０．２μＬを全量２５μＬとし、９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ２０秒］４０回繰り返し、７２℃ ５分）で増幅し、次いで、増幅核酸（ＤＮＡ）１５μＬを３７℃にて、制限酵素ＢｓｍＩ１単位／μＬを含む緩衝液５μＬで処理し、得られた試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけた。該電気泳動の結果、制限酵素断片のバンドが見られ、前記遺伝子はＶＤＲ遺伝子Ｂ型を有するものと確認した。
【００３１】
上記ヒト血液から採取した遺伝子（ＶＤＲ遺伝子Ｂ型を有するヒト血液由来ＤＮＡ）１μＬ、上記緩衝溶液１μＬおよび１μＬのプローブ溶液１に精製水５μＬを加えた反応液Ａ８μＬを用意した。また、同じヒト血液由来ＤＮＡ １μＬ、上記▲１▼緩衝溶液１μＬおよび▲３▼１μＬのプローブ溶液２に精製水５μＬを加えた反応液Ｂ８μＬを用意した。
上記反応液Ａおよび反応液Ｂをそれぞれ９５℃で５分間加温の後、６２℃まで温度を下げた。６２℃まで温度が下がったところで、エキソヌクレアーゼIII（東洋紡製、２００単位/μＬ）２μＬをそれぞれの反応液に加え、そのままの温度で２時間放置した後、該酵素の失活のため、再度、反応液を９５℃まで加温し、５分間おき、そのまま４℃に冷却した。
【００３２】
冷却後の２つの反応液を、核酸が高次構造を持たないように尿素が入ったポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムで可視化した。その結果を図２に示す。レーンＡは反応液Ａを示し、レーンＢは反応液Ｂを示す。
図２から、使用した標的核酸はプローブ１と反応せず、プローブ２と反応することが明らかである。つまり、イントロン部分に存在するＶＤＲ遺伝子型はＢ型であることが確認された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の標的核酸検出法および標的核酸検出用試薬により、ＤＮＡだけでなくＲＮＡも、ｃＤＮＡを作成することなく、直接的に検出することができる。また、ＳＮＰなどの１〜数塩基しか異ならない標的核酸の存在下においても、特異性の高く、かつ簡便で汎用的な検出方法が提供される。
【００３４】
【配列表】
＜１１０＞ 株式会社ニッショー
＜１２０＞ 標的核酸検出法およびそのための試薬
＜１３０＞ １３−０００
＜１６０＞ ４
【００３５】
＜２１０＞ １
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２０＞ ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
＜２２３＞ ＶＤＲ遺伝子ｂ型とハイブリッドする（Ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）プローブ
＜４００＞ ｇｃｃｃａｃａｇａｃ ａｇｇｃｃｔｇｃｇ 19
【００３６】
＜２１０＞ ２
＜２１１＞ ２０
＜２１３＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２０＞ ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
＜２２３＞ ＶＤＲ遺伝子Ｂ型とハイブリッドする（ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）プローブ
＜４００＞ ｇｇｇｃｃａｃａｇａ ｃａｇｇｃｃｔｇｃａ 20
【００３７】
＜２１０＞ ３
＜２１１＞ 19
＜２１４＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２３＞ ＰＣＲ法による核酸増幅プライマー
＜４００＞ ｇｔｃａｇｇｃｇａｔ ｔｃｇｇｔａｇｇｇ 19
【００３８】
＜２１０＞ ４
＜２１１＞ ２０
＜２１４＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２３＞ ＰＣＲ法による核酸増幅プライマー
＜４００＞ ｃｃａｇｃｇｇａａｇ ａｇｇｔｃａａｇｇｇ 20
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の標的核酸検出方法の概略図である。
【図２】本発明方法を用いたＶＤＲ遺伝子ＢｓｍＩのＳＮＰを検出する電気泳動図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的および臨床的試料中の特定の核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を高感度で検出する標的核酸検出方法およびそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、試料中の標的核酸配列の検出は、医学的分野における感染症の診断、微生物の同定あるいは遺伝性疾患の診断などのほか、生物種の同定、生物の進化図の作成、遺伝子の機能解析、食物の検査など、種々の分野で利用されている。
目下、試料中の標的核酸配列を含む核酸を２種の核酸プライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを使用して、指数関数的に核酸を増幅させる方法（ＰＣＲ法など）が主に用いられている。増幅した核酸に標的核酸配列を認識する相補的な標識核酸プローブを反応させ、増幅した核酸配列と相補的な標識核酸プローブを１：１でハイブリッドさせ、結合した標識核酸プローブの標識をもとに標的核酸を検出する方法が実用化されている。
【０００３】
しかし、上記標的核酸配列と検出される標識核酸プローブは１：１であるため検出感度上、前以て核酸の多数の増幅を必要としている。また、プローブの特異性が低く、核酸の非特異的検出を抑えるためにも、標的核酸を増幅し、非特異的検出を希釈しておく必要があった。
【０００４】
このような核酸の増幅工程を必要とせず、試料核酸から直接的に標的核酸配列を検出できる方法として、相補的な核酸プローブの開裂を利用し、標的核酸配列を複数回、相補的な核酸プローブとハイブリッド結合させることにより、開裂した核酸プローブを検出して標的核酸配列の有無を検出する方法（特許2856804号）が提案されている。この方法を具体的に実現する手段として、サイクリング・プローブ・テクノロジー法（ＣＰＴ法）（特許第2839608号）およびインベーダー法（米国特許第5846717号）が報告されている。
【０００５】
ＣＰＴ法は、相補的な核酸プローブとしてＤＮＡとＲＮＡからなるキメラプローブを使用し、該プローブのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨで切断することを特徴としている。ＣＰＴ法においては、核酸プローブのＲＮＡ部分が標的核酸のＤＮＡと二本鎖を形成した場合にのみ、リボヌクレアーゼＨの消化を受ける。標的核酸がＲＮＡの場合には、プローブと結合した標的自身がリボヌクレアーゼＨにより切断され、その後の反応に利用できなくなるため、ＣＰＴ法により直接検出を行うことはできない。このためＣＰＴ法の対象となる核酸は基本的にはＤＮＡであり、ＲＮＡの検出を行う場合には、事前にＲＮＡから逆転写を行ったcＤＮＡを準備しておく必要がある。
【０００６】
また、ＣＰＴ法を用いて一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism：以下、ＳＮＰとよぶ）のような１塩基のみ異なる核酸配列を選択的に検出する場合には、作成するプローブのＲＮＡ部分を短くする必要がある。なぜなら、ＣＰＴ法では、プローブのＲＮＡ部分とＳＮＰにおける置換塩基部分（以下、ＳＮＰ部位とよぶ）が対になるようプローブをデザインするが、プローブのＲＮＡ部分と標的ＤＮＡがハイブリッドした場合に、リボヌクレアーゼが不特定の開始位置からＲＮＡを消化するため、プローブのＲＮＡ部分が長いと、ＳＮＰ部位以外でＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖が形成されてしまい、ＳＮＰの区別なくリボヌクレアーゼＨがＲＮＡを消化してしまうからである。
【０００７】
また、インベーダー法は、標的核酸（Ａ）に、該標的核酸の一部と相補的な部分を持つ核酸プローブ（Ｂ）と該標的核酸の他の部分に相補的であり、一部プローブ（Ｂ）と重複する核酸プローブ（Ｃ）（以下インベーダープローブと呼ぶ）を反応させ、部分的に３本鎖核酸を形成した場合にのみ、その部分が酵素Cleavaseによって消化され、前記核酸プローブ（Ｂ）が開裂することを特徴としている。核酸プローブ（Ｂ）が開裂し、生成した核酸配列を、続く２段階目反応のインベーダープローブ（Ｄ）として、標識されたプローブ（Ｅ）を開裂し、プローブＥの標識を基に検出を行う。該方法は、複数のＳＮＰを同時に解析するなどの用途に適しているが、１つの目的核酸配列に複数のプローブ（Ｂ、ＣおよびＥ）を必要とし、また該反応のために見いだされた特別な酵素Cleavaseを利用するため、汎用性が低く、簡便に実施できる方法ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる事情を背景になされたものであって、その課題はＳＮＰのような１塩基しか異ならない核酸配列の存在下においても、高い感度でもって標的核酸配列を検出でき、かつ、複数の標的核酸配列を効率よく検出でき、さらに、一連の検出反応の条件設定を簡便に行える方法および標的核酸検出試薬を提供することにある。また、本発明の課題は、対象となる核酸がＤＮＡに限らず、ＲＮＡであっても前処理を必要とせずに検出できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、種々鋭意検討したところ、特定のエキソデオキシリボヌクレアーゼ（以下、エキソデオキシリボヌクレアーゼと呼ぶ）が核酸の二本鎖に特異的に反応して、ＤＮＡ部分を３’側または５’側から消化することに着目し、該酵素を用いて、標的核酸配列にハイブリッド結合した相補的な核酸プローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡからなる）のうち、ＤＮＡ部分を消化し、次いで、消化後の核酸プローブの非消化部分（ＲＮＡを含む部分）を遊離させ、もとの標的核酸を得て、複数回、上記反応を繰り返して非消化部分を蓄積し、該非消化部分を検出することにより、標的核酸を検出することを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち、本発明は標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせ（工程１）、次いで、エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させ（工程２）、次いで、ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブの非消化部分を遊離させ（工程３）、該遊離した非消化部分を検出する（工程４）ことを特徴とする標的核酸検出方法である。
【００１１】
また、本発明は下記工程１、２および３を複数回繰り返し、遊離したキメラ核酸プローブの非消化部分を検出することを特徴とする標的核酸検出方法である。
工程１：標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせる；
工程２：エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させる；
工程３：ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させて、標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する。
【００１２】
さらに、本発明はＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブおよびエキソデオキシリボヌクレアーゼを含む標的核酸検出用試薬である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明において、エキソデオキシリボヌクレアーゼとは、ＤＮＡ：ＤＮＡもしくはＤＮＡ：ＲＮＡからなる二本鎖核酸のＤＮＡ部分の３’末端または５’末端の塩基から順に塩基を消化する酵素である。このため、例えば、一本鎖核酸とその一部と相補的なプローブが、該一本鎖核酸の両端以外にハイブリッドした場合には、プローブのみが消化され、一本鎖核酸部分は消化されない。また、該酵素は標的核酸配列の３’または５’末端以外の核酸配列を消化するエンドヌクレアーゼ活性をほとんど有しないものである。該酵素の一例を挙げるならば、エキソヌクレアーゼIII、ラムダエキソヌクレアーゼなどであり、同様の活性を有する他の酵素であっても使用可能である。
【００１４】
また、本発明において、ＤＮＡとＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとは、エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性が二本鎖の５’末端に対して作用する場合、該プローブの５’側はＤＮＡ部分であり、同活性が３’末端に対して作用する場合、３’側はＤＮＡ部分である。該ＤＮＡ部分の長さは約１〜２０塩基であり、そこに続く部分に任意な長さを有するＲＮＡ部分が存在する。キメラ核酸プローブ全体の長さは約１０〜１００塩基であることが好ましく、ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を繰り返して有していてもよい。具体例としては、エキソヌクレアーゼIIIを用いる場合、3'側には5'-ＲＮＡ(1塩基以上)-ＤＮＡ(1〜20塩基)-3'の配列を有していればよく、5'-ＲＮＡより上流の塩基配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでも良い。ラムダエキソヌクレアーゼを用いる場合、5'-ＤＮＡ(1〜20塩基)-ＲＮＡ(1塩基以上)-3'の配列を有していれば、3'−ＲＮＡより下流の塩基配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであっても良い。
【００１５】
本発明において標識とは、放射性、螢光性、電気化学的、発光性若しくは酵素性の標識、又は他のリポーター指示基などを含む核酸の標識に利用可能なあらゆる物質を意味する。核酸の標識に利用可能な物質としては、色素や蛍光色素のような直接検出可能なもの、アルカリフォスファターゼなど基質を与えることで検出可能な酵素などの他、ビオチン、ジゴキシゲニンの様に特定の物質と高い結合性を有したものを用いて、間接的に検出可能なものを含む。
【００１６】
本発明の検出方法は下記工程１〜４を含む。なお、図１は本発明の下記工程１〜３を具体的に示す。図１においてキメラ核酸プローブは、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡであり、エキソデオキシリボヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを３’末端から消化するエキソヌクレアーゼIIIを示す。エキソヌクレアーゼIIIに代えて、ラムダエキソヌクレアーゼを使用してもよい。
【００１７】
工程１：標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（図１中、▲１▼）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせる（図１中、▲２▼）。
試料となる標的核酸は、採取した試料から常法に従い、精製し、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬになるようＴＥ緩衝液（ｐＨ７〜８）もしくは精製水に溶解する。
試料核酸は緩衝液、プローブと共に９０〜９５℃、３〜１０分加温し、一本鎖核酸に変性する。この際の試料核酸を好ましくは５〜１５０μｇ／ｍＬ、プローブを好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように調製する。
ハイブリダイゼーション条件は、用いるエキソデオキシリボヌクレアーゼの至適条件および用いるプローブのＴｍにあわせる。一例としてエキソヌクレアーゼIIIを用いる場合５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）ｐＨ７．６、温度はプローブのＴｍの上下１０℃以内とする。
【００１８】
工程２：エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させる（図１中、▲３▼）。
消化は、ハイブリダイゼーション条件下の反応液にエキソデオキシリボヌクレアーゼを加えることで起こる。加える酵素量は１〜１００単位／μＬの範囲で、反応温度と酵素の至適温度との差が大きい場合は１０〜１００単位／μＬの範囲が望ましい。
【００１９】
工程３：ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させる（図１中、▲４▼）。
遊離はプローブのＤＮＡ部分が消化されることによりプローブのＴｍ（融解温度）が下がるために起こる。従って、ハイブリダイズあるいは消化の条件を維持すれば良い。
【００２０】
工程４：該遊離した非消化部分を検出する。
検出には、電気泳動、核酸染色または標識核酸プローブにより検出する。 標識核酸プローブは、ラテックス、ポリスチレン、架橋結合を有するデキストランまたはガラスビーズ、セルロース、あるいはテフロンまたはナイロンの膜に固相してもよい。
【００２１】
本発明方法は、さらに、上記工程１、２および３を実施して、キメラ核酸プローブの非消化部分が遊離した後の標的核酸を、工程１の標的核酸配列として複数回、使用することができる。工程１、２および３を繰り返して実施することにより、検出すべきキメラ核酸プローブの非消化部分が多数、蓄積されるため、高い検出感度が得られる。
【００２２】
本発明の工程に用いる酵素は、容易に入手可能な市販のエキソデオキシリボヌクレアーゼであり、標的核酸を一本鎖に変成する工程および酵素を失活する工程を除き、一定温度で検出反応が進み、比較的、緩慢な温度制御でよいため、簡便で汎用的な検出方法である。
【００２３】
本発明の標的核酸検出用試薬は、キメラ核酸プローブおよび緩衝液、エキソデオキシリボヌクレアーゼ、必要によりコントロールＤＮＡを含む。さらに、検出のために必要な電気泳動用ゲルなどを含む
【００２４】
【実施例】
次に、実施例により本発明を詳細に説明する。
なお、対象となる核酸、核酸プローブ配列、使用される酵素および反応条件などは、適宜必要により変更できるものであり、本発明はこれらの実施例で限定されるものではない。
【００２５】
本発明を用いて、ＳＮＰ解析を行う場合、 ＳＮＰ箇所とプローブの3'又は5'末端に位置するＤＮＡとが相補的となるように、プローブの合成が行われる。このとき、ＳＮＰ箇所に対応するプローブの塩基が、エキソデオキシリボヌクレアーゼの消化開始部位から約５塩基以内に位置していれば、ＳＮＰ特異的な検出が可能である。なぜなら、標的核酸以外のＳＮＰに対して、このようなプローブのエキソデオキシリボヌクレアーゼ消化開始部位は２本鎖を形成しないため、エキソデオキシリボヌクレアーゼによる消化が起こらないからである。
【００２６】
このため、プローブのＤＮＡ部分の長さは特に制限されず、使用目的に応じたプローブ選択を行うことができる。疾患との関連調査や体質決定因子の検索などの複数の検査目的で行われる実際のＳＮＰ解析においては、約１００〜約１０００種のＳＮＰを同時に検出する必要があり、検出する複数の核酸配列に対し、ほぼ同じ温度で特異的に反応するプローブを設計する必要がある。このような場合には、プローブ選択の自由度が高いことは、プローブ設計を容易にする。
【００２７】
なお、ＳＮＰとは一塩基多型を意味し、例えば、骨粗鬆症診断におけるビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲ）をコードする遺伝子において、制限酵素BsmIにて消化される部位、gaatgcgを有する遺伝子および該遺伝子を有さない遺伝子が存在し、通常、ｂ型およびＢ型と呼ばれている。
【００２８】
実施例１
ヒト血液由来ＤＮＡ中のＶＤＲ遺伝子において、イントロンに存在する制限酵素ＢｓｍＩで切断される型（ｂ型）および切断されない型（Ｂ型）、２種のタイプがあるＳＮＰ分析を実施した。
（キメラ核酸プローブの調製）
使用したプローブ１および２の配列は、以下の通りである。
プローブ１ 「 5’-ｇｃｃｃａｃａｇａｃ ａｇｇｃｃｔｇｃｇ-3’ 」
プローブ２ 「 5’-ｇｇｇｃｃａｃａｇａ ｃａｇｇｃｃｔｇｃａ-3’ 」
（下線部はＲＮＡを表す。）
プローブ１はＶＤＲ遺伝子ｂ型とハイブリッドし（Ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）、プローブ２はＶＤＲ遺伝子Ｂ型とハイブリッドする（ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）。
【００２９】
（反応溶液の調製）
下記３種類の溶液を調製した。
（試料の調製）
ヒト血液から核酸抽出キット（ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製）を用い抽出した試料をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法と呼ばれる、従来のＰＣＲ法（試料１μＬ、トリス−塩酸緩衝液 １０ｍＭ、プライマー１：5’-ｇｔｃ ａｇｇ ｃｇａ ｔｔｃ ｇｇｔ ａｇｇ ｇ-3’ ０．５μＭ、プライマー２：5'-ｃｃａ ｇｃｇ ｇａａ ｇａｇ ｇｔｃ ａａｇ ｇｇ-3’ ０．５μＭ、塩化マグネシウム １．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ各２００μＭ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製、Ｔａq Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５単位／μＬ）０．２μＬを全量２５μＬとし、９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ２０秒］４０回繰り返し、７２℃ ５分）で増幅し、次いで、増幅核酸（ＤＮＡ）１５μＬを３７℃にて、制限酵素ＢｓｍＩ１単位／μＬを含む緩衝液５μＬで処理し、得られた試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけた。該電気泳動の結果、制限酵素断片のバンドが見られ、前記遺伝子はＶＤＲ遺伝子Ｂ型を有するものと確認した。
【００３１】
上記ヒト血液から採取した遺伝子（ＶＤＲ遺伝子Ｂ型を有するヒト血液由来ＤＮＡ）１μＬ、上記緩衝溶液１μＬおよび１μＬのプローブ溶液１に精製水５μＬを加えた反応液Ａ８μＬを用意した。また、同じヒト血液由来ＤＮＡ １μＬ、上記▲１▼緩衝溶液１μＬおよび▲３▼１μＬのプローブ溶液２に精製水５μＬを加えた反応液Ｂ８μＬを用意した。
上記反応液Ａおよび反応液Ｂをそれぞれ９５℃で５分間加温の後、６２℃まで温度を下げた。６２℃まで温度が下がったところで、エキソヌクレアーゼIII（東洋紡製、２００単位/μＬ）２μＬをそれぞれの反応液に加え、そのままの温度で２時間放置した後、該酵素の失活のため、再度、反応液を９５℃まで加温し、５分間おき、そのまま４℃に冷却した。
【００３２】
冷却後の２つの反応液を、核酸が高次構造を持たないように尿素が入ったポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムで可視化した。その結果を図２に示す。レーンＡは反応液Ａを示し、レーンＢは反応液Ｂを示す。
図２から、使用した標的核酸はプローブ１と反応せず、プローブ２と反応することが明らかである。つまり、イントロン部分に存在するＶＤＲ遺伝子型はＢ型であることが確認された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の標的核酸検出法および標的核酸検出用試薬により、ＤＮＡだけでなくＲＮＡも、ｃＤＮＡを作成することなく、直接的に検出することができる。また、ＳＮＰなどの１〜数塩基しか異ならない標的核酸の存在下においても、特異性の高く、かつ簡便で汎用的な検出方法が提供される。
【００３４】
【配列表】
＜１１０＞ 株式会社ニッショー
＜１２０＞ 標的核酸検出法およびそのための試薬
＜１３０＞ １３−０００
＜１６０＞ ４
【００３５】
＜２１０＞ １
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２０＞ ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
＜２２３＞ ＶＤＲ遺伝子ｂ型とハイブリッドする（Ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）プローブ
＜４００＞ ｇｃｃｃａｃａｇａｃ ａｇｇｃｃｔｇｃｇ 19
【００３６】
＜２１０＞ ２
＜２１１＞ ２０
＜２１３＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２０＞ ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
＜２２３＞ ＶＤＲ遺伝子Ｂ型とハイブリッドする（ｂ型の遺伝子にはハイブリッドしない）プローブ
＜４００＞ ｇｇｇｃｃａｃａｇａ ｃａｇｇｃｃｔｇｃａ 20
【００３７】
＜２１０＞ ３
＜２１１＞ 19
＜２１４＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２３＞ ＰＣＲ法による核酸増幅プライマー
＜４００＞ ｇｔｃａｇｇｃｇａｔ ｔｃｇｇｔａｇｇｇ 19
【００３８】
＜２１０＞ ４
＜２１１＞ ２０
＜２１４＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜２２３＞ ＰＣＲ法による核酸増幅プライマー
＜４００＞ ｃｃａｇｃｇｇａａｇ ａｇｇｔｃａａｇｇｇ 20
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の標的核酸検出方法の概略図である。
【図２】本発明方法を用いたＶＤＲ遺伝子ＢｓｍＩのＳＮＰを検出する電気泳動図である。
Claims (6)
- 標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせ（工程１）、次いで、エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、ハイブリダイズした該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させ（工程２）、次いで、ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させ（工程３）、該遊離した非消化部分を検出する（工程４）ことを特徴とする標的核酸検出方法（ここで、前記エキソデオキシリボヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブは３’側がＤＮＡであり、前記エキソデオキシリボヌクレアーゼとしてラムダエキソヌクレアーゼを用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブは５’側がＤＮＡである）。
- 下記工程１、２および３を複数回繰り返し、遊離したキメラ核酸プローブの非消化部分を検出することを特徴とする標的核酸検出方法。
工程１：標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブとハイブリダイズさせる；
工程２：エキソデオキシリボヌクレアーゼを作用させて、該キメラ核酸プローブ中のＤＮＡ部分を消化させる；
工程３：ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブ中の非消化部分を遊離させて、標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する。
（ここで、前記エキソデオキシリボヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブは３’側がＤＮＡであり、前記エキソデオキシリボヌクレアーゼとしてラムダエキソヌクレアーゼを用いる場合、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるキメラ核酸プローブは５’側がＤＮＡである） - 前記ハイブリダイズしたキメラ核酸プローブの非消化部分を遊離させ、電気泳動、核酸染色または標識核酸プローブにより検出する、請求項１または２記載の標的核酸検出方法。
- 前記標識核酸プローブの標識は、放射性、螢光性、電気化学的、発光性若しくは酵素性の標識、又は他のリポーター指示基である、請求項３記載の標的核酸検出方法。
- 前記標識核酸プローブは、膜に固定化してなる、請求項３記載の標的核酸検出方法。
- 前記標識キメラ核酸プローブは、エキソデオキシリボヌクレアーゼ開裂反応後、または該開裂反応中に、膜に固定化してなる、請求項３記載の標的核酸検出方法。
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