JP4643004B2 - 生体材料中の病原体不活性化剤をクエンチするための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年１月６日出願の米国暫定出願番号第６０／０７０，５９７号の利益を請求し、その開示は本明細書中参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本出願は、血液製剤のような生体材料中の反応性求電子化合物をクエンチするために、材料を求核化合物で処理する方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
血液製剤および他の生体材料による疾患の伝播は、依然として深刻な衛生問題のままである。血液ドナースクリーニングおよび血液試験においてかなりの進歩が生じて来てはいるが、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＢＣ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスは、ウイルスまたはウイルス性抗体が低濃度であるため、試験の間、血液製剤中での検出を免れ得る。ウイルス性の危険に加えて、輸血に使用される予定である血液中のバクテリアまたは原生動物の存在をスクリーニングするための認可せられた試験は、目下、存在しない。危険性はまた、輸血を介したＨＩＶ伝播の危険性が認識される前に実際に生じたように、これまで未知の病原体が血液供給中に優勢になり、そして疾患の伝播の脅威を現し得るということにある。
【０００４】
研究所の労働者が血液または他の体液にさらされることもまた、衛生上の危険を現す。最近では１９８９年に、疾病管理センターは、血液にさらされることを含む仕事を行う保健医療労働者１２０００人が毎年Ｂ型肝炎ウイルスに感染すると見積もった。「保健医療および公衆安全労働者へのヒト免疫不全ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの伝播を予防するためのガイドライン」Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ、第３８巻、第Ｓ−６号、１９８９年６月。この統計は、生体材料中の病原体を不活性化するための方法に対する必要性を示している。
【０００５】
血液製剤の臨床使用の前に、病原体を不活性化するために、化学薬品が血液または血漿中に導入されてきた。病原体の光化学的不活性化のための方法および組成物が記載されてきた。米国特許第５，５８７，４９０号、および第５，４１８，１３０号は、体液中のウイルスまたはバクテリア混入物を光化学的に不活性化するために使用される置換ソラレンを記載している。メチレンブルーのようなフェノチアジンは、照明に対して血液製剤中の病原体を不活性化することを示してきた。Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３３：３０〜３６（１９９３）。米国特許第５，６３７，４５１号は、フタロシアニン化合物を加え、そして材料を照射することにより赤血球含有材料中のウイルスを不活性化する方法を記載している。
【０００６】
病原体不活性化のための光化学的方法の短所は、また生成する反応性フリーラジカルおよび酸素種が、血液製剤に損傷を引き起こし、そしてそれらの予定される使用に対する安定性を落とし得ることである。米国特許第４，７２７，０２７号、第５，５８７，４９０号、第５，４１８，１３０号、第５，２３２，８４４号、第５，６５８，７２２号、および第５，６３７，４５１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ ９７／１６９６６号において記載されるように、光化学反応の間に生じるフリーラジカル損傷を減少し、そして最小限にするために、フリーラジカルクエンチャーが病原体不活性化のための光化学的方法において使用されてきた。
【０００７】
光活性化を必要としない化合物が、病原体不活性化のために開発されてきた。これらの化合物は、代表的には病原体と反応する求電子試薬である。例えば、米国特許第５，０５５，４８５号は、アリールジオールエポキシドを使用した、組成物を含む細胞およびタンパク質中のウイルスの不活性化を記載している。他の化合物は、インサイチュで求電子試薬を生成する。ＬｏＧｒｉｐｐｏらは、ウイルス不活性化のための、ナイトロジェンマスタード、ＣＨ3−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2の使用を評価した。ＬｏＧｒｉｐｐｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、編）、１９５８年、２２５〜２３０頁。より重要には、米国特許第５，６９１，１３２号および第５，５５９，２５０号（これらの開示は本明細書中参考として援用される）が、Ｎ１，Ｎ１−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ４−（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）−１，４−ペンタンジアミン（「キナクリンマスタード」）および５−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］メチル−８−メトキシソラレンの、血液、血液製剤、および種々の生物学的起源のサンプルにおける病原体の不活性化のための使用を記載している。ポリアミン部分に共有結合したアジリジンを含む病原体不活性化化合物もまた、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）において記載されるように、使用されてきている。
【０００８】
理想的には、求電子反応により不活性化する病原体不活性化化合物または中間体の、血液製剤または他の生物学的サンプルへの添加は、サンプルに対するどのような望ましくない改変も引き起こすことなく病原体を不活性化する。病原体不活性化化合物は、求電子プロセスにより病原体と反応し、そして光活性化を必要としない。それ故、反応性酸素またはフリーラジカル種が生成されず、そして酸化的損傷は関係ない。しかしながら、他の望ましくない副反応が生じ得る。例えば、タンパク質を含む他の生体材料との求電子反応が生じ得る。これらの副反応は、潜在的に、生物学的サンプルの予定される目的に対するそれらの使用をおとしめ得る。
【０００９】
従って、病原体不活性化化合物の有害な病原体を不活性化する能力を保ちながら、病原体と求電子的に反応する病原体不活性化化合物の望まない求電子副反応を防止するための方法に対する必要が存在する。望ましくない副反応を減少しながら、生体材料中の病原体を不活性化する方法に対する必要が存在する。
【００１０】
（発明の開示）
材料中の反応基を含む化合物をクエンチするための方法が提供される。種々の化合物が、生体材料のような材料中、本明細書中で開示される方法を使用して、クエンチされ得る。クエンチされ得る化合物は、求電子基のような反応性基である官能基か、または求電子基のような反応性基をインサイチュで形成し得、および形成した官能基を含む化合物を含む。例えば、官能基は、インサイチュで求電子アジリジン、アジリジニウム（ａｚｉｒｉｄｉｎｉｕｍ）、チイラン（ｔｉｉｒａｎｅ）、またはチイラニイウム（ｔｈｉｉｒａｎｉｕｍ）イオンのような反応性基を形成し得るマスタード基であり得る。別の実施態様において、官能基はエポキシドであり得る。
【００１１】
１つの実施態様において、生体材料中の病原体を不活性化するために使用される病原体不活性化化合物の副反応をクエンチするための方法が提供される。特定の実施態様において、求電子基である官能基、または求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。この実施態様において、生体材料は、病原体不活性化化合物、および求電子基と共有結合的に反応し得る求核官能基を含むクエンチャーで処理される。病原体不活性化化合物の求電子基は、１つの好適な実施態様において、カチオン性基である。生体材料は、例えばインビトロまたはエキソビボで、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得る。好適な実施態様において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、また病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチャーにクエンチさせながら、病原体不活性化化合物が材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で材料に投与される。
【００１２】
１つの実施態様において、クエンチャーは、２相系のような多相系中に導入され得る。例えば、クエンチャーは、膜が第一および第二相を分離している２相系へ投与され得る。１つの実施態様において、１つの相は膜により閉ざされて（ｂｏｕｎｄ）いる。例えば、膜は病原性有機体の外部膜を規定し得、第一相は病原性有機体を含む相であり得、そして第二相は病原性有機体の内部であり得る。膜は、例えばウイルスの脂質被覆であり得、第一相は、例えば血液のようなウイルスが分散している液体であり得、そして第二相はウイルス核酸を含むウイルスの内部であり得る。別の実施態様において、膜は細胞膜であり得、そして膜に閉ざされた相は、バクテリアのような、病原性単細胞有機体の内部であり得る。この実施態様において、病原体不活性化化合物は、２相系中へ導入され、これは好ましくは速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得、一方でクエンチャーは実質的に、病原体不活性化化合物と比較して、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。
【００１３】
１つの実施態様において、その中に膜を含む病原体を有する第一の液相、および病原体の膜により閉ざされた第二相を含む２相生体材料中の、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。従って、第二相は病原体膜内に含まれる内容物である。生体材料は、求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理される。病原体不活性化化合物での処理の前、それと同時に、またはその後、生体材料は求電子基と共有結合的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで処理される。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前に、またはそれと同時に加えられる。好ましくは、病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得る。好ましくは、病原体不活性化化合物による膜透過速度は、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に減少する。好ましくは、病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。クエンチャーは、好ましくは、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の求電子基と反応し得、そしてクエンチャーの、病原体不活性化化合物の求電子基との反応は、好ましくは実質的に第一相で生じる。求電子基を含む病原体不活性化化合物は、膜に閉ざされた第二相中の病原体の核酸と反応し、それにより病原体を不活性化する。この方法は、病原体が処理される相において、反応性病原体不活性化化合物、ならびにそこから形成される反応性種をクエンチしながら、病原体膜内での病原体不活性化化合物と病原体核酸との反応により病原体を不活性化させる。
【００１４】
本明細書中で開示される方法は、２相系において、クエンチャーが第一相に投与され、そして実質的に病原体の外部膜を通り抜け得ず、従って実質的に第二相、すなわち病原体の内部に存在しないため、有利である。病原体不活性化化合物は、例えば、第一相へ投与され、そして求電子基の形成前に病原体の膜を通り抜け得る。インサイチュでの求電子基の形成において、病原体不活性化化合物は実質的に、もはや膜を通り抜け得ない。従って、第二相、すなわち病原体の内部で病原体不活性化化合物はクエンチされることなく病原体の核酸と反応しながら、第一相でクエンチが選択的に生じる。従って、生体材料、例えば血液製剤中、病原体不活性化化合物およびそれらの分解生成物の反応性基のクエンチは、病原体が懸濁している第一相で選択的に生じる。従って、第一相におけるクエンチは、血液中のタンパク質または細胞表面の共有結合的改変のような、病原体不活性化化合物上の反応基の望まない副反応を減少させる。この方法において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体の不活性化を生じさせながら、血液のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて保護的効果を有する。
【００１５】
この方法は、原核および真核生物ならびに脂質被覆ウイルスのような病原体を含む生体材料を処理するために使用され得る。詳細には、この方法は、脂質被覆ウイルス、および細胞膜の形態で膜を含むバクテリアのような、膜を含む病原体を処理するために使用され得る。その中に膜を含む病原体を有する、血液製剤のような生体材料を処理するための例示的なクエンチャーには、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、メルカプトエタンスルホン酸塩、またはジメルカプロールが挙げられる。
【００１６】
病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、および求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基を含み得、ここで求電子基は、核酸と反応して核酸と共有結合を形成し得る。病原体不活性化化合物はまたさらに、壊れやすいリンカーを含み得、これは核酸結合リガンドおよび官能基を連結する。例えば、官能基は、インサイチュで反応してアジリジニウムイオンのような求電子基を形成し得るマスタード基であり得る。例示的な病原体不活性化化合物は、キナクリンマスタード、Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−エチル−Ｎ’−（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）−１，３−プロパンジアミンジヒドロクロリド、および５−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］メチル−８−メトキシソラレンを含む。他の病原体不活性化化合物は、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）において記載されるような、ポリアミン部分に共有結合的に連結したアジリジンを含む化合物を含む。
【００１７】
使用され得るクエンチャーは、チオール、チオ酸、ジチオ酸、ホスフェート、チオホスフェート、およびアミンのような求核官能基を含み得る。例示的なクエンチャーは、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チオスルフェート、メルカプトエタンスルホン酸塩、およびジメルカプロールを含む。好適な実施態様において、クエンチャーはグルタチオンである。
【００１８】
血液製剤のような生体材料がクエンチャーおよび病原体不活性化化合物で処理される方法において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後に材料へ加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、または同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える約３０分以内、例えば、約１５〜２０分以内、または約１０分以内に加えられる。処理され得る生体材料は、全血、赤血球、血漿またはそのフラクション、および血小板のような血液製剤を含む。この方法は、個体内へ導入するのに適している処理済み血液製剤を製造するために使用され得る。例えば、処理済み材料はそれを必要としている個体中へ輸注され得る。必要に応じて、材料中の病原体不活性化化合物および／またはクエンチャーの濃度は、処理後、および輸注前に、例えば濾過または吸着により減少され得る。病原体を含む、または含むと疑われる広範な生体材料（例えば血液製剤）が処理され得る。
【００１９】
１つの好適な実施態様において、赤血球を含む材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供され、ここでこの方法は、赤血球を含む材料を、求電子基であるかまたは求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理する工程、および求電子基と電子共有的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで材料を処理する工程を含む。１つの実施態様における病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、およびインサイチュで反応してアジリジニウムイオンのような求電子基を形成し得るマスタード基を含む。材料は、濃縮（ｐａｃｋｅｄ）赤血球を含み得る。材料は、例えば約３０〜８５％のヘマトクリットを有する血液製剤を含み得る。例えば、赤血球を含む材料は、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得、次いで処理された材料はそれを必要としている個体中に輸注され得る。
【００２０】
病原体不活性化化合物の濃度は、例えば、約０．１μＭ〜５ｍＭであり得る。病原体不活性化化合物の濃度は、例えば、処理されるべき材料中の病原体の少なくとも約３〜６ ｌｏｇを不活性化するのに十分であるように提供され得る。求核基は、好ましくはチオール基である。好適な実施態様におけるクエンチャーは、グルタチオンである。グルタチオンの濃度は、例えば約０．５〜３０ｍＭのオーダーであり得る。材料は、例えば少なくとも約１〜４８時間、病原体不活性化化合物およびクエンチャーとともにインキュベートされ得る。
【００２１】
好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物による病原体の不活性化を、クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して約３ ｌｏｇ以下まで減少させる。別の好適な実施態様において、この方法において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物によるウイルス性病原体の不活性化を、クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して約１ ｌｏｇ以下まで減少させる。好ましくは、赤血球を含む材料が処理される実施態様において、赤血球機能は、処理後実質的に変更されない。
【００２２】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は赤血球含有材料を、病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化するのに有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理する工程を含み、そしてここで赤血球機能は処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、この材料を、病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化するのに有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理する工程を含み、そしてここで赤血球の溶血は貯蔵の２８日後で３％未満である。
【００２３】
（発明を実施するための最適な様式）
材料中の、求電子基を含む化合物のような反応性化学種をクエンチするための方法が提供される。１つの実施態様において、血液製剤のような生体材料を含む材料中の病原体不活性化化合物をクエンチするための方法が提供される。別の実施態様において、病原体不活性化化合物で処理される、赤血球のような生体材料の改変を阻害するための方法が提供される。病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体の不活性化を生じさせながら、血液製剤のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて、保護的効果を有する。
【００２４】
（定義）
「病原体」は、ヒト、他の哺乳動物、または脊椎動物に疾患を引き起こしうる因子を含む任意の核酸として定義される。病原体因子は、単細胞または多細胞であり得る。病原体の例は、ヒト、他の哺乳動物、または脊椎動物に疾患を引き起こす、バクテリア、ウイルス、原生動物、真菌、酵母、糸状菌、およびマイコプラズマである。病原体の遺伝材料は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして遺伝材料は一重らせんまたは二重らせん核酸として存在し得る。表Ｉは、ウイルスの例を列挙し、そしていかなる様式においても本発明を制限することを意図しない。
【００２５】
【表１】
材料または化合物の「インビボ」使用は、材料または化合物の、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物中への導入として定義される。
【００２６】
材料または化合物の「インビトロ」使用は、材料または化合物の、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外側での使用として定義され、ここで材料または化合物は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物中へ再導入することを意図しない。インビトロ使用の例は、研究室装置を使用する血液サンプルの成分分析がある。
【００２７】
化合物の「エキソビボ」使用は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外側で、生体材料の処理のために化合物を使用することとして定義され、ここで処理された生体材料は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の内側で使用することを意図する。例えば、ヒトからの血液の除去、および病原体を不活性化するためのその血液中への化合物の導入は、その血液がそのヒトまたは別のヒト中へ再導入されることを意図する場合に、その化合物のエキソビボ使用として定義される。ヒト血液の、そのヒトまたは別のヒト中への再導入は、化合物のエキソビボ使用とは対照的に、血液のインビボ使用である。血液がヒト中へ再導入されるときに、化合物が依然として血液中に存在しているならば、化合物は、そのエキソビボ使用に加えて、インビボでもまた導入される。
【００２８】
「処理され得る材料」は、任意の材料を含み、生体材料を含む。そのような材料は、化学製品、溶液を含み、これは、塩、または緩衝化溶液、および溶媒を含む。生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物と接触することになるか、またはその中へ導入される任意の材料（ここで、そのような接触が疾患または病原体を伝染させる危険をもたらす）が、本明細書中で開示されるように処理され得る。
【００２９】
「生体材料」は、任意の型の生物学的有機体を起源とする材料として定義される。生体材料の例は、以下を含むがこれらに限定されない；血液、血漿、分画化血漿、血小板調製物、赤血球、および濃縮赤血球のような血液製剤、髄液、唾液、尿、汗、糞、***、乳、組織サンプル、ホモジナイズされた組織サンプル、ならびに生物学的有機体にその起源を有する任意の他の物質。生体材料はまた、その起源を生物学的有機体に持つ物質を組み込んでいる合成材料を含む；例えば、病原体またはその一部分を含むワクチン調製物（この場合、病原体がその起源を生物学的有機体に持つ物質である）または組換えタンパク質、血液および分析試薬の混合物である、分析のために調製されたサンプル、細胞培養培地、細胞培養物、ウイルス培養物、および生きている有機体から由来する他の培養物など。
【００３０】
「病原体の不活性化」は、材料中の病原体を繁殖し得ないようにする工程として定義される。不活性化は、残存する繁殖し得る病原体のフラクションの、負の対数として表される。従って、特定の濃度にある化合物が材料中の病原体の９０％を繁殖し得ないようにするならば、１０％または１／１０（０．１）の病原体が繁殖し得るままである。０．１の負の対数は１であり、そしてその化合物のその濃度は１ ｌｏｇまで病原体を不活性化したとされる。あるいは、化合物は、その濃度で１ ｌｏｇの殺傷を有するとされる。従って、特定の濃度にある化合物が１０％または０．１を除く全ての病原体を繁殖不可能にするならば、それは１ ｌｏｇで病原体を不活性化するとされる。１％または０．１％を除く全ての病原体を不活性化することは、それぞれ、その化合物のその濃度において２ ｌｏｇまたは３ ｌｏｇの病原体の減少に対応する。
【００３１】
（クエンチされる化合物）
種々の化合物が、生体材料のような材料中で、本明細書中で開示される方法を使用してクエンチされ得る。クエンチされ得る化合物は、求電子基のような反応基であるか、またはそれを形成し得る、および例えばインサイチュでそれを形成した官能基を含む化合物を含む。例えば、官能基は、インサイチュで反応基（例えば、求電子アジリジン、アジリジニウム、チイラン、またはチイラニイウムイオンなど）を形成し得るマスタード基であり得る。別の実施態様において、官能基はエポキシドであり得る。クエンチャーは、求核基を含み、そしてクエンチャーの求核基の、反応性求電子基との共有結合的反応により、化合物の求電子性反応基を補足するように作用する。クエンチャーは、求電子基を含む化合物ならびにそこから形成された反応性種を含む反応性種を補足するために使用され得る。
【００３２】
１つの実施態様において、材料中の病原体を不活性化するために使用される化合物をクエンチするための方法が提供される。血液製剤において、不活性化されることが望ましい病原体は、微生物（例えば、原核生物、真核生物、および核酸を含むウイルス性微生物など）ならびにそのような微生物由来の核酸ゲノムまたはそのフラグメントを含む。不活性化され得るウイルスの例は、脂質被覆ウイルス（例えば、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モロニー肉腫ウイルス、シンドビスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２）、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎およびヘルペス群ウイルスなど）、ならびにパルボウイルスを含む非エンベロープウイルス（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ）を含む。
【００３３】
反応性求電子基を含むか、または光活性化を必要とすることなくインサイチュで反応して反応性求電子基を形成する化合物が、生体材料中の病原体を不活性化するために開発されてきた。反応性求電子基は、ウイルスおよびバクテリアのような病原体の核酸と反応して、それらを不活性化させる。しかしながら、これらの反応性化合物はまた、望まない副反応に関係し得る。本明細書中で提供されるのは、クエンチ化合物を加えて、化合物上の求電子基と病原体との反応により病原体を不活性化するこれらの化合物の、望まない副反応を減少する方法である。
【００３４】
反応性求電子基を形成し、そして病原体を不活性化するために使用され得る病原体不活性化化合物の例は、ＰＣＴ ＷＯ ９６／１４７３７、ＰＣＴ ＷＯ ９６／３９８１８に、および米国暫定出願番号第６０／０４３，６９６号（１９９７年４月１５日出願）に記載される（これらの開示は本明細書中で援用される）。さらに、ナイトロジェンマスタード、ＣＨ3−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2は、特定の病原体を不活性化し得る。ＬｏＧｒｉｐｐｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、編）、１９５８年、２２５〜２３０頁。
【００３５】
好適であるのは、エフェクターと共有結合したアンカーを含む病原体不活性化化合物である。用語「アンカー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸生物高分子に、非共有結合的に結合し得る部分を示す。「アンカー」はまた、「核酸結合リガンド」として示される。用語「エフェクター」は、核酸と反応して核酸と共有結合を形成し得る部分を示す。好ましくは、エフェクターは、求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基であり、ここで求電子基は、核酸と共有結合を形成し得る。例えば、ＰＣＴ ＷＯ ９６／１４７３７、ＰＣＴ ＷＯ ９６／３９８１８、および米国特許第５，５５９，２５０号（これらの開示は本明細書中で援用される）は、マスタード基であるエフェクターおよび核酸結合リガンドを含む病原体不活性化化合物を記載している。ポリアミンアンカーに共有結合で接続されたアジリジンを含む病原体不活性化化合物もまた、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）；およびＰＣＴ ＷＯ ９７／０７６７４に記載されるように、使用され得る（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。
【００３６】
例示的な化合物は、キナクリンマスタードであり、その構造は以下に示される。
【００３７】
【化１】
病原体不活性化化合物はまた、アンカーが壊れやすいリンカーに共有結合している形態で提供され得、リンカーはエフェクターに共有結合している。用語「壊れやすいリンカー」は、アンカーおよびエフェクターに共有結合で連結している部分を示し、そしてこれは、アンカーおよびエフェクターがもはや共有結合で連結しないように特定の条件下で分解し得る。アンカー−壊れやすいリンカー−エフェクターの配列は、アンカーの結合能力によって、化合物が核酸に特異的に結合することを可能にする。このことは、エフェクターを核酸との反応のために近接させる。アンカー−壊れやすいリンカー−エフェクターの配列を含む病原体不活性化化合物は、米国暫定出願番号第６０／０４３，６９６号（１９９７年４月１５日出願）に、および米国特許出願番号第０９／００３，１１５号（１９９８年１月６日出願）に開示される（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。エフェクターは、例えば、マスタード基、マスタード基等価物、またはエポキシドであり得る。
【００３８】
例示的な病原体不活性化化合物（ＰＩＣ）は、ＰＩＣ−１およびＰＩＣ−２を含み、それらの構造は以下に示される。ＰＩＣ−１はエステル官能性を有する壊れやすいリンカーを含むが、一方ＰＩＣ−２はアミド官能性を有する壊れやすいリンカーを含む。
【００３９】
【化２】
広範な基が、アンカー、リンカー、およびエフェクターとして使用され得る。アンカー基の例は、以下を含むがこれらに限定されない；インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、メジャーグルーブバインダー、ポリアミンを含む静電相互作用により結合する分子、および配列特異的相互作用により結合する分子。以下は、可能なアンカー基の非制限的列挙である：
アクリジン（およびアクリジン誘導体、例えば、プロフラビン、アクリフラビン、ジアクリジン、アクリドン、ベンズアクリジン、キナクリン）、アクチノマイシン、アンスラサイクリノン、ロドマイシン、ダウノマイシン、チオキサンテノン（およびチオキサンテノン誘導体、例えばミラシルＤ）、アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン（キノマイシンＡ（ｑｕｉｎｏｍｙｃｉｎ Ａ））、トリオスチン（ｔｒｉｏｓｔｉｎｓ）、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）（ならびに二量体、三量体、およびそれらのアナログ）、ノルフィリンＡ（ｎｏｒｐｈｉｌｉｎ Ａ）、フルオレン（および誘導体、例えば、フルオレノン、フルオレノジアミン）、フェナジン、フェナントリジン、フェノチアジン（例えばクロルプロマジン）、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテンおよびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、３，４−ベンゾピレン、１−ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン、ベンゾジピロン、キノリン（例えば、クロロキン、キニン、フェニルキノリンカルボキサミド）、フロクマリン（ｆｕｒｏｃｏｕｍａｒｉｎｅｓ）（例えば、ソラレンおよびイソソラレン）、エチジウム、プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）、コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）、および多環式芳香族炭化水素ならびにそれらのオキシラン誘導体；
ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、他のレキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８および他のＨｏｅｃｈｓｔ色素、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）、およびトリアリールメタン色素；
アフラトキシン；
スペルミン、スペルミジン、および他のポリアミン；ならびに
三重らせん形成、Ｄ−ループ形成、および一重らせん標的への直接塩基対形成のような配列特異的相互作用により結合する、核酸またはアナログ。これらの化合物の誘導体もまた、アンカー基の非制限的例であり、ここで化合物の誘導体は、任意の部位で任意の型の１つ以上の置換基を持つ化合物、化合物の酸化または還元生成物、などを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
壊れやすいリンカーの例は、以下を含むがこれらに限定されない；エステルのような官能基を含む部分（ここでエステルのカルボニル炭素は、アンカーとエステルのｓｐ3酸素との間にある；この配列は「順接（ｆｏｒｗａｒｄ）エステル」とも呼ばれる）、「逆接（ｒｅｖｅｒｓｅ）エステル」（ここでエステルのｓｐ3酸素は、アンカーとエステルのカルボニル炭素との間にある）、チオエステル（ここでチオエステルのカルボニル炭素は、アンカーとチオエステルの硫黄との間にあり、「順接チオエステル」とも呼ばれる）、逆接チオエステル（ここでチオエステルの硫黄は、アンカーとチオエステルのカルボニル炭素との間にあり、「逆接チオエステル」とも呼ばれる）、順接および逆接チオノエステル、順接および逆接ジチオ酸、スルフェート、順接および逆接スルホネート、ホスフェート、ならびに順接および逆接ホスホネート基。「チオエステル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−基を表す；「チオノエステル」は、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−基を表し、そして「ジチオ酸」は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−基を表す。壊れやすいリンカーはまた、アミドを含み、ここでアミドのカルボニル炭素はアンカーとアミドの窒素との間にある（「順接アミド」とも呼ばれる）か、またはここでアミドの窒素はアンカーとアミドのカルボニル炭素との間にある（「逆接アミド」とも呼ばれる）。「順接」および「逆接」として表され得る基に対して、順接方向とは、官能基の加水分解後、得られる酸官能性がアンカー部分に共有結合され、そして得られるアルコール、チオール、またはアミン官能性がエフェクター部分に共有結合される、官能基の方向である。逆接方向とは、官能基の加水分解後、得られる酸官能性がエフェクター部分に共有結合され、そして得られるアルコールまたはチオール官能性がアンカー部分に共有結合される、官能基の方向である。
【００４１】
アミド部分のような壊れやすいリンカーはまた、処理される生体材料中の内因性酵素により、または材料へ加えられた酵素により、酵素的分解の条件下分解し得る。
【００４２】
エフェクターの例は、以下を含むがこれらに限定されない；マスタード基、マスタード基等価物、エポキシド、アルデヒド、ホルムアルデヒドシントン、ならびに他のアルキル化剤、および架橋化剤。マスタード基は、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基を含むとして定義される。マスタード基等価物は、マスタードと類似の機構により反応する基により定義される（例えば、モノまたはビスメシルエチルアミン基、モノメシルエチルスルフィド基、モノまたはビストシルエチルアミン基、およびモノトシルエチルスルフィド基など）。ホルムアルデヒドシントンは、水性溶液中で壊れてホルムアルデヒドになる任意の化合物として定義され、ヒドロキシメチルグリシンのようなヒドロキシメチルアミンを含む。ホルムアルデヒドシントンの例は、米国特許第４，３３７，２６９号に、および国際特許出願第ＷＯ ９７／０２０２８号において与えられる。
【００４３】
病原体不活性化化合物の濃度は、病原体の型、処理される生体材料の性質、および使用される不活性化化合物のような要因に基づいて選択され得る。
【００４４】
（クエンチ化合物）
クエンチ化合物（本明細書中「クエンチャー」とも示される）で生体材料を処理して、材料中の反応性求電子種の望まない副反応を減少するための方法が提供される。詳細には、生体材料中の病原体を不活性化する病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供され、ここで病原体不活性化化合物は、病原体の核酸に損傷を与える求電子基を含んでいるか、またはそれを形成し得るかのいずれかである。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の、および病原体不活性化化合物により生成した反応生成物の望まない反応を減少させる。病原体不活性化化合物の求電子基と反応し得る求核基を含むクエンチャーが好ましい。求核基を含むクエンチャーは、クエンチャーの求核基と、反応性求電子基との共有結合反応により、化合物の反応性求電子基を補足するように作用する。クエンチャーにより補足され得る反応性種は、求電子基を含む化合物、ならびにそれから形成される反応性求電子基を含む種を含む。
【００４５】
本明細書中で開示される方法の利点は、病原体不活性化化合物の望まない副反応を減少させ、しかしながら病原体不活性化化合物による病原体不活性化が依然として生じ得るように、有効量のクエンチャーが使用され得ることである。従って、クエンチャーは、病原体不活性化を生じさせながら、血液のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて保護的効果を有する。種々の副反応が減少され得る。例えば、血液製剤を含む材料が処理される方法において、赤血球の改変が減少され得る。例えば、ＩｇＧのようなタンパク質の結合、および／または病原体不活性化化合物の赤血球への結合が減少され得る。
【００４６】
１つの実施態様において、血液製剤のような生体材料は、求電子基であるか、またはそれを形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物、およびクエンチャーで処理される。好適な実施態様において、病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、および反応性求電子基であるか、またはそれを形成し得る官能基であるエフェクターを含む。求電子基は、例えば、オキシラン、チイラン、チイラニウム、またはアジリジニウムイオン、あるいはアジリジンであり得る。エフェクターは、求電子基を形成し得るマスタード基であり得る。マスタード基は、例えば、求電子アジリジン、または求電子アジリジニウムもしくはチイラニウムイオンをインサイチュで形成し得る。
【００４７】
この方法において、生体材料は病原体不活性化化合物の求電子基と共有結合的に反応し得る求核官能基を含むクエンチャーで処理される。クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後、材料に加えられる。好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加える前、またはそれと同時に加えられる。１つの好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物と同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加える前後、約３０分以内、例えば、約１５〜２０分以内、または必要に応じて、約１０分以内に加えられる。材料は、例えば、インビトロまたはエキソビボで処理され得る。病原体不活性化化合物の病原体を不活性化する能力に影響を及ぼすことなく、そして生体材料の性質を実質的に変化させることなく、病原体不活性化化合物の望まない副反応を減少させるクエンチャーが好ましい。
【００４８】
クエンチャーの例は、求核基、または求電子基と反応する他の基を含む化合物である。クエンチ化合物の混合物もまた、使用され得る。例示的な求核基は、チオール、チオ酸、ジチオ酸、チオカルバメート、ジチオカルバメート、アミン、ホスフェート、およびチオホスフェート基を含む。クエンチャーは、ピリジンのような窒素複素環であるか、またはそれを含み得る。クエンチャーは、グルコース−６−リン酸のようなリン酸含有化合物であり得る。クエンチャーはまた、チオール含有化合物であり得、以下を含むがこれらに限定されない；グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノール、ジメルカプロール、メルカプタン、メルカプトエタンスルホン酸およびそれらの塩（例えば、ＭＥＳＮＡ、ホモシステイン、アミノエタンチオール、ジメチルアミノエタンチオール、ジチオトレイトール、および他のチオール含有化合物）。クエンチャーはまた、ナトリウムまたは塩酸塩のような、塩の形態であり得る。
【００４９】
他のチオール含有化合物は、メチルチオグリコレート、チオ乳酸、チオフェノール、２−メルカプトピリジン、３−メルカプト−２−ブタノール、２−メルカプトベンゾチアゾール、チオサリチル酸、およびチオクト酸を含む。例示的な芳香族チオール化合物は、２−メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、２−メルカプト−ニコチン酸、ナフタレンチオール、キノリンチオール、４−ニトロ−チオフェノール、およびチオフェノールを含む。他のクエンチャーは、ニトロベンジルピリジン、およびセレン化物塩のような無機求核試薬またはセレノシステインのような有機セレン化物、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、スルフィド、チオリン酸塩、ピロリン酸塩、ヒドロスルフィド、および亜ジチオン酸塩を含む。クエンチャーはまた、求核基を含むペプチド化合物であり得る。例えば、クエンチャーは、例えば、ＧｌｙＣｙｓのようなジペプチド、グルタチオンのようなトリペプチドを含むシステイン含有化合物であり得る。
【００５０】
求核基または求核基を含む化合物を含む高分子錯体もまた、本発明の範囲内である。別の実施態様において、チオール基のような求核基、または求核基を含む化合物は、クロマトグラフィー材料のような固体支持体上に固定されて、固定クエンチャーを形成する。固体支持体は、例えばアガロース、ポリスチレン、または他のクロマトグラフィー材料であり得る。例えば、グルタチオン、または硫黄基のような求核基を含む他の化合物が、エポキシ活性化アガロースへ接着され得る。例えば、グルタチオン−アガロースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、ここでグルタチオンは、アミノ基を通して、エポキシ活性化４％架橋ビーズ状アガロース（１０炭素スペーサーを介する）へ接着されている。さらに、システイン−アガロースがＳｉｇｍａから入手可能であり、これはアミノ基を通して臭化シアン活性化４％架橋ビーズ状アガロースへ接着されている。任意の範囲の活性化クロマトグラフィー樹脂または他の材料が、１個、２個、またはそれより多くの求核基を含むように誘導化され得る。誘導化され得るそのような活性化マトリックスは、臭化シアン、エポキシ、ニトロフェニルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、チオピリジル、ポリアクリルヒドラジド、およびオキシランアクリル酸活性化マトリックスを含む。チオールのような固定された求核基を含む他の例示的なクロマトグラフィー材料（市販されている）は、ＤｕｏｌｉｔｅＧＴ−７３ポリスチレンチオール含有樹脂およびＤｕｏｌｉｔｅＣ−４６７を含み、これはアミノホスホン酸基を含む（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）。
【００５１】
別の実施態様において、クエンチャーの反応は、グルタチオントランスフェラーゼのような酵素の反応により、触媒され得る。グルタチオントランスフェラーゼの存在はまた、クエンチャーの、求電子基を含む病原体不活性化化合物との反応性に影響を与える。例えば、グルタチオントランスフェラーゼは、膜系中で区分けされて、グルタチオントランスフェラーゼが存在する領域においてクエンチを生じさせ、そして増強させ得る。
【００５２】
クエンチャーはまた、例えば、酵素の反応により、または前駆体分子からの化学的再配列を通して、インサイチュで生成され得る。酵素的触媒によりインサイチュでクエンチャーを生成する化合物の例は、アミフォステン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標）、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｅｓｔ Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ、ＰＡ）である。
【００５３】
（血液製剤の処置のためのクエンチャーの好ましい性質）
１つの実施態様において、赤血球を含む生体材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。例えば、材料は約３０〜８５％のヘマトクリットを有する血液製剤であり得る。病原体不活性化化合物は、好ましくは、求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基を含む。
【００５４】
クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後、血液製剤に加えられる。好ましくは、血液製剤の処理において、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前に、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える約３０分以内に、また早く１５〜２０分以内に、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。処理され得る血液製剤の例は、全血、血小板、赤血球、および血漿を含む。好ましいクエンチャーは、病原体不活性化または血液製剤に有意に影響を与えること無く、反応性化合物の望まない副反応を減少させる化合物である。例えば、クエンチャーは、病原体不活性化化合物で処理される血液製剤へ加えられ得、ここで病原体不活性化化合物は、ｉ）核酸結合リガンド（核酸へ非共有結合的に結合し得る）；およびｉｉ）カチオン性求電子基のような求電子基であるか、またはそれを形成し得る基、を含む。病原体不活性化または処理される特定の血液製剤の性質に有意に影響を与えることなく化合物の望まない副反応を減少し得るクエンチャーが好ましい。１つの好適なクエンチャーはグルタチオンである。
【００５５】
好適な実施態様における病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンドおよびインサイチュで反応して求電子基を形成し得るマスタード基を含み、ここで求電子基はアジリジニウムイオンである。非共有結合核酸リガンドおよびマスタード基を含む化合物が、例えば、米国特許第５，５５９，２５０号において記載される。例示的な化合物は、キナクリンマスタードを含む。これらの化合物は、病原体の核酸物質に結合し、そしてそれをアルキル化することにより、病原体を不活性化すると思われる。不活性化反応において、化合物上のマスタード基は反応性アジリジニウムイオンを形成する。病原体の核酸は、化合物により形成された求電子アジリジニウム中間体への核酸の求核攻撃により化合物と反応すると思われる。どのような理論にも制限されていないが、グルタチオンのようなクエンチャーは、求電子アジリジニウム中間体へのクエンチャーの求核攻撃により、類似の様式でこれらの病原体不活性化化合物と反応し、もはや核酸と反応し得ない反応生成物（単数または複数）を生成すると思われる。
【００５６】
どのような理論にも制限されていないが、求核試薬（Ｎｕ1およびＮｕ2）の病原体不活性化化合物上のマスタード基との反応の、提案される機構は、以下のスキームＩに示される。
【００５７】
【化３】
マスタード基は、スキームＩに示されるように、プロトン化型Ｂに、または脱プロトン化型Ａに、のいずれかであり得る。典型的には、生理学的ｐＨにおいて、アジリジニウム中間体ＣおよびＥの分子内形成が容易となる。アジリジニウム中間体ＣおよびＥと反応し得る求核基を含むクエンチャーが使用され、最終生成物Ｆを形成し、ここで求核基はマスタード基の塩素原子と置換する。
【００５８】
アジリジニウムイオンの反応性は高いが、反応速度は依然として反応する求核試薬の性質に依存する。その上さらに、クエンチャー求核試薬は、例えば、存在する他の内因性求核試薬よりも高い濃度で存在する場合、またはそれらがより反応性が高い場合、他に存在する内因性求核試薬と競合し得る。生理学的条件下、好適な求核基は、チオール基である。他の求核基は、ホスフェートおよびアミノ基を含む。
【００５９】
クエンチャーは、好ましくは、血液製剤の機能を維持し、かつ病原体不活性化化合物の副作用を最小限にする。血液製剤、特に赤血球を含む血液製剤の処理のための好適なクエンチャーは、グルタチオンである。グルタチオンは、マスタード基を含む病原体不活性化化合物のような、アジリジニウム中間体を形成する病原体不活性化試薬と組み合わせた材料を含む赤血球の処理において使用するのに特に有用である。グルタチオンのチオール基は、親マスタード化合物とよりも速くアジリジニウム中間体と反応する。
【００６０】
クエンチャーは、好ましくは、細胞膜およびウイルス脂質被覆のような病原体外部膜を実質的に通り抜けない。クエンチャーは、好ましくは、病原体不活性化化合物により引き起こされる病原体の核酸に対する損傷をクエンチャーが有意に減少させるほどの程度で、ウイルス、バクテリア、および他の標的病原体の脂質膜を通り抜けない。さらに、クエンチャーは、好ましくは、病原体不活性化化合物自身と反応するよりはむしろ、この化合物から形成された求電子基と反応する。任意の理論により制限されないが、病原体不活性化化合物は、ウイルス脂質被覆およびバクテリア膜のような病原体膜を自由に通過し得るが、しかしアジリジニウムイオンのようなカチオン性求電子基が形成された後、化合物はどのような有意の程度でも病原体膜を通過し得ないと思われる。従って、標的病原体の外側で形成される求電子カチオンは、実質的に核酸と架橋し得ない；しかしながら、クエンチャーはそれらと反応し得る。逆に言えば、１つの実施態様において、求電子カチオンが病原体の内側で形成される場合、クエンチャーは病原体膜を通り抜ける能力が無く、そして核酸の架橋は加えられたクエンチャーから実質的に有意の干渉を受けることなく進行する。
【００６１】
病原体不活性化化合物による病原体不活性化に干渉することなく、クエンチャーが病原体不活性化化合物と反応して望まない副反応をクエンチすることが好ましい。このことは、例えば、実質的に病原体膜を横切らないクエンチャーの使用により生じ得、そしてそれ故に副反応を病原体膜の外側でクエンチする。別の実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物、またはそれらから形成される反応性中間体と速度論的に非常にゆっくりと反応し得る、すなわち、実質的に病原体不活性化と干渉しない。
【００６２】
１つの実施態様において、クエンチャーは、第一および第二相を分離する膜を含む２相系のような多相系へ投与され得る。１つの実施態様において、２相系において１つの相は膜により閉じられている。膜は、天然または合成分子、あるいはそれらの混合物で構成された、天然または合成の半透過性バリアであり得る。例えば、膜で閉じられた相は、病原性有機体の内部であり得、そして他方の相は、病原性有機体が含まれている相であり得る。例えば、病原体は、血液を含む液相のような流体相中に懸濁され得る。膜に閉じられた相は、例えば、ウイルス核酸を含むウイルス脂質被覆の内部であり得る。別の実施態様において、膜は細胞膜であり得、そして膜で閉じられた相は、バクテリアのような病原性単細胞有機体の内部であり得る。病原体不活性化化合物の少なくとも一部分が、好ましくは、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得、一方でクエンチャーは、病原体不活性化化合物と比較して、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。
【００６３】
他の膜は、例えばＬａｓｉｃ，Ｄ．、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｌｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９９７、第６章において記載されるように、リポソームを含む。リポソームは、レシチン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルエタノールアミンのような自己集合した両親媒性分子を使用して小胞性粒子として形成され得る。リポソームはまた、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルイノシトールのような、負に電荷を帯びた脂質を使用して形成され得る。カチオン性リポソームもまた、市販されているカチオン性界面活性剤を使用するか、または以下に記載されるようにコレステロールに連結したポリカチオン性基を使用して、調製され得る；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７９：２８０〜２８５（１９９１）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２８６７〜２８７２（１９９３）；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１０２７〜１０３６（１９９６）。膜はまた、米国特許第５，７５３，２５８号において記載されるように、人工ウイルス外被を含む（その開示は本明細書中で援用される）。膜はさらに、白血球のような非病原性細胞の膜を含む。
【００６４】
１つの実施態様において、その中に膜を含む病原体を有する液体を含む第一の相、および病原体の膜により閉ざされた第二の相を含む、２相の生体材料において病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。生体材料は、求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理される。病原体不活性化化合物で処理される前、それと同時に、またはその後、生体材料は、求電子基と共有結合的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで処理される。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。
【００６５】
好ましくは、病原体不活性化化合物は、クエンチャーと比較して、求電子基を形成する前に、実質的に速度論的に膜を通り抜ける。病原体不活性化化合物はまた、好ましくは、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に速度論的に膜を通り抜けない。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の求電子基と反応することが可能であり、そしてクエンチャーの病原体不活性化化合物の求電子基との反応は、実質的に第一相で生じる。求電子基を含む病原体不活性化化合物は、病原体膜内の第二相で病原体の核酸と反応し、それにより病原体を不活性化する。膜は、例えば、脂質を含み得る。病原体は、例えば、膜を規定する脂質被覆を含むウイルスであり得、ここで第二相は、脂質被覆の内部により規定される。病原体はまた、２相系の膜を規定する脂質を含む細胞膜を含むバクテリアであり得、ここで第二相は、細胞膜の内部により規定される。
【００６６】
有利なことには、２相系において、クエンチャーは第一相へ投与され、そして実質的に病原体の膜を通り抜け得ない。病原体不活性化化合物は、例えば、第一相へ投与される。病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前に、膜を通り抜けて第二相へ移り得る。インサイチュでの求電子基の形成に際して、病原体不活性化化合物は、実質的にもはや膜を通り抜け得ない。従って、クエンチは選択的に第一相において生じ、一方で第二相、すなわち病原体の内部において、病原体不活性化化合物はクエンチされることなく病原体の核酸と反応する。従って、血液製剤のような生体材料において、病原体不活性化化合物およびその分解生成物上の反応基のクエンチは、病原体が懸濁している第一相において選択的に生じる。従って、第一相におけるクエンチは、第一相において病原体不活性化化合物上の反応基の望まない副反応（例えば、血液中のタンパク質の共有結合的改変）を減少する。この方法において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体不活性化を生じさせながら、血液製剤のような材料中の望まない副反応を減少させるということにおいて、保護的効果を有する。
【００６７】
グルタチオンは、それをクエンチャーとして特に有用にする多くの性質を有する。それは、通常全ての細胞型に存在する。それは、バクテリアおよび脂質外被ウイルスの細胞膜または脂質被覆のような膜を受動的に通過し得るとは、実質的に思われない。ｐＨ７において、グルタチオンは電荷を帯び、そして能動輸送が存在しない場合、脂質二重層を有意の程度で透過しない。このことは、ＶＳＶおよびグルタチオンにより実質的に影響を受けない他の外被ウイルスのウイルス不活性と矛盾しない。ＨＩＶおよびＶＳＶのような脂質外被ウイルスの不活性化は、グルタチオンまたはＮ−アセチルシステイン、２個のチオールクエンチ剤の存在により影響されない。グルタチオンはウイルス不活性化においてほとんど効果が無く、そして一方でそれはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化にいくらか効果を有する。これは加えられるクエンチャーの用量を最小限にすることにより操作され得る。例えば、約２〜４ｍＭのグルタチオンの存在は、約１〜２ ｌｏｇ殺傷で、０．３ｍＭ ＰＩＣ−１によるＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化を減少させる。グルタチオンはまた、赤血球のインビトロ貯蔵と両立し得る。
【００６８】
実質的に、処理後に赤血球機能に損傷を与えないか、または赤血球を改変せず、かつまた実質的に病原体不活性化化合物による病原体不活性化を減少させないクエンチャーが好ましい。赤血球機能へ実質的に損傷を与える効果のないことは、赤血球機能の試験について当該分野で公知の方法により測定され得る。例えば、細胞内ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、細胞内２，３−ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセロール）、または細胞外カリウムのような指標の濃度が測定され、そして未処理のコントロールと比較され得る。さらに、溶血、ｐＨ、ヘマトクリット、ヘモグロビン、浸透圧脆弱性、グルコース消費量、および乳酸生成が測定され得る。
【００６９】
ＡＴＰ、２，３−ＤＰＧ、グルコース、ヘモグロビン、溶血、およびカリウムを測定するための方法は、当該分野で利用可能である。例えば、Ｄａｖｅｙら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３２：５２５〜５２８（１９９２）を参照のこと（その開示は、本明細書中で援用される）。赤血球機能を測定するための方法もまた、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、５８：９４〜９９（１９９０）；Ｈｏｇｍａｎら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、６５：２７１〜２７８（１９９３）；およびＢｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、第５９巻（１９８２）において記載される（これらの開示は、本明細書中参考として援用される）。細胞外カリウム濃度は、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ６１４Ｋ+／Ｎａ+ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定され得る。ｐＨは、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ２３８ Ｂｌｏｏｄ Ｇａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定され得る。
【００７０】
グルタチオンのようなクエンチャーの存在下、赤血球を、核酸結合リガンドおよびマスタード基を含む病原体不活性化化合物で処理する方法において、好ましくは、１つの実施態様において、細胞外カリウムの濃度は、１日後、未処理のコントロール中に示される量の３倍よりも大きくはなく、より好ましくは２倍以下である。
【００７１】
また、１つの実施態様において、病原体不活性化の間、溶血または他の損傷のような赤血球の望ましくない改変を阻害するクエンチャーが好ましい。好ましくは、処理された赤血球の溶血は、２８日貯蔵後に３％未満、より好ましくは４２日貯蔵後に２％未満、そして最も好ましくは４℃で４２日貯蔵後に約１％未満またはそれと等しい。
【００７２】
赤血球への、ＩｇＧ結合のようなタンパク質結合を減少し得、かつクエンチャーの不在下行われたコントロールと比較して病原体不活性化を実質的に阻害しない条件下で使用され得るクエンチャーが好ましい。病原体不活性化化合物の赤血球表面への結合を阻害するクエンチャーもまた好ましい。例示的なクエンチャーはグルタチオンである。グルタチオンは、病原体不活性化化合物による赤血球の潜在的な改変を、有利に減少する。
【００７３】
ＩｇＧ、アルブミン、およびＩｇＭのような種の赤血球への結合もまた、当該分野で利用可能な方法を使用して測定され得る。１つの実施態様において、クエンチャーの存在下、核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物で赤血球を処理する方法において、ＩｇＧの赤血球への結合は、クエンチャーの不在下におけるＩｇＧの結合と比較して減少し得る。グルタチオンのようなクエンチャーおよび病原体不活性化化合物の存在下のＩｇＧの赤血球への結合は、好ましくは、クエンチャーの不在下のＩｇＧ結合の約７５％未満、または好ましくは約５０％未満である。
【００７４】
赤血球への分子の結合は、例えばアクリジンおよびＩｇＧに対する抗体を使用して検出され得る。アッセイにおいて使用するための抗体は、市販で入手され得るか、または当該分野で利用可能な方法を使用して作られ得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，」１９８８において記載される（この開示は本明細書中参考として援用される））。例えば、抗−ＩｇＧは、Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、およびＬａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｉｐｅｒｓｖｅｌｌｅ、ＰＡから市販されている。
【００７５】
病原体不活性化化合物またはそのフラグメントの赤血球への結合を減少させるクエンチャーが好ましい。赤血球を含む生体材料が、マスタード基のようなエフェクターおよびアクリジン基のような核酸結合基を含む病原体不活性化化合物で処理される実施態様において、病原体不活性化化合物またはそのフラグメントの赤血球への結合は、減少され得る。例えば、病原体不活性化化合物から誘導されるアクリジン（ここで核酸結合リガンドがアクリジンである）の赤血球への結合は、グルタチオンのようなクエンチャーの存在下減少され得る。好適な実施態様において、クエンチャーの存在下、アクリジン基を含む病原体不活性化化合物で処理された赤血球へのアクリジンの結合は、クエンチャーの不在下のアクリジン結合の、約７５％未満、または好ましくは約５０％未満、または別の好適な実施態様において、約５％未満である。
【００７６】
１つの実施態様において、病原体不活性化後、反応性求電子アルキル化種の濃度を、例えば、約１〜４８時間以内、例えば約２４時間で、少なくとも約５％、または約２０％、または必要に応じて約５０％、またはそれより多く減少させるクエンチャーが提供される。反応性求電子種の存在は、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）を含むクロマトグラフィー法のような当該分野で利用可能な方法を使用して、測定され得る。
【００７７】
１つの実施態様において、病原体不活性化化合物による病原体の不活性化を、クエンチャーの不在下行われたコントロールの病原体不活性化と比較して、約１ ｌｏｇより多く、または約２ ｌｏｇより多く、または必要に応じて、約３ ｌｏｇより多く、あるいは別の実施態様において４ ｌｏｇよりも多くは決して減少させないクエンチャーがまた、好ましい。好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物によるウイルス性病原体の不活性化を、クエンチャーの不在下行われたコントロールの病原体不活性化と比較して、約１ ｌｏｇよりも多く、または約２ ｌｏｇよりも多く、または必要に応じて約３ ｌｏｇよりも多くは決して減少させない。病原体不活性化化合物およびクエンチャーの濃度は、所望のｌｏｇ殺傷を得るように、およびクエンチャーの存在により生じ得る不活性化の減少を最小限にするように調製され得る。
【００７８】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、赤血球含有材料を、有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで、赤血球機能は、処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、材料を、有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで、赤血球の溶血は、処理後２８日の貯蔵後、３％未満である。
【００７９】
グルタチオンで処理された赤血球は、未処理のコントロールと比較して、赤血球機能において有意な差異を示さない。グルタチオンそれ自身は、インビボまたはインビトロ機能アッセイにより測定されるように、有意な程度に赤血球溶解または他の損傷に寄与しない。グルタチオンは、病原体不活性化化合物の存在下の赤血球溶解を減少させ得る。赤血球は、インビトロまたはエキソビボでグルタチオンで処理され得る。チオ硫酸、ＭＥＳＮＡ、およびＮ−アセチルシステインのようなある化合物は、クエンチのために有効な濃度で活性ではないか、または赤血球を改変し得るかのいずれかである。
【００８０】
（病原体不活性化およびクエンチの条件）
生体材料を病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して望まない副反応を減少させるための条件は、選択された材料、クエンチャーおよび不活性化する化合物に基づいて選択され得る。種々の生体材料が、例えばインビトロまたはエキソビボで、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得る。条件は、生体材料を実質的に変化させない一方で、病原体不活性化を生じさせるように選択される。
【００８１】
好適な実施態様において、血液製剤は、核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物で不活性化され、ここでマスタード基はインサイチュで反応性求電子基を形成し得る。血液製剤は、クエンチャーで処理されて、血液製剤の性質に有意に影響することなく、病原体不活性化化合物の望まない副反応を防止する。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、後、またはそれと同時に加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に血液製剤に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加えた前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。赤血球含有材料は、例えばインビトロまたはエキソビボで処理され得る。
【００８２】
処理される血液製剤中の病原体不活性化化合物およびクエンチ剤の濃度は、赤血球機能のような材料の性質を依然保護しながら、そしてまた病原体の所望のｌｏｇ殺傷を達しながら、望まない副反応の所望の減少を生じるために必要とされるのに応じて、調製され得る。
【００８３】
クエンチャーの濃度は、１つの非制限的例では、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜３０ｍＭであり得る。赤血球の処理に適した条件の非制限的例は、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭのグルタチオン、例えば、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約２ｍＭ〜４ｍＭのグルタチオン、あるいは１つの実施態様において約１ｍＭ〜３ｍＭである。
【００８４】
クエンチャー：病原体不活性化化合物のモル比は、１つの非制限的実施態様において、約１００：１〜１：１、例えば約５０：１、または例えば約１０：１の範囲であり得る。赤血球の処理のために使用され得る、グルタチオン：病原体不活性化化合物の非制限的例示的な比は、約１００：１〜１：１、例えば約５０：１〜１：１、または別の実施態様において、約１０：１〜約２：１であり得る。１つの好適な実施態様において、グルタチオン：病原体不活性化化合物のモル比は約１０：１である。例えば、赤血球を含む組成物の処理において、グルタチオンのモル濃度は、好ましくは、病原体不活性化化合物のモル濃度の約５〜２０倍、例えば約１０倍である。クエンチャーの病原体不活性化化合物に対する比は、選択された病原体不活性化化合物およびクエンチャーに依存して変化し得る。
【００８５】
核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物の典型的な濃度は、約０．１μＭ〜５ｍＭ、例えば約５０〜５００μＭのオーダーである。例えば、サンプル中の病原体の、少なくとも約１ ｌｏｇ、例えば少なくとも約３〜６ ｌｏｇ、または必要に応じて少なくとも約５〜６ ｌｏｇを不活性化するのに十分である、病原体不活性化化合物の濃度が使用され得る。１つの実施態様において、好ましい病原体不活性化化合物は、約５００μＭよりも決して多くない濃度で少なくとも１ ｌｏｇ殺傷を、より好ましくは約５００μＭよりも決して多くない濃度で少なくとも３ ｌｏｇ殺傷を生じるものである。別の非制限的な例において、病原体不活性化化合物は、約０．１μＭ〜約３ｍＭの濃度において少なくとも１ ｌｏｇ殺傷を、好ましくは少なくとも６ ｌｏｇ殺傷を有し得る。例えば、約０．１５ｍＭのキナクリンマスタードおよび約３ｍＭのグルタチオンの濃度は、赤血球機能を保護しながら、赤血球含有組成物中の２ ｌｏｇより多いＶＳＶおよびＨＩＶを不活性化するために使用され得る。
【００８６】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、赤血球含有材料を有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで赤血球機能は処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、材料を有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで赤血球の溶血は貯蔵の２８日後で３％未満である。
【００８７】
病原体不活性化化合物およびクエンチャーとの血液製剤のインキュベーションは、例えば少なくとも約０．５〜４８時間またはそれより多く、例えば少なくとも約１〜４８時間、または少なくとも約１〜２４時間、あるいは、例えば少なくとも約８〜２０時間行われ得る。別の実施態様において、インキュベーションは、さらに材料を加工処理または使用するまで続く。
【００８８】
クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、それと同時に、またはその後に血液製剤のような材料に加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内に加えられる。
【００８９】
グルタチオンのようなあるクエンチャーは、経時的に酸化されるかまたはそれ以外で分解するか、または反応し得る。例えば、クエンチャーがチオール含有化合物である場合、クエンチャーは酸化されてジスルフィド二量体を形成し得る。クエンチャーがインサイチュで実質的に分解してしまうかまたはそれ以外に反応してしまう前に、クエンチャーが病原体不活性化化合物をクエンチし得るような時および濃度で、クエンチャーを材料へ加えることが好ましい。例えば、クエンチャーがグルタチオンである場合、グルタチオンが病原体不活性化化合物の前に加えられる実施態様において、グルタチオンは好ましくは、病原体不活性化化合物を加える約１２時間未満前に加えられる。好適な実施態様において、グルタチオンは病原体不活性化化合物と同時に加えられる。別の実施態様において、グルタチオンは、病原体不活性化化合物を加えた後、３０分以内に、または約１５〜２０分以内に、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。病原体不活性化化合物を加えた時間と近いグルタチオンの添加は、例えば血漿のようなある生体材料中で起こり得る、例えば酸化またはペプチド分解による、グルタチオン濃度の可能な減少を最小限にすることに対して有利である。
【００９０】
赤血球については、インキュベーションは典型的には、約２℃〜３７℃、好ましくは約１８℃〜２５℃の温度で行われる。例えば、クエンチャーがグルタチオンである場合、赤血球は、病原体不活性化化合物およびグルタチオンとともに、約２２℃の温度で約１２時間インキュベートされ得る。血小板については、温度は好ましくは約２０〜２４℃である。血漿については、温度は約０〜６０℃、代表的には約０〜２４℃であり得る。
【００９１】
（生体材料）
種々の生体材料が、病原体不活性化化合物およびクエンチ化合物で処理され得る。クエンチ化合物で処理され得る生体材料は、全血、濃縮赤血球、血小板、および新鮮なまたは凍結した血漿のような血液製剤を含む。血液製剤はさらに、血漿タンパク質部分、抗血友病因子（因子ＶＩＩＩ）、因子ＩＸ、および因子ＩＸ複合体、フィブリノーゲン、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビンおよびトロンビン、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにそれらのフラグメント）、アルブミン、インターフェロン、ならびにリンホカインを包含する。合成血液製剤もまた意図される。
【００９２】
他の生体材料は、ワクチン、組み換えＤＮＡ製造タンパク質、およびオリゴペプチドリガンドを含む。尿、汗、唾液、糞便、脊髄液のような臨床サンプルもまた包含される。さらに合成血液または血液製剤貯蔵媒体が包含される。
【００９３】
（処理後の材料中の化合物の濃度の減少）
血液製剤のような生体材料中の病原体不活性化化合物および／またはクエンチャーの濃度は、処理後、例えばバッチ中への吸着またはフロー除去プロセスにより減少され得る。使用され得る方法および装置は、ＰＣＴ ＵＳ９６／０９８４６；米国特許出願番号第０８／７７９、８３０号（１９９７年１月６日出願）；および同時出願において、米国特許出願番号第０９／００３，１１３号（１９９８年１月６日出願）において記載される（これらのそれぞれの開示は、その全てにおいて参考として本明細書中で援用される）。
【００９４】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参考にすることにより、さらに理解される。
【００９５】
（材料）
以下の材料を、以下の実施例において使用した。
【００９６】
Ａｄｓｏｌは、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬから市販されているが、今回および以下の実験において使用されたＡｄｓｏｌは、以下の混合物を滅菌濾過することにより作成した：１リットルの蒸留水中、２２ｇのグルコース、９ｇのＮａＣｌ、７．５ｇのマンニトール、および０．２７ｇのアデニン。
【００９７】
エリトロゾルは、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬから入手したか、または１リットルの蒸留水中、クエン酸ナトリウム二水和物（７．８２ｇ）；酸性リン酸ナトリウム二水和物（０．７３ｇ）；リン酸ナトリウム二水和物（３．０３ｇ）；アデニン（０．２２ｇ）；マンニトール（７．７４ｇ）；およびグルコース（９ｇ）を混合することにより作製した。
【００９８】
キナクリンマスタードは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。グルタチオンおよびシステインは、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。ＰＩＣ−１（β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル）は、米国仮出願番号第６０／０４３，６９６号（１９９７年４月１５日出願）に記載されるとおりに合成した（この開示は本明細書中で援用される）。ＰＩＣ−２（β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルアミド）は、米国特許出願番号第０９／００３，１１５号（１９９８年１月６日出願）に記載されるとおりに合成した（この開示は本明細書中で援用される）。
【００９９】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ＡＴＣＣ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手した（力価８．８ ｌｏｇ単位）。
【０１００】
全血をＳａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ ＣＡ）から入手した。
【０１０１】
濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）を、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから約５５〜６５％のヘマトクリット（ＨＣＴ）で入手したか、または添加溶液としてＡｄｓｏｌまたはＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌを使用して以下のように調製した：受け取りの２０時間以内に、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから受け取った全血の単位を３８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして血漿を別の容器中へ急送した；毛細管を血液サンプルで満たし、そして５分間回転させることにより、％ヘマトクリットを測定した；赤血球により占められる体積を較正曲線と比較した；９４ｍＬのＡｄｓｏｌまたはＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌを加えた；最終のヘマトクリットを処理に応じて５０〜６０％の範囲にした。
【０１０２】
（実施例）
（実施例１：リン酸イオンと病原体不活性化化合物との反応）
リン酸イオンと病原体不活性化化合物との反応性を実証した。反応性は、より高いｐＨ値、より高い温度、そしてより高いリン酸イオン濃度となるにつれて増加することが分かった。
【０１０３】
室温（ＲＴ）でｐＨ値の増加する、２５ｍＭリン酸緩衝液での１００μＭ ＰＩＣ−１のインキュベーションにおいて、分解速度の大きな増加を観測した。ｐＨ約６で２５分のｔ1/2と比較して、ｐＨ２．２において、４５０分のｔ1/2を観測した。ＰＩＣ−１のリン酸イオンとの反応は、ＨＰＬＣにより測定されるように、少なくとも２種の観測可能なリン酸中間体を生成する。ＰＩＣ−１の二リン酸エステルはさらに、壊れやすいエステルで加水分解する。ＰＩＣ−１とリン酸イオンとの間の反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析を行なった。反応条件（ｐＨ＝７，リン酸緩衝液）下観測された種は、ジオールの二リン酸エステル、一リン酸エステル、およびクロロヒドロキシ化合物のリン酸エステルであった。
【０１０４】
キナクリンマスタード（これは、壊れやすいリンカーを欠いている）もまた、リン酸イオンと反応する。室温での、１００μＭのキナクリンマスタードと５０ｍＭのリン酸との反応は、３７℃での、１３０ｍＭのリン酸との同一反応よりもゆっくりである（それぞれ、ｔ１／２＝１０分、および３．５分）。このことは、最終生成物のビスホスホエステルのよりゆっくりとした生成、および中間体種のより長い寿命の両方により実証される。
【０１０５】
キナクリンマスタードとグルコース−６−リン酸との反応もまた、ｐＨ＝７．８で容易であった。ＨＰＬＣにより新しい生成物種を観測し、少なくとも１種の付加物がグルコース−６−リン酸と形成されることと一致する。
【０１０６】
（実施例２：チオールおよび他の求核試薬と病原体不活性化化合物との反応） チオール含有化合物グルタチオンと病原体不活性化化合物との反応性を研究した。反応性は、より高いｐＨ値、より高い温度、そしてより高いチオール濃度になるにつれて増加することが分かった。１ｍＭのキナクリンマスタードを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ中、ｐＨ７で、４ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）とともにインキュベートした。さらに、１００μＭのＰＩＣ−１を、室温で、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中、ｐＨ７で、４ｍＭのＧＳＨとともにインキュベートした。キナクリンマスタードおよびＰＩＣ−１とグルタチオンとの反応は、それぞれ５０分および３２分のｔ１／２で生じた。ＰＩＣ−１／ＧＳＨビス付加物を質量分析により同定した。初期の時点でのグルタチオンとの反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析は、グルタチオンモノ付加物／アジリジニウム中間体を同定した。
【０１０７】
チオールと病原体不活性化化合物との反応をまた、チオール基の消滅をモニターすることで追跡し、Ｅｌｌｍａｎ反応を通して測定した。これはＡｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、４：３３（１９７１）において記載されるように行ない、その開示は本明細書中援用される。Ｅｌｌｍａｎ反応は、１：１．９の化学量論で、そしてキナクリンマスタードの分解と一致する時間推移で、２個の２−クロロエチル基を含む化合物（キナクリンマスタード）とチオールとの反応を実証した。これらの結果は、マスタード中心での定量的なグルタチオンの反応性がチオエーテル共有結合を形成することを実証する。
【０１０８】
他のチオールがＰＩＣ−１と反応することを見出し、これにはＮ−アセチルシステイン、システイン、ホモシステイン、ジペプチドＧｌｙＣｙｓ、アミノエタンチオール、ジメチルアミノエタンチオール、ジチオトレイトール、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、およびキノリンチオールが含まれる。チオールは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）または（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から市販されている。全ての場合において、中間体種の形成を、反応混合物のＨＰＬＣ分析を通して観測し、そしてスルフヒドリル基の消費をＥｌｌｍａｎ反応を通して観測した。キナクリンマスタードはまた、求核試薬、チオ硫酸、ヒドロスルフィド（ＨＳ-）、およびジチオカルバメートと反応することを見いだした。
【０１０９】
（実施例３：グルタチオンの赤血球膜透過の研究）
グルタチオンの赤血球膜を透過する能力をウイルスの外被に対するモデル膜系として研究した。というのは両者がこのペプチドに対してどのような能動輸送系も欠いているからである。赤血球（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒの濃縮赤血球、ＨＣＴ５５〜６５％）の内側と外とのＧＳＨの分配を、外因性グルタチオンを加えた後の、細胞の内側および外側におけるチオール基の量を測定することにより評価した。表２は、グルタチオン総量（細胞内および上清）および赤血球のグルタチオン細胞内量を３ｍＭのＧＳＨの添加するかまたは添加しない場合の時間の関数として示す。ＧＳＨの濃度は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−２０（Ｂｅｃｋｍａ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）単波長分光計を使用して、４１２ｎｍでの吸光度に基づいて計算した。結果は、両コンパートメント中のスルフヒドリル基の量が一定のままであることを示す。
【０１１０】
【表２】
（実施例４：水疱性口内炎ウイルスのキナクリンマスタードでの不活性化）
病原体不活性化剤の添加に続いて１５分後、種々のクエンチャーを加えた効果を研究した。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ＡＴＣＣ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、力価８．８ｌｏｇ単位／ｍＬ）を、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）から入手した、ＨＣＴ５５〜６５％の濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）中に希釈し、そして１５０μＭのキナクリンマスタード（ＱＭ）で処理した。ＱＭを加えて１５分後、種々のクエンチャーを１ｍＭと１０ｍＭとの間の用量で加えた。クエンチャーは、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、チオ硫酸、グルタチオン、およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）であり、これらはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から入手した。４時間室温でインキュベート後、生存能力のあるウイルスをウイルスプラークアッセイで評価した（Ｍａｒｋｕｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５７：３２１〜３３８（１９７４））。
【０１１１】
表３は、インキュベーションの１５分後に加えられた種々のクエンチャーの存在下、１５０μＭのＱＭによるＶＳＶの不活性化の結果を示す。クエンチャーの不在下、ＱＭは３．５ ｌｏｇのＶＳＶを不活性化した。ＡＥＴおよびチオ硫酸は、用量依存性の様式で不活性化を減少させた。グルタチオンもＮＡＣも、いずれもＶＳＶ不活性化の減少を示さなかった。
【０１１２】
【表３】
（実施例５：種々のクエンチャーを同時に加えたキナクリンマスタードでの水疱性口内炎ウイルスの不活性化）
病原体不活性化化合物と同時に加えられた種々のクエンチャーの効果を研究した。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を、濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）中へ希釈した。次いで、ＰＲＢＣを、１５０μＭのキナクリンマスタード（ＱＭ）、および３ｍＭと３０ｍＭとの間の用量で加えられた種々のクエンチャーで同時に処理した。クエンチャーは、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、チオ硫酸、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、システイン、およびメルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）であり、これらはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から入手した。室温４時間の不活性化後、生存能力のあるウイルスを、ハムスター新生児腎臓（ＢＨＫ）細胞に対するウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）を評価することによるＣＰＥアッセイで、評価した（Ｂａｘｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：３８３〜３９２（１９７６））。
【０１１３】
表４は、１５０μＭのＱＭによるＶＳＶの不活性化を、ＡＥＴ、チオ硫酸、グルタチオン、またはＮＡＣの同時添加で実施した実験の結果を示す。この実験において、ＶＳＶは検出下限まで殺傷され、＞４．０ ｌｏｇが不活性化した。従って、特定のクエンチャーはこの限界により覆い隠されたウイルス不活性化の効果を有し得る。ＡＥＴおよびチオ硫酸は再びウイルス不活性化の有意な阻害を示し、そしてＡＥＴはより強力なインヒビターであった。グルタチオンおよびＮＡＣは、１０ｍＭの濃度までウイルス殺傷に影響する証拠を示さず、そして３０ｍＭで阻害の証拠をいくらか示した。
【０１１４】
【表４】
表５は、１５０μＭのＱＭによるＶＳＶの不活性化を、グルタチオン、システイン、またはＭＥＳＮＡの同時添加で行なった別の実験結果を示す。ＱＭ単独による不活性化は３．０ ｌｏｇであり、そしてこのレベルはたとえ３０ｍＭでもグルタチオンにより影響されなかった。システインは、ウイルス不活性化において用量依存性減少を示し、そしてＭＥＳＮＡは、３０ｍＭのクエンチャーで２．３ ｌｏｇ殺傷の混合した結果を与えた。
【０１１５】
【表５】
（実施例６：病原体不活性化剤およびクエンチャーを使用するＨＩＶの不活性化）
ＰＲＢＣ中の病原体不活性化剤によるＨＩＶの不活性化に対するグルタチオンの効果を試験した。ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ添加溶液中ほぼ６０％のヘマトクリットで調製した。セルフリーのＨＩＶ−ＩＩＩBのストック（Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：４９７（１９８４）、ほぼ８ ｌｏｇ／ｍＬ）を加えて、ほぼ７ ｌｏｇ／ｍｌの力価にした。
【０１１６】
ＨＩＶ混入血液のアリコートに、グルタチオンを加えて種々の最終濃度にし、続いて５０μＭのＰＩＣ−１を加えた。サンプルを室温で１２時間インキュベートした。次いで、赤血球をペレットにし、上清フラクション中の残存ウイルスを、ミクロ−プラークアッセイを使用して検出した（Ｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．、２８：２０３０（１９９０））。ＨＩＶ生存能力におけるグルタチオンの効果を測定するために、コントロールサンプルをグルタチオンのみでインキュベートした。
【０１１７】
ＰＩＣ−１およびグルタチオンによるＨＩＶの不活性化の結果を表６に示す。表６中のデータは、セルフリーのＨＩＶの不活性化がグルタチオンにより阻害されなかったことを実証する。室温で１２時間のインキュベーションによる、ＨＩＶ感染力のいくらかの損失、ほぼ０．２ ｌｏｇがあった（サンプル１対サンプル３）。３０ｍＭのグルタチオン単独は、さらに０．３〜０．６ ｌｏｇで感染力を減少させることを示した（サンプル１および３と比較したサンプル２および４）。５０μＭのＰＩＣ−１のみで、不活性化は約１．８ ｌｏｇであった；５０μＭのＰＩＣ−１＋３０ｍＭのグルタチオンは、約２．４ ｌｏｇで不活性化した。不活性化における明らかな増加が、グルタチオンそれ自身の効果により完全に説明され得る。０．１ｍＭ〜３０ｍＭのグルタチオンの範囲中にわたり、ＨＩＶ不活性化においてわずかな増加が存在し、これはＨＩＶに対するグルタチオンのみの効果と一致する。
【０１１８】
【表６】
（実施例７：不活性化剤およびクエンチャーでのバクテリア混入ＲＢＣの処理）
赤血球サンプル中のＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化に対するクエンチャーグルタチオンおよびシステインの効果を試験した。ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ中で調製し、そしてＹｅｒｓｉｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、（血液の一般的なグラム陰性バクテリア混入物）でスパイクした。サンプルを、表７に示されるように、１５０μＭのＰＩＣ−１およびクエンチャーで調製した。ＰＩＣ−１を、クエンチャーのほぼ５分後に加えた。室温で４時間インキュベート後、バクテリアの力価を、栄養寒天に希釈物を置き、そして３７℃で一晩培養することにより測定した。
【０１１９】
表７は、１５０μＭのＰＩＣ−１でのＹｅｒｓｉｎｉａの不活性化に対するＧＳＨおよびシステインの効果を示す。１６ｍＭの濃度で、グルタチオンまたはシステイン単独のいずれもＹｅｒｓｉｎｉａの力価にどのような効果も有さなかった（サンプル３および１０）。しかしながら、クエンチャーを用いる不活性化において用量依存性の減少があった。不活性化は１６ｍＭのクエンチャーで４〜４．５ ｌｏｇで阻害された（サンプル９および１６）が、しかし阻害は２ｍＭのクエンチャーで１ ｌｏｇ未満であった（サンプル６および１３）。
【０１２０】
【表７】
（実施例８：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活性化におけるクエンチャーとしてのグルタチオンの使用）
赤血球サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）の不活性化に対するグルタチオンの効果を試験した。ＰＲＢＣをＡｄｓｏｌ中で調製し、そしてＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでスパイクした。サンプルを、表８に示されるように、７５μＭのＰＩＣ−１およびクエンチャーのグルタチオンで調製した。ＰＩＣ−１を、クエンチャーのほぼ５分後に加えた。室温で４時間インキュベート後、バクテリアの力価を、栄養寒天に希釈物を置き、そして３７℃で一晩培養することにより測定した。
【０１２１】
表８は、７５μＭのＰＩＣ−１および種々の量のＧＳＨでの、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活性化を示す。表８に示される結果は、グルタチオンがある程度までバクテリアの不活性化を阻害するという観察と一致する。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、明らかに、Ｙｅｒｓｉｎｉａよりもグルタチオンのクエンチに対して敏感ではない。
【０１２２】
【表８】
１〜４ｍＭの濃度において、クエンチャーはわずかにのみバクテリア殺傷を減少させ、そして３ ｌｏｇまたはそれより多いバクテリアが不活性化され得る。
【０１２３】
（実施例９：赤血球を含む材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応を減少させることに対するクエンチャーの効果の研究）
グルタチオンおよびシステインの、ＩｇＧ、アルブミン、および病原体不活性化化合物の赤血球への結合に対する効果を試験した。ＰＩＣ−１のような、核酸結合リガンドおよびマスタード基のような反応性基を含むある病原体不活性化化合物での赤血球の処理は、ＩｇＧの赤血球表面への低レベルの共有結合を導き得る。ＩｇＧの量は一般に、Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎｔｉｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｔｅｓｔ（ＤＡＴ）において陽性の結果を生じるために要求されるレベルの下である（Ｗａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｈ．編、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、第１０版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ、１９９０）。しかしながら、クエンチャーを含むことは、タンパク質の結合を減少または除去し得る。その上さらに、ＰＩＣ−１のアクリジン部分を認識するポリクローン性抗体混合物を使用して、クエンチャーが含まれる場合に病原体不活性化化合物の赤血球表面への結合が減少される。
【０１２４】
ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ中、６０％のヘマトクリットで調製した。ＰＩＣ−１での処理前、グルタチオンまたはシステインのいずれかを０．５および１６ｍＭの間の濃度で加え、そしてサンプルを混合した。ＰＩＣ−１を１ｍＭまで加え、そしてサンプルを室温で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプルの２０μｌを１ｍＬの血液銀行生理食塩水で３回洗い、そして最終容積０．４ｍＬに再懸濁した。
【０１２５】
抗アクリジン抗体を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，」１９８８において記載されるように調製した（この開示は本明細書中援用される）。ヤギ抗マウスＩｇＧおよび抗ヒトアルブミン抗体を、Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手した。
【０１２６】
分析のために、希釈し洗浄した赤血球の５０μＬアリコートを４本の管に等分し、そして抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトアルブミン、または抗アクリジン抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１．０ｍＬの血液銀行生理食塩水で洗った。抗ヒト抗体を、フルオレセインで共有結合的に標識し、そしてサンプルをフローサイトメーターを使用して直接分析した。抗アクリジン抗体を検出するために、サンプルを２度目に洗浄し、次いでフルオレセイン標識化ヤギ抗マウスＩｇＧとともに３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを分析前に、先のように洗った。
【０１２７】
分析のために、サンプルをＨａｅｍａｌｉｎｅ２（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）溶液中に１：１で希釈し、そして赤血球識別に最適化された設定の散乱でＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。２００００の蛍光発光を、１サンプルあたり収集した。
【０１２８】
表９は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジンの赤血球への結合に対するグルタチオンおよびシステインの効果を示す結果を例示する。ＰＩＣ−１単独での処理は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジンのシグナルの明らかな増加を起こした（サンプル１および２）。１６ｍＭのグルタチオンまたはシステインいずれかとのインキュベーションは、未処理のサンプル（それぞれサンプル３および１０）と比較して、蛍光を変化させなかった。いずれかのクエンチャーの存在下、ＰＩＣ−１での処理は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジン結合のレベルにおいて用量依存性の減少を引き起こした。ＩｇＧおよびアルブミン結合の両方が、≧２ｍＭのクエンチャーの存在下での、バックグラウンドレベルにあるもであることを示した（サンプル６および１３）。アクリジン結合は、対照的に、試験された範囲全てにわたって、クエンチャー濃度に依存した。１６ｍＭのグルタチオンまたはシステインであっても、アクリジンシグナルを完全に排除しなかった。４ｍＭのグルタチオンで、アクリジンシグナルは５３倍減少した（サンプル２対サンプル７）；４ｍＭのシステインで、アクリジンシグナルは８３倍減少した（サンプル２対サンプル１４）。０．３ｍＭのＰＩＣ−１を使用する平行研究において、タンパク質およびアクリジンの結合の初期レベルはＰＩＣ−１のより低い濃度のために減少されているが、グルタチオンを使用して類似の傾向が見られた。
【０１２９】
【表９】
（実施例１０：ＰＩＣ−１処理後貯蔵されたＰＲＢＣの性質に対するグルタチオンの効果の研究）
赤血球の性質に対するグルタチオンの任意の効果を測定するために、以下の実験を二重に行った。４単位のＡＢＯ−一致全血をプールし、混合し、次いで４個の血液バッグ中へ再分配して同一の５００ｍＬ単位を作った。ＰＲＢＣを、添加溶液としてＡｄｓｏｌを使用して調製した。受け取りの２０時間以内に、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから受け取った全血の単位を３８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして血漿を別の容器中へ急送する。％ヘマトクリットを、毛細管を血液サンプルで満たし、そして５分間回転させることにより測定する。赤血球により占められる容積を、較正曲線と比較する。９４ｍＬのＡｄｓｏｌを加える。最終ヘマトクリットは、処理に応じて５０〜５３％の範囲であった。
【０１３０】
各実験において、４種の条件を試験した：（１）コントロール、ＰＩＣ−１無し、およびグルタチオン無し；（２）３ｍＭのグルタチオンのみ；（３）０．３ｍＭのＰＩＣ−１のみ；および（４）０．３ｍＭのＰＩＣ−１＋３ｍＭのグルタチオン。コントロールを含む全ての単位を、２０℃で１４時間インキュベートした。次いで、ＰＲＢＣを継続のために４℃の貯蔵所へ移した。サンプルを、処理に続いて直ちに、およびそれ以降約１週間を基準に、分析のために採取した。２，３−ＤＰＧ、ＡＴＰ、および溶血の結果は、表１０および１１に要約される。これらのデータは、コントロールと比較してどの処理の間にも有意の差異を実証しなかった。細胞外カリウム、細胞内グルタチオン、浸透圧脆弱性、グルコース消費、および乳酸生成の測定もまた、グルタチオンが、単独またはＰＩＣ−１とともにのいずれでも、赤血球のインビトロ性質を有意に変更しないことを確実にした。
【０１３１】
細胞外カリウムレベルは、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ６１４Ｋ+／Ｎａ+ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定した。溶血を、Ｈｏｇｍａｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３１：２６〜２９（１９９１）において記載されるように測定した。細胞内グルタチオンを、Ｂｅｕｔｌｅｒ、「Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、ＧｒｕｎｅおよびＳｔｒａｔｔｏｎ、第３版、１９８４に記載されるように測定した。２，３−ＤＰＧおよびＡＴＰは、それぞれＳｉｇｍａ手順第６６５および３６６（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して測定した。グルコース消費および乳酸生成を、それぞれＳｉｇｍａ手順第１１５および７３５（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して測定した。浸透圧脆弱性を、Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、第５９巻（１９８２）に記載されるように測定した。
【０１３２】
【表１０】
【０１３３】
【表１１】
（実施例１１：ＧＳＨで処理したマウスＲＢＣの回収および生存の研究）
ビオチン標識化ネズミ赤血球（ＲＢＣ）のインビボ回収および生存に対する、０．６ｍＭのＰＩＣ−２の、６．０ｍＭのＧＳＨありおよび無しでの効果を研究した。マウスＲＢＣを標識し、次いでＰＩＣ−２、ＰＩＣ−２＋グルタチオン、またはグルタチオンのみで処理した。処理済み標識化細胞を、レシピエント中に注入した。これらの細胞の循環を、フローサイトメトリーにより３６日にわたって追跡した。標識のみのコントロールと比較して、いずれの処理済みＲＢＣの回収または寿命にも差異は観測されなかった。データは、処理におけるグルタチオンがインビボＲＢＣ機能と適合性であること、およびＰＩＣ−２処理それ自身が赤血球に損傷を与えないことを実証する。
【０１３４】
ドナーマウス（ＢＡＬＢ／ｃ オス）に、１日目および２日目に０．１ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を注入した。第二の注入の１時間後に、少量の、各マウスからのビオチン標識化全血を、ストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）と反応させ、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で蛍光細胞の割合を測定することにより、標識化効率をチェックした。≧９０％の標識化ＲＢＣを有するマウス全てを、ドナーマウスとして使用した。
【０１３５】
ドナーマウスから、心臓穿刺により血液を採取し、そして１２８２×ｇで６分間で１回回転させた。血漿を除去し、そしてＰＲＢＣを、室温で１４時間、±０．６ｍＭのＰＩＣ−２±６．０ｍＭのＧＳＨでインキュベートした。次の朝、ＲＢＣを洗浄し、そしてＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁した。洗浄したＲＢＣの％ビオチン標識化を、上記のように測定した。ＲＢＣの総数を、細胞計数器（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｕｎｔ Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）でＣＢＣ（全血球計算）を行うことにより測定した。
【０１３６】
次いで、洗浄したＲＢＣをレシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ メス）へ輸注した。各マウスは≒８００×１０6のビオチン標識化ＲＢＣを受けた。輸注の時点で各マウスの重量を計り、そして標識化ＲＢＣ／マウスの真の割合を、マウスの重量に基づいて計算し、そのＲＢＣをＣＢＣにより測定されたように計数し、そして輸注された標識化ＲＢＣの割合を上記のように決定した。
【０１３７】
標識化ＲＢＣの生存割合を、１時間、および１日〜４０日で測定した。結果を、１時間での生存割合＝１００％を使用することにより規格化した。全てのマウスについて１時間での標識化ＲＢＣの真の回収％は、１０５．８±１７．５％であった。結果を、標識化ＲＢＣ静脈注射の効率における差異を斟酌するために１時間での％生存＝１００％に規格化した。
【０１３８】
ＰＩＣ−２処理済みＲＢＣ生存は、実験全てにわたり実質的にコントロールと同じであった。平均中央生存値を、図１に示した。データは、ＰＩＣ−２での処理が、グルタチオンありまたは無しのいずれでもＲＢＣ生存に対して有意の効果を持たなかったことを示唆する。従って、グルタチオンは処理後の赤血球のインビボ循環と適合する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、グルタチオンおよび病原体不活性化化合物で処理した後、生存しているネズミ赤血球を示すグラフである。
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年１月６日出願の米国暫定出願番号第６０／０７０，５９７号の利益を請求し、その開示は本明細書中参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本出願は、血液製剤のような生体材料中の反応性求電子化合物をクエンチするために、材料を求核化合物で処理する方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
血液製剤および他の生体材料による疾患の伝播は、依然として深刻な衛生問題のままである。血液ドナースクリーニングおよび血液試験においてかなりの進歩が生じて来てはいるが、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＢＣ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスは、ウイルスまたはウイルス性抗体が低濃度であるため、試験の間、血液製剤中での検出を免れ得る。ウイルス性の危険に加えて、輸血に使用される予定である血液中のバクテリアまたは原生動物の存在をスクリーニングするための認可せられた試験は、目下、存在しない。危険性はまた、輸血を介したＨＩＶ伝播の危険性が認識される前に実際に生じたように、これまで未知の病原体が血液供給中に優勢になり、そして疾患の伝播の脅威を現し得るということにある。
【０００４】
研究所の労働者が血液または他の体液にさらされることもまた、衛生上の危険を現す。最近では１９８９年に、疾病管理センターは、血液にさらされることを含む仕事を行う保健医療労働者１２０００人が毎年Ｂ型肝炎ウイルスに感染すると見積もった。「保健医療および公衆安全労働者へのヒト免疫不全ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの伝播を予防するためのガイドライン」Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ、第３８巻、第Ｓ−６号、１９８９年６月。この統計は、生体材料中の病原体を不活性化するための方法に対する必要性を示している。
【０００５】
血液製剤の臨床使用の前に、病原体を不活性化するために、化学薬品が血液または血漿中に導入されてきた。病原体の光化学的不活性化のための方法および組成物が記載されてきた。米国特許第５，５８７，４９０号、および第５，４１８，１３０号は、体液中のウイルスまたはバクテリア混入物を光化学的に不活性化するために使用される置換ソラレンを記載している。メチレンブルーのようなフェノチアジンは、照明に対して血液製剤中の病原体を不活性化することを示してきた。Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３３：３０〜３６（１９９３）。米国特許第５，６３７，４５１号は、フタロシアニン化合物を加え、そして材料を照射することにより赤血球含有材料中のウイルスを不活性化する方法を記載している。
【０００６】
病原体不活性化のための光化学的方法の短所は、また生成する反応性フリーラジカルおよび酸素種が、血液製剤に損傷を引き起こし、そしてそれらの予定される使用に対する安定性を落とし得ることである。米国特許第４，７２７，０２７号、第５，５８７，４９０号、第５，４１８，１３０号、第５，２３２，８４４号、第５，６５８，７２２号、および第５，６３７，４５１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ ９７／１６９６６号において記載されるように、光化学反応の間に生じるフリーラジカル損傷を減少し、そして最小限にするために、フリーラジカルクエンチャーが病原体不活性化のための光化学的方法において使用されてきた。
【０００７】
光活性化を必要としない化合物が、病原体不活性化のために開発されてきた。これらの化合物は、代表的には病原体と反応する求電子試薬である。例えば、米国特許第５，０５５，４８５号は、アリールジオールエポキシドを使用した、組成物を含む細胞およびタンパク質中のウイルスの不活性化を記載している。他の化合物は、インサイチュで求電子試薬を生成する。ＬｏＧｒｉｐｐｏらは、ウイルス不活性化のための、ナイトロジェンマスタード、ＣＨ3−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2の使用を評価した。ＬｏＧｒｉｐｐｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、編）、１９５８年、２２５〜２３０頁。より重要には、米国特許第５，６９１，１３２号および第５，５５９，２５０号（これらの開示は本明細書中参考として援用される）が、Ｎ１，Ｎ１−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ４−（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）−１，４−ペンタンジアミン（「キナクリンマスタード」）および５−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］メチル−８−メトキシソラレンの、血液、血液製剤、および種々の生物学的起源のサンプルにおける病原体の不活性化のための使用を記載している。ポリアミン部分に共有結合したアジリジンを含む病原体不活性化化合物もまた、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）において記載されるように、使用されてきている。
【０００８】
理想的には、求電子反応により不活性化する病原体不活性化化合物または中間体の、血液製剤または他の生物学的サンプルへの添加は、サンプルに対するどのような望ましくない改変も引き起こすことなく病原体を不活性化する。病原体不活性化化合物は、求電子プロセスにより病原体と反応し、そして光活性化を必要としない。それ故、反応性酸素またはフリーラジカル種が生成されず、そして酸化的損傷は関係ない。しかしながら、他の望ましくない副反応が生じ得る。例えば、タンパク質を含む他の生体材料との求電子反応が生じ得る。これらの副反応は、潜在的に、生物学的サンプルの予定される目的に対するそれらの使用をおとしめ得る。
【０００９】
従って、病原体不活性化化合物の有害な病原体を不活性化する能力を保ちながら、病原体と求電子的に反応する病原体不活性化化合物の望まない求電子副反応を防止するための方法に対する必要が存在する。望ましくない副反応を減少しながら、生体材料中の病原体を不活性化する方法に対する必要が存在する。
【００１０】
（発明の開示）
材料中の反応基を含む化合物をクエンチするための方法が提供される。種々の化合物が、生体材料のような材料中、本明細書中で開示される方法を使用して、クエンチされ得る。クエンチされ得る化合物は、求電子基のような反応性基である官能基か、または求電子基のような反応性基をインサイチュで形成し得、および形成した官能基を含む化合物を含む。例えば、官能基は、インサイチュで求電子アジリジン、アジリジニウム（ａｚｉｒｉｄｉｎｉｕｍ）、チイラン（ｔｉｉｒａｎｅ）、またはチイラニイウム（ｔｈｉｉｒａｎｉｕｍ）イオンのような反応性基を形成し得るマスタード基であり得る。別の実施態様において、官能基はエポキシドであり得る。
【００１１】
１つの実施態様において、生体材料中の病原体を不活性化するために使用される病原体不活性化化合物の副反応をクエンチするための方法が提供される。特定の実施態様において、求電子基である官能基、または求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。この実施態様において、生体材料は、病原体不活性化化合物、および求電子基と共有結合的に反応し得る求核官能基を含むクエンチャーで処理される。病原体不活性化化合物の求電子基は、１つの好適な実施態様において、カチオン性基である。生体材料は、例えばインビトロまたはエキソビボで、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得る。好適な実施態様において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、また病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチャーにクエンチさせながら、病原体不活性化化合物が材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で材料に投与される。
【００１２】
１つの実施態様において、クエンチャーは、２相系のような多相系中に導入され得る。例えば、クエンチャーは、膜が第一および第二相を分離している２相系へ投与され得る。１つの実施態様において、１つの相は膜により閉ざされて（ｂｏｕｎｄ）いる。例えば、膜は病原性有機体の外部膜を規定し得、第一相は病原性有機体を含む相であり得、そして第二相は病原性有機体の内部であり得る。膜は、例えばウイルスの脂質被覆であり得、第一相は、例えば血液のようなウイルスが分散している液体であり得、そして第二相はウイルス核酸を含むウイルスの内部であり得る。別の実施態様において、膜は細胞膜であり得、そして膜に閉ざされた相は、バクテリアのような、病原性単細胞有機体の内部であり得る。この実施態様において、病原体不活性化化合物は、２相系中へ導入され、これは好ましくは速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得、一方でクエンチャーは実質的に、病原体不活性化化合物と比較して、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。
【００１３】
１つの実施態様において、その中に膜を含む病原体を有する第一の液相、および病原体の膜により閉ざされた第二相を含む２相生体材料中の、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。従って、第二相は病原体膜内に含まれる内容物である。生体材料は、求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理される。病原体不活性化化合物での処理の前、それと同時に、またはその後、生体材料は求電子基と共有結合的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで処理される。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前に、またはそれと同時に加えられる。好ましくは、病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得る。好ましくは、病原体不活性化化合物による膜透過速度は、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に減少する。好ましくは、病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。クエンチャーは、好ましくは、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の求電子基と反応し得、そしてクエンチャーの、病原体不活性化化合物の求電子基との反応は、好ましくは実質的に第一相で生じる。求電子基を含む病原体不活性化化合物は、膜に閉ざされた第二相中の病原体の核酸と反応し、それにより病原体を不活性化する。この方法は、病原体が処理される相において、反応性病原体不活性化化合物、ならびにそこから形成される反応性種をクエンチしながら、病原体膜内での病原体不活性化化合物と病原体核酸との反応により病原体を不活性化させる。
【００１４】
本明細書中で開示される方法は、２相系において、クエンチャーが第一相に投与され、そして実質的に病原体の外部膜を通り抜け得ず、従って実質的に第二相、すなわち病原体の内部に存在しないため、有利である。病原体不活性化化合物は、例えば、第一相へ投与され、そして求電子基の形成前に病原体の膜を通り抜け得る。インサイチュでの求電子基の形成において、病原体不活性化化合物は実質的に、もはや膜を通り抜け得ない。従って、第二相、すなわち病原体の内部で病原体不活性化化合物はクエンチされることなく病原体の核酸と反応しながら、第一相でクエンチが選択的に生じる。従って、生体材料、例えば血液製剤中、病原体不活性化化合物およびそれらの分解生成物の反応性基のクエンチは、病原体が懸濁している第一相で選択的に生じる。従って、第一相におけるクエンチは、血液中のタンパク質または細胞表面の共有結合的改変のような、病原体不活性化化合物上の反応基の望まない副反応を減少させる。この方法において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体の不活性化を生じさせながら、血液のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて保護的効果を有する。
【００１５】
この方法は、原核および真核生物ならびに脂質被覆ウイルスのような病原体を含む生体材料を処理するために使用され得る。詳細には、この方法は、脂質被覆ウイルス、および細胞膜の形態で膜を含むバクテリアのような、膜を含む病原体を処理するために使用され得る。その中に膜を含む病原体を有する、血液製剤のような生体材料を処理するための例示的なクエンチャーには、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、メルカプトエタンスルホン酸塩、またはジメルカプロールが挙げられる。
【００１６】
病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、および求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基を含み得、ここで求電子基は、核酸と反応して核酸と共有結合を形成し得る。病原体不活性化化合物はまたさらに、壊れやすいリンカーを含み得、これは核酸結合リガンドおよび官能基を連結する。例えば、官能基は、インサイチュで反応してアジリジニウムイオンのような求電子基を形成し得るマスタード基であり得る。例示的な病原体不活性化化合物は、キナクリンマスタード、Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−エチル−Ｎ’−（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）−１，３−プロパンジアミンジヒドロクロリド、および５−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］メチル−８−メトキシソラレンを含む。他の病原体不活性化化合物は、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）において記載されるような、ポリアミン部分に共有結合的に連結したアジリジンを含む化合物を含む。
【００１７】
使用され得るクエンチャーは、チオール、チオ酸、ジチオ酸、ホスフェート、チオホスフェート、およびアミンのような求核官能基を含み得る。例示的なクエンチャーは、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チオスルフェート、メルカプトエタンスルホン酸塩、およびジメルカプロールを含む。好適な実施態様において、クエンチャーはグルタチオンである。
【００１８】
血液製剤のような生体材料がクエンチャーおよび病原体不活性化化合物で処理される方法において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後に材料へ加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、または同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える約３０分以内、例えば、約１５〜２０分以内、または約１０分以内に加えられる。処理され得る生体材料は、全血、赤血球、血漿またはそのフラクション、および血小板のような血液製剤を含む。この方法は、個体内へ導入するのに適している処理済み血液製剤を製造するために使用され得る。例えば、処理済み材料はそれを必要としている個体中へ輸注され得る。必要に応じて、材料中の病原体不活性化化合物および／またはクエンチャーの濃度は、処理後、および輸注前に、例えば濾過または吸着により減少され得る。病原体を含む、または含むと疑われる広範な生体材料（例えば血液製剤）が処理され得る。
【００１９】
１つの好適な実施態様において、赤血球を含む材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供され、ここでこの方法は、赤血球を含む材料を、求電子基であるかまたは求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理する工程、および求電子基と電子共有的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで材料を処理する工程を含む。１つの実施態様における病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、およびインサイチュで反応してアジリジニウムイオンのような求電子基を形成し得るマスタード基を含む。材料は、濃縮（ｐａｃｋｅｄ）赤血球を含み得る。材料は、例えば約３０〜８５％のヘマトクリットを有する血液製剤を含み得る。例えば、赤血球を含む材料は、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得、次いで処理された材料はそれを必要としている個体中に輸注され得る。
【００２０】
病原体不活性化化合物の濃度は、例えば、約０．１μＭ〜５ｍＭであり得る。病原体不活性化化合物の濃度は、例えば、処理されるべき材料中の病原体の少なくとも約３〜６ ｌｏｇを不活性化するのに十分であるように提供され得る。求核基は、好ましくはチオール基である。好適な実施態様におけるクエンチャーは、グルタチオンである。グルタチオンの濃度は、例えば約０．５〜３０ｍＭのオーダーであり得る。材料は、例えば少なくとも約１〜４８時間、病原体不活性化化合物およびクエンチャーとともにインキュベートされ得る。
【００２１】
好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物による病原体の不活性化を、クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して約３ ｌｏｇ以下まで減少させる。別の好適な実施態様において、この方法において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物によるウイルス性病原体の不活性化を、クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して約１ ｌｏｇ以下まで減少させる。好ましくは、赤血球を含む材料が処理される実施態様において、赤血球機能は、処理後実質的に変更されない。
【００２２】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は赤血球含有材料を、病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化するのに有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理する工程を含み、そしてここで赤血球機能は処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、この材料を、病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化するのに有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理する工程を含み、そしてここで赤血球の溶血は貯蔵の２８日後で３％未満である。
【００２３】
（発明を実施するための最適な様式）
材料中の、求電子基を含む化合物のような反応性化学種をクエンチするための方法が提供される。１つの実施態様において、血液製剤のような生体材料を含む材料中の病原体不活性化化合物をクエンチするための方法が提供される。別の実施態様において、病原体不活性化化合物で処理される、赤血球のような生体材料の改変を阻害するための方法が提供される。病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体の不活性化を生じさせながら、血液製剤のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて、保護的効果を有する。
【００２４】
（定義）
「病原体」は、ヒト、他の哺乳動物、または脊椎動物に疾患を引き起こしうる因子を含む任意の核酸として定義される。病原体因子は、単細胞または多細胞であり得る。病原体の例は、ヒト、他の哺乳動物、または脊椎動物に疾患を引き起こす、バクテリア、ウイルス、原生動物、真菌、酵母、糸状菌、およびマイコプラズマである。病原体の遺伝材料は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして遺伝材料は一重らせんまたは二重らせん核酸として存在し得る。表Ｉは、ウイルスの例を列挙し、そしていかなる様式においても本発明を制限することを意図しない。
【００２５】
【表１】
【００２６】
材料または化合物の「インビトロ」使用は、材料または化合物の、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外側での使用として定義され、ここで材料または化合物は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物中へ再導入することを意図しない。インビトロ使用の例は、研究室装置を使用する血液サンプルの成分分析がある。
【００２７】
化合物の「エキソビボ」使用は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の外側で、生体材料の処理のために化合物を使用することとして定義され、ここで処理された生体材料は、生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物の内側で使用することを意図する。例えば、ヒトからの血液の除去、および病原体を不活性化するためのその血液中への化合物の導入は、その血液がそのヒトまたは別のヒト中へ再導入されることを意図する場合に、その化合物のエキソビボ使用として定義される。ヒト血液の、そのヒトまたは別のヒト中への再導入は、化合物のエキソビボ使用とは対照的に、血液のインビボ使用である。血液がヒト中へ再導入されるときに、化合物が依然として血液中に存在しているならば、化合物は、そのエキソビボ使用に加えて、インビボでもまた導入される。
【００２８】
「処理され得る材料」は、任意の材料を含み、生体材料を含む。そのような材料は、化学製品、溶液を含み、これは、塩、または緩衝化溶液、および溶媒を含む。生きているヒト、哺乳動物、または脊椎動物と接触することになるか、またはその中へ導入される任意の材料（ここで、そのような接触が疾患または病原体を伝染させる危険をもたらす）が、本明細書中で開示されるように処理され得る。
【００２９】
「生体材料」は、任意の型の生物学的有機体を起源とする材料として定義される。生体材料の例は、以下を含むがこれらに限定されない；血液、血漿、分画化血漿、血小板調製物、赤血球、および濃縮赤血球のような血液製剤、髄液、唾液、尿、汗、糞、***、乳、組織サンプル、ホモジナイズされた組織サンプル、ならびに生物学的有機体にその起源を有する任意の他の物質。生体材料はまた、その起源を生物学的有機体に持つ物質を組み込んでいる合成材料を含む；例えば、病原体またはその一部分を含むワクチン調製物（この場合、病原体がその起源を生物学的有機体に持つ物質である）または組換えタンパク質、血液および分析試薬の混合物である、分析のために調製されたサンプル、細胞培養培地、細胞培養物、ウイルス培養物、および生きている有機体から由来する他の培養物など。
【００３０】
「病原体の不活性化」は、材料中の病原体を繁殖し得ないようにする工程として定義される。不活性化は、残存する繁殖し得る病原体のフラクションの、負の対数として表される。従って、特定の濃度にある化合物が材料中の病原体の９０％を繁殖し得ないようにするならば、１０％または１／１０（０．１）の病原体が繁殖し得るままである。０．１の負の対数は１であり、そしてその化合物のその濃度は１ ｌｏｇまで病原体を不活性化したとされる。あるいは、化合物は、その濃度で１ ｌｏｇの殺傷を有するとされる。従って、特定の濃度にある化合物が１０％または０．１を除く全ての病原体を繁殖不可能にするならば、それは１ ｌｏｇで病原体を不活性化するとされる。１％または０．１％を除く全ての病原体を不活性化することは、それぞれ、その化合物のその濃度において２ ｌｏｇまたは３ ｌｏｇの病原体の減少に対応する。
【００３１】
（クエンチされる化合物）
種々の化合物が、生体材料のような材料中で、本明細書中で開示される方法を使用してクエンチされ得る。クエンチされ得る化合物は、求電子基のような反応基であるか、またはそれを形成し得る、および例えばインサイチュでそれを形成した官能基を含む化合物を含む。例えば、官能基は、インサイチュで反応基（例えば、求電子アジリジン、アジリジニウム、チイラン、またはチイラニイウムイオンなど）を形成し得るマスタード基であり得る。別の実施態様において、官能基はエポキシドであり得る。クエンチャーは、求核基を含み、そしてクエンチャーの求核基の、反応性求電子基との共有結合的反応により、化合物の求電子性反応基を補足するように作用する。クエンチャーは、求電子基を含む化合物ならびにそこから形成された反応性種を含む反応性種を補足するために使用され得る。
【００３２】
１つの実施態様において、材料中の病原体を不活性化するために使用される化合物をクエンチするための方法が提供される。血液製剤において、不活性化されることが望ましい病原体は、微生物（例えば、原核生物、真核生物、および核酸を含むウイルス性微生物など）ならびにそのような微生物由来の核酸ゲノムまたはそのフラグメントを含む。不活性化され得るウイルスの例は、脂質被覆ウイルス（例えば、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モロニー肉腫ウイルス、シンドビスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２）、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎およびヘルペス群ウイルスなど）、ならびにパルボウイルスを含む非エンベロープウイルス（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ）を含む。
【００３３】
反応性求電子基を含むか、または光活性化を必要とすることなくインサイチュで反応して反応性求電子基を形成する化合物が、生体材料中の病原体を不活性化するために開発されてきた。反応性求電子基は、ウイルスおよびバクテリアのような病原体の核酸と反応して、それらを不活性化させる。しかしながら、これらの反応性化合物はまた、望まない副反応に関係し得る。本明細書中で提供されるのは、クエンチ化合物を加えて、化合物上の求電子基と病原体との反応により病原体を不活性化するこれらの化合物の、望まない副反応を減少する方法である。
【００３４】
反応性求電子基を形成し、そして病原体を不活性化するために使用され得る病原体不活性化化合物の例は、ＰＣＴ ＷＯ ９６／１４７３７、ＰＣＴ ＷＯ ９６／３９８１８に、および米国暫定出願番号第６０／０４３，６９６号（１９９７年４月１５日出願）に記載される（これらの開示は本明細書中で援用される）。さらに、ナイトロジェンマスタード、ＣＨ3−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ）2は、特定の病原体を不活性化し得る。ＬｏＧｒｉｐｐｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、編）、１９５８年、２２５〜２３０頁。
【００３５】
好適であるのは、エフェクターと共有結合したアンカーを含む病原体不活性化化合物である。用語「アンカー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸生物高分子に、非共有結合的に結合し得る部分を示す。「アンカー」はまた、「核酸結合リガンド」として示される。用語「エフェクター」は、核酸と反応して核酸と共有結合を形成し得る部分を示す。好ましくは、エフェクターは、求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基であり、ここで求電子基は、核酸と共有結合を形成し得る。例えば、ＰＣＴ ＷＯ ９６／１４７３７、ＰＣＴ ＷＯ ９６／３９８１８、および米国特許第５，５５９，２５０号（これらの開示は本明細書中で援用される）は、マスタード基であるエフェクターおよび核酸結合リガンドを含む病原体不活性化化合物を記載している。ポリアミンアンカーに共有結合で接続されたアジリジンを含む病原体不活性化化合物もまた、Ｂｕｄｏｗｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２９〜３９（１９９６）；およびＰＣＴ ＷＯ ９７／０７６７４に記載されるように、使用され得る（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。
【００３６】
例示的な化合物は、キナクリンマスタードであり、その構造は以下に示される。
【００３７】
【化１】
【００３８】
例示的な病原体不活性化化合物（ＰＩＣ）は、ＰＩＣ−１およびＰＩＣ−２を含み、それらの構造は以下に示される。ＰＩＣ−１はエステル官能性を有する壊れやすいリンカーを含むが、一方ＰＩＣ−２はアミド官能性を有する壊れやすいリンカーを含む。
【００３９】
【化２】
アクリジン（およびアクリジン誘導体、例えば、プロフラビン、アクリフラビン、ジアクリジン、アクリドン、ベンズアクリジン、キナクリン）、アクチノマイシン、アンスラサイクリノン、ロドマイシン、ダウノマイシン、チオキサンテノン（およびチオキサンテノン誘導体、例えばミラシルＤ）、アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン（キノマイシンＡ（ｑｕｉｎｏｍｙｃｉｎ Ａ））、トリオスチン（ｔｒｉｏｓｔｉｎｓ）、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）（ならびに二量体、三量体、およびそれらのアナログ）、ノルフィリンＡ（ｎｏｒｐｈｉｌｉｎ Ａ）、フルオレン（および誘導体、例えば、フルオレノン、フルオレノジアミン）、フェナジン、フェナントリジン、フェノチアジン（例えばクロルプロマジン）、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテンおよびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、３，４−ベンゾピレン、１−ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン、ベンゾジピロン、キノリン（例えば、クロロキン、キニン、フェニルキノリンカルボキサミド）、フロクマリン（ｆｕｒｏｃｏｕｍａｒｉｎｅｓ）（例えば、ソラレンおよびイソソラレン）、エチジウム、プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）、コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）、および多環式芳香族炭化水素ならびにそれらのオキシラン誘導体；
ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、他のレキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８および他のＨｏｅｃｈｓｔ色素、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）、およびトリアリールメタン色素；
アフラトキシン；
スペルミン、スペルミジン、および他のポリアミン；ならびに
三重らせん形成、Ｄ−ループ形成、および一重らせん標的への直接塩基対形成のような配列特異的相互作用により結合する、核酸またはアナログ。これらの化合物の誘導体もまた、アンカー基の非制限的例であり、ここで化合物の誘導体は、任意の部位で任意の型の１つ以上の置換基を持つ化合物、化合物の酸化または還元生成物、などを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
壊れやすいリンカーの例は、以下を含むがこれらに限定されない；エステルのような官能基を含む部分（ここでエステルのカルボニル炭素は、アンカーとエステルのｓｐ3酸素との間にある；この配列は「順接（ｆｏｒｗａｒｄ）エステル」とも呼ばれる）、「逆接（ｒｅｖｅｒｓｅ）エステル」（ここでエステルのｓｐ3酸素は、アンカーとエステルのカルボニル炭素との間にある）、チオエステル（ここでチオエステルのカルボニル炭素は、アンカーとチオエステルの硫黄との間にあり、「順接チオエステル」とも呼ばれる）、逆接チオエステル（ここでチオエステルの硫黄は、アンカーとチオエステルのカルボニル炭素との間にあり、「逆接チオエステル」とも呼ばれる）、順接および逆接チオノエステル、順接および逆接ジチオ酸、スルフェート、順接および逆接スルホネート、ホスフェート、ならびに順接および逆接ホスホネート基。「チオエステル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−基を表す；「チオノエステル」は、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−基を表し、そして「ジチオ酸」は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−基を表す。壊れやすいリンカーはまた、アミドを含み、ここでアミドのカルボニル炭素はアンカーとアミドの窒素との間にある（「順接アミド」とも呼ばれる）か、またはここでアミドの窒素はアンカーとアミドのカルボニル炭素との間にある（「逆接アミド」とも呼ばれる）。「順接」および「逆接」として表され得る基に対して、順接方向とは、官能基の加水分解後、得られる酸官能性がアンカー部分に共有結合され、そして得られるアルコール、チオール、またはアミン官能性がエフェクター部分に共有結合される、官能基の方向である。逆接方向とは、官能基の加水分解後、得られる酸官能性がエフェクター部分に共有結合され、そして得られるアルコールまたはチオール官能性がアンカー部分に共有結合される、官能基の方向である。
【００４１】
アミド部分のような壊れやすいリンカーはまた、処理される生体材料中の内因性酵素により、または材料へ加えられた酵素により、酵素的分解の条件下分解し得る。
【００４２】
エフェクターの例は、以下を含むがこれらに限定されない；マスタード基、マスタード基等価物、エポキシド、アルデヒド、ホルムアルデヒドシントン、ならびに他のアルキル化剤、および架橋化剤。マスタード基は、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基を含むとして定義される。マスタード基等価物は、マスタードと類似の機構により反応する基により定義される（例えば、モノまたはビスメシルエチルアミン基、モノメシルエチルスルフィド基、モノまたはビストシルエチルアミン基、およびモノトシルエチルスルフィド基など）。ホルムアルデヒドシントンは、水性溶液中で壊れてホルムアルデヒドになる任意の化合物として定義され、ヒドロキシメチルグリシンのようなヒドロキシメチルアミンを含む。ホルムアルデヒドシントンの例は、米国特許第４，３３７，２６９号に、および国際特許出願第ＷＯ ９７／０２０２８号において与えられる。
【００４３】
病原体不活性化化合物の濃度は、病原体の型、処理される生体材料の性質、および使用される不活性化化合物のような要因に基づいて選択され得る。
【００４４】
（クエンチ化合物）
クエンチ化合物（本明細書中「クエンチャー」とも示される）で生体材料を処理して、材料中の反応性求電子種の望まない副反応を減少するための方法が提供される。詳細には、生体材料中の病原体を不活性化する病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供され、ここで病原体不活性化化合物は、病原体の核酸に損傷を与える求電子基を含んでいるか、またはそれを形成し得るかのいずれかである。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の、および病原体不活性化化合物により生成した反応生成物の望まない反応を減少させる。病原体不活性化化合物の求電子基と反応し得る求核基を含むクエンチャーが好ましい。求核基を含むクエンチャーは、クエンチャーの求核基と、反応性求電子基との共有結合反応により、化合物の反応性求電子基を補足するように作用する。クエンチャーにより補足され得る反応性種は、求電子基を含む化合物、ならびにそれから形成される反応性求電子基を含む種を含む。
【００４５】
本明細書中で開示される方法の利点は、病原体不活性化化合物の望まない副反応を減少させ、しかしながら病原体不活性化化合物による病原体不活性化が依然として生じ得るように、有効量のクエンチャーが使用され得ることである。従って、クエンチャーは、病原体不活性化を生じさせながら、血液のような材料中の望まない副反応を減少させることにおいて保護的効果を有する。種々の副反応が減少され得る。例えば、血液製剤を含む材料が処理される方法において、赤血球の改変が減少され得る。例えば、ＩｇＧのようなタンパク質の結合、および／または病原体不活性化化合物の赤血球への結合が減少され得る。
【００４６】
１つの実施態様において、血液製剤のような生体材料は、求電子基であるか、またはそれを形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物、およびクエンチャーで処理される。好適な実施態様において、病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンド、および反応性求電子基であるか、またはそれを形成し得る官能基であるエフェクターを含む。求電子基は、例えば、オキシラン、チイラン、チイラニウム、またはアジリジニウムイオン、あるいはアジリジンであり得る。エフェクターは、求電子基を形成し得るマスタード基であり得る。マスタード基は、例えば、求電子アジリジン、または求電子アジリジニウムもしくはチイラニウムイオンをインサイチュで形成し得る。
【００４７】
この方法において、生体材料は病原体不活性化化合物の求電子基と共有結合的に反応し得る求核官能基を含むクエンチャーで処理される。クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後、材料に加えられる。好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加える前、またはそれと同時に加えられる。１つの好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物と同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加える前後、約３０分以内、例えば、約１５〜２０分以内、または必要に応じて、約１０分以内に加えられる。材料は、例えば、インビトロまたはエキソビボで処理され得る。病原体不活性化化合物の病原体を不活性化する能力に影響を及ぼすことなく、そして生体材料の性質を実質的に変化させることなく、病原体不活性化化合物の望まない副反応を減少させるクエンチャーが好ましい。
【００４８】
クエンチャーの例は、求核基、または求電子基と反応する他の基を含む化合物である。クエンチ化合物の混合物もまた、使用され得る。例示的な求核基は、チオール、チオ酸、ジチオ酸、チオカルバメート、ジチオカルバメート、アミン、ホスフェート、およびチオホスフェート基を含む。クエンチャーは、ピリジンのような窒素複素環であるか、またはそれを含み得る。クエンチャーは、グルコース−６−リン酸のようなリン酸含有化合物であり得る。クエンチャーはまた、チオール含有化合物であり得、以下を含むがこれらに限定されない；グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノール、ジメルカプロール、メルカプタン、メルカプトエタンスルホン酸およびそれらの塩（例えば、ＭＥＳＮＡ、ホモシステイン、アミノエタンチオール、ジメチルアミノエタンチオール、ジチオトレイトール、および他のチオール含有化合物）。クエンチャーはまた、ナトリウムまたは塩酸塩のような、塩の形態であり得る。
【００４９】
他のチオール含有化合物は、メチルチオグリコレート、チオ乳酸、チオフェノール、２−メルカプトピリジン、３−メルカプト−２−ブタノール、２−メルカプトベンゾチアゾール、チオサリチル酸、およびチオクト酸を含む。例示的な芳香族チオール化合物は、２−メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、２−メルカプト−ニコチン酸、ナフタレンチオール、キノリンチオール、４−ニトロ−チオフェノール、およびチオフェノールを含む。他のクエンチャーは、ニトロベンジルピリジン、およびセレン化物塩のような無機求核試薬またはセレノシステインのような有機セレン化物、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、スルフィド、チオリン酸塩、ピロリン酸塩、ヒドロスルフィド、および亜ジチオン酸塩を含む。クエンチャーはまた、求核基を含むペプチド化合物であり得る。例えば、クエンチャーは、例えば、ＧｌｙＣｙｓのようなジペプチド、グルタチオンのようなトリペプチドを含むシステイン含有化合物であり得る。
【００５０】
求核基または求核基を含む化合物を含む高分子錯体もまた、本発明の範囲内である。別の実施態様において、チオール基のような求核基、または求核基を含む化合物は、クロマトグラフィー材料のような固体支持体上に固定されて、固定クエンチャーを形成する。固体支持体は、例えばアガロース、ポリスチレン、または他のクロマトグラフィー材料であり得る。例えば、グルタチオン、または硫黄基のような求核基を含む他の化合物が、エポキシ活性化アガロースへ接着され得る。例えば、グルタチオン−アガロースは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、ここでグルタチオンは、アミノ基を通して、エポキシ活性化４％架橋ビーズ状アガロース（１０炭素スペーサーを介する）へ接着されている。さらに、システイン−アガロースがＳｉｇｍａから入手可能であり、これはアミノ基を通して臭化シアン活性化４％架橋ビーズ状アガロースへ接着されている。任意の範囲の活性化クロマトグラフィー樹脂または他の材料が、１個、２個、またはそれより多くの求核基を含むように誘導化され得る。誘導化され得るそのような活性化マトリックスは、臭化シアン、エポキシ、ニトロフェニルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、チオピリジル、ポリアクリルヒドラジド、およびオキシランアクリル酸活性化マトリックスを含む。チオールのような固定された求核基を含む他の例示的なクロマトグラフィー材料（市販されている）は、ＤｕｏｌｉｔｅＧＴ−７３ポリスチレンチオール含有樹脂およびＤｕｏｌｉｔｅＣ−４６７を含み、これはアミノホスホン酸基を含む（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）。
【００５１】
別の実施態様において、クエンチャーの反応は、グルタチオントランスフェラーゼのような酵素の反応により、触媒され得る。グルタチオントランスフェラーゼの存在はまた、クエンチャーの、求電子基を含む病原体不活性化化合物との反応性に影響を与える。例えば、グルタチオントランスフェラーゼは、膜系中で区分けされて、グルタチオントランスフェラーゼが存在する領域においてクエンチを生じさせ、そして増強させ得る。
【００５２】
クエンチャーはまた、例えば、酵素の反応により、または前駆体分子からの化学的再配列を通して、インサイチュで生成され得る。酵素的触媒によりインサイチュでクエンチャーを生成する化合物の例は、アミフォステン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標）、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｅｓｔ Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ、ＰＡ）である。
【００５３】
（血液製剤の処置のためのクエンチャーの好ましい性質）
１つの実施態様において、赤血球を含む生体材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。例えば、材料は約３０〜８５％のヘマトクリットを有する血液製剤であり得る。病原体不活性化化合物は、好ましくは、求電子基であるか、または求電子基を形成し得る官能基を含む。
【００５４】
クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前、それと同時に、またはその後、血液製剤に加えられる。好ましくは、血液製剤の処理において、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前に、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える約３０分以内に、また早く１５〜２０分以内に、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。処理され得る血液製剤の例は、全血、血小板、赤血球、および血漿を含む。好ましいクエンチャーは、病原体不活性化または血液製剤に有意に影響を与えること無く、反応性化合物の望まない副反応を減少させる化合物である。例えば、クエンチャーは、病原体不活性化化合物で処理される血液製剤へ加えられ得、ここで病原体不活性化化合物は、ｉ）核酸結合リガンド（核酸へ非共有結合的に結合し得る）；およびｉｉ）カチオン性求電子基のような求電子基であるか、またはそれを形成し得る基、を含む。病原体不活性化または処理される特定の血液製剤の性質に有意に影響を与えることなく化合物の望まない副反応を減少し得るクエンチャーが好ましい。１つの好適なクエンチャーはグルタチオンである。
【００５５】
好適な実施態様における病原体不活性化化合物は、核酸結合リガンドおよびインサイチュで反応して求電子基を形成し得るマスタード基を含み、ここで求電子基はアジリジニウムイオンである。非共有結合核酸リガンドおよびマスタード基を含む化合物が、例えば、米国特許第５，５５９，２５０号において記載される。例示的な化合物は、キナクリンマスタードを含む。これらの化合物は、病原体の核酸物質に結合し、そしてそれをアルキル化することにより、病原体を不活性化すると思われる。不活性化反応において、化合物上のマスタード基は反応性アジリジニウムイオンを形成する。病原体の核酸は、化合物により形成された求電子アジリジニウム中間体への核酸の求核攻撃により化合物と反応すると思われる。どのような理論にも制限されていないが、グルタチオンのようなクエンチャーは、求電子アジリジニウム中間体へのクエンチャーの求核攻撃により、類似の様式でこれらの病原体不活性化化合物と反応し、もはや核酸と反応し得ない反応生成物（単数または複数）を生成すると思われる。
【００５６】
どのような理論にも制限されていないが、求核試薬（Ｎｕ1およびＮｕ2）の病原体不活性化化合物上のマスタード基との反応の、提案される機構は、以下のスキームＩに示される。
【００５７】
【化３】
【００５８】
アジリジニウムイオンの反応性は高いが、反応速度は依然として反応する求核試薬の性質に依存する。その上さらに、クエンチャー求核試薬は、例えば、存在する他の内因性求核試薬よりも高い濃度で存在する場合、またはそれらがより反応性が高い場合、他に存在する内因性求核試薬と競合し得る。生理学的条件下、好適な求核基は、チオール基である。他の求核基は、ホスフェートおよびアミノ基を含む。
【００５９】
クエンチャーは、好ましくは、血液製剤の機能を維持し、かつ病原体不活性化化合物の副作用を最小限にする。血液製剤、特に赤血球を含む血液製剤の処理のための好適なクエンチャーは、グルタチオンである。グルタチオンは、マスタード基を含む病原体不活性化化合物のような、アジリジニウム中間体を形成する病原体不活性化試薬と組み合わせた材料を含む赤血球の処理において使用するのに特に有用である。グルタチオンのチオール基は、親マスタード化合物とよりも速くアジリジニウム中間体と反応する。
【００６０】
クエンチャーは、好ましくは、細胞膜およびウイルス脂質被覆のような病原体外部膜を実質的に通り抜けない。クエンチャーは、好ましくは、病原体不活性化化合物により引き起こされる病原体の核酸に対する損傷をクエンチャーが有意に減少させるほどの程度で、ウイルス、バクテリア、および他の標的病原体の脂質膜を通り抜けない。さらに、クエンチャーは、好ましくは、病原体不活性化化合物自身と反応するよりはむしろ、この化合物から形成された求電子基と反応する。任意の理論により制限されないが、病原体不活性化化合物は、ウイルス脂質被覆およびバクテリア膜のような病原体膜を自由に通過し得るが、しかしアジリジニウムイオンのようなカチオン性求電子基が形成された後、化合物はどのような有意の程度でも病原体膜を通過し得ないと思われる。従って、標的病原体の外側で形成される求電子カチオンは、実質的に核酸と架橋し得ない；しかしながら、クエンチャーはそれらと反応し得る。逆に言えば、１つの実施態様において、求電子カチオンが病原体の内側で形成される場合、クエンチャーは病原体膜を通り抜ける能力が無く、そして核酸の架橋は加えられたクエンチャーから実質的に有意の干渉を受けることなく進行する。
【００６１】
病原体不活性化化合物による病原体不活性化に干渉することなく、クエンチャーが病原体不活性化化合物と反応して望まない副反応をクエンチすることが好ましい。このことは、例えば、実質的に病原体膜を横切らないクエンチャーの使用により生じ得、そしてそれ故に副反応を病原体膜の外側でクエンチする。別の実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物、またはそれらから形成される反応性中間体と速度論的に非常にゆっくりと反応し得る、すなわち、実質的に病原体不活性化と干渉しない。
【００６２】
１つの実施態様において、クエンチャーは、第一および第二相を分離する膜を含む２相系のような多相系へ投与され得る。１つの実施態様において、２相系において１つの相は膜により閉じられている。膜は、天然または合成分子、あるいはそれらの混合物で構成された、天然または合成の半透過性バリアであり得る。例えば、膜で閉じられた相は、病原性有機体の内部であり得、そして他方の相は、病原性有機体が含まれている相であり得る。例えば、病原体は、血液を含む液相のような流体相中に懸濁され得る。膜に閉じられた相は、例えば、ウイルス核酸を含むウイルス脂質被覆の内部であり得る。別の実施態様において、膜は細胞膜であり得、そして膜で閉じられた相は、バクテリアのような病原性単細胞有機体の内部であり得る。病原体不活性化化合物の少なくとも一部分が、好ましくは、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得、一方でクエンチャーは、病原体不活性化化合物と比較して、実質的に、速度論的または熱力学的に膜を通り抜け得ない。
【００６３】
他の膜は、例えばＬａｓｉｃ，Ｄ．、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｌｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９９７、第６章において記載されるように、リポソームを含む。リポソームは、レシチン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルエタノールアミンのような自己集合した両親媒性分子を使用して小胞性粒子として形成され得る。リポソームはまた、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルイノシトールのような、負に電荷を帯びた脂質を使用して形成され得る。カチオン性リポソームもまた、市販されているカチオン性界面活性剤を使用するか、または以下に記載されるようにコレステロールに連結したポリカチオン性基を使用して、調製され得る；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７９：２８０〜２８５（１９９１）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２８６７〜２８７２（１９９３）；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１０２７〜１０３６（１９９６）。膜はまた、米国特許第５，７５３，２５８号において記載されるように、人工ウイルス外被を含む（その開示は本明細書中で援用される）。膜はさらに、白血球のような非病原性細胞の膜を含む。
【００６４】
１つの実施態様において、その中に膜を含む病原体を有する液体を含む第一の相、および病原体の膜により閉ざされた第二の相を含む、２相の生体材料において病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチするための方法が提供される。生体材料は、求電子基を形成し得る官能基を含む病原体不活性化化合物で処理される。病原体不活性化化合物で処理される前、それと同時に、またはその後、生体材料は、求電子基と共有結合的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで処理される。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。
【００６５】
好ましくは、病原体不活性化化合物は、クエンチャーと比較して、求電子基を形成する前に、実質的に速度論的に膜を通り抜ける。病原体不活性化化合物はまた、好ましくは、求電子基の形成前の病原体不活性化化合物と比較して、求電子基の形成後、実質的に速度論的に膜を通り抜けない。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の求電子基と反応することが可能であり、そしてクエンチャーの病原体不活性化化合物の求電子基との反応は、実質的に第一相で生じる。求電子基を含む病原体不活性化化合物は、病原体膜内の第二相で病原体の核酸と反応し、それにより病原体を不活性化する。膜は、例えば、脂質を含み得る。病原体は、例えば、膜を規定する脂質被覆を含むウイルスであり得、ここで第二相は、脂質被覆の内部により規定される。病原体はまた、２相系の膜を規定する脂質を含む細胞膜を含むバクテリアであり得、ここで第二相は、細胞膜の内部により規定される。
【００６６】
有利なことには、２相系において、クエンチャーは第一相へ投与され、そして実質的に病原体の膜を通り抜け得ない。病原体不活性化化合物は、例えば、第一相へ投与される。病原体不活性化化合物は、求電子基の形成前に、膜を通り抜けて第二相へ移り得る。インサイチュでの求電子基の形成に際して、病原体不活性化化合物は、実質的にもはや膜を通り抜け得ない。従って、クエンチは選択的に第一相において生じ、一方で第二相、すなわち病原体の内部において、病原体不活性化化合物はクエンチされることなく病原体の核酸と反応する。従って、血液製剤のような生体材料において、病原体不活性化化合物およびその分解生成物上の反応基のクエンチは、病原体が懸濁している第一相において選択的に生じる。従って、第一相におけるクエンチは、第一相において病原体不活性化化合物上の反応基の望まない副反応（例えば、血液中のタンパク質の共有結合的改変）を減少する。この方法において、病原体不活性化化合物およびクエンチャーは、病原体不活性化化合物の望ましくない副反応をクエンチしながら、材料中の病原体を不活性化するのに有効な量で投与される。従って、クエンチャーは、病原体不活性化を生じさせながら、血液製剤のような材料中の望まない副反応を減少させるということにおいて、保護的効果を有する。
【００６７】
グルタチオンは、それをクエンチャーとして特に有用にする多くの性質を有する。それは、通常全ての細胞型に存在する。それは、バクテリアおよび脂質外被ウイルスの細胞膜または脂質被覆のような膜を受動的に通過し得るとは、実質的に思われない。ｐＨ７において、グルタチオンは電荷を帯び、そして能動輸送が存在しない場合、脂質二重層を有意の程度で透過しない。このことは、ＶＳＶおよびグルタチオンにより実質的に影響を受けない他の外被ウイルスのウイルス不活性と矛盾しない。ＨＩＶおよびＶＳＶのような脂質外被ウイルスの不活性化は、グルタチオンまたはＮ−アセチルシステイン、２個のチオールクエンチ剤の存在により影響されない。グルタチオンはウイルス不活性化においてほとんど効果が無く、そして一方でそれはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化にいくらか効果を有する。これは加えられるクエンチャーの用量を最小限にすることにより操作され得る。例えば、約２〜４ｍＭのグルタチオンの存在は、約１〜２ ｌｏｇ殺傷で、０．３ｍＭ ＰＩＣ−１によるＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化を減少させる。グルタチオンはまた、赤血球のインビトロ貯蔵と両立し得る。
【００６８】
実質的に、処理後に赤血球機能に損傷を与えないか、または赤血球を改変せず、かつまた実質的に病原体不活性化化合物による病原体不活性化を減少させないクエンチャーが好ましい。赤血球機能へ実質的に損傷を与える効果のないことは、赤血球機能の試験について当該分野で公知の方法により測定され得る。例えば、細胞内ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、細胞内２，３−ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセロール）、または細胞外カリウムのような指標の濃度が測定され、そして未処理のコントロールと比較され得る。さらに、溶血、ｐＨ、ヘマトクリット、ヘモグロビン、浸透圧脆弱性、グルコース消費量、および乳酸生成が測定され得る。
【００６９】
ＡＴＰ、２，３−ＤＰＧ、グルコース、ヘモグロビン、溶血、およびカリウムを測定するための方法は、当該分野で利用可能である。例えば、Ｄａｖｅｙら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３２：５２５〜５２８（１９９２）を参照のこと（その開示は、本明細書中で援用される）。赤血球機能を測定するための方法もまた、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、５８：９４〜９９（１９９０）；Ｈｏｇｍａｎら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、６５：２７１〜２７８（１９９３）；およびＢｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、第５９巻（１９８２）において記載される（これらの開示は、本明細書中参考として援用される）。細胞外カリウム濃度は、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ６１４Ｋ+／Ｎａ+ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定され得る。ｐＨは、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ２３８ Ｂｌｏｏｄ Ｇａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定され得る。
【００７０】
グルタチオンのようなクエンチャーの存在下、赤血球を、核酸結合リガンドおよびマスタード基を含む病原体不活性化化合物で処理する方法において、好ましくは、１つの実施態様において、細胞外カリウムの濃度は、１日後、未処理のコントロール中に示される量の３倍よりも大きくはなく、より好ましくは２倍以下である。
【００７１】
また、１つの実施態様において、病原体不活性化の間、溶血または他の損傷のような赤血球の望ましくない改変を阻害するクエンチャーが好ましい。好ましくは、処理された赤血球の溶血は、２８日貯蔵後に３％未満、より好ましくは４２日貯蔵後に２％未満、そして最も好ましくは４℃で４２日貯蔵後に約１％未満またはそれと等しい。
【００７２】
赤血球への、ＩｇＧ結合のようなタンパク質結合を減少し得、かつクエンチャーの不在下行われたコントロールと比較して病原体不活性化を実質的に阻害しない条件下で使用され得るクエンチャーが好ましい。病原体不活性化化合物の赤血球表面への結合を阻害するクエンチャーもまた好ましい。例示的なクエンチャーはグルタチオンである。グルタチオンは、病原体不活性化化合物による赤血球の潜在的な改変を、有利に減少する。
【００７３】
ＩｇＧ、アルブミン、およびＩｇＭのような種の赤血球への結合もまた、当該分野で利用可能な方法を使用して測定され得る。１つの実施態様において、クエンチャーの存在下、核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物で赤血球を処理する方法において、ＩｇＧの赤血球への結合は、クエンチャーの不在下におけるＩｇＧの結合と比較して減少し得る。グルタチオンのようなクエンチャーおよび病原体不活性化化合物の存在下のＩｇＧの赤血球への結合は、好ましくは、クエンチャーの不在下のＩｇＧ結合の約７５％未満、または好ましくは約５０％未満である。
【００７４】
赤血球への分子の結合は、例えばアクリジンおよびＩｇＧに対する抗体を使用して検出され得る。アッセイにおいて使用するための抗体は、市販で入手され得るか、または当該分野で利用可能な方法を使用して作られ得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，」１９８８において記載される（この開示は本明細書中参考として援用される））。例えば、抗−ＩｇＧは、Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、およびＬａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｉｐｅｒｓｖｅｌｌｅ、ＰＡから市販されている。
【００７５】
病原体不活性化化合物またはそのフラグメントの赤血球への結合を減少させるクエンチャーが好ましい。赤血球を含む生体材料が、マスタード基のようなエフェクターおよびアクリジン基のような核酸結合基を含む病原体不活性化化合物で処理される実施態様において、病原体不活性化化合物またはそのフラグメントの赤血球への結合は、減少され得る。例えば、病原体不活性化化合物から誘導されるアクリジン（ここで核酸結合リガンドがアクリジンである）の赤血球への結合は、グルタチオンのようなクエンチャーの存在下減少され得る。好適な実施態様において、クエンチャーの存在下、アクリジン基を含む病原体不活性化化合物で処理された赤血球へのアクリジンの結合は、クエンチャーの不在下のアクリジン結合の、約７５％未満、または好ましくは約５０％未満、または別の好適な実施態様において、約５％未満である。
【００７６】
１つの実施態様において、病原体不活性化後、反応性求電子アルキル化種の濃度を、例えば、約１〜４８時間以内、例えば約２４時間で、少なくとも約５％、または約２０％、または必要に応じて約５０％、またはそれより多く減少させるクエンチャーが提供される。反応性求電子種の存在は、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）を含むクロマトグラフィー法のような当該分野で利用可能な方法を使用して、測定され得る。
【００７７】
１つの実施態様において、病原体不活性化化合物による病原体の不活性化を、クエンチャーの不在下行われたコントロールの病原体不活性化と比較して、約１ ｌｏｇより多く、または約２ ｌｏｇより多く、または必要に応じて、約３ ｌｏｇより多く、あるいは別の実施態様において４ ｌｏｇよりも多くは決して減少させないクエンチャーがまた、好ましい。好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物によるウイルス性病原体の不活性化を、クエンチャーの不在下行われたコントロールの病原体不活性化と比較して、約１ ｌｏｇよりも多く、または約２ ｌｏｇよりも多く、または必要に応じて約３ ｌｏｇよりも多くは決して減少させない。病原体不活性化化合物およびクエンチャーの濃度は、所望のｌｏｇ殺傷を得るように、およびクエンチャーの存在により生じ得る不活性化の減少を最小限にするように調製され得る。
【００７８】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、赤血球含有材料を、有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで、赤血球機能は、処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、材料を、有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで、赤血球の溶血は、処理後２８日の貯蔵後、３％未満である。
【００７９】
グルタチオンで処理された赤血球は、未処理のコントロールと比較して、赤血球機能において有意な差異を示さない。グルタチオンそれ自身は、インビボまたはインビトロ機能アッセイにより測定されるように、有意な程度に赤血球溶解または他の損傷に寄与しない。グルタチオンは、病原体不活性化化合物の存在下の赤血球溶解を減少させ得る。赤血球は、インビトロまたはエキソビボでグルタチオンで処理され得る。チオ硫酸、ＭＥＳＮＡ、およびＮ−アセチルシステインのようなある化合物は、クエンチのために有効な濃度で活性ではないか、または赤血球を改変し得るかのいずれかである。
【００８０】
（病原体不活性化およびクエンチの条件）
生体材料を病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して望まない副反応を減少させるための条件は、選択された材料、クエンチャーおよび不活性化する化合物に基づいて選択され得る。種々の生体材料が、例えばインビトロまたはエキソビボで、病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理され得る。条件は、生体材料を実質的に変化させない一方で、病原体不活性化を生じさせるように選択される。
【００８１】
好適な実施態様において、血液製剤は、核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物で不活性化され、ここでマスタード基はインサイチュで反応性求電子基を形成し得る。血液製剤は、クエンチャーで処理されて、血液製剤の性質に有意に影響することなく、病原体不活性化化合物の望まない副反応を防止する。クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、後、またはそれと同時に加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に血液製剤に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは病原体不活性化化合物を加えた前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。赤血球含有材料は、例えばインビトロまたはエキソビボで処理され得る。
【００８２】
処理される血液製剤中の病原体不活性化化合物およびクエンチ剤の濃度は、赤血球機能のような材料の性質を依然保護しながら、そしてまた病原体の所望のｌｏｇ殺傷を達しながら、望まない副反応の所望の減少を生じるために必要とされるのに応じて、調製され得る。
【００８３】
クエンチャーの濃度は、１つの非制限的例では、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜３０ｍＭであり得る。赤血球の処理に適した条件の非制限的例は、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭのグルタチオン、例えば、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約２ｍＭ〜４ｍＭのグルタチオン、あるいは１つの実施態様において約１ｍＭ〜３ｍＭである。
【００８４】
クエンチャー：病原体不活性化化合物のモル比は、１つの非制限的実施態様において、約１００：１〜１：１、例えば約５０：１、または例えば約１０：１の範囲であり得る。赤血球の処理のために使用され得る、グルタチオン：病原体不活性化化合物の非制限的例示的な比は、約１００：１〜１：１、例えば約５０：１〜１：１、または別の実施態様において、約１０：１〜約２：１であり得る。１つの好適な実施態様において、グルタチオン：病原体不活性化化合物のモル比は約１０：１である。例えば、赤血球を含む組成物の処理において、グルタチオンのモル濃度は、好ましくは、病原体不活性化化合物のモル濃度の約５〜２０倍、例えば約１０倍である。クエンチャーの病原体不活性化化合物に対する比は、選択された病原体不活性化化合物およびクエンチャーに依存して変化し得る。
【００８５】
核酸結合リガンドおよびマスタード基のようなエフェクターを含む病原体不活性化化合物の典型的な濃度は、約０．１μＭ〜５ｍＭ、例えば約５０〜５００μＭのオーダーである。例えば、サンプル中の病原体の、少なくとも約１ ｌｏｇ、例えば少なくとも約３〜６ ｌｏｇ、または必要に応じて少なくとも約５〜６ ｌｏｇを不活性化するのに十分である、病原体不活性化化合物の濃度が使用され得る。１つの実施態様において、好ましい病原体不活性化化合物は、約５００μＭよりも決して多くない濃度で少なくとも１ ｌｏｇ殺傷を、より好ましくは約５００μＭよりも決して多くない濃度で少なくとも３ ｌｏｇ殺傷を生じるものである。別の非制限的な例において、病原体不活性化化合物は、約０．１μＭ〜約３ｍＭの濃度において少なくとも１ ｌｏｇ殺傷を、好ましくは少なくとも６ ｌｏｇ殺傷を有し得る。例えば、約０．１５ｍＭのキナクリンマスタードおよび約３ｍＭのグルタチオンの濃度は、赤血球機能を保護しながら、赤血球含有組成物中の２ ｌｏｇより多いＶＳＶおよびＨＩＶを不活性化するために使用され得る。
【００８６】
１つの好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、赤血球含有材料を有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで赤血球機能は処理により実質的に変更されない。別の好適な実施態様において、ある方法が提供され、ここでその方法は、材料を有効量の病原体不活性化化合物およびクエンチャーで処理して病原体の少なくとも２ ｌｏｇを不活性化する工程を含み、そしてここで赤血球の溶血は貯蔵の２８日後で３％未満である。
【００８７】
病原体不活性化化合物およびクエンチャーとの血液製剤のインキュベーションは、例えば少なくとも約０．５〜４８時間またはそれより多く、例えば少なくとも約１〜４８時間、または少なくとも約１〜２４時間、あるいは、例えば少なくとも約８〜２０時間行われ得る。別の実施態様において、インキュベーションは、さらに材料を加工処理または使用するまで続く。
【００８８】
クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、それと同時に、またはその後に血液製剤のような材料に加えられ得る。好ましくは、クエンチャーは、病原体不活性化化合物の前、またはそれと同時に加えられる。別の好適な実施態様において、クエンチャーは、病原体不活性化化合物を加える前後の約３０分以内、または約１５〜２０分以内に加えられる。
【００８９】
グルタチオンのようなあるクエンチャーは、経時的に酸化されるかまたはそれ以外で分解するか、または反応し得る。例えば、クエンチャーがチオール含有化合物である場合、クエンチャーは酸化されてジスルフィド二量体を形成し得る。クエンチャーがインサイチュで実質的に分解してしまうかまたはそれ以外に反応してしまう前に、クエンチャーが病原体不活性化化合物をクエンチし得るような時および濃度で、クエンチャーを材料へ加えることが好ましい。例えば、クエンチャーがグルタチオンである場合、グルタチオンが病原体不活性化化合物の前に加えられる実施態様において、グルタチオンは好ましくは、病原体不活性化化合物を加える約１２時間未満前に加えられる。好適な実施態様において、グルタチオンは病原体不活性化化合物と同時に加えられる。別の実施態様において、グルタチオンは、病原体不活性化化合物を加えた後、３０分以内に、または約１５〜２０分以内に、または必要に応じて約１０分以内に加えられる。病原体不活性化化合物を加えた時間と近いグルタチオンの添加は、例えば血漿のようなある生体材料中で起こり得る、例えば酸化またはペプチド分解による、グルタチオン濃度の可能な減少を最小限にすることに対して有利である。
【００９０】
赤血球については、インキュベーションは典型的には、約２℃〜３７℃、好ましくは約１８℃〜２５℃の温度で行われる。例えば、クエンチャーがグルタチオンである場合、赤血球は、病原体不活性化化合物およびグルタチオンとともに、約２２℃の温度で約１２時間インキュベートされ得る。血小板については、温度は好ましくは約２０〜２４℃である。血漿については、温度は約０〜６０℃、代表的には約０〜２４℃であり得る。
【００９１】
（生体材料）
種々の生体材料が、病原体不活性化化合物およびクエンチ化合物で処理され得る。クエンチ化合物で処理され得る生体材料は、全血、濃縮赤血球、血小板、および新鮮なまたは凍結した血漿のような血液製剤を含む。血液製剤はさらに、血漿タンパク質部分、抗血友病因子（因子ＶＩＩＩ）、因子ＩＸ、および因子ＩＸ複合体、フィブリノーゲン、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビンおよびトロンビン、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにそれらのフラグメント）、アルブミン、インターフェロン、ならびにリンホカインを包含する。合成血液製剤もまた意図される。
【００９２】
他の生体材料は、ワクチン、組み換えＤＮＡ製造タンパク質、およびオリゴペプチドリガンドを含む。尿、汗、唾液、糞便、脊髄液のような臨床サンプルもまた包含される。さらに合成血液または血液製剤貯蔵媒体が包含される。
【００９３】
（処理後の材料中の化合物の濃度の減少）
血液製剤のような生体材料中の病原体不活性化化合物および／またはクエンチャーの濃度は、処理後、例えばバッチ中への吸着またはフロー除去プロセスにより減少され得る。使用され得る方法および装置は、ＰＣＴ ＵＳ９６／０９８４６；米国特許出願番号第０８／７７９、８３０号（１９９７年１月６日出願）；および同時出願において、米国特許出願番号第０９／００３，１１３号（１９９８年１月６日出願）において記載される（これらのそれぞれの開示は、その全てにおいて参考として本明細書中で援用される）。
【００９４】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参考にすることにより、さらに理解される。
【００９５】
（材料）
以下の材料を、以下の実施例において使用した。
【００９６】
Ａｄｓｏｌは、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬから市販されているが、今回および以下の実験において使用されたＡｄｓｏｌは、以下の混合物を滅菌濾過することにより作成した：１リットルの蒸留水中、２２ｇのグルコース、９ｇのＮａＣｌ、７．５ｇのマンニトール、および０．２７ｇのアデニン。
【００９７】
エリトロゾルは、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬから入手したか、または１リットルの蒸留水中、クエン酸ナトリウム二水和物（７．８２ｇ）；酸性リン酸ナトリウム二水和物（０．７３ｇ）；リン酸ナトリウム二水和物（３．０３ｇ）；アデニン（０．２２ｇ）；マンニトール（７．７４ｇ）；およびグルコース（９ｇ）を混合することにより作製した。
【００９８】
キナクリンマスタードは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。グルタチオンおよびシステインは、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した。ＰＩＣ−１（β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル）は、米国仮出願番号第６０／０４３，６９６号（１９９７年４月１５日出願）に記載されるとおりに合成した（この開示は本明細書中で援用される）。ＰＩＣ−２（β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルアミド）は、米国特許出願番号第０９／００３，１１５号（１９９８年１月６日出願）に記載されるとおりに合成した（この開示は本明細書中で援用される）。
【００９９】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ＡＴＣＣ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手した（力価８．８ ｌｏｇ単位）。
【０１００】
全血をＳａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ ＣＡ）から入手した。
【０１０１】
濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）を、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから約５５〜６５％のヘマトクリット（ＨＣＴ）で入手したか、または添加溶液としてＡｄｓｏｌまたはＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌを使用して以下のように調製した：受け取りの２０時間以内に、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから受け取った全血の単位を３８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして血漿を別の容器中へ急送した；毛細管を血液サンプルで満たし、そして５分間回転させることにより、％ヘマトクリットを測定した；赤血球により占められる体積を較正曲線と比較した；９４ｍＬのＡｄｓｏｌまたはＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌを加えた；最終のヘマトクリットを処理に応じて５０〜６０％の範囲にした。
【０１０２】
（実施例）
（実施例１：リン酸イオンと病原体不活性化化合物との反応）
リン酸イオンと病原体不活性化化合物との反応性を実証した。反応性は、より高いｐＨ値、より高い温度、そしてより高いリン酸イオン濃度となるにつれて増加することが分かった。
【０１０３】
室温（ＲＴ）でｐＨ値の増加する、２５ｍＭリン酸緩衝液での１００μＭ ＰＩＣ−１のインキュベーションにおいて、分解速度の大きな増加を観測した。ｐＨ約６で２５分のｔ1/2と比較して、ｐＨ２．２において、４５０分のｔ1/2を観測した。ＰＩＣ−１のリン酸イオンとの反応は、ＨＰＬＣにより測定されるように、少なくとも２種の観測可能なリン酸中間体を生成する。ＰＩＣ−１の二リン酸エステルはさらに、壊れやすいエステルで加水分解する。ＰＩＣ−１とリン酸イオンとの間の反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析を行なった。反応条件（ｐＨ＝７，リン酸緩衝液）下観測された種は、ジオールの二リン酸エステル、一リン酸エステル、およびクロロヒドロキシ化合物のリン酸エステルであった。
【０１０４】
キナクリンマスタード（これは、壊れやすいリンカーを欠いている）もまた、リン酸イオンと反応する。室温での、１００μＭのキナクリンマスタードと５０ｍＭのリン酸との反応は、３７℃での、１３０ｍＭのリン酸との同一反応よりもゆっくりである（それぞれ、ｔ１／２＝１０分、および３．５分）。このことは、最終生成物のビスホスホエステルのよりゆっくりとした生成、および中間体種のより長い寿命の両方により実証される。
【０１０５】
キナクリンマスタードとグルコース−６−リン酸との反応もまた、ｐＨ＝７．８で容易であった。ＨＰＬＣにより新しい生成物種を観測し、少なくとも１種の付加物がグルコース−６−リン酸と形成されることと一致する。
【０１０６】
（実施例２：チオールおよび他の求核試薬と病原体不活性化化合物との反応） チオール含有化合物グルタチオンと病原体不活性化化合物との反応性を研究した。反応性は、より高いｐＨ値、より高い温度、そしてより高いチオール濃度になるにつれて増加することが分かった。１ｍＭのキナクリンマスタードを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ中、ｐＨ７で、４ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）とともにインキュベートした。さらに、１００μＭのＰＩＣ−１を、室温で、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中、ｐＨ７で、４ｍＭのＧＳＨとともにインキュベートした。キナクリンマスタードおよびＰＩＣ−１とグルタチオンとの反応は、それぞれ５０分および３２分のｔ１／２で生じた。ＰＩＣ−１／ＧＳＨビス付加物を質量分析により同定した。初期の時点でのグルタチオンとの反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析は、グルタチオンモノ付加物／アジリジニウム中間体を同定した。
【０１０７】
チオールと病原体不活性化化合物との反応をまた、チオール基の消滅をモニターすることで追跡し、Ｅｌｌｍａｎ反応を通して測定した。これはＡｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、４：３３（１９７１）において記載されるように行ない、その開示は本明細書中援用される。Ｅｌｌｍａｎ反応は、１：１．９の化学量論で、そしてキナクリンマスタードの分解と一致する時間推移で、２個の２−クロロエチル基を含む化合物（キナクリンマスタード）とチオールとの反応を実証した。これらの結果は、マスタード中心での定量的なグルタチオンの反応性がチオエーテル共有結合を形成することを実証する。
【０１０８】
他のチオールがＰＩＣ−１と反応することを見出し、これにはＮ−アセチルシステイン、システイン、ホモシステイン、ジペプチドＧｌｙＣｙｓ、アミノエタンチオール、ジメチルアミノエタンチオール、ジチオトレイトール、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、およびキノリンチオールが含まれる。チオールは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）または（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から市販されている。全ての場合において、中間体種の形成を、反応混合物のＨＰＬＣ分析を通して観測し、そしてスルフヒドリル基の消費をＥｌｌｍａｎ反応を通して観測した。キナクリンマスタードはまた、求核試薬、チオ硫酸、ヒドロスルフィド（ＨＳ-）、およびジチオカルバメートと反応することを見いだした。
【０１０９】
（実施例３：グルタチオンの赤血球膜透過の研究）
グルタチオンの赤血球膜を透過する能力をウイルスの外被に対するモデル膜系として研究した。というのは両者がこのペプチドに対してどのような能動輸送系も欠いているからである。赤血球（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒの濃縮赤血球、ＨＣＴ５５〜６５％）の内側と外とのＧＳＨの分配を、外因性グルタチオンを加えた後の、細胞の内側および外側におけるチオール基の量を測定することにより評価した。表２は、グルタチオン総量（細胞内および上清）および赤血球のグルタチオン細胞内量を３ｍＭのＧＳＨの添加するかまたは添加しない場合の時間の関数として示す。ＧＳＨの濃度は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−２０（Ｂｅｃｋｍａ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）単波長分光計を使用して、４１２ｎｍでの吸光度に基づいて計算した。結果は、両コンパートメント中のスルフヒドリル基の量が一定のままであることを示す。
【０１１０】
【表２】
病原体不活性化剤の添加に続いて１５分後、種々のクエンチャーを加えた効果を研究した。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ＡＴＣＣ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、力価８．８ｌｏｇ単位／ｍＬ）を、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）から入手した、ＨＣＴ５５〜６５％の濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）中に希釈し、そして１５０μＭのキナクリンマスタード（ＱＭ）で処理した。ＱＭを加えて１５分後、種々のクエンチャーを１ｍＭと１０ｍＭとの間の用量で加えた。クエンチャーは、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、チオ硫酸、グルタチオン、およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）であり、これらはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から入手した。４時間室温でインキュベート後、生存能力のあるウイルスをウイルスプラークアッセイで評価した（Ｍａｒｋｕｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５７：３２１〜３３８（１９７４））。
【０１１１】
表３は、インキュベーションの１５分後に加えられた種々のクエンチャーの存在下、１５０μＭのＱＭによるＶＳＶの不活性化の結果を示す。クエンチャーの不在下、ＱＭは３．５ ｌｏｇのＶＳＶを不活性化した。ＡＥＴおよびチオ硫酸は、用量依存性の様式で不活性化を減少させた。グルタチオンもＮＡＣも、いずれもＶＳＶ不活性化の減少を示さなかった。
【０１１２】
【表３】
病原体不活性化化合物と同時に加えられた種々のクエンチャーの効果を研究した。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を、濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）中へ希釈した。次いで、ＰＲＢＣを、１５０μＭのキナクリンマスタード（ＱＭ）、および３ｍＭと３０ｍＭとの間の用量で加えられた種々のクエンチャーで同時に処理した。クエンチャーは、アミノエタンチオール（ＡＥＴ）、チオ硫酸、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、システイン、およびメルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）であり、これらはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から入手した。室温４時間の不活性化後、生存能力のあるウイルスを、ハムスター新生児腎臓（ＢＨＫ）細胞に対するウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）を評価することによるＣＰＥアッセイで、評価した（Ｂａｘｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：３８３〜３９２（１９７６））。
【０１１３】
表４は、１５０μＭのＱＭによるＶＳＶの不活性化を、ＡＥＴ、チオ硫酸、グルタチオン、またはＮＡＣの同時添加で実施した実験の結果を示す。この実験において、ＶＳＶは検出下限まで殺傷され、＞４．０ ｌｏｇが不活性化した。従って、特定のクエンチャーはこの限界により覆い隠されたウイルス不活性化の効果を有し得る。ＡＥＴおよびチオ硫酸は再びウイルス不活性化の有意な阻害を示し、そしてＡＥＴはより強力なインヒビターであった。グルタチオンおよびＮＡＣは、１０ｍＭの濃度までウイルス殺傷に影響する証拠を示さず、そして３０ｍＭで阻害の証拠をいくらか示した。
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
【表５】
ＰＲＢＣ中の病原体不活性化剤によるＨＩＶの不活性化に対するグルタチオンの効果を試験した。ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ添加溶液中ほぼ６０％のヘマトクリットで調製した。セルフリーのＨＩＶ−ＩＩＩBのストック（Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：４９７（１９８４）、ほぼ８ ｌｏｇ／ｍＬ）を加えて、ほぼ７ ｌｏｇ／ｍｌの力価にした。
【０１１６】
ＨＩＶ混入血液のアリコートに、グルタチオンを加えて種々の最終濃度にし、続いて５０μＭのＰＩＣ−１を加えた。サンプルを室温で１２時間インキュベートした。次いで、赤血球をペレットにし、上清フラクション中の残存ウイルスを、ミクロ−プラークアッセイを使用して検出した（Ｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．、２８：２０３０（１９９０））。ＨＩＶ生存能力におけるグルタチオンの効果を測定するために、コントロールサンプルをグルタチオンのみでインキュベートした。
【０１１７】
ＰＩＣ−１およびグルタチオンによるＨＩＶの不活性化の結果を表６に示す。表６中のデータは、セルフリーのＨＩＶの不活性化がグルタチオンにより阻害されなかったことを実証する。室温で１２時間のインキュベーションによる、ＨＩＶ感染力のいくらかの損失、ほぼ０．２ ｌｏｇがあった（サンプル１対サンプル３）。３０ｍＭのグルタチオン単独は、さらに０．３〜０．６ ｌｏｇで感染力を減少させることを示した（サンプル１および３と比較したサンプル２および４）。５０μＭのＰＩＣ−１のみで、不活性化は約１．８ ｌｏｇであった；５０μＭのＰＩＣ−１＋３０ｍＭのグルタチオンは、約２．４ ｌｏｇで不活性化した。不活性化における明らかな増加が、グルタチオンそれ自身の効果により完全に説明され得る。０．１ｍＭ〜３０ｍＭのグルタチオンの範囲中にわたり、ＨＩＶ不活性化においてわずかな増加が存在し、これはＨＩＶに対するグルタチオンのみの効果と一致する。
【０１１８】
【表６】
赤血球サンプル中のＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活性化に対するクエンチャーグルタチオンおよびシステインの効果を試験した。ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ中で調製し、そしてＹｅｒｓｉｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、（血液の一般的なグラム陰性バクテリア混入物）でスパイクした。サンプルを、表７に示されるように、１５０μＭのＰＩＣ−１およびクエンチャーで調製した。ＰＩＣ−１を、クエンチャーのほぼ５分後に加えた。室温で４時間インキュベート後、バクテリアの力価を、栄養寒天に希釈物を置き、そして３７℃で一晩培養することにより測定した。
【０１１９】
表７は、１５０μＭのＰＩＣ−１でのＹｅｒｓｉｎｉａの不活性化に対するＧＳＨおよびシステインの効果を示す。１６ｍＭの濃度で、グルタチオンまたはシステイン単独のいずれもＹｅｒｓｉｎｉａの力価にどのような効果も有さなかった（サンプル３および１０）。しかしながら、クエンチャーを用いる不活性化において用量依存性の減少があった。不活性化は１６ｍＭのクエンチャーで４〜４．５ ｌｏｇで阻害された（サンプル９および１６）が、しかし阻害は２ｍＭのクエンチャーで１ ｌｏｇ未満であった（サンプル６および１３）。
【０１２０】
【表７】
赤血球サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）の不活性化に対するグルタチオンの効果を試験した。ＰＲＢＣをＡｄｓｏｌ中で調製し、そしてＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでスパイクした。サンプルを、表８に示されるように、７５μＭのＰＩＣ−１およびクエンチャーのグルタチオンで調製した。ＰＩＣ−１を、クエンチャーのほぼ５分後に加えた。室温で４時間インキュベート後、バクテリアの力価を、栄養寒天に希釈物を置き、そして３７℃で一晩培養することにより測定した。
【０１２１】
表８は、７５μＭのＰＩＣ−１および種々の量のＧＳＨでの、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活性化を示す。表８に示される結果は、グルタチオンがある程度までバクテリアの不活性化を阻害するという観察と一致する。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、明らかに、Ｙｅｒｓｉｎｉａよりもグルタチオンのクエンチに対して敏感ではない。
【０１２２】
【表８】
【０１２３】
（実施例９：赤血球を含む材料中の病原体不活性化化合物の望ましくない副反応を減少させることに対するクエンチャーの効果の研究）
グルタチオンおよびシステインの、ＩｇＧ、アルブミン、および病原体不活性化化合物の赤血球への結合に対する効果を試験した。ＰＩＣ−１のような、核酸結合リガンドおよびマスタード基のような反応性基を含むある病原体不活性化化合物での赤血球の処理は、ＩｇＧの赤血球表面への低レベルの共有結合を導き得る。ＩｇＧの量は一般に、Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎｔｉｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｔｅｓｔ（ＤＡＴ）において陽性の結果を生じるために要求されるレベルの下である（Ｗａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｈ．編、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、第１０版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ、１９９０）。しかしながら、クエンチャーを含むことは、タンパク質の結合を減少または除去し得る。その上さらに、ＰＩＣ−１のアクリジン部分を認識するポリクローン性抗体混合物を使用して、クエンチャーが含まれる場合に病原体不活性化化合物の赤血球表面への結合が減少される。
【０１２４】
ＰＲＢＣを、Ａｄｓｏｌ中、６０％のヘマトクリットで調製した。ＰＩＣ−１での処理前、グルタチオンまたはシステインのいずれかを０．５および１６ｍＭの間の濃度で加え、そしてサンプルを混合した。ＰＩＣ−１を１ｍＭまで加え、そしてサンプルを室温で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプルの２０μｌを１ｍＬの血液銀行生理食塩水で３回洗い、そして最終容積０．４ｍＬに再懸濁した。
【０１２５】
抗アクリジン抗体を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，」１９８８において記載されるように調製した（この開示は本明細書中援用される）。ヤギ抗マウスＩｇＧおよび抗ヒトアルブミン抗体を、Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手した。
【０１２６】
分析のために、希釈し洗浄した赤血球の５０μＬアリコートを４本の管に等分し、そして抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトアルブミン、または抗アクリジン抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１．０ｍＬの血液銀行生理食塩水で洗った。抗ヒト抗体を、フルオレセインで共有結合的に標識し、そしてサンプルをフローサイトメーターを使用して直接分析した。抗アクリジン抗体を検出するために、サンプルを２度目に洗浄し、次いでフルオレセイン標識化ヤギ抗マウスＩｇＧとともに３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを分析前に、先のように洗った。
【０１２７】
分析のために、サンプルをＨａｅｍａｌｉｎｅ２（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）溶液中に１：１で希釈し、そして赤血球識別に最適化された設定の散乱でＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。２００００の蛍光発光を、１サンプルあたり収集した。
【０１２８】
表９は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジンの赤血球への結合に対するグルタチオンおよびシステインの効果を示す結果を例示する。ＰＩＣ−１単独での処理は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジンのシグナルの明らかな増加を起こした（サンプル１および２）。１６ｍＭのグルタチオンまたはシステインいずれかとのインキュベーションは、未処理のサンプル（それぞれサンプル３および１０）と比較して、蛍光を変化させなかった。いずれかのクエンチャーの存在下、ＰＩＣ−１での処理は、ＩｇＧ、アルブミン、およびアクリジン結合のレベルにおいて用量依存性の減少を引き起こした。ＩｇＧおよびアルブミン結合の両方が、≧２ｍＭのクエンチャーの存在下での、バックグラウンドレベルにあるもであることを示した（サンプル６および１３）。アクリジン結合は、対照的に、試験された範囲全てにわたって、クエンチャー濃度に依存した。１６ｍＭのグルタチオンまたはシステインであっても、アクリジンシグナルを完全に排除しなかった。４ｍＭのグルタチオンで、アクリジンシグナルは５３倍減少した（サンプル２対サンプル７）；４ｍＭのシステインで、アクリジンシグナルは８３倍減少した（サンプル２対サンプル１４）。０．３ｍＭのＰＩＣ−１を使用する平行研究において、タンパク質およびアクリジンの結合の初期レベルはＰＩＣ−１のより低い濃度のために減少されているが、グルタチオンを使用して類似の傾向が見られた。
【０１２９】
【表９】
赤血球の性質に対するグルタチオンの任意の効果を測定するために、以下の実験を二重に行った。４単位のＡＢＯ−一致全血をプールし、混合し、次いで４個の血液バッグ中へ再分配して同一の５００ｍＬ単位を作った。ＰＲＢＣを、添加溶液としてＡｄｓｏｌを使用して調製した。受け取りの２０時間以内に、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから受け取った全血の単位を３８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして血漿を別の容器中へ急送する。％ヘマトクリットを、毛細管を血液サンプルで満たし、そして５分間回転させることにより測定する。赤血球により占められる容積を、較正曲線と比較する。９４ｍＬのＡｄｓｏｌを加える。最終ヘマトクリットは、処理に応じて５０〜５３％の範囲であった。
【０１３０】
各実験において、４種の条件を試験した：（１）コントロール、ＰＩＣ−１無し、およびグルタチオン無し；（２）３ｍＭのグルタチオンのみ；（３）０．３ｍＭのＰＩＣ−１のみ；および（４）０．３ｍＭのＰＩＣ−１＋３ｍＭのグルタチオン。コントロールを含む全ての単位を、２０℃で１４時間インキュベートした。次いで、ＰＲＢＣを継続のために４℃の貯蔵所へ移した。サンプルを、処理に続いて直ちに、およびそれ以降約１週間を基準に、分析のために採取した。２，３−ＤＰＧ、ＡＴＰ、および溶血の結果は、表１０および１１に要約される。これらのデータは、コントロールと比較してどの処理の間にも有意の差異を実証しなかった。細胞外カリウム、細胞内グルタチオン、浸透圧脆弱性、グルコース消費、および乳酸生成の測定もまた、グルタチオンが、単独またはＰＩＣ−１とともにのいずれでも、赤血球のインビトロ性質を有意に変更しないことを確実にした。
【０１３１】
細胞外カリウムレベルは、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ６１４Ｋ+／Ｎａ+ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定した。溶血を、Ｈｏｇｍａｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３１：２６〜２９（１９９１）において記載されるように測定した。細胞内グルタチオンを、Ｂｅｕｔｌｅｒ、「Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、ＧｒｕｎｅおよびＳｔｒａｔｔｏｎ、第３版、１９８４に記載されるように測定した。２，３−ＤＰＧおよびＡＴＰは、それぞれＳｉｇｍａ手順第６６５および３６６（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して測定した。グルコース消費および乳酸生成を、それぞれＳｉｇｍａ手順第１１５および７３５（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して測定した。浸透圧脆弱性を、Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、第５９巻（１９８２）に記載されるように測定した。
【０１３２】
【表１０】
【表１１】
ビオチン標識化ネズミ赤血球（ＲＢＣ）のインビボ回収および生存に対する、０．６ｍＭのＰＩＣ−２の、６．０ｍＭのＧＳＨありおよび無しでの効果を研究した。マウスＲＢＣを標識し、次いでＰＩＣ−２、ＰＩＣ−２＋グルタチオン、またはグルタチオンのみで処理した。処理済み標識化細胞を、レシピエント中に注入した。これらの細胞の循環を、フローサイトメトリーにより３６日にわたって追跡した。標識のみのコントロールと比較して、いずれの処理済みＲＢＣの回収または寿命にも差異は観測されなかった。データは、処理におけるグルタチオンがインビボＲＢＣ機能と適合性であること、およびＰＩＣ−２処理それ自身が赤血球に損傷を与えないことを実証する。
【０１３４】
ドナーマウス（ＢＡＬＢ／ｃ オス）に、１日目および２日目に０．１ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を注入した。第二の注入の１時間後に、少量の、各マウスからのビオチン標識化全血を、ストレプトアビジン、Ｒ−フィコエリトリン複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）と反応させ、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で蛍光細胞の割合を測定することにより、標識化効率をチェックした。≧９０％の標識化ＲＢＣを有するマウス全てを、ドナーマウスとして使用した。
【０１３５】
ドナーマウスから、心臓穿刺により血液を採取し、そして１２８２×ｇで６分間で１回回転させた。血漿を除去し、そしてＰＲＢＣを、室温で１４時間、±０．６ｍＭのＰＩＣ−２±６．０ｍＭのＧＳＨでインキュベートした。次の朝、ＲＢＣを洗浄し、そしてＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁した。洗浄したＲＢＣの％ビオチン標識化を、上記のように測定した。ＲＢＣの総数を、細胞計数器（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｕｎｔ Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）でＣＢＣ（全血球計算）を行うことにより測定した。
【０１３６】
次いで、洗浄したＲＢＣをレシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ メス）へ輸注した。各マウスは≒８００×１０6のビオチン標識化ＲＢＣを受けた。輸注の時点で各マウスの重量を計り、そして標識化ＲＢＣ／マウスの真の割合を、マウスの重量に基づいて計算し、そのＲＢＣをＣＢＣにより測定されたように計数し、そして輸注された標識化ＲＢＣの割合を上記のように決定した。
【０１３７】
標識化ＲＢＣの生存割合を、１時間、および１日〜４０日で測定した。結果を、１時間での生存割合＝１００％を使用することにより規格化した。全てのマウスについて１時間での標識化ＲＢＣの真の回収％は、１０５．８±１７．５％であった。結果を、標識化ＲＢＣ静脈注射の効率における差異を斟酌するために１時間での％生存＝１００％に規格化した。
【０１３８】
ＰＩＣ−２処理済みＲＢＣ生存は、実験全てにわたり実質的にコントロールと同じであった。平均中央生存値を、図１に示した。データは、ＰＩＣ−２での処理が、グルタチオンありまたは無しのいずれでもＲＢＣ生存に対して有意の効果を持たなかったことを示唆する。従って、グルタチオンは処理後の赤血球のインビボ循環と適合する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、グルタチオンおよび病原体不活性化化合物で処理した後、生存しているネズミ赤血球を示すグラフである。
Claims (27)
- 血液製剤中の病原体をインビトロまたはエキソビボで不活性化するための方法であって、該方法は以下の工程：
求電子基であるかまたは求電子基を形成し得る官能基と、核酸結合リガンドとを含む病原体不活性化化合物の有効量で、血液製剤をインビトロまたはエキソビボで処理する工程であって、該病原体不活性化化合物は病原体を不活性化するために光活性化を必要としない、工程；および
該求電子基と共有結合的に反応し得る求核基を含むクエンチャーで、該血液製剤をインビトロまたはエキソビボで処理する工程；
を包含し、
該病原体不活性化化合物および該クエンチャーが、該血液製剤中の病原体を不活性化するために有効な量で投与されることを特徴とし、
該病原体不活性化化合物は、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、またはキナクリンマスタードであり、
該求核基はチオールである、
方法。 - 前記血液製剤が、全血、赤血球、血漿、および血小板、濃縮赤血球、または３０〜８５％のヘマトクリットを有する血液製剤を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記求電子基が、核酸と反応して該核酸と共有結合を形成する、請求項１〜２のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記病原体不活性化化合物が、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、請求項１〜２のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、メルカプトエタンスルホン酸塩、またはジメルカプロールである、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、濃度０．５〜３０ｍＭのグルタチオンである、請求項５に記載の方法。
- 前記病原体不活性化化合物およびクエンチャーが、少なくとも１〜４８時間、前記血液製剤とともにインキュベートされる、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記病原体不活性化化合物の濃度が０．１μＭ〜５ｍＭである、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、該クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して、３ ｌｏｇ以下、前記病原体不活性化化合物による病原体の不活性化を減少させる、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、該クエンチャーの非存在下で行われるコントロールの病原体不活性化と比較して、１ ｌｏｇ以下、前記病原体不活性化化合物によるウイルス性病原体の不活性化を減少させる、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが前記求核基を含む固体支持材料を含む、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記クエンチャーが、前記病原体活性化化合物の添加の後に、前記血液製剤へ加えられることを特徴とする、方法。
- 前記クエンチャーが、前記病原体活性化化合物の添加の前、またはそれと同時に、またはその添加後２０分以内に、前記血液製剤へ加えられる、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記血液製剤が赤血球を含み、赤血球機能が前記処理後に実質的に変更されない、請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記血液製剤が赤血球を含み、前記方法が、
少なくとも２ ｌｏｇの病原体を不活性化するのに有効な量の前記病原体不活性化化合物および前記クエンチャーで、該材料を処理する工程
を含み、そして赤血球機能が該処理により実質的に変更されない、
請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。 - 前記血液製剤が赤血球を含み、該赤血球の溶血が、処理後２８日の貯蔵後３％未満である、請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、
少なくとも２ ｌｏｇの病原体を不活性化するのに有効な量の前記病原体不活性化化合物および前記クエンチャーで、前記血液製剤を処理する工程
を含む、請求項１〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法。 - 前記病原体不活性化化合物の濃度が、前記血液製剤中の病原体の少なくとも３〜６ ｌｏｇを不活性化するのに十分である、請求項１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記処理の後、前記血液製剤が個体中への導入に適した状態である、請求項１〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、
病原体を含む血液製剤を処理する工程
を含む、請求項１〜１９のうちのいずれか１項に記載の方法。 - 前記病原体が、原核生物または真核生物、または脂質被覆ウイルスである、請求項２０に記載の方法。
- 請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
前記病原体不活性化化合物は、前記求電子基の形成前に、該クエンチャーと比較して、速度論的に膜を通り抜け得；そして
ここで、該病原体不活性化化合物は、該求電子基の形成前の該病原体不活性化化合物と比較して、該求電子基の形成後、該膜を実質的に速度論的に通り抜け得ない、方法。 - 前記方法が、
前記病原体不活性化化合物と前記クエンチャーとを反応させる工程
を含み、そしてここで、該クエンチャーは、実質的に前記第一相において、該病原体不活性化化合物の求電子基と反応する、請求項２２に記載の方法。 - 前記求電子基を含む病原体不活性化化合物を、前記病原体の核酸と反応させ、それにより該病原体を不活性化させる工程
を含む、請求項２２または２３に記載の方法。 - 前記膜が脂質を含む、請求項２２〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、前記求電子基の形成前の前記病原体不活性化化合物と比較して、実質的に速度論的に前記膜を通り抜け得ない、請求項２２〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法。
- 前記血液製剤の処理後の該血液製剤中の前記病原体不活性化化合物およびクエンチャーのうちの少なくとも１種の濃度を、個体への導入に適した製剤を得るように減少させる工程、
を含む、請求項１〜２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
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