JP4639629B2 - 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 - Google Patents
偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4639629B2 JP4639629B2 JP2004126494A JP2004126494A JP4639629B2 JP 4639629 B2 JP4639629 B2 JP 4639629B2 JP 2004126494 A JP2004126494 A JP 2004126494A JP 2004126494 A JP2004126494 A JP 2004126494A JP 4639629 B2 JP4639629 B2 JP 4639629B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- dna
- activity
- ribonucleic acid
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title description 92
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title description 79
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 40
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 80
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 66
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 48
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 26
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 26
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 25
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 claims description 19
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 18
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 14
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims 11
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 8
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 3
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- -1 that is Proteins 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、および該組成を用いたリボ核酸の増幅方法ならびに該方法を使用するための試薬またはキットに関する。
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法に代表される核酸増幅法は、特定の配列を有する核酸を短時間で特異的に検出する目的において優れた方法である。しかし、ＰＣＲ法による増幅の鋳型となる核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の形で提供される必要があるため、リボ核酸（ＲＮＡ）を対象とする場合は、直接、ＰＣＲ法によって増幅することはできない。ＲＮＡをＰＣＲ法により検出するためには、ＲＮＡが有する遺伝情報を逆転写活性を有する酵素などを用いてＤＮＡに変換する必要がある。このような逆転写とＰＣＲを組み合わせた方法においては、特にＲＮＡのみが検出対象である場合、特定の予防処理をしない限り、ＲＮＡ試料に混入したＤＮＡによって肯定的な結果が導かれることによる偽陽性が大きな問題となる。
上記問題を解決するための１つの可能性は接合プライマーの使用である。接合プライマーは、ゲノムＤＮＡがＲＮＡに転写されるエキソン配列と、プロセシングによりＲＮＡに転写されないイントロン配列を含むことを利用し、その５'末端がエキソンの５'末端の配列に相補的で、その３'末端が隣接したエキソンの３'末端のヌクレオチドに相補的だが、ゲノム上の該２つのエキソンの間に位置するイントロンの３'末端のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドを含むように配列が選択されたオリゴヌクレオチドである。この場合、試料へのＤＮＡの混入による偽陽性は少なくとも部分的に回避できる。しかしながら、該方法では、イントロンを含まない遺伝子に対しては無効である。
さらに、ゲノム上に存在する偽遺伝子は長さにおいて転写されたＲＮＡと同一であるため、ＰＣＲにおいて両者を区別することができないという同じ問題を提示する。このような場合、転写反応の前に試料をＤＮアーゼで処理することが有効である（例えば、非特許文献１および２、参照）。偽陽性を低減させるためのＤＮアーゼの使用に関しては、例えば反応試薬に添加する２価イオンとしてマグネシウムの代わりにマンガンイオンを存在させることでＤＮアーゼを効率的に作用させる、などの改良が行われている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、従来公知のいずれの技術においても、試料をＤＮＡ分解活性を有する酵素と反応させた後、煩雑な抽出操作などにより該酵素を除去したＲＮＡ試料を逆転写反応に供している。すなわち、試料を入手してからリボ核酸の増幅を行うまでに煩雑な偽陽性予防処理を行う必要があり、これは研究や診断の現場において人的または時間的な効率を低下させる要因の一つとなり得る。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、簡便に偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、および該組成を用いたリボ核酸の増幅方法ならびに該方法を使用するための試薬またはキットを提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討したところ、試料に含まれるＤＮＡの分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことが可能な試薬組成を見出した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）少なくとも一種類の酵素を含有することによりＤＮＡ分解活性および逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特徴とする、リボ核酸増幅用試薬組成。
（２）ＤＮＡ分解活性を有する酵素、および逆転写活性および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する少なくとも一種類の酵素を含有することを特徴とする、リボ核酸増幅用試薬組成。
（３）少なくとも一種類の酵素を用いて１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸増幅用試薬組成であって、
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅するための成分を含有する試薬組成。
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅するための成分を含有する試薬組成。
（４）ＤＮＡ分解活性を有する酵素がＤＮアーゼIであることを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
（５）マンガンイオンを含まないことを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
（６）反応容器中にＤＮＡ分解活性を有する酵素、逆転写活性および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を一緒に存在させ、１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸の増幅方法。
（７）少なくとも一種類の酵素を用いて１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸増幅方法であって、下記工程
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅することから成る方法。
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅することから成る方法。
（８）ＤＮＡ分解活性を有する酵素がＤＮアーゼIであることを特徴とする、（６）または（７）に記載のリボ核酸増幅方法。
（９）マンガンイオンを含まないことを特徴とする、（６）から（８）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
（１０）（６）から（９）のいずれかに記載の方法を用いてリボ核酸を増幅するための試薬またはキット。
本発明により、試料に含まれるデオキシリボ核酸の分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことができ、特に研究や診断の現場において人的または時間的な効率を大きく向上させることが可能となる。また、本発明の波及効果として、該現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策を提供することができる。
本発明においてリボ核酸の増幅とは、試料中のリボ核酸から増幅したい核酸（標的核酸）をその固有の配列の相補性を利用して増幅することを指し、具体的には、該リボ核酸を自身に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に変換した後、該ｃＤＮＡを増幅する一連の流れを指す。本発明におけるリボ核酸増幅試薬組成およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法が適用可能な該ｃＤＮＡ増幅の方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法など特に限定されるものではないが、一般的に熱安定性の高い酵素を用いるＰＣＲ法の使用がより好ましい。
RNAを含む試料に混在するDNAによる擬陽性を防止するためには、まずRNAを含む試料に混在するDNAをDNアーゼで分解するが、次のRNAからｃDNAに変換した際にこのDNアーゼが残存している場合にはｃDNAが分解すると考えられていた。しかしながら発明者らの検討によると、逆転写酵素によりｃDNAに変換した際のRNA-ｃDNAハイブリッド状態では、DNアーゼが存在していても分解されることなくｃDNAが維持されることを見出し、さらに、引き続くPCR反応の高温下によってDNアーゼ、逆転写酵素の活性を失活させることができることにをヒントに、各酵素の組み合わせ、各酵素量の最適化、各酵素のいずれもが有効に働く試薬液組成の最適化を検討することにより、本発明を完成させた。
本発明の偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成の好ましい一例としては、まず、（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素、（ｂ）逆転写活性を有する酵素、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、を含むことが好ましい。
さらに、（ｄ）ＲＮアーゼ阻害剤、（ｅ）核酸増幅用プライマー、（ｆ）ｄＮＴＰ、（ｇ）反応バッファー、（ｈ）リボ核酸含有試料などを含むことができる。
さらに、（ｄ）ＲＮアーゼ阻害剤、（ｅ）核酸増幅用プライマー、（ｆ）ｄＮＴＰ、（ｇ）反応バッファー、（ｈ）リボ核酸含有試料などを含むことができる。
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素としては、各種のＤＮＡ依存的エキソヌクレアーゼまたはＤＮＡ依存的エンドヌクレアーゼを使用し得るが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖を分解する活性を有しない酵素の使用が望ましい。具体的にはＤＮアーゼの使用が好ましく、ＤＮアーゼIの使用がより好ましい。該酵素の使用量としては、おおよそ０〜２５℃程度の温度範囲にて６０分以内に偽陽性の原因となる試料中のデオキシリボ核酸を分解し、かつ後工程の酵素反応を阻害しない量であることが必要である。また、RNA-ｃDNAハイブリッドを実質上分解しない量であること、加熱のみで失活させうる量であることが大切である。具体的には、ＤＮアーゼIの場合は５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
（ｂ）逆転写活性を有する酵素としては、従来公知のレトロウイルス、特にモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、ヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、トリ骨髄芽症ウイルス（ＡＭＶ）などに由来する各種の逆転写酵素を特に限定されることなく使用できる。また、レトロウイルス由来の逆転写酵素の多くでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖のＲＮＡを分解する活性、すなわちＲＮａｓｅＨ活性を有することが知られており、この活性の存在はＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する際に鋳型−プライマー複合体の鋳型を分解し、その分解位置がプライマーの３'端に近い場合は鋳型−プライマー複合体が解離されるため伸長性が低下するという結果を招く。このような問題を排除するため、本発明の逆転写活性を有する酵素としては、実質的にＲＮａｓｅＨ活性を有していない逆転写酵素を使用することが好ましい。具体的には、Ｍ−ＭＬＶ由来のＲＮａｓｅＨ活性除去変異体の場合は５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、Ｔ４またはＴ７ファージ、大腸菌、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属など種々の起源のＤＮＡポリメラーゼおよびその改良変異体を特に限定されることなく使用できるが、核酸の増幅方法としてＰＣＲ法を使用する場合はＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性の酵素を使用することが好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。具体的には、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼの場合は１〜２００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１０〜１００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
なお、（ｂ）逆転写活性を有する酵素および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素については逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる代替も可能であり、このような性質の酵素としてはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが最も代表的である。
なお、（ｂ）逆転写活性を有する酵素および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素については逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる代替も可能であり、このような性質の酵素としてはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが最も代表的である。
本発明において、１工程で反応を行うためには、上述の各酵素の組み合わせの相性も考慮することが重要である。具体的な個々の酵素を選択するときには、各酵素が有効に作用するバッファー組成（ｐH、塩濃度等）が共通するもの、近いものを組み合わせることが好ましい。
（ｄ）ＲＮアーゼ阻害剤としては、ヒト胎盤やブタ肝臓などに由来する各種のＲＮアーゼ阻害剤を特に限定されることなく使用でき、５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
（ｅ）核酸増幅用プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好ましく、２００ｎＭ程度がさらに好ましい。
（ｆ）ｄＮＴＰは５０〜１０００μＭ程度を含む。１００〜７００μＭ程度がより好ましく、２００〜４００μＭ程度がさらに好ましい。
（ｇ）反応バッファーについては、本発明のリボ核酸増幅試薬に含まれる酵素の能力を最大限に発揮する目的で、緩衝液や金属塩の濃度、溶液のｐＨなどが適宜選択され得る。
これらは、組み合わせる酵素により、最適な範囲は異なるが、例えば実施例で示したＤＮａｓｅI（ロシュ製）、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）の組み合わせの場合では、ｐＨは室温下で測定した場合に６．５〜９．５、さらには室温下で測定した場合に８．０〜９．０が好ましく、Ｍｇ濃度は１．０ｍＭ〜５．０ｍＭ、さらには１．５〜４．０ｍＭが好ましい。
（ｇ）反応バッファーについては、本発明のリボ核酸増幅試薬に含まれる酵素の能力を最大限に発揮する目的で、緩衝液や金属塩の濃度、溶液のｐＨなどが適宜選択され得る。
これらは、組み合わせる酵素により、最適な範囲は異なるが、例えば実施例で示したＤＮａｓｅI（ロシュ製）、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）の組み合わせの場合では、ｐＨは室温下で測定した場合に６．５〜９．５、さらには室温下で測定した場合に８．０〜９．０が好ましく、Ｍｇ濃度は１．０ｍＭ〜５．０ｍＭ、さらには１．５〜４．０ｍＭが好ましい。
特に、１工程で反応を行うためには、試薬に含まれる酵素のいずれもがその能力を発揮できる試薬組成に調整する必要がある。特にMgは各酵素の依存性が高いため、各酵素の適正濃度範囲にすることが好ましい。なお、やむを得ない場合には反応中に塩などを追加しても良いが、操作性等の面で、反応開始時にはすべての添加物が反応溶液中に含まれる様にすることが好ましい。
また、酵素の安定性を高める目的で、該試薬にウシ血清アルブミンなどの添加剤を適宜混合しても良い。
また、酵素の安定性を高める目的で、該試薬にウシ血清アルブミンなどの添加剤を適宜混合しても良い。
さらに、試薬組成物中のマンガンイオンの含有量は１ｍＭ以下であることが好ましい。マンガンイオンは通常、例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼに代表される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を増強するために添加することがあるが、マンガンイオンの存在は非特異的な増幅やスメア状の増幅を引き起こしやすくなる、または核酸を増幅する効率が低下するなどの理由で好ましくない。
マンガンイオンの含有量はさらに好ましくは０．５ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．１ｍＭ以下であり、 最も好ましくは実質的に含有されないことである。実質的に含有されないとは、非特異的な増幅やスメア状の増幅を引き起こしやすくなる、または核酸を増幅する効率が低下するなどの不具合を生じない量以下である。
マンガンイオンの含有量はさらに好ましくは０．５ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．１ｍＭ以下であり、 最も好ましくは実質的に含有されないことである。実質的に含有されないとは、非特異的な増幅やスメア状の増幅を引き起こしやすくなる、または核酸を増幅する効率が低下するなどの不具合を生じない量以下である。
（ｈ）リボ核酸は本発明において、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの、いずれのリボ核酸であってもよい。また本発明は、イントロンを含まないｍＲＮＡ試料、および偽遺伝子が存在するまたは偽遺伝子が存在するかどうかわからないｍＲＮＡ試料において、特に効果的に作用する。本発明によれば、偽陽性の原因となるデオキシリボ核酸が高度に混入した場合でさえ、リボ核酸を選択的に増幅し得る（実施例１を参照）。したがって、本発明のリボ核酸増幅方法において、完全には精製されていないＲＮＡを含有する試料を用いることが可能である。特にデオキシリボ核酸の含有量は、標的となるリボ核酸に対応するかどうかに関わらず、リボ核酸を増幅するための従来技術にしたがって用いられた試料中の含有量を越えることができる。試料は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。また、リボ核酸は試料中に溶解させてもよいし、固相に固定させてもよい。
増幅反応は、ＤＮＡ分解反応、逆転写反応、ＰＣＲ反応を含む。これらの反応は１ステップで行われることが好ましい。ここで言う１工程とは、これらの反応を途中に抽出・分離工程を入れることなく行うことであり、さらには途中で添加物等を加えることなく行われる行われることが好ましい。特には、測定サンプルを含めた反応溶液を調整した後は、温度コントロールおよび必要に応じて攪拌のみで各反応が順次進められることが好ましい。
以下に、ＤＮＡ分解活性を有する酵素としてＤＮアーゼIを、逆転写活性を有する酵素としてＭ−ＭＬＶ由来のＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）を、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）をそれぞれ用いることを例に挙げて、本発明について具体的に説明する。なお、該発明の最大の新規性は、増幅反応系からＤＮＡ分解活性を有する酵素を除去する工程および途中で酵素を含有する溶液などを添加する工程を省略し、１工程で、偽陰性の原因となり得るＤＮＡの分解から標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ増幅の反応までを行うことにある。したがって、以下に開示する例において構成成分の一部、すなわち酵素の変更または該変更に合わせた試薬組成の改良などは、前述の指針に従えば当業者にとって容易である。したがって、以下の事例は、本発明の内容を何ら限定するものではない。
実施例１
本発明のリボ核酸増幅試薬組成における偽陽性低減効果の確認
（１）試料の調製
ＨｅＬａ細胞よりＲＮＡおよびＤＮＡをそれぞれ抽出した。該核酸を１％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。このとき核酸抽出に用いた細胞数および電気泳動に用いた核酸の量を表１に示し、該電気泳動によって得られた写真を図１に示す。なお、図１のレーン番号は表１のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。
本発明のリボ核酸増幅試薬組成における偽陽性低減効果の確認
（１）試料の調製
ＨｅＬａ細胞よりＲＮＡおよびＤＮＡをそれぞれ抽出した。該核酸を１％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。このとき核酸抽出に用いた細胞数および電気泳動に用いた核酸の量を表１に示し、該電気泳動によって得られた写真を図１に示す。なお、図１のレーン番号は表１のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。
（２）試料に含まれるリボ核酸の増幅
表１におけるサンプル番号１〜４の核酸について、それぞれ電気泳動に用いた量を試料としてＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。反応液組成は、ＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌ、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製、室温下で測定した場合のｐＨが８．６のトリス緩衝液および３．７ｍＭのＭｇを含む）である。 また、Mnイオンの添加は行われていない。ただし、本検討におけるＤＮａｓｅIおよびＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体の有効性を確認する目的で、表２に示すように一部の酵素を添加しない反応液も用意した。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液を添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
表１におけるサンプル番号１〜４の核酸について、それぞれ電気泳動に用いた量を試料としてＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。反応液組成は、ＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌ、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製、室温下で測定した場合のｐＨが８．６のトリス緩衝液および３．７ｍＭのＭｇを含む）である。 また、Mnイオンの添加は行われていない。ただし、本検討におけるＤＮａｓｅIおよびＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体の有効性を確認する目的で、表２に示すように一部の酵素を添加しない反応液も用意した。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液を添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
ＤＮＡ分解反応 ４℃、１５分
逆転写反応 ４２℃、２０分
ＰＣＲ反応 熱変性 ：９８℃、１０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応 ：７４℃、３０秒
逆転写反応 ４２℃、２０分
ＰＣＲ反応 熱変性 ：９８℃、１０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応 ：７４℃、３０秒
上記ＤＮＡ分解反応および逆転写反応は１回のみ、ＰＣＲ反応（熱変性、アニーリング、伸長反応）は３５回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて行った。増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図２に示す。なお、図２のレーン番号は表２のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
（３）結果
図１（および表１）のサンプル番号１〜３より明らかなように、細胞試料によっては、抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）に大量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が混入することがある。図１のサンプル番号４に対照として電気泳動した抽出ＤＮＡと比較すると、例えば図１のサンプル番号２の抽出ＲＮＡに混入しているＤＮＡは試料とした細胞の１０％前後に相当する量に及ぶ。ＤＮＡとＲＮＡは化学的に極めて類似した物質であるため、このように特に両核酸を含有する生体細胞などを試料とする場合では、抽出ＲＮＡからＤＮＡを完全に排除することは極めて困難である。同様に図１のサンプル番号４に電気泳動した抽出ＤＮＡにも、電気泳動で検出できない量のＲＮＡが混入していることが予想される。
図１（および表１）のサンプル番号１〜３より明らかなように、細胞試料によっては、抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）に大量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が混入することがある。図１のサンプル番号４に対照として電気泳動した抽出ＤＮＡと比較すると、例えば図１のサンプル番号２の抽出ＲＮＡに混入しているＤＮＡは試料とした細胞の１０％前後に相当する量に及ぶ。ＤＮＡとＲＮＡは化学的に極めて類似した物質であるため、このように特に両核酸を含有する生体細胞などを試料とする場合では、抽出ＲＮＡからＤＮＡを完全に排除することは極めて困難である。同様に図１のサンプル番号４に電気泳動した抽出ＤＮＡにも、電気泳動で検出できない量のＲＮＡが混入していることが予想される。
図２（および表２）より明らかなように、本発明の試薬組成（サンプル番号１〜４）では約４５０ｂｐの部分に明瞭な増幅を確認できるが、ＲＮＡ増幅試薬組成に逆転写酵素が含まれない、すなわち本発明のリボ核酸増幅試薬組成から逆転写活性を有する酵素を除去した場合（サンプル番号５〜８）には増幅を確認できない。したがって、図２のサンプル番号１〜４で確認された増幅は各試料に含まれるＲＮＡに起因する。一方、ＲＮＡ増幅試薬組成にＤＮＡ分解酵素が含まれない、すなわち本発明のリボ核酸増幅試薬組成からＤＮＡ分解活性を有する酵素を除去した場合では、該組成に逆転写酵素が含まれる場合（サンプル番号９〜１２）および逆転写酵素が含まれない場合（サンプル番号１３〜１６）ともに約４５０ｂｐの部分に明瞭な増幅を確認できる。すなわち、図２のサンプル番号１３〜１６で確認された増幅は各試料に含まれるＤＮＡに起因する偽陽性である。このように本発明のリボ核酸増幅試薬組成ではＤＮＡ分解活性を有する酵素を含んでいることにより、試料に含まれるＲＮＡのみに起因する増幅を確認することが可能である。
実施例２
既存のリボ核酸増幅試薬組成との増幅効率の比較
（１）試料の調製
実施例１においてＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡ溶液（図１におけるサンプル番号１）を１０倍ずつ希釈した段階希釈液を調製し、試料とした。
既存のリボ核酸増幅試薬組成との増幅効率の比較
（１）試料の調製
実施例１においてＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡ溶液（図１におけるサンプル番号１）を１０倍ずつ希釈した段階希釈液を調製し、試料とした。
（２）試料に含まれるリボ核酸の増幅
I．本発明のリボ核酸増幅試薬組成による増幅
実施例１と同様の方法により、表３に示す試料についてそれぞれＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。
I．本発明のリボ核酸増幅試薬組成による増幅
実施例１と同様の方法により、表３に示す試料についてそれぞれＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。
II．従来のリボ核酸増幅試薬組成による増幅
表３に示す試料にそれぞれＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌを添加し、４℃で１５分間反応させ、試料に含まれるＤＮＡを分解した。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱してＤＮａｓｅIを失活させた後、該溶液にＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製）を添加し、４２℃で２０分間反応させ、逆転写反応を行った。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱して逆転写酵素を失活させた後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌを添加し、増幅反応を行った。増幅反応の条件は以下の通りである：
表３に示す試料にそれぞれＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌを添加し、４℃で１５分間反応させ、試料に含まれるＤＮＡを分解した。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱してＤＮａｓｅIを失活させた後、該溶液にＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製）を添加し、４２℃で２０分間反応させ、逆転写反応を行った。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱して逆転写酵素を失活させた後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌを添加し、増幅反応を行った。増幅反応の条件は以下の通りである：
熱変性： ９８℃、１０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応： ７４℃、３０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応： ７４℃、３０秒
上記熱変性、アニーリング、伸長反応は３５回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて行った。
I．本発明のリボ核酸増幅試薬組成による増幅、II．従来のリボ核酸増幅試薬組成による増幅ともに、増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図３に示す。なお、図３のレーン番号は表３のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
（３）結果
図３（および表３）のサンプル番号１〜３より明らかなように、本発明のリボ核酸増幅試薬組成によって１工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号１〜７）および従来のリボ核酸増幅試薬組成によって３工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号８〜１４）について、増幅効率は同様であった。すなわち、本発明のリボ核酸増幅試薬組成では従来の方法と同様の増幅効率を実現しながら、増幅に必要な作業工程数を大幅に短縮することが可能である。また、該工程数の短縮は単に手間が軽減されるだけでなく、研究や診断の現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策としても重要な効果である。
図３（および表３）のサンプル番号１〜３より明らかなように、本発明のリボ核酸増幅試薬組成によって１工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号１〜７）および従来のリボ核酸増幅試薬組成によって３工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号８〜１４）について、増幅効率は同様であった。すなわち、本発明のリボ核酸増幅試薬組成では従来の方法と同様の増幅効率を実現しながら、増幅に必要な作業工程数を大幅に短縮することが可能である。また、該工程数の短縮は単に手間が軽減されるだけでなく、研究や診断の現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策としても重要な効果である。
本発明により、試料に含まれるデオキシリボ核酸の分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことができ、特に研究や診断の現場において人的または時間的な効率を大きく向上させることが可能となる。また、本発明の波及効果として、該現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策を提供することができる。
Claims (9)
- ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも２種類の酵素を含有することを特徴とする、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
- ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、逆転写活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも３種類の酵素を含有することを特徴とする、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
- 少なくとも２種類の酵素を用いて１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ用試薬であって、
（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素により試料に含まれるＤＮＡを分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を合成し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡを増幅するための成分を含有する試薬。 - ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素がＤＮアーゼＩであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
- マンガンイオン含有量が１ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
- 反応容器中にＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも２種類の酵素を一緒に存在させ、１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法。
- 反応容器中にＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、逆転写活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも３種類の酵素を一緒に存在させ、１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法。
- 少なくとも２種類の酵素を用いて１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法であって、下記工程
（ｄ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素により試料に含まれるＤＮＡを分解し、
（ｅ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を合成し、
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡを増幅すること、からなる方法。 - ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素がＤＮアーゼＩであることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004126494A JP4639629B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004126494A JP4639629B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005304396A JP2005304396A (ja) | 2005-11-04 |
| JP4639629B2 true JP4639629B2 (ja) | 2011-02-23 |
Family
ID=35433872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004126494A Expired - Lifetime JP4639629B2 (ja) | 2004-04-22 | 2004-04-22 | 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4639629B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102884186A (zh) * | 2010-05-14 | 2013-01-16 | 宝生物工程株式会社 | 合成cDNA的方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| EP1707623A1 (de) * | 2005-04-01 | 2006-10-04 | Qiagen GmbH | Reverse Transkription und Amplifikation von RNA bei simultaner Degradierung von DNA |
| EP1863908B1 (de) | 2005-04-01 | 2010-11-17 | Qiagen GmbH | Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna |
| EP1762627A1 (de) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion |
-
2004
- 2004-04-22 JP JP2004126494A patent/JP4639629B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102884186A (zh) * | 2010-05-14 | 2013-01-16 | 宝生物工程株式会社 | 合成cDNA的方法 |
| CN102884186B (zh) * | 2010-05-14 | 2015-01-28 | 宝生物工程株式会社 | 合成cDNA的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005304396A (ja) | 2005-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8431347B2 (en) | Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base | |
| JP6652693B2 (ja) | ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いたｄｎａ増幅の方法 | |
| US9464318B2 (en) | Methods and compositions for reducing non-specific amplification products | |
| JP2009284896A (ja) | 核酸増幅方法 | |
| JP2003199592A (ja) | インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素 | |
| CA2249717A1 (en) | Target nucleic acid sequence amplification | |
| US7618773B2 (en) | Headloop DNA amplification | |
| EP0632134A2 (en) | Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reaction | |
| JP2012080871A (ja) | Ｒｎａの直接検出法 | |
| EP0585660B1 (en) | Exonuclease decontamination method | |
| JP2005518216A (ja) | 融解温度依存ｄｎａ増幅 | |
| US10023908B2 (en) | Nucleic acid amplification method using allele-specific reactive primer | |
| WO2016106113A1 (en) | Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction | |
| JP4639629B2 (ja) | 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 | |
| CN106868165B (zh) | 一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用 | |
| WO2016106129A2 (en) | Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction | |
| JP5052500B2 (ja) | Ｄｎａの同時分解を伴う逆転写及びｒｎａの増幅 | |
| EP2546363B1 (en) | Method and kit for amplifying and detecting polynucleotide | |
| AU2022264812A9 (en) | Amplification of single stranded dna | |
| JP2016049107A (ja) | 核酸増幅の特異的抑制方法 | |
| JP4186269B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| JP4126348B2 (ja) | リボ核酸のデオキシリボ核酸への転写中のアーティファクト形成の低減方法 | |
| JP2005304397A (ja) | リボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法 | |
| JP7306722B2 (ja) | プライマー及びその使用 | |
| WO2021032583A1 (en) | Composition and method for amplification of str loci |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070314 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100415 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100614 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100804 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101102 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101115 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4639629 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |