JP4633232B2 - 成長因子誘導剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、内因性の成長因子を誘導しうるグリコサミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する成長因子誘導剤に関する。
【従来の技術】
【０００２】
従来、各種疾病の治療を目的として、ＤＮＡ組み換え技術により得られた成長因子自体を投与する試みがなされている。しかし、成長因子自体の投与には、成長因子がタンパク質であって一般的に不安定であり、またその製造コストが高いなどの欠点がある。また、成長因子の多くがガン細胞を活性化しうることから、成長因子自体を直接投与することには懸念がある。
【０００３】
一方、ヘパリンは、グリコサミノグリカンの一種であり、体内に存在する種々の成長因子に結合性を示し、成長因子の血中半減期を延長し、生物学的利用能を増大させることが既に知られており、更に近年、ヘパリン及びヘパリンを含む各種グリコサミノグリカンについて、種々の成長因子に対する作用が研究されている。
【０００４】
特開平５−１４８３０５には、線維芽細胞増殖因子結合担体に結合性を有するヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩ処理することによって得られ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合性を有するオリゴ糖とＦＧＦを含有する組成物を投与することにより、ＦＧＦのタンパク分解酵素に対する抵抗性が増大し、更に、細胞外マトリックス中においてＦＧＦが高拡散性を示すようになるので、このような組成物が医薬として高い有用性を有し得ることが記載されている。また、特開平５−３０１８２４には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、ヘパリン、デキストラン硫酸などの多糖類とからなる組成物を投与することにより、ＨＧＦの活性が増強され、ＨＧＦの分解が抑制されることが報告されている。更に、ＵＳＰ５,８４９,６８９には、肝細胞増殖因子とヘパリンなどの併用投与によりＨＧＦの血漿内半減期が延長されるなど、ＨＧＦの作用を増強する効果が報告されている。また、ＨＧＦに関しては、ＨＧＦを併用せずに、ヘパリン、ヘパラン硫酸などを単独で投与しても、ＨＧＦ産生細胞におけるＨＧＦ産生が促進されるとの報告がされている（特開平６−３１２９４１）。
【０００５】
また、多糖に限らず、ヘパリン型又は硫酸ヘパラン型の少糖類も、成長因子に対し顕著な親和性を示し、成長因子と併用しなくても単独で投与することにより、細胞の分割及び分化に対する活性が示されること（特開昭６３−６６１９２）や、多糖だけではなく硫酸化された特定の構造を有する８糖以上の硫酸化多糖が、ＨＧＦに親和性を有し、ＨＧＦを安定化し、その増殖活性を向上させること（特開平８−３４８０１）も報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、各種グリコサミノグリカンと共に、成長因子を外的に投与することにより、当該成長因子の寿命が延長されたり、薬理作用が増強されることは従来知られていたが、成長因子をなんら人為的に外部から併用投与しなくても、グリコサミノグリカンを単独で投与することにより、体内に存在する内因性の各成長因子の濃度を上昇させうることは、ヘパリン及び硫酸ヘパラン型の少糖類以外については、現在に至るまで知られていなかった。また、成長因子は、ガン細胞から発見されたものであり、ガン細胞を活性化すると認識されているため、成長因子を外的に投与することには懸念があり、更にヘパリンについては出血活性も知られている。そのため、外部から成長因子を併用投与しなくても、単独で投与することにより、体内に存在する内因性の成長因子の濃度を増加及び／又は活性を増強し、かつ出血傾向などの副作用が少なく、成長因子誘導剤として有用な医薬の開発が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、各種グリコサミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩が、外部から成長因子を併用投与したり、又は予め成長因子を配合又は結合して投与しなくても、単独に投与された場合に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の濃度を増加させる作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する成長因子誘導剤に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。本発明における「グリコサミノグリカン」（ＧＡＧ）とは、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクトースとヘキソサミン残基が、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクトースの１位とヘキソサミン残基の３位又は４位とでグリコシド結合した二糖単位の繰り返し構造で形成された基本骨格を有する、ヘパリン以外の多糖又はオリゴ糖を指し、直鎖状のものであっても、分枝状のものであっても良い。
【００１０】
本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であるヘキスロン酸残基としては、イズロン酸残基、ガラクツロン酸残基、グルクロン酸残基、グルロン酸残基、マンヌロン酸残基などを挙げることができ、好ましくは、イズロン酸残基、ガラクツロン酸残基及びグルクロン酸残基、より好ましくは、イズロン酸残基及びグルクロン酸残基、特に好ましくは、Ｌ−イズロン酸及びＤ−グルクロン酸を挙げることができる。
【００１１】
本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であるヘキソサミン残基としては、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、マンノサミン残基、及びこれらのＮ−アセチル化物を挙げることができ、好ましくはグルコサミン残基及びそのＮ−アセチル化物、並びにガラクトサミン残基及びそのＮ−アセチル化物、より好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、特に好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を挙げることができる。
【００１２】
本発明に使用されるＧＡＧを構成する糖残基は、前述の各残基よりそれぞれ選択することができ、イズロン酸残基又はグルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を構成糖とするヘパラン硫酸及びヒアルロン酸、Ｄ−ガラクトースとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成るケラタン硫酸などに加えて、特に好ましくは、Ｌ−イズロン酸残基又はＤ−グルクロン酸残基のいずれかとＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の組み合わせからなるデルマタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸などをＧＡＧとして用いることができる。
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、なかでもヘパラン硫酸や、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸のようなガラクトサミノグリカンを用いることができ、特にデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸のようなガラクトサミノグリカンをＧＡＧとして好ましく用いることができる。
【００１４】
本発明に使用されるＧＡＧは、その起源、由来によっては特に限定されるものではなく、天然から得られるグリコサミノグリカン（本明細書中では単に天然グリコサミノグリカンという）、天然グリコサミノグリカンを化学的又は硫酸基転移酵素などにより酵素的に改変したグリコサミノグリカン、人工的に化学合成したグリコサミノグリカン、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物などにより合成させたグリコサミノグリカンなどいずれのグリコサミノグリカンも用いることができる。
【００１５】
本発明に使用されるＧＡＧとして用いることが可能な天然グリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカンを含む生物体（例えば動物組織）から通常用いられている方法（物理的抽出法、酵素抽出法、有機溶媒分画法、イオン交換樹脂などを用いるクロマトグラフィー分画法などの単独又は組合わせ）により抽出・精製して得ることができる。天然グリコサミノグリカンの供給源は、当該グリコサミノグリカンを得ることが可能であれば、特に限定はされないが、例えば、鶏冠、ブタ皮、ヒト臍帯、サメ軟骨又はクジラ軟骨、ウシ腎臓、ウシ腸などから得られるグリコサミノグリカンを用いることができる。このような生物の組織、器官から抽出、精製されたグリコサミノグリカンは市販されており、本発明に使用されるＧＡＧとして、このような市販のグリコサミノグリカンを用いることも可能である。
【００１６】
また、本発明に使用されるＧＡＧにおけるヘキソサミン残基及びヘキスロン酸残基は、好ましくは硫酸化されており、その硫酸化の位置や割合は特に限定されない。硫酸化とは、ヘキソサミン残基又はヘキスロン酸残基を構成している炭素原子上に、オキソ基（−Ｏ−）又はイミノ基（−ＮＨ−）を介して硫酸基（−ＳＯ3Ｈ）及び／又はヒドロキシスルフィニル基（−ＳＯ・ＯＨ）が結合していることを意味する。
【００１７】
本発明に使用されるＧＡＧの分子量は、特に限定されないが、平均分子量５千〜２００万のＧＡＧが好ましく、より好ましくは平均分子量５,０００〜２００,０００、更に好ましくは平均分子量５,０００〜５０,０００のＧＡＧを用いることができる。なお、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明に使用されるＧＡＧにおいても、上記の平均分子量の範囲のものに厳密に限定されるべきものではない。
【００１８】
本発明の成長因子誘導剤は、上述のＧＡＧ又はその薬理学的に許容しうる塩を含有するが、その薬理学的に許容しうる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との間で形成された塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩などの有機塩基との塩のうち、薬理学的に許容しうる塩を選択し用いることができる。
【００１９】
ヘパリンは、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧではないが、グリコサミノグリカンの１種類であり、抗血液凝固活性（出血活性）を有することが知られている。一方、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧは、ヘパリンと比較して抗血液凝固活性が極めて低いため、本発明の成長因子誘導剤を生体に投与しても、出血傾向などの副作用を惹起する可能性が少ない。またヘパリンは、副作用として血小板減少症を惹起しやすいが、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧであるデルマタン硫酸ではこのような副作用は起こりにくい。
【００２０】
一般に、物質の抗血液凝固活性を表す指標としては、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）がある。出血活性を有することが知られているヘパリンと比較するため、後述する試験例１に記載する方法により、ヘパリン及び本発明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ及びＴＴ値を測定し、また、何も添加しない状態におけるＡＰＴＴ及びＴＴ値（以下、正常値）の２倍の凝固時間を示すヘパリン及び本発明に使用されるＧＡＧの濃度を求め、下記式によって百分率で表した数値（％）を、それぞれＡＰＴＴ活性、ＴＴ活性として比較に用いた。両活性とも数値（％）が大きいほど、出血活性が高いことを示している。
（ヘパリンの濃度／各ＧＡＧの濃度）×１００
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ活性は、１０％以下であり、特に５％以下である。なかでも、本発明に使用されるＧＡＧの一例として挙げられるデルマタン硫酸のＡＰＴＴ活性は、１.５％以下であると、より好ましい。また、本発明に使用されるＧＡＧのＴＴ活性は、１５％以下であり、特に１０％以下である。
【００２３】
このように、本発明に使用されるＧＡＧは、極めて低いＡＰＴＴ活性、ＴＴ活性を示し、その抗血液凝固活性が極めて低いため、本発明の成長因子誘導剤を医薬品として投与した際に、出血を惹起する危険性が低く、本発明の成長因子誘導剤の安全性は高い。
【００２４】
上述したように、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などの本発明の成長因子誘導剤に含有されるＧＡＧは、外因性の成長因子を併用投与しなくても、単独に投与された場合に内因性の成長因子濃度を増加させる作用を有する。なお、ＰＤＧＦ-ＡＢ（血小板由来増殖因子）については、本発明に使用されるＧＡＧを単独投与した後の培養細胞中濃度は、ほぼ０であり、本発明に使用されるＧＡＧは、ＰＤＧＦ-ＡＢの体内における調節機能にも影響を及ぼすことが判明しているので、ＰＤＧＦ−ＡＢの生体内での産生を抑制するために利用できる可能性がある。
【００２５】
本発明に使用されるＧＡＧの投与により誘導することができる体内に存在する成長因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などである。
【００２６】
本発明の成長因子誘導剤は、本発明に使用されるＧＡＧの投与により誘導しうる各種成長因子の欠乏あるいは減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療などを目的として投与することができる。本発明の成長因子誘導剤を適応しうる疾患としては、具体的には肝疾患（肝炎、肝硬変、肝不全など）、外科手術後の肝再生、腎疾患（糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の腎障害など）、皮膚疾患（白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚潰瘍、禿頭症など）、血液疾患（血小板減少症、血流障害など）、骨髄移植手術時、眼疾患（角膜潰瘍など）、肺疾患（肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺繊維症など）、胃十二指腸疾患（胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍など）、癌疾患、各種癌又は癌療法による肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛など副作用の予防、骨疾患（骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎など）、中枢疾患（神経分化異常症など）などを挙げることができる。
【００２７】
本発明の成長因子誘導剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内、関節腔内、眼内、腹腔内など）、点眼、点入、経皮、経口、経直腸、吸入などの投与方法によって経口又は非経口的に投与することができる。本発明の成長因子誘導剤は、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤型も、本発明の成長因子誘導剤の有効性が保持され、重篤な副作用が惹起されない範囲において、特に限定はされず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤など）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、坐剤などの剤型とすることができる。
【００２８】
また、本発明の成長因子誘導剤の上記製剤の調製にあたり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、着色剤、崩壊剤、溶媒、可溶化剤、乳化剤、界面活性剤、浸透圧調節剤など、通常医薬品の製剤に用いられる成分を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明の成長因子誘導剤には、その有効成分であるＧＡＧのほか、成長因子誘導作用を有する他の物質や、有効成分であるＧＡＧの作用を損うことのない薬理学上許容されうる他の物質を、組成成分として配合し、あるいは結合体として、又は併用薬剤として、投与することもできる。
【００２９】
上記の「成長因子誘導作用を有する他の物質」とは、本発明に使用されるＧＡＧとの組合せ配合あるいは結合させて、又は併用投与により、重篤な副作用を惹起したり、一方の物質が他方の物質の本来有する成長因子誘導作用を阻害する物質ではない限りにおいて特に限定されない。
【００３０】
本発明の成長因子誘導剤中の有効成分であるＧＡＧの配合量、及びその投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、疾患の重症度、患者の年齢、体重などに応じて個別に決定することができ、特に限定はされないが、ＧＡＧの臨床投与量としては、例えば成人に対しては、１日当り約０．１mg/kg〜３００mg/kg・体重を例示することができる。また、投与回数は１日１回程度でも可能であり、また１日２〜４回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴などにより連続的に投与することも可能である。
【００３１】
【実施例】
以下に、本発明を以下の製造例、試験例、及び製剤例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
製造例１
〔鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）の製造〕
鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）は「新規ガラクトサミノグリカン」（特開２０００−４０６０１号公報）に開示の方法で製造した。
ＡＣＤＳの調製
＜１＞鶏冠１，５００kgに水４０００Ｌを加えてミンチした後、煮沸し、冷却後、プロテアーゼ（商品名：プロナーゼ 科研製薬（株）製）を添加して一晩放置し、加水分解した。加水分解液に、塩化ベンザルコニウム溶液３２Ｌを添加後、珪藻土でろ過し、ろ過上清を捨て、珪藻土１８０kgを得た。この珪藻土に水３５０Ｌと塩化ナトリウム４２kgを加えた後、ろ過し、ろ液にエタノール２５０Ｌを加え、得られた沈殿物を乾燥させて、粉体１．３kgを得た。
＜２＞上記粉体を水１．３Ｌに溶解して１０％溶液となるように調製し、ShivelyとConrad法により亜硝酸処理を行って、ヘパリン／ヘパラン硫酸を除去した。すなわち、上記粉体を溶解した溶液を、０．１％亜硝酸水溶液に混和し、室温で１０分間放置した後、沈殿をろ過して除いた。ろ過液のｐＨを１０．５に調整し、塩化ナトリウムを終濃度１％になるように加え、さらにエタノールを終濃度４８％になるように３０〜４０分かけて攪拌しながら加えた。得られた沈殿物に活性炭を加えて、吸引ろ過し、ろ過液をイオン交換樹脂Diaion SA-12A（三菱化学（株））に通して脱塩し、通過液にエタノールを加え、鶏冠由来デルマタン硫酸の調製品（ＡＣＤＳ）１０５ｇを得た。
【００３２】
製造例２
〔ウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）の製造〕
ウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）は「抗血栓剤」（ＷＯ９５/０９１８８）に開示の方法で製造した。
ＢＩＤＳの調製
＜１＞ウシ小腸１０kgを切断し、糞及び脂肪を除去後、粘膜を回収した。これに水酸化ナトリウムを加え、２.５Ｎ、３Ｌに調整して、３７℃で２時間抽出した。この抽出液を中和後、珪藻土で濾過し、濾液を水で透析し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。上清に等量のエタノール及び５ｇの酢酸ナトリウムを加えて、沈澱物を得た。この沈澱物を０.６５Ｍ食塩溶液に溶かし、０．５Ｍ食塩溶液で平衡化した Diaion HPA-10（三菱化学（株）製）アニオン交換樹脂に負荷し、０.６５Ｍ及び１.１Ｍ食塩溶液で順次洗浄後、１.５Ｍ食塩溶液で溶出した。溶出画分を蒸留水を用いて透析し、透析内液に酢酸カルシウム及び酢酸を加え、それぞれ終濃度５％及び０.５Ｍに調整した。この液にエタノールを加え、１５〜３０％(V/V)で沈澱する画分を集めた。沈澱物を水に溶解して、イオン交換樹脂に通液して脱塩後、通過液を酢酸又は水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和液に２倍量のエタノールを加え、生じた沈殿を７０％エタノール、純エタノール及びエーテルの順で洗浄後、五酸化リン存在下で減圧乾燥し、ＢＩＤＳ中間品を得た。
＜２＞＜１＞で得られたＢＩＤＳ中間品について、ShivelとConrad法（Biochemistry 15, 3932-3942, 1976）の方法に準拠して亜硝酸分解を行い、ヘパリン・ヘパラン硫酸を除去し、ウシ腸由来デルマタン硫酸の調製品（ＢＩＤＳ）を得た。
【００３３】
以上のデルマタン硫酸２種（ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ）に加え、サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（以下、ＣＳＣという。生化学工業（株）製）、ウシ腎臓由来ヘパラン硫酸ナトリウム塩（以下ＨＳという。生化学工業（株）製）を後述する試験例の被検物質として用いた。
【００３４】
試験例１
〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）の測定法〕
ＡＰＴＴ活性の測定方法
ラットの下大静脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採血し、血液を３０００r.p.mで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得た鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得たウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリン（Syntex社製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．１０，０００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、あらかじめ３７℃に保温しておいたアクチン１００μlを添加し、さらに２分間保温した。ついで３７℃に保温しておいた０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。
【００３５】
ＴＴ活性の測定方法
血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得た鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得たウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリン（Syntex社製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．１０，０００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップに入れ、３７℃で２分間保温した。その後、５分前より３７℃に保温しておいたトロンビン（１０U/ml)１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。
【００３６】
上記試験法によって測定したＡＰＴＴ及びＴＴ値を示すグラフを、図１及び図２に示す。この結果から、試験したＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ及びヘパリンのいずれも、濃度依存性に血液凝固開始までの時間の延長傾向を示したものの、ＡＣＤＳ及びＢＩＤＳは、ヘパリンに比して抗血液凝固作用が極めて弱いことが示された。したがって、本発明の成長因子誘導剤の出血傾向は、ヘパリンより非常に弱く、本発明の成長因子誘導剤は、ヘパリンより安全性が高い医薬であることが示された。
【００３７】
試験例２
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）に対する各種グリコサミノグリカンの成長因子誘導作用〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）を２６才の成人女性肘内側皮膚より分離し、真皮を分離後トリプシン処理し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地にて８世代継代維持した後、通常の方法により凍結保存した。
試験時には、凍結保存したＨＳＦ−１をHuMedia-EG2培地（クラボウ（株）製）を用いて２４wellマイクロプレートでコンフルエントになるまで培養した。
【００３８】
培地を HuMedia-EG培地（クラボウ（株）製）に置換したのち、最終濃度０.１mg/mlになるようにＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、又はヘパリン（ＳＰＬ社製ブタ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，０００）を添加した。４８時間培養後、培養上清を別の容器に移し、遠心分離して、細胞成分を除去した後、各種成長因子の濃度を測定した。
【００３９】
培養上清中に含まれるｂＦＧＦおよびＨＧＦの濃度は、それぞれQuantikine HUMAN FGF-basic ELISA kitおよび Quantikine HUMAN HGF ELISA kit（いずれもR&D systems製）を用いて測定した。対象として何も添加せず同様にして得られた培養上清中の各種成長因子の濃度も測定した。この測定結果を図３及び図４に示す。
【００４０】
この結果から、ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、又はヘパリンのいずれを添加した場合においても、無添加対照群に比して、培養終了後における培養上清中のｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度が高いことが示された。また、本試験例では、各種ＧＡＧ又はヘパリンの添加後４８時間しか経過しておらず、細胞***は起こっていないと推測され、更に、本試験例における添加濃度０.１mg/mlにおいては各種ＧＡＧ自身に細胞毒性がないことも確認済みである。したがって、本試験に用いたＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンが、培養線維芽細胞自体が有する内因性成長因子の濃度に関する制御機構に働きかけ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度を増加させたものと考えられる。
【００４１】
試験例３
〔初代ヒト真皮線維芽細胞に対する各種グリコサミノグリカンの成長因子誘導作用〕
初代ヒト真皮線維芽細胞（日水製薬（株）製）を、type-1コラーゲン(Cell Matrix Type-1A、新田ゼラチン製）をコートしたディッシュ上で、５％のＦＢＳを含有する線維芽細胞用培地（日水製薬（株）製）にて培養した。適度に増殖させた後、細胞をトリプシン/０．０２％エチレンジアミン４酢酸水溶液を用いて、回収した。回収した細胞を５％ＦＢＳを含有する線維芽細胞用培地で５×１０4個/wellになるように４８−wellプレートに播種した。常法で２４時間培養した後、培地を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリン（ＳＰＬ社製ブタ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，０００）を、種々の濃度（１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml、１０００μg/ml、ただしＡＣＤＳのみ１０μg/ml、１００μg/ml、１０００μg/ml、２５００μg/ml）で添加した。さらに２４時間培養後、培養上清を別の容器に移し遠心分離して細胞成分を除去した後、成長因子の濃度を測定した。
【００４２】
培養上清中に含まれるＨＧＦの濃度は、Quantikine HUMAN HGF ELISA kit（ R&D systems製）を用いて測定した。対照として何も添加せず同様にして得られた培養上清中の成長因子の濃度も測定した。その結果を図５に示す。
【００４３】
この結果から、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリンのいずれを添加した場合でも、培養上清中のＨＧＦ濃度が増加したことが示された。試験例２においては各種ＧＡＧ又はヘパリンの添加濃度は０.１mg/mlであったが、０.１mg/mlの１０分の１あるいは１００分の１の低濃度においても各種ＧＡＧ及びヘパリンが、培養線維芽細胞自体が有する内因性のＨＧＦ濃度を増加させることが示された。
【００４４】
製剤例
製剤例１：眼用溶液
製造例１で得たＡＣＤＳ １mg
塩化ナトリウム ９００mg
チオメルサール １mg
上記に精製水を加えて全１００mlとし、pH５．５〜７．５に調整したのち、無菌濾過し、無菌容器に充填した。
【００４５】
製剤例２：軟膏１
製造例２で得たＢＩＤＳ ２ｇ
鉱油 ４ｇ
石油ゼリー ８ｇ
混合メチル／プロピルパラバン ０．０６ｇ
非イオン性界面活性剤 １ｇ
精製水 ３０ｇ
上記を常法により混合し、容器に充填した。
【００４６】
製剤例３：軟膏２
製造例１で得たＡＣＤＳ ０．１ｇ
白色ワセリン １８ｇ
精製水 ２ｇ
上記を常法により混合し、容器に充填した。
【００４７】
製剤例４：注射用製剤
製造例１で得たＡＣＤＳ ０．５ｇ
上記に注射用食塩水２０mlを加え、無菌濾過した後アンプルに分注し、密封した。
【００４８】
【発明の効果】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有効成分として含有する本発明の成長因子誘導剤は、成長因子を人為的に外部から併用投与したり、又は予め成長因子を配合又は結合させて投与しなくても、単独に投与された場合に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の濃度調節機構に働きかけ、内因性の成長因子の濃度を増加させる。また、本発明の成長因子誘導剤では、ヘパリン系医薬において問題となる抗血液凝固活性が低く、出血の危険性が極めて低いため、成長因子の欠乏あるいは減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療のために、安全で有用な医薬として投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＡＰＴＴ測定値を示す。
【図２】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＴＴ測定値を示す。
【図３】培養上清中のｂＦＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。
【図４】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。
【図５】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＨＳ、及びヘパリンの効果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、内因性の成長因子を誘導しうるグリコサミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する成長因子誘導剤に関する。
【従来の技術】
【０００２】
従来、各種疾病の治療を目的として、ＤＮＡ組み換え技術により得られた成長因子自体を投与する試みがなされている。しかし、成長因子自体の投与には、成長因子がタンパク質であって一般的に不安定であり、またその製造コストが高いなどの欠点がある。また、成長因子の多くがガン細胞を活性化しうることから、成長因子自体を直接投与することには懸念がある。
【０００３】
一方、ヘパリンは、グリコサミノグリカンの一種であり、体内に存在する種々の成長因子に結合性を示し、成長因子の血中半減期を延長し、生物学的利用能を増大させることが既に知られており、更に近年、ヘパリン及びヘパリンを含む各種グリコサミノグリカンについて、種々の成長因子に対する作用が研究されている。
【０００４】
特開平５−１４８３０５には、線維芽細胞増殖因子結合担体に結合性を有するヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩ処理することによって得られ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合性を有するオリゴ糖とＦＧＦを含有する組成物を投与することにより、ＦＧＦのタンパク分解酵素に対する抵抗性が増大し、更に、細胞外マトリックス中においてＦＧＦが高拡散性を示すようになるので、このような組成物が医薬として高い有用性を有し得ることが記載されている。また、特開平５−３０１８２４には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、ヘパリン、デキストラン硫酸などの多糖類とからなる組成物を投与することにより、ＨＧＦの活性が増強され、ＨＧＦの分解が抑制されることが報告されている。更に、ＵＳＰ５,８４９,６８９には、肝細胞増殖因子とヘパリンなどの併用投与によりＨＧＦの血漿内半減期が延長されるなど、ＨＧＦの作用を増強する効果が報告されている。また、ＨＧＦに関しては、ＨＧＦを併用せずに、ヘパリン、ヘパラン硫酸などを単独で投与しても、ＨＧＦ産生細胞におけるＨＧＦ産生が促進されるとの報告がされている（特開平６−３１２９４１）。
【０００５】
また、多糖に限らず、ヘパリン型又は硫酸ヘパラン型の少糖類も、成長因子に対し顕著な親和性を示し、成長因子と併用しなくても単独で投与することにより、細胞の分割及び分化に対する活性が示されること（特開昭６３−６６１９２）や、多糖だけではなく硫酸化された特定の構造を有する８糖以上の硫酸化多糖が、ＨＧＦに親和性を有し、ＨＧＦを安定化し、その増殖活性を向上させること（特開平８−３４８０１）も報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、各種グリコサミノグリカンと共に、成長因子を外的に投与することにより、当該成長因子の寿命が延長されたり、薬理作用が増強されることは従来知られていたが、成長因子をなんら人為的に外部から併用投与しなくても、グリコサミノグリカンを単独で投与することにより、体内に存在する内因性の各成長因子の濃度を上昇させうることは、ヘパリン及び硫酸ヘパラン型の少糖類以外については、現在に至るまで知られていなかった。また、成長因子は、ガン細胞から発見されたものであり、ガン細胞を活性化すると認識されているため、成長因子を外的に投与することには懸念があり、更にヘパリンについては出血活性も知られている。そのため、外部から成長因子を併用投与しなくても、単独で投与することにより、体内に存在する内因性の成長因子の濃度を増加及び／又は活性を増強し、かつ出血傾向などの副作用が少なく、成長因子誘導剤として有用な医薬の開発が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、各種グリコサミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩が、外部から成長因子を併用投与したり、又は予め成長因子を配合又は結合して投与しなくても、単独に投与された場合に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の濃度を増加させる作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する成長因子誘導剤に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。本発明における「グリコサミノグリカン」（ＧＡＧ）とは、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクトースとヘキソサミン残基が、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクトースの１位とヘキソサミン残基の３位又は４位とでグリコシド結合した二糖単位の繰り返し構造で形成された基本骨格を有する、ヘパリン以外の多糖又はオリゴ糖を指し、直鎖状のものであっても、分枝状のものであっても良い。
【００１０】
本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であるヘキスロン酸残基としては、イズロン酸残基、ガラクツロン酸残基、グルクロン酸残基、グルロン酸残基、マンヌロン酸残基などを挙げることができ、好ましくは、イズロン酸残基、ガラクツロン酸残基及びグルクロン酸残基、より好ましくは、イズロン酸残基及びグルクロン酸残基、特に好ましくは、Ｌ−イズロン酸及びＤ−グルクロン酸を挙げることができる。
【００１１】
本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であるヘキソサミン残基としては、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、マンノサミン残基、及びこれらのＮ−アセチル化物を挙げることができ、好ましくはグルコサミン残基及びそのＮ−アセチル化物、並びにガラクトサミン残基及びそのＮ−アセチル化物、より好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、特に好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を挙げることができる。
【００１２】
本発明に使用されるＧＡＧを構成する糖残基は、前述の各残基よりそれぞれ選択することができ、イズロン酸残基又はグルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を構成糖とするヘパラン硫酸及びヒアルロン酸、Ｄ−ガラクトースとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成るケラタン硫酸などに加えて、特に好ましくは、Ｌ−イズロン酸残基又はＤ−グルクロン酸残基のいずれかとＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の組み合わせからなるデルマタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸などをＧＡＧとして用いることができる。
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、なかでもヘパラン硫酸や、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸のようなガラクトサミノグリカンを用いることができ、特にデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸のようなガラクトサミノグリカンをＧＡＧとして好ましく用いることができる。
【００１４】
本発明に使用されるＧＡＧは、その起源、由来によっては特に限定されるものではなく、天然から得られるグリコサミノグリカン（本明細書中では単に天然グリコサミノグリカンという）、天然グリコサミノグリカンを化学的又は硫酸基転移酵素などにより酵素的に改変したグリコサミノグリカン、人工的に化学合成したグリコサミノグリカン、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物などにより合成させたグリコサミノグリカンなどいずれのグリコサミノグリカンも用いることができる。
【００１５】
本発明に使用されるＧＡＧとして用いることが可能な天然グリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカンを含む生物体（例えば動物組織）から通常用いられている方法（物理的抽出法、酵素抽出法、有機溶媒分画法、イオン交換樹脂などを用いるクロマトグラフィー分画法などの単独又は組合わせ）により抽出・精製して得ることができる。天然グリコサミノグリカンの供給源は、当該グリコサミノグリカンを得ることが可能であれば、特に限定はされないが、例えば、鶏冠、ブタ皮、ヒト臍帯、サメ軟骨又はクジラ軟骨、ウシ腎臓、ウシ腸などから得られるグリコサミノグリカンを用いることができる。このような生物の組織、器官から抽出、精製されたグリコサミノグリカンは市販されており、本発明に使用されるＧＡＧとして、このような市販のグリコサミノグリカンを用いることも可能である。
【００１６】
また、本発明に使用されるＧＡＧにおけるヘキソサミン残基及びヘキスロン酸残基は、好ましくは硫酸化されており、その硫酸化の位置や割合は特に限定されない。硫酸化とは、ヘキソサミン残基又はヘキスロン酸残基を構成している炭素原子上に、オキソ基（−Ｏ−）又はイミノ基（−ＮＨ−）を介して硫酸基（−ＳＯ3Ｈ）及び／又はヒドロキシスルフィニル基（−ＳＯ・ＯＨ）が結合していることを意味する。
【００１７】
本発明に使用されるＧＡＧの分子量は、特に限定されないが、平均分子量５千〜２００万のＧＡＧが好ましく、より好ましくは平均分子量５,０００〜２００,０００、更に好ましくは平均分子量５,０００〜５０,０００のＧＡＧを用いることができる。なお、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明に使用されるＧＡＧにおいても、上記の平均分子量の範囲のものに厳密に限定されるべきものではない。
【００１８】
本発明の成長因子誘導剤は、上述のＧＡＧ又はその薬理学的に許容しうる塩を含有するが、その薬理学的に許容しうる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との間で形成された塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩などの有機塩基との塩のうち、薬理学的に許容しうる塩を選択し用いることができる。
【００１９】
ヘパリンは、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧではないが、グリコサミノグリカンの１種類であり、抗血液凝固活性（出血活性）を有することが知られている。一方、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧは、ヘパリンと比較して抗血液凝固活性が極めて低いため、本発明の成長因子誘導剤を生体に投与しても、出血傾向などの副作用を惹起する可能性が少ない。またヘパリンは、副作用として血小板減少症を惹起しやすいが、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧであるデルマタン硫酸ではこのような副作用は起こりにくい。
【００２０】
一般に、物質の抗血液凝固活性を表す指標としては、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）がある。出血活性を有することが知られているヘパリンと比較するため、後述する試験例１に記載する方法により、ヘパリン及び本発明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ及びＴＴ値を測定し、また、何も添加しない状態におけるＡＰＴＴ及びＴＴ値（以下、正常値）の２倍の凝固時間を示すヘパリン及び本発明に使用されるＧＡＧの濃度を求め、下記式によって百分率で表した数値（％）を、それぞれＡＰＴＴ活性、ＴＴ活性として比較に用いた。両活性とも数値（％）が大きいほど、出血活性が高いことを示している。
（ヘパリンの濃度／各ＧＡＧの濃度）×１００
【００２１】
【表１】
本発明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ活性は、１０％以下であり、特に５％以下である。なかでも、本発明に使用されるＧＡＧの一例として挙げられるデルマタン硫酸のＡＰＴＴ活性は、１.５％以下であると、より好ましい。また、本発明に使用されるＧＡＧのＴＴ活性は、１５％以下であり、特に１０％以下である。
【００２３】
このように、本発明に使用されるＧＡＧは、極めて低いＡＰＴＴ活性、ＴＴ活性を示し、その抗血液凝固活性が極めて低いため、本発明の成長因子誘導剤を医薬品として投与した際に、出血を惹起する危険性が低く、本発明の成長因子誘導剤の安全性は高い。
【００２４】
上述したように、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などの本発明の成長因子誘導剤に含有されるＧＡＧは、外因性の成長因子を併用投与しなくても、単独に投与された場合に内因性の成長因子濃度を増加させる作用を有する。なお、ＰＤＧＦ-ＡＢ（血小板由来増殖因子）については、本発明に使用されるＧＡＧを単独投与した後の培養細胞中濃度は、ほぼ０であり、本発明に使用されるＧＡＧは、ＰＤＧＦ-ＡＢの体内における調節機能にも影響を及ぼすことが判明しているので、ＰＤＧＦ−ＡＢの生体内での産生を抑制するために利用できる可能性がある。
【００２５】
本発明に使用されるＧＡＧの投与により誘導することができる体内に存在する成長因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などである。
【００２６】
本発明の成長因子誘導剤は、本発明に使用されるＧＡＧの投与により誘導しうる各種成長因子の欠乏あるいは減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療などを目的として投与することができる。本発明の成長因子誘導剤を適応しうる疾患としては、具体的には肝疾患（肝炎、肝硬変、肝不全など）、外科手術後の肝再生、腎疾患（糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の腎障害など）、皮膚疾患（白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚潰瘍、禿頭症など）、血液疾患（血小板減少症、血流障害など）、骨髄移植手術時、眼疾患（角膜潰瘍など）、肺疾患（肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺繊維症など）、胃十二指腸疾患（胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍など）、癌疾患、各種癌又は癌療法による肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛など副作用の予防、骨疾患（骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎など）、中枢疾患（神経分化異常症など）などを挙げることができる。
【００２７】
本発明の成長因子誘導剤は、注射（筋肉内、皮下、皮内、静脈内、関節腔内、眼内、腹腔内など）、点眼、点入、経皮、経口、経直腸、吸入などの投与方法によって経口又は非経口的に投与することができる。本発明の成長因子誘導剤は、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤型も、本発明の成長因子誘導剤の有効性が保持され、重篤な副作用が惹起されない範囲において、特に限定はされず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤など）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、坐剤などの剤型とすることができる。
【００２８】
また、本発明の成長因子誘導剤の上記製剤の調製にあたり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、着色剤、崩壊剤、溶媒、可溶化剤、乳化剤、界面活性剤、浸透圧調節剤など、通常医薬品の製剤に用いられる成分を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明の成長因子誘導剤には、その有効成分であるＧＡＧのほか、成長因子誘導作用を有する他の物質や、有効成分であるＧＡＧの作用を損うことのない薬理学上許容されうる他の物質を、組成成分として配合し、あるいは結合体として、又は併用薬剤として、投与することもできる。
【００２９】
上記の「成長因子誘導作用を有する他の物質」とは、本発明に使用されるＧＡＧとの組合せ配合あるいは結合させて、又は併用投与により、重篤な副作用を惹起したり、一方の物質が他方の物質の本来有する成長因子誘導作用を阻害する物質ではない限りにおいて特に限定されない。
【００３０】
本発明の成長因子誘導剤中の有効成分であるＧＡＧの配合量、及びその投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、疾患の重症度、患者の年齢、体重などに応じて個別に決定することができ、特に限定はされないが、ＧＡＧの臨床投与量としては、例えば成人に対しては、１日当り約０．１mg/kg〜３００mg/kg・体重を例示することができる。また、投与回数は１日１回程度でも可能であり、また１日２〜４回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴などにより連続的に投与することも可能である。
【００３１】
【実施例】
以下に、本発明を以下の製造例、試験例、及び製剤例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
製造例１
〔鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）の製造〕
鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）は「新規ガラクトサミノグリカン」（特開２０００−４０６０１号公報）に開示の方法で製造した。
ＡＣＤＳの調製
＜１＞鶏冠１，５００kgに水４０００Ｌを加えてミンチした後、煮沸し、冷却後、プロテアーゼ（商品名：プロナーゼ 科研製薬（株）製）を添加して一晩放置し、加水分解した。加水分解液に、塩化ベンザルコニウム溶液３２Ｌを添加後、珪藻土でろ過し、ろ過上清を捨て、珪藻土１８０kgを得た。この珪藻土に水３５０Ｌと塩化ナトリウム４２kgを加えた後、ろ過し、ろ液にエタノール２５０Ｌを加え、得られた沈殿物を乾燥させて、粉体１．３kgを得た。
＜２＞上記粉体を水１．３Ｌに溶解して１０％溶液となるように調製し、ShivelyとConrad法により亜硝酸処理を行って、ヘパリン／ヘパラン硫酸を除去した。すなわち、上記粉体を溶解した溶液を、０．１％亜硝酸水溶液に混和し、室温で１０分間放置した後、沈殿をろ過して除いた。ろ過液のｐＨを１０．５に調整し、塩化ナトリウムを終濃度１％になるように加え、さらにエタノールを終濃度４８％になるように３０〜４０分かけて攪拌しながら加えた。得られた沈殿物に活性炭を加えて、吸引ろ過し、ろ過液をイオン交換樹脂Diaion SA-12A（三菱化学（株））に通して脱塩し、通過液にエタノールを加え、鶏冠由来デルマタン硫酸の調製品（ＡＣＤＳ）１０５ｇを得た。
【００３２】
製造例２
〔ウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）の製造〕
ウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）は「抗血栓剤」（ＷＯ９５/０９１８８）に開示の方法で製造した。
ＢＩＤＳの調製
＜１＞ウシ小腸１０kgを切断し、糞及び脂肪を除去後、粘膜を回収した。これに水酸化ナトリウムを加え、２.５Ｎ、３Ｌに調整して、３７℃で２時間抽出した。この抽出液を中和後、珪藻土で濾過し、濾液を水で透析し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。上清に等量のエタノール及び５ｇの酢酸ナトリウムを加えて、沈澱物を得た。この沈澱物を０.６５Ｍ食塩溶液に溶かし、０．５Ｍ食塩溶液で平衡化した Diaion HPA-10（三菱化学（株）製）アニオン交換樹脂に負荷し、０.６５Ｍ及び１.１Ｍ食塩溶液で順次洗浄後、１.５Ｍ食塩溶液で溶出した。溶出画分を蒸留水を用いて透析し、透析内液に酢酸カルシウム及び酢酸を加え、それぞれ終濃度５％及び０.５Ｍに調整した。この液にエタノールを加え、１５〜３０％(V/V)で沈澱する画分を集めた。沈澱物を水に溶解して、イオン交換樹脂に通液して脱塩後、通過液を酢酸又は水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和液に２倍量のエタノールを加え、生じた沈殿を７０％エタノール、純エタノール及びエーテルの順で洗浄後、五酸化リン存在下で減圧乾燥し、ＢＩＤＳ中間品を得た。
＜２＞＜１＞で得られたＢＩＤＳ中間品について、ShivelとConrad法（Biochemistry 15, 3932-3942, 1976）の方法に準拠して亜硝酸分解を行い、ヘパリン・ヘパラン硫酸を除去し、ウシ腸由来デルマタン硫酸の調製品（ＢＩＤＳ）を得た。
【００３３】
以上のデルマタン硫酸２種（ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ）に加え、サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（以下、ＣＳＣという。生化学工業（株）製）、ウシ腎臓由来ヘパラン硫酸ナトリウム塩（以下ＨＳという。生化学工業（株）製）を後述する試験例の被検物質として用いた。
【００３４】
試験例１
〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）の測定法〕
ＡＰＴＴ活性の測定方法
ラットの下大静脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採血し、血液を３０００r.p.mで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得た鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得たウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリン（Syntex社製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．１０，０００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、あらかじめ３７℃に保温しておいたアクチン１００μlを添加し、さらに２分間保温した。ついで３７℃に保温しておいた０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。
【００３５】
ＴＴ活性の測定方法
血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得た鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得たウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリン（Syntex社製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．１０，０００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップに入れ、３７℃で２分間保温した。その後、５分前より３７℃に保温しておいたトロンビン（１０U/ml)１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。
【００３６】
上記試験法によって測定したＡＰＴＴ及びＴＴ値を示すグラフを、図１及び図２に示す。この結果から、試験したＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ及びヘパリンのいずれも、濃度依存性に血液凝固開始までの時間の延長傾向を示したものの、ＡＣＤＳ及びＢＩＤＳは、ヘパリンに比して抗血液凝固作用が極めて弱いことが示された。したがって、本発明の成長因子誘導剤の出血傾向は、ヘパリンより非常に弱く、本発明の成長因子誘導剤は、ヘパリンより安全性が高い医薬であることが示された。
【００３７】
試験例２
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）に対する各種グリコサミノグリカンの成長因子誘導作用〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）を２６才の成人女性肘内側皮膚より分離し、真皮を分離後トリプシン処理し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地にて８世代継代維持した後、通常の方法により凍結保存した。
試験時には、凍結保存したＨＳＦ−１をHuMedia-EG2培地（クラボウ（株）製）を用いて２４wellマイクロプレートでコンフルエントになるまで培養した。
【００３８】
培地を HuMedia-EG培地（クラボウ（株）製）に置換したのち、最終濃度０.１mg/mlになるようにＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、又はヘパリン（ＳＰＬ社製ブタ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，０００）を添加した。４８時間培養後、培養上清を別の容器に移し、遠心分離して、細胞成分を除去した後、各種成長因子の濃度を測定した。
【００３９】
培養上清中に含まれるｂＦＧＦおよびＨＧＦの濃度は、それぞれQuantikine HUMAN FGF-basic ELISA kitおよび Quantikine HUMAN HGF ELISA kit（いずれもR&D systems製）を用いて測定した。対象として何も添加せず同様にして得られた培養上清中の各種成長因子の濃度も測定した。この測定結果を図３及び図４に示す。
【００４０】
この結果から、ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、又はヘパリンのいずれを添加した場合においても、無添加対照群に比して、培養終了後における培養上清中のｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度が高いことが示された。また、本試験例では、各種ＧＡＧ又はヘパリンの添加後４８時間しか経過しておらず、細胞***は起こっていないと推測され、更に、本試験例における添加濃度０.１mg/mlにおいては各種ＧＡＧ自身に細胞毒性がないことも確認済みである。したがって、本試験に用いたＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンが、培養線維芽細胞自体が有する内因性成長因子の濃度に関する制御機構に働きかけ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度を増加させたものと考えられる。
【００４１】
試験例３
〔初代ヒト真皮線維芽細胞に対する各種グリコサミノグリカンの成長因子誘導作用〕
初代ヒト真皮線維芽細胞（日水製薬（株）製）を、type-1コラーゲン(Cell Matrix Type-1A、新田ゼラチン製）をコートしたディッシュ上で、５％のＦＢＳを含有する線維芽細胞用培地（日水製薬（株）製）にて培養した。適度に増殖させた後、細胞をトリプシン/０．０２％エチレンジアミン４酢酸水溶液を用いて、回収した。回収した細胞を５％ＦＢＳを含有する線維芽細胞用培地で５×１０4個/wellになるように４８−wellプレートに播種した。常法で２４時間培養した後、培地を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリン（ＳＰＬ社製ブタ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，０００）を、種々の濃度（１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml、１０００μg/ml、ただしＡＣＤＳのみ１０μg/ml、１００μg/ml、１０００μg/ml、２５００μg/ml）で添加した。さらに２４時間培養後、培養上清を別の容器に移し遠心分離して細胞成分を除去した後、成長因子の濃度を測定した。
【００４２】
培養上清中に含まれるＨＧＦの濃度は、Quantikine HUMAN HGF ELISA kit（ R&D systems製）を用いて測定した。対照として何も添加せず同様にして得られた培養上清中の成長因子の濃度も測定した。その結果を図５に示す。
【００４３】
この結果から、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリンのいずれを添加した場合でも、培養上清中のＨＧＦ濃度が増加したことが示された。試験例２においては各種ＧＡＧ又はヘパリンの添加濃度は０.１mg/mlであったが、０.１mg/mlの１０分の１あるいは１００分の１の低濃度においても各種ＧＡＧ及びヘパリンが、培養線維芽細胞自体が有する内因性のＨＧＦ濃度を増加させることが示された。
【００４４】
製剤例
製剤例１：眼用溶液
製造例１で得たＡＣＤＳ １mg
塩化ナトリウム ９００mg
チオメルサール １mg
上記に精製水を加えて全１００mlとし、pH５．５〜７．５に調整したのち、無菌濾過し、無菌容器に充填した。
【００４５】
製剤例２：軟膏１
製造例２で得たＢＩＤＳ ２ｇ
鉱油 ４ｇ
石油ゼリー ８ｇ
混合メチル／プロピルパラバン ０．０６ｇ
非イオン性界面活性剤 １ｇ
精製水 ３０ｇ
上記を常法により混合し、容器に充填した。
【００４６】
製剤例３：軟膏２
製造例１で得たＡＣＤＳ ０．１ｇ
白色ワセリン １８ｇ
精製水 ２ｇ
上記を常法により混合し、容器に充填した。
【００４７】
製剤例４：注射用製剤
製造例１で得たＡＣＤＳ ０．５ｇ
上記に注射用食塩水２０mlを加え、無菌濾過した後アンプルに分注し、密封した。
【００４８】
【発明の効果】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有効成分として含有する本発明の成長因子誘導剤は、成長因子を人為的に外部から併用投与したり、又は予め成長因子を配合又は結合させて投与しなくても、単独に投与された場合に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の濃度調節機構に働きかけ、内因性の成長因子の濃度を増加させる。また、本発明の成長因子誘導剤では、ヘパリン系医薬において問題となる抗血液凝固活性が低く、出血の危険性が極めて低いため、成長因子の欠乏あるいは減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）及び治療のために、安全で有用な医薬として投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＡＰＴＴ測定値を示す。
【図２】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＴＴ測定値を示す。
【図３】培養上清中のｂＦＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。
【図４】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。
【図５】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、ＨＳ、及びヘパリンの効果を示す。
Claims (3)
- コンドロイチン硫酸Ｃ若しくはデルマタン硫酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、塩基性線維芽細胞増殖因子又は肝細胞増殖因子誘導剤。
- デルマタン硫酸が、鶏冠由来のデルマタン硫酸又はウシ腸由来のデルマタン硫酸である、請求項１記載の誘導剤。
- 皮膚組織における塩基性線維芽細胞増殖因子又は肝細胞増殖因子を誘導する、請求項１又は２記載の誘導剤。
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