JP4627296B2 - 発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法、具体的には、麦芽使用比率の低い発泡酒等の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、用いるプロテアーゼのエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの構成を調整し、麦汁中の遊離アミノ酸、起泡性タンパク質含量、及び、麦汁の濾過性において優れた発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造する方法に関する。更に、詳しくは、発泡酒等の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、該麦汁の製造に用いられるプロテアーゼとして、低減化した量のエンドプロテアーゼと増加した量のエキソペプチダーゼからなるプロテアーゼを用い、麦汁中の遊離アミノ酸の増強と起泡性タンパク質の保持、及び、麦汁の濾過性の保持とを図り、発酵麦芽飲料製造用麦汁として優れた性質を持つ発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造する方法に関する。
我が国の酒税法上、麦芽を使用する酒類のうち、ビールは、主原料としての麦芽、副原料としての米、麦、コーン、スターチ等の澱粉質、ホップ及び水を原料とするものであり、水を除く麦芽の使用量が６６．７重量％以上と規定されている。一方、発泡酒では、上記原料のうち、水を除く麦芽の使用量が５０重量％以上６６．７重量％未満、２５重量％以上５０重量％未満、２５重量％未満の３種類が規定されている。
発泡酒は、我が国の酒税法上、麦芽を原料の一部として用いた雑種に属し、ビールも発泡酒も、いずれも麦芽の活性酵素やカビ由来などの精製された酵素を用い、副原料である澱粉質を糖化させ、糖化液を発酵させて、アルコール、炭酸ガスに分解して得るアルコール飲料である点では共通している。従って、発泡酒の作り方も、ビールの作り方と基本的に大きく変わるものでなく、ビールの製造装置を使用して作ることが可能である。
このような発泡酒においては、仕込等を同一条件で製造したとしても、麦芽の使用量によって、得られる麦汁中の遊離アミノ態窒素（ＦＡＮ）量が変化し、発酵工程における酵母の代謝及び生育に影響を及ぼし、その香味に変化を生ずる。すなわち、麦芽の使用量を減らしていき、麦芽以外の副原料の使用量に対して麦芽の使用量を少なくした場合には、ビールと同一条件で発泡酒を製造したとしても、麦汁中のＦＡＮ生成量の減少によって酵母の醗酵性が悪化し、コハク酸やリンゴ酸のような有機酸の生成量が増加し、酸味の増加が目立ってくる。
発泡酒のような発酵麦芽飲料の製造において問題となる、麦芽使用量の減少による酵素不足及び香味の変化に対する改善技術としては、仕込工程において外部酵素を添加する方法（特公昭５５−３８１１０号公報）や、副原料の一部又は全部を大麦分解物とする方法（特開２００１-３３３７６０号公報）、或いは、発酵工程前に酵母の栄養源として酵母エキスやペプトンなどの有機窒素源を添加する方法（特開平１１−１７８５６４号公報）が開示されている。
また、仕込工程中にプロテアーゼを添加することにより、麦汁中の遊離アミノ酸が増加することが知られており（発酵工学会誌, Vol.59, No.5, 421-429, 1981）、プロテアーゼの添加によって麦汁中のＦＡＮ生成量を増加させる、或いは発酵工程前にアミノ酸を添加する方法が開示されている（特開平１０−１１７７６０号公報、特開平１０−２２５２８７号公報）。しかし、一方で、プロテアーゼの添加は麦汁濾過を悪化させることやビールの泡持ちを低下させることが知られている。
麦汁中の遊離アミノ酸の増加には、エンドプロテアーゼとエキソペプチダーゼが寄与していることが開示されている（特表２０００−５０４５７１号公報）。しかし、ここで報告されているエキソペプチダーゼはロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）若しくはフェニルアラニン−アミノペプチダーゼを指しており、該公報では、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）については言及されていない。しかしながら、本発明者は、精製したＬＡＰ及びＤＡＰを用いて糖化試験を行い、ＬＡＰのみを増強してもＦＡＮ増加効果は低いこと、を確認している。
プロテアーゼを用いたペプチドの分解において、ペプチド中にプロリンが存在する場合には、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したＸ-Pro-peptideの状態でＬＡＰによる分解が停止してしまい、ＬＡＰを増強しても遊離アミノ酸は増加しないことが知られており（醤油の科学と技術, 栃倉辰六郎編, 日本醸造協会, 174-176, 1988）、醤油醸造における原料タンパクの分解では、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）がＬＡＰの分解できないX-Pro-peptideのアミノ末端よりX-Proのジペプチドを特異的に遊離することによって、ＤＡＰ分解生成ペプチドに更にＬＡＰが作用して、アミノ酸の遊離生成が進行することが報告されている（J. Brew. Soc. Japan, Vol.93, No.4, 307-311, 1998）。
また、上記特許（特表２０００−５０４５７１号公報）では、エキソペプチダーゼ（ＬＡＰ）の添加によって麦汁濾過性が改善することが報告されているが、上記のように、本発明者は、精製したＬＡＰ及びＤＡＰを用いて糖化試験を行い、ＬＡＰのみを増強しても濾過性が改善しないことを見出している。
以上のように、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、該麦汁の製造に用いられるプロテアーゼの市販酵素剤は、該プロテアーゼのエンドプロテアーゼやエキソペプチダーゼのような構成酵素の比率や組成については、何も考慮されていないことから、プロテアーゼを用いて調製した麦汁においては、仕込工程で麦汁中の遊離アミノ酸が思うように増加しないことや、遊離アミノ酸が増加しても、麦汁濾過の悪化やビールの泡持ち低下を引き起こすなどの問題があった。そこで、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造におけるこれらの問題の解決が課題とされていた。
本発明の課題は、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法、具体的には、麦芽使用比率の低い発泡酒等の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、麦汁中の遊離アミノ酸、起泡性タンパク質含量、及び、麦汁の濾過性等において優れた発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造する方法を提供すること、更に、詳細には、発泡酒等の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、該麦汁の製造に用いられるプロテアーゼのエンドプロテアーゼとエキソペプチダーゼの構成を調整し、麦汁中の遊離アミノ酸の増強と起泡性タンパク質の保持、及び、麦汁の濾過性の保持とを図り、発酵麦芽飲料製造用麦汁として優れた性質を持つ発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造する方法を提供することにある。更には、優れた性質を持つ発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造に用いられる上記プロテアーゼの調製方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、次のようなことを確認した。すなわち、特表２０００−５０４５７１号公報に記載された発明では、エキソペプチダーゼ（ＬＡＰ）の添加によって麦汁濾過性が改善することが報告されているが、本発明者は、精製したＬＡＰ及びＤＡＰ（Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノぺプチダーゼ）を用いて糖化試験を行い、ＬＡＰのみを増強しても濾過性が改善しないこと、ＤＡＰの共存によって濾過性が改善することを確認した。更に、エンドプロテアーゼ（特に、耐熱性エンドプロテアーゼ）が過剰にあると、エキソペプチダーゼの増強によって濾過性が悪化することを確認した。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、該麦汁の製造に用いられるプロテアーゼとして、低減化した量のエンドプロテアーゼ（エンドプロテアーゼの低減化）と増加した量のエキソペプチダーゼ（エキソペプチダーゼの増強）からなるプロテアーゼを用い、麦汁を製造することにより、麦汁中の遊離アミノ酸を増強し、かつ、起泡性タンパク質と麦汁の濾過性の低減化を抑制して、発酵麦芽飲料製造用麦汁として優れた性質を持つ発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造するものである。
本発明においては、プロテアーゼ（粗酵素）における構成酵素、すなわち、エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼ、エンドプロテアーゼにおける耐熱性エンドプロテアーゼ及び非耐熱性エンドプロテアーゼ、エキソペプチダーゼにおけるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノぺプチダーゼ（ＤＡＰ）等について、及びそれらの酵素の含有比率についての、麦汁製造における影響について、特に、麦汁中の遊離アミノ酸の増強及び、麦汁の濾過性、起泡タンパク量の改善について検討する中で、遊離アミノ態窒素の増強と濾過性の改善について、それらを両立する以下の３通りの最適比率を見出し、本発明は、かかるプロテアーゼの構成酵素の含有比率を基本構成とする。
（１）エンドプロテアーゼ活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にする。
（２）エンドプロテアーゼ活性５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときには、総エンド活性中の耐熱性エンドプロテアーゼの比率を２．５％未満、望ましくは１．２５％以下に低減する、若しくは耐熱性エンドプロテアーゼ無添加とし、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にする。
（３）耐熱性エンドプロテアーゼ活性を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にする。
（２）エンドプロテアーゼ活性５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときには、総エンド活性中の耐熱性エンドプロテアーゼの比率を２．５％未満、望ましくは１．２５％以下に低減する、若しくは耐熱性エンドプロテアーゼ無添加とし、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にする。
（３）耐熱性エンドプロテアーゼ活性を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にする。
ここで、本発明における、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）、及びエンド型プロテアーゼ（アゾカゼイン法）の活性の定義は、実施例２に示した、［ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性測定］、［Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性測定］、［エンド型プロテアーゼ活性測定（アゾカゼイン法）］の測定の定義による。
本発明は、更に、本発明のプロテアーゼの構成酵素の含有比率を有するプロテアーゼの調製方法を包含する。本発明において用いられるエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼとしては、Aspergillus属に属する麹菌、例えば、Aspergillus oryzaeのような微生物由来のプロテアーゼを用いることができる。本発明において、本発明の麦汁の製造に用いられるプロテアーゼの調製には、上記のような微生物に由来するプロテアーゼ粗酵素剤から、エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼを精製・分離し、所定のエンドプロテアーゼ含量及びエキソペプチダーゼ含量に再構成することにより調製することができる。
上記プロテアーゼ粗酵素剤からのエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの精製・分離、及び再構成は、プロテアーゼ粗酵素剤を、クロマトグラフィーにより精製・分離して、或いは、プロテアーゼ粗酵素剤を、熱処理することによって粗酵素剤中の非耐熱性エンドプロテアーゼを失活させ、行うことができる。酵素の精製・分離については、［「タンパク質実験ハンドブック」羊土社、２００３；「蛋白質、酵素の基礎実験法」南江堂、１９９４］などの文献に記載の一般的な方法で精製・分離が可能である。また、本発明においては、プロテアーゼ粗酵素剤を、阻害剤若しくは吸着剤により粗酵素中から耐熱性エンドプロテアーゼを失活、除去させ、所定のエンドプロテアーゼ含量及びエキソペプチダーゼ含量への再構成を行うことができる。本発明における上記エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼの精製・分離、及び再構成においては、熱処理による粗酵素剤中の非耐熱性エンドプロテアーゼの失活、及び／又は、阻害剤若しくは吸着剤による粗酵素中からの耐熱性エンドプロテアーゼの失活を、熱処理及び阻害剤添加アッセイによって、特異的に定量測定することによって行うことができる。
更に、本発明においては、麦汁の製造に用いるプロテアーゼの調製を、プロテアーゼ生産菌のエキソペプチダーゼ(ＬＡＰ及びＤＡＰ)量に対するエンドプロテアーゼ総量の相対的な低減化、非耐熱性エンドプロテアーゼの非生産化、エキソペプチダーゼ(ＬＡＰ及びＤＡＰ)量に対する耐熱性エンドプロテアーゼ量の相対的な低減化、及び、耐熱性エンドプロテアーゼ非生産化に繋がるいずれかの特性を獲得したプロテアーゼ生産菌を育種し、該プロテアーゼ生産菌により行うことができる。本発明における、所定のエンドプロテアーゼ含量及びエキソペプチダーゼ含量のプロテアーゼを生産するプロテアーゼ生産菌の育種手段としては、該プロテアーゼを発現する遺伝子の改変によって行うことができる。該プロテアーゼを発現する遺伝子としては、Aspergillus oryzaeのプロテアーゼ遺伝子を用いることができる。
本発明は、本発明のプロテアーゼの調製方法によって調製されたプロテアーゼを用いて、麦汁を製造し、該麦汁を発酵させることにより製造された、発泡酒のような発酵麦芽飲料を包含する。
すなわち具体的には本発明は、［１］麦汁の製造に用いられるプロテアーゼとして、低減化した量のエンドプロテアーゼと増加した量のエキソペプチダーゼからなるプロテアーゼを用い、麦汁中の遊離アミノ酸の増強と起泡性タンパク質の保持、及び、麦汁の濾過性の保持とを図った発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減された量であるか、又は、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときに、耐熱性エンドプロテアーゼ活性の全体のエンド活性に対する比率が１．２５％以下に低減された量であり、かつ、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかとなるように増加した量であることを特徴とする発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法からなる。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
また本発明は、［２］プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減された量であるか、又は、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときに、耐熱性エンドプロテアーゼ活性の全体のエンド活性に対する比率が１．２５％以下に低減された量であり、かつ、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかであることを特徴とする前記［１］記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法からなる。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
さらに本発明は、［３］プロテアーゼのエンドプロテアーゼを耐熱性エンドプロテアーゼのみとし、耐熱性エンドプロテアーゼ含量を０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下とし、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかとなるように増加した量であることを特徴とする前記［２］記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法からなる。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
また本発明は、［４］耐熱性エンドプロテアーゼ含量を０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下とし、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかであることを特徴とする前記［３］記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法からなる。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
以下に、本発明を更に詳細に説明するために、本発明のプロテアーゼについて、該プロテアーゼの構成酵素及び含有比率による麦汁への影響について、本発明者が行った該構成酵素の分離・精製、及びそれらの各酵素の機能の解明についての実験例を記載する。
（市販プロテアーゼ製剤の評価）
各種市販酵素剤をタンパク質原料に添加して糖化したところ、Aspergillus oryzae起源の「スミチームＦＰ」（新日本化学工業社製）の遊離アミノ態窒素増強効果が最も高かった。しかし、麹菌由来の酵素は遊離アミノ態窒素を増強する一方で、麦汁濾過性を悪化させることがわかった。そこで、スミチームＦＰ中のプロテアーゼを精製し、遊離アミノ態窒素増強因子および濾過性悪化因子を特定することとした。
各種市販酵素剤をタンパク質原料に添加して糖化したところ、Aspergillus oryzae起源の「スミチームＦＰ」（新日本化学工業社製）の遊離アミノ態窒素増強効果が最も高かった。しかし、麹菌由来の酵素は遊離アミノ態窒素を増強する一方で、麦汁濾過性を悪化させることがわかった。そこで、スミチームＦＰ中のプロテアーゼを精製し、遊離アミノ態窒素増強因子および濾過性悪化因子を特定することとした。
（各種酵素の大量精製）
スミチームＦＰをクロマト（DEAEおよびPhenyl、ハイドロキシアパタイト）によって精製し、エンドプロテアーゼ３種、エキソペプチダーゼ２種を得た。SDS-PAGEでのメインバンドをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、リジルエンドペプチダーゼ（LysC）で限定分解後、MALDI-TOF/MS（マルディ−トフマス）解析による分子種の特定を行った結果、エンドプロテアーゼ３種は、セリンタイプのアルカリプロテアーゼ（別名：オリツィン）、中性メタルプロテアーゼＩ、耐熱性が高くカゼインに対する反応性が低い中性メタルプロテアーゼII（別名：デューテロリシン）であった。便宜上それぞれエンドａ、エンドｂ、エンドｃと命名した（以降、エンドａ、ｂ、ｃと表記した場合は上記の分子種を指すこととする）。エキソ型２種は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ：別名ＤＡＰIV）であった。
スミチームＦＰをクロマト（DEAEおよびPhenyl、ハイドロキシアパタイト）によって精製し、エンドプロテアーゼ３種、エキソペプチダーゼ２種を得た。SDS-PAGEでのメインバンドをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、リジルエンドペプチダーゼ（LysC）で限定分解後、MALDI-TOF/MS（マルディ−トフマス）解析による分子種の特定を行った結果、エンドプロテアーゼ３種は、セリンタイプのアルカリプロテアーゼ（別名：オリツィン）、中性メタルプロテアーゼＩ、耐熱性が高くカゼインに対する反応性が低い中性メタルプロテアーゼII（別名：デューテロリシン）であった。便宜上それぞれエンドａ、エンドｂ、エンドｃと命名した（以降、エンドａ、ｂ、ｃと表記した場合は上記の分子種を指すこととする）。エキソ型２種は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ：別名ＤＡＰIV）であった。
ＬＡＰはＬＡＰ１とＬＡＰ２の種類の分子種があったが、遊離アミノ態窒素増強への効果は同程度であり、主にＬＡＰ１を用いて検討を実施したため、以降ＬＡＰと表記した場合はＬＡＰ１を指すこととする。ＤＡＰについてもLys-Ala-MCAを基質とするＤＡＰIIが存在したが、遊離アミノ態窒素増強への効果はほとんどなく、主にＤＡＰ１を用いて検討を実施したため、以降ＤＡＰと表記した場合はＤＡＰ１を指すこととする。
（エンド型分子種特異的検出法の開発）
エンドｃはカゼインへの反応性が低く、特異的に反応する基質としては、Boc-Arg-Val-Arg-Arg-MCAやBoc-Leu-Lys-Arg-MCAなどが報告されている（日本農芸化学会誌, 大会講演要旨集, 50, 2001）が、粗酵素の状態ではＬＡＰの混入によってエンドａ及びｂでも蛍光を発してしまう。そこで本発明者らは、エンドｃの耐熱性を利用して、熱処理と阻害剤添加アッセイを組み合わせることにより、エンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出法を開発した。この検出法により、粗酵素の状態でもエンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出・定量が可能となった。
エンドｃはカゼインへの反応性が低く、特異的に反応する基質としては、Boc-Arg-Val-Arg-Arg-MCAやBoc-Leu-Lys-Arg-MCAなどが報告されている（日本農芸化学会誌, 大会講演要旨集, 50, 2001）が、粗酵素の状態ではＬＡＰの混入によってエンドａ及びｂでも蛍光を発してしまう。そこで本発明者らは、エンドｃの耐熱性を利用して、熱処理と阻害剤添加アッセイを組み合わせることにより、エンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出法を開発した。この検出法により、粗酵素の状態でもエンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出・定量が可能となった。
（遊離アミノ態窒素増強因子・濾過性悪化因子の特定）
精製したエンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼを用いて糖化したところ、エンド型もエキソ型も遊離アミノ態窒素増強因子であることを確認した。しかし、エキソ型は単独では遊離アミノ態窒素がほとんど増加せず、エンド型の添加によって遊離アミノ態窒素の増加が進行した。したがって、エンドとエキソの共存によって、遊離アミノ態窒素が増強することが明らかとなった。一方で、エンド型を増強すると濾過性が悪化することがわかった。その中でも、エンドｃは遊離アミノ態窒素増強・濾過性悪化への寄与が大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。エンドｃはカゼインに対する反応性が低く、アゾカゼイン法ではスミチームＦＰ中エンド活性の５％程度であるが、遊離アミノ態窒素増強の５０％程度の効果はエンドｃに起因しており、見かけ上の活性以上にその影響が大きいことが明らかとなった。
精製したエンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼを用いて糖化したところ、エンド型もエキソ型も遊離アミノ態窒素増強因子であることを確認した。しかし、エキソ型は単独では遊離アミノ態窒素がほとんど増加せず、エンド型の添加によって遊離アミノ態窒素の増加が進行した。したがって、エンドとエキソの共存によって、遊離アミノ態窒素が増強することが明らかとなった。一方で、エンド型を増強すると濾過性が悪化することがわかった。その中でも、エンドｃは遊離アミノ態窒素増強・濾過性悪化への寄与が大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。エンドｃはカゼインに対する反応性が低く、アゾカゼイン法ではスミチームＦＰ中エンド活性の５％程度であるが、遊離アミノ態窒素増強の５０％程度の効果はエンドｃに起因しており、見かけ上の活性以上にその影響が大きいことが明らかとなった。
（最適比率検討：エンド添加量低減）
エンド添加量を低減して糖化したところ、エンド活性５〜１０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、エキソ(ＬＡＰ及びＤＡＰ)の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンド活性を２．５Ｕ／ｇ−大麦まで低減すると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善が両立できることがわかった。
エンド添加量を低減して糖化したところ、エンド活性５〜１０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、エキソ(ＬＡＰ及びＤＡＰ)の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンド活性を２．５Ｕ／ｇ−大麦まで低減すると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善が両立できることがわかった。
つまり、エンドが過剰に存在していると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の添加量を増やしても濾過性は改善されず、むしろ悪化してしまうため、エキソの増強によって濾過性を改善するには、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減する必要があることを明らかにした。本発明者は、様々な酵素比率での糖化試験により、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善が両立できることを見出した。
（最適比率検討：耐熱性エンド低減）
濾過性悪化には耐熱性のエンドｃの寄与が大きいことから、エンドｃ添加量を低減して糖化したところ、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）とし、総エンド活性中の耐熱性エンド(エンドｃ)比率を２．５〜５．０％とした系では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ比率を１．２５％まで低減すると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。更に、エンドｃ無添加として糖化したところ、エンド活性を７．５Ｕ／ｇ−大麦とし、エンドａ：ｂ：ｃ＝７０：３０：０で、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善が両立できることがわかった。
濾過性悪化には耐熱性のエンドｃの寄与が大きいことから、エンドｃ添加量を低減して糖化したところ、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）とし、総エンド活性中の耐熱性エンド(エンドｃ)比率を２．５〜５．０％とした系では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ比率を１．２５％まで低減すると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。更に、エンドｃ無添加として糖化したところ、エンド活性を７．５Ｕ／ｇ−大麦とし、エンドａ：ｂ：ｃ＝７０：３０：０で、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善が両立できることがわかった。
また、ＬＡＰを増強してもＤＡＰ無添加の系では遊離アミノ態窒素がほとんど増加しないことを確認した。同様に、ＬＡＰ無添加の系では、ＤＡＰを増強しても遊離アミノ態窒素がほとんど増加しないことを確認した。これも、特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、遊離アミノ態窒素増強にはＬＡＰとＤＡＰの共存が重要であることが明らかとなった。更に、ＤＡＰ無添加の系、或いはＬＡＰ無添加の系では、それぞれＬＡＰ、或いはＤＡＰを増強しても濾過性はほとんど改善しないことを確認した。
本発明者らは、様々な酵素比率での糖化試験により、エンド活性５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときには、総エンド活性中の耐熱性エンド（エンドｃ）比率を２．５％未満、望ましくは１．２５％以下に低減する、もしくは耐熱性エンド無添加とし、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ-大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した。
（最適比率検討：耐熱性エンド単独添加量低減）
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、エンドプロテアーゼを耐熱性エンド（エンドｃ）のみにして糖化したところ、エンドｃ活性０．１Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化することを確認した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ活性０．０５Ｕ／ｇ−大麦では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。本発明者らは、様々な酵素比率での糖化試験により、耐熱性エンド活性を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ-大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した。
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、エンドプロテアーゼを耐熱性エンド（エンドｃ）のみにして糖化したところ、エンドｃ活性０．１Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化することを確認した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ活性０．０５Ｕ／ｇ−大麦では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。本発明者らは、様々な酵素比率での糖化試験により、耐熱性エンド活性を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ-大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した。
（起泡タンパク低減抑制）
ビール、発泡酒中において、ＬＴＰ（Lipid transfer protein）は起泡タンパク質であることが報告されている（J. Agric.Food Chem. Vol. 48,No.10, 5023-5029,2000）。そこで、エンド型の添加が起泡タンパク（ＬＴＰ）に及ぼす影響を評価したところ、エンド型の添加によってＬＴＰが分解されていることを確認した。したがって、エンド型は起泡タンパク低減因子であることが明らかとなった。その中でも、エンドａ、ｃの添加によってＬＴＰが分解されており、一方で、エキソ型及びエンドｂの添加では、ＬＴＰはほとんど分解されなかったことから、起泡タンパク低減因子はエンドａ及びエンドｃであることが明らかとなった。特にエンドｃの寄与は大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。
ビール、発泡酒中において、ＬＴＰ（Lipid transfer protein）は起泡タンパク質であることが報告されている（J. Agric.Food Chem. Vol. 48,No.10, 5023-5029,2000）。そこで、エンド型の添加が起泡タンパク（ＬＴＰ）に及ぼす影響を評価したところ、エンド型の添加によってＬＴＰが分解されていることを確認した。したがって、エンド型は起泡タンパク低減因子であることが明らかとなった。その中でも、エンドａ、ｃの添加によってＬＴＰが分解されており、一方で、エキソ型及びエンドｂの添加では、ＬＴＰはほとんど分解されなかったことから、起泡タンパク低減因子はエンドａ及びエンドｃであることが明らかとなった。特にエンドｃの寄与は大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。
エンド添加量およびエンドｃ添加量を低減して糖化したところ、エンド添加量が多い、若しくはエンドｃ添加量が多いほどＬＴＰの分解は進行することがわかった。一方で、エンドｃ無添加及びエンドｃ添加量を低減した系ではＬＴＰが残存していることから、エンド添加量を減らす、若しくは耐熱性エンド添加量を低減することによって、起泡タンパクの低減を抑制できると考えられる。エキソの増強ではＬＴＰはほとんど分解されないことから、本発明者は、エンド添加量を減らす、若しくは耐熱性エンド添加量を低減し、エキソ型を増強することによって、遊離アミノ態窒素の増強及び濾過性の改善だけでなく、起泡タンパクの低減も抑制できることを見出した。
本発明により、麦汁の調製に用いるプロテアーゼの構成酵素を、その機能によって調整することができ、麦汁の調製に好ましい酵素作用を選択的に調整したプロテアーゼを調製することができる。したがって、本発明で調製したプロテアーゼを用い、麦汁を製造することにより、麦汁中の遊離アミノ酸を増強し、かつ、起泡性タンパク質と麦汁の濾過性の低減化を抑制して、発酵麦芽飲料製造用麦汁として優れた性質を持つ発酵麦芽飲料製造用麦汁を製造することができる。
本発明は、発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、麦汁の製造に用いられるプロテアーゼとして、低減化した量のエンドプロテアーゼと増加した量のエキソペプチダーゼからなるプロテアーゼを用い、製造した麦汁中の遊離アミノ酸の増強と起泡性タンパク質の保持、及び、麦汁の濾過性の保持とを図ることからなる。ここで、エキソペプチダーゼとしては、ロイシン−アミノペプチダーゼ(ＬＡＰ)、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ(ＤＡＰ)が挙げられる。エンドプロテアーゼとしては、耐熱性或いは非耐熱性エンドプロテアーゼが挙げられる。
（プロテアーゼ）
本発明において用いるアミノペプチダーゼとしては、ロイシンアミノペプチダーゼ、或いはそれに類するようなアミノ末端からアミノ酸を一つずつ遊離する活性を持つ酵素であれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。ジペプチジルアミノペプチダーゼとしては、アミノ末端にＸ−プロリン配列を持つペプチドからＸ−プロリンを遊離する活性を持つ酵素、すなわちＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼであれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。エンド型プロテアーゼとしては、耐熱性の低いものとして中性メタルプロテアーゼＩやアルカリプロテアーゼ（別名オリツィン）などが挙げられる。耐熱性の高いものとしては中性メタルプロテアーゼＩＩ（別名デューテロリシン）などが挙げられる。耐熱性、至適ｐＨや基質特異性など、酵素学的な性質の類似した酵素であれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。
本発明において用いるアミノペプチダーゼとしては、ロイシンアミノペプチダーゼ、或いはそれに類するようなアミノ末端からアミノ酸を一つずつ遊離する活性を持つ酵素であれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。ジペプチジルアミノペプチダーゼとしては、アミノ末端にＸ−プロリン配列を持つペプチドからＸ−プロリンを遊離する活性を持つ酵素、すなわちＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼであれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。エンド型プロテアーゼとしては、耐熱性の低いものとして中性メタルプロテアーゼＩやアルカリプロテアーゼ（別名オリツィン）などが挙げられる。耐熱性の高いものとしては中性メタルプロテアーゼＩＩ（別名デューテロリシン）などが挙げられる。耐熱性、至適ｐＨや基質特異性など、酵素学的な性質の類似した酵素であれば、いずれの麹菌由来の酵素でもよい。
麹菌としては、Aspergillus oryzae（アスペルギルス・オリゼ）、Aspergillus sojae（アスペルギルス・ソーエ）、Aspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）、Aspergillus kawachii（アスペルギルス・カワチ）、Aspergillus awamori（アスペルギルス・アワモリ）、Aspergillus saitoi（アスペルギルス・サイトイ）等が挙げられる。その中でもAspergillus oryzae（アスペルギルス・オリゼ）、或いはその近縁であり、ほぼ同等の酵素を生産するAspergillus sojae（アスペルギルス・ソーエ）由来のものが特によい。その他同等の酵素を生産するものであれば、その他の糸状菌（RhizopusやMucor、Monascusなど）を用いてもよい。また、同等の性質を持つ酵素（アミノペプチダーゼ、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ、或いはエンド型プロテアーゼ）を生産する微生物であれば、麹菌だけでなく、PenicilliumやAcremoniumのようなその他の糸状菌、Saccaromycesのような酵母、Grifolaのような担子菌、BacillusやLactobacillusのような細菌、或いは放線菌などに由来するものでもよい。
（プロテアーゼ構成酵素の精製・分離）
本発明における麹菌の各種プロテアーゼの分画物は下記に示すような、公知の方法によって得ることができる。例えば、麹菌の液体培養物を遠心分離、珪藻土濾過、或いは膜濾過等によって菌体除去し、濾液として粗酵素抽出物を得る事ができる。また固体培養物を常温の水、若しくは適当な緩衝液中に懸濁し、そのまま攪拌若しくは超音波処理、磨砕、フレンチプレス等により固形物を破砕し、遠心分離、珪藻土濾過、或いは膜濾過等によって残渣を除去し、濾液として粗酵素抽出物を得る事ができる。粗酵素抽出液は更に減圧濃縮、ＵＦ濃縮、凍結乾燥、或いはスプレードライによる乾燥などの方法によって濃縮する事ができる。
本発明における麹菌の各種プロテアーゼの分画物は下記に示すような、公知の方法によって得ることができる。例えば、麹菌の液体培養物を遠心分離、珪藻土濾過、或いは膜濾過等によって菌体除去し、濾液として粗酵素抽出物を得る事ができる。また固体培養物を常温の水、若しくは適当な緩衝液中に懸濁し、そのまま攪拌若しくは超音波処理、磨砕、フレンチプレス等により固形物を破砕し、遠心分離、珪藻土濾過、或いは膜濾過等によって残渣を除去し、濾液として粗酵素抽出物を得る事ができる。粗酵素抽出液は更に減圧濃縮、ＵＦ濃縮、凍結乾燥、或いはスプレードライによる乾燥などの方法によって濃縮する事ができる。
粗酵素抽出物からの各種プロテアーゼの精製には、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、塩沈澱及び有機溶媒沈澱のような溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。また、抽出、精製後の濃縮についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、限外濾過、減圧加熱濃縮などを具体的に例示することができる。
更に、抽出、精製後の乾燥についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法などを具体的に例示することができる。また、熱処理、ｐＨ処理、阻害剤、吸着剤による吸着除去、或いはこれらのいずれかの組み合わせ等により、夾雑酵素を物理的に失活、或いは除去し、目的の酵素活性だけを残して、精製分画する事もできる。
（プロテアーゼ構成酵素の最適構成の調製）
このようにして調製した精製酵素を本発明で示すような最適比率のプロテアーゼ組成に混合する事により、遊離アミノ態窒素量と麦汁濾過性および起泡タンパク量に優れた麦汁の調製に用いる事ができる。例えば本発明で指すエンドａ、ｂは耐熱性が低く、かつロイシンアミノペプチダーゼ、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ、及びエンドｃは耐熱性が高いことを見出したので、熱処理によってロイシンアミノペプチダーゼ、Ｘ-プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼなどのエキソ型は残し、エンド型としてはエンドｃのみにしてエンド型を低減する事により、最適比率のプロテアーゼ組成を作る事もできる。
このようにして調製した精製酵素を本発明で示すような最適比率のプロテアーゼ組成に混合する事により、遊離アミノ態窒素量と麦汁濾過性および起泡タンパク量に優れた麦汁の調製に用いる事ができる。例えば本発明で指すエンドａ、ｂは耐熱性が低く、かつロイシンアミノペプチダーゼ、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ、及びエンドｃは耐熱性が高いことを見出したので、熱処理によってロイシンアミノペプチダーゼ、Ｘ-プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼなどのエキソ型は残し、エンド型としてはエンドｃのみにしてエンド型を低減する事により、最適比率のプロテアーゼ組成を作る事もできる。
（微生物によるプロテアーゼ構成酵素の最適構成の調製）
本発明においては、プロテアーゼ構成酵素の最適構成の調製を、該酵素を生産する微生物を用いて行うことができる。該微生物の取得には、ＮＴＧ、ＥＭＳ、ＢＵ、などの変異剤、ＵＶ処理、Ｘ線処理などにより突然変異を誘発し、目的酵素の生産性を増強させ、また、抑制する酵素の生産を阻害して、目的の最適比率のプロテアーゼ組成物を生産させるように育種した微生物を作出する。該微生物を用いて、公知の方法により液体培養、或いは、固体培養を行い、最適組成のプロテアーゼ組成物を調製し、遊離アミノ態窒素量と麦汁濾過性、及び起泡タンパク量に優れた麦汁の調製に用いることができる。又は、個々の酵素成分を特異的に高発現する様に育種した菌株を個別に培養し、最適比率のプロテアーゼ組成に混合して用いてもよい。
本発明においては、プロテアーゼ構成酵素の最適構成の調製を、該酵素を生産する微生物を用いて行うことができる。該微生物の取得には、ＮＴＧ、ＥＭＳ、ＢＵ、などの変異剤、ＵＶ処理、Ｘ線処理などにより突然変異を誘発し、目的酵素の生産性を増強させ、また、抑制する酵素の生産を阻害して、目的の最適比率のプロテアーゼ組成物を生産させるように育種した微生物を作出する。該微生物を用いて、公知の方法により液体培養、或いは、固体培養を行い、最適組成のプロテアーゼ組成物を調製し、遊離アミノ態窒素量と麦汁濾過性、及び起泡タンパク量に優れた麦汁の調製に用いることができる。又は、個々の酵素成分を特異的に高発現する様に育種した菌株を個別に培養し、最適比率のプロテアーゼ組成に混合して用いてもよい。
プロテアーゼ構成酵素の最適構成の調製のために、該酵素を生産する微生物の調製に際しては、遺伝子工学的手法により遺伝子を改変し、最適構成の酵素を生産する微生物を取得することができる。すなわち、遺伝子操作によって目的の酵素遺伝子を組込んだり、転写制御因子の発現を制御することにより、目的酵素の生産性を増強させ、目的の最適比率のプロテアーゼ組成物を生産させるように調製した微生物を構築することができる。該遺伝子操作に用いる手法は、公知の方法を用いることができる。また、該遺伝子操作に用いる遺伝子情報は、遺伝子の商用データーベースから入手することができる。
例えば、Aspergillus oryzae由来の酵素に関して、エンドａの遺伝子については、アクセッションナンバー：ＢＡＡ００２５８．１（セリンタイプのアルカリプロテアーゼ：オリツィン）で；エンドｂの遺伝子については、アクセッションナンバー：ＡＡＦ０４６２８．１で；エンドｃの遺伝子については、アクセッションナンバー：１ＥＢ６、ＡＡＢ１９７０１（中性メタルプロテアーゼII：デューテロシン）で；ＬＡＰの遺伝子については、アクセッションナンバー：ＡＡＮ３１３９５．１で；ＤＡＰの遺伝子については、アクセッションナンバー：ＣＡＡ０５３４３．１でアクセスすることができ、遺伝子情報を入手し、用いることができる。また、特定の酵素の生産を抑制するためには、該酵素を発現する遺伝子を遺伝子ターゲッティング技術により不活化し、該酵素の生産を抑制することができる。
上記のようにして、分子育種した微生物を公知の方法により液体培養、或いは固体培養を行い、最適組成のプロテアーゼ組成物を調製し、遊離アミノ態窒素量と麦汁濾過性および起泡タンパク量に優れた麦汁の調製に用いることができる。又は、個々の酵素成分を特異的に高発現する様に分子育種した菌株を個別に培養し、最適比率のプロテアーゼ組成に混合して用いてもよい。
上記方法により、プロテアーゼの構成酵素の組成を最適化するが、本発明によれば、エンドプロテアーゼ含量は５．０Ｕ／ｇ−大麦未満に低減すればよい。望ましくは４．５、４．０、３．５或いは３．０Ｕ／ｇ−大麦以下まで低減すればよい。更に望ましくは２．５Ｕ／ｇ−大麦以下まで低減すればよい。なお、ここでいうエンドプロテアーゼ活性中に含まれる耐熱性エンドプロテアーゼ活性は、エンドプロテアーゼ活性全体の５％以下であればよい。上記条件におけるエンドプロテアーゼとエキソペプチダーゼの含有比率は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性がそれぞれ、以下のいずれかの比率であればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、１．２以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が３．２×１０−２以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、１．８以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が１．６×１０−２以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．６以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が４．８×１０−２以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、１．２以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が３．２×１０−２以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、１．８以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が１．６×１０−２以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．６以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性が４．８×１０−２以上である。
望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
更に望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦でかつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
更に望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦でかつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
また、エンドプロテアーゼ含量が５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときは、耐熱性エンドプロテアーゼの比率を全体のエンド活性に対して２．５％未満にすればよい。望ましくは２．２５、２．０、あるいは１．５％以下まで低減すればよい。さらに望ましくは１．２５％以下まで低減すればよい。上記条件におけるエンドプロテアーゼとエキソペプチダーゼの含有比率は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性がそれぞれ、以下のいずれかの比率であればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．４以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性１．１×１０−２以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．６以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性５．５×１０−３以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．２以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性１．６５×１０−２以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．４以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性１．１×１０−２以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．６以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性５．５×１０−３以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性／エンド活性が、０．２以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性／エンド活性１．６５×１０−２以上である。
望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
更に望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
更に望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
なお、ここでいうエンドプロテアーゼ含量は、耐熱性エンドプロテアーゼが含まれていなければ、１０．０Ｕ／ｇ−大麦未満に低減すればよい。望ましくは９．５、９．０、８．５或いは８．０Ｕ／ｇ−大麦以下まで低減すればよい。更に望ましくは７．５Ｕ／ｇ−大麦以下まで低減すればよい。
また、非耐熱性エンドプロテアーゼを含まず、耐熱性エンドプロテアーゼ含量を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０９、０．０８、０．０７、或いは０．０６Ｕ／ｇ−大麦以下に低減してもよい。更に望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減してもよい。望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍU／
ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍU／
ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
更に望ましくは上記条件におけるエキソペプチダーゼ含量が、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性がそれぞれ、以下のいずれかであればよい。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。
本発明において、本発明で指すエンドプロテアーゼａ、ｂ及びｃの量は、本発明による方法である、エンドｃの耐熱性を利用した、熱処理と阻害剤の添加を組み合わせることにより、粗酵素の状態でも特異的に検出し、定量する事ができる。また、本発明において、麦汁の濾過性は公知の漏斗法、或いは、クロマト管法などで測定することができる。大規模の場合はロイターで濾過を行い、測定することができる。更に、発酵後の起泡性はグラスに注いだ際の泡立ち量や泡の持続時間などを測定することにより確認することができる。
本発明においては、上記のようにして調製したプロテアーゼを用いて糖化を行い、定法に従って発泡酒等の発酵麦芽飲料を製造する。本発明において、遊離アミノ態窒素増強、濾過性、起泡性に関しては、本発明の方法を利用して、大麦や麦芽蛋白に限らず、大豆、エンドウ、その他雑穀に由来するような蛋白についても同様の方法で実施することができる。該方法により、大豆、エンドウ、その他雑穀に由来するような蛋白を原料として用いた場合にも、遊離アミノ態窒素増強、濾過性、起泡性の全てを満たす麦汁や雑酒を作ることができる。
本発明における発酵麦芽飲料の製造に用いる方法は、上記のとおり、本発明の方法によって調製された発酵麦芽飲料用麦汁を用いる点を除いて、従来の発酵麦芽飲料の製造に用いられている方法と変わるところはない。本発明の発酵麦芽飲料の製造を実施するための一般的な製造方法を発泡酒の製造工程を例にとって概略を説明すると、まず、主原料である麦芽の一部と澱粉質の一部又は全部を仕込釜に温水とともに投入し、更に攪拌しながら所定の温度制御下に加熱し液化して醪を形成する。又、残りの麦芽に温水とともに仕込槽に投入し、混合しながら所定温度所定時間経過させて醪を形成する。麦芽比率を一定とし、発酵に必要な糖分を米、大麦、トウモロコシ（コーン、スターチ）、液糖等の副原料を使用することができる。次に、仕込釜で形成した醪を仕込槽で形成した醪に加え、仕込槽中に醪を所定温度で所定時間保持して酵素作用による糖化を行う。糖化終了後、濾過槽で濾過して麦汁を得る。本発明においては、この麦汁の製造工程において、本発明の調製方法によって調製されたプロテアーゼを添加して、分解を行う。
濾過工程によって得られた麦汁にホップを加え煮沸釜にて煮沸し熱麦汁を得る。
得られた熱麦汁は沈殿槽に送られ、ここで煮沸時に形成した凝固物や粕などを沈殿させて除去し、清澄な麦汁を得る。得られた麦汁をプレートクーラーで６〜１０℃までに冷却される。冷却された麦汁は発酵タンクに移され、これに酵母を加えて発酵を数日間行う。得られた発酵液を貯蔵タンクにて熟成を数週間行う。熟成を終了した段階で目的とする発泡酒が得られる。以上が発泡酒の製造の一般的な工程であるが、該工程は、ビール等麦芽を使用した通常の発酵麦芽飲料の製造工程と基本的に変わるものではない。
得られた熱麦汁は沈殿槽に送られ、ここで煮沸時に形成した凝固物や粕などを沈殿させて除去し、清澄な麦汁を得る。得られた麦汁をプレートクーラーで６〜１０℃までに冷却される。冷却された麦汁は発酵タンクに移され、これに酵母を加えて発酵を数日間行う。得られた発酵液を貯蔵タンクにて熟成を数週間行う。熟成を終了した段階で目的とする発泡酒が得られる。以上が発泡酒の製造の一般的な工程であるが、該工程は、ビール等麦芽を使用した通常の発酵麦芽飲料の製造工程と基本的に変わるものではない。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［市販プロテアーゼ製剤の評価］
（各種市販酵素剤）：各種酵素メーカー（ノボザイムス、天野エンザイム、新日本化学、ナガセケムテック、ヤクルト薬品工業、大和化成等）より各種プロテアーゼ製剤をサンプルとして入手した。
（各種市販酵素剤）：各種酵素メーカー（ノボザイムス、天野エンザイム、新日本化学、ナガセケムテック、ヤクルト薬品工業、大和化成等）より各種プロテアーゼ製剤をサンプルとして入手した。
（発泡酒用麦汁の調製・糖化）：ユニテック社製１０連式自動糖化装置を用いて、副原料としては粉砕した大麦１５．６ｇを湯１０５ｍｌに加え、市販の糖質分解酵素を常法により所定量添加し、常法により所定の糖化条件で、麦汁を調製した。得られた麦汁の糖度は２２〜２３％であった。市販酵素剤添加区では、それに市販酵素剤を１５．６ｍｇ添加して糖化を実施した。
（遊離アミノ態窒素測定）：希釈した麦汁２ｍｌに０．５％ニンヒドリン溶液１ｍｌを添加し、沸騰した湯浴で１６分間加熱する。反応終了後、流水で冷却し、０．２％ヨウ素酸カリウム溶液５ｍｌを加え、そのうちの１５０μｌをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍの吸光度を測定した。
（麦汁濾過性測定）：温調したクロマト管（直径２６ｍｍ×長さ５００ｍｍ）に醪を投入し、濾層を乱さないように濾液を循環させて麦層を形成させた後、清澄麦汁の濾過液量を測定し、濾過初速度を求め、麦汁の濾過性とした。
（麦汁濾過性測定）：温調したクロマト管（直径２６ｍｍ×長さ５００ｍｍ）に醪を投入し、濾層を乱さないように濾液を循環させて麦層を形成させた後、清澄麦汁の濾過液量を測定し、濾過初速度を求め、麦汁の濾過性とした。
市販酵素剤添加糖化試験の結果を図１（市販酵素剤添加によるＦＡＮ増強効果）に示す。この結果からわかるように、Aspergillus oryzae起源の「スミチームＦＰ」（新日本化学工業社製）の遊離アミノ態窒素増強効果が最も高かった。しかし、麹菌由来の酵素はアミノ態窒素を増強する一方で、麦汁濾過性を悪化させることがわかった（図２：スミチームＦＰ添加醪の濾過性評価）。そこで、スミチームＦＰ中のプロテアーゼを精製し、遊離アミノ態窒素増強因子および濾過性悪化因子を特定することとした。
（各種酵素の大量精製）
（スミチームＦＰの透析）：スミチームＦＰを２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）に３０％（Ｗ／Ｖ）となるよう溶解し、５０倍量の同緩衝液に対し、３時間×２回透析を行ない脱塩した。
（ＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィー）：トーソー社のＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィー６５０Ｍカラム（ファルマシア社ＢＰＧカラム φ１０ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて定法に従いクロマトを行なった。緩衝液系は２５ｍＭトリスＨＣＬ（ｐＨ７．０）０Ｍ及び０．３Ｍ ＮａＣｌを用いた。
（Phenylトヨパールクロマトグラフィー）：トーソー社のPhenyl トヨパールクロマトグラフィー６５０Ｍカラム（ファルマシア社ＢＰＧカラム φ１０ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて定法に従いクロマトを行なった。緩衝液系は２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）０．７５Ｍ及び０Ｍ 硫安を用いた。
（ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）：バイオラッド社のハイドロキシアパタイト充填剤ＣＨＴ−ＩＩをバイオスケールカラム（φ１×８ｃｍ）に充填したハイドロキシアパタイトカラムを用いて、イニシャル緩衝液（１０ｍＭリン酸Ｋ ｐＨ７．２）、溶出緩衝液（４００ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ６．８）にてリニアグラジェントによってクロマトを行った。
（スミチームＦＰの透析）：スミチームＦＰを２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）に３０％（Ｗ／Ｖ）となるよう溶解し、５０倍量の同緩衝液に対し、３時間×２回透析を行ない脱塩した。
（ＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィー）：トーソー社のＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィー６５０Ｍカラム（ファルマシア社ＢＰＧカラム φ１０ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて定法に従いクロマトを行なった。緩衝液系は２５ｍＭトリスＨＣＬ（ｐＨ７．０）０Ｍ及び０．３Ｍ ＮａＣｌを用いた。
（Phenylトヨパールクロマトグラフィー）：トーソー社のPhenyl トヨパールクロマトグラフィー６５０Ｍカラム（ファルマシア社ＢＰＧカラム φ１０ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて定法に従いクロマトを行なった。緩衝液系は２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）０．７５Ｍ及び０Ｍ 硫安を用いた。
（ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）：バイオラッド社のハイドロキシアパタイト充填剤ＣＨＴ−ＩＩをバイオスケールカラム（φ１×８ｃｍ）に充填したハイドロキシアパタイトカラムを用いて、イニシャル緩衝液（１０ｍＭリン酸Ｋ ｐＨ７．２）、溶出緩衝液（４００ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ６．８）にてリニアグラジェントによってクロマトを行った。
［酵素活性測定法］
（ロイシン-アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性測定）：３６ｍｇのL-Leucine-p-nitiroanilideＨＣｌを２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解したのち、５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１００ｍｌにメスアップした。酵素はＭＱ水にて適宜希釈する。基質溶液８０μｌ、酵素希釈液２０μｌを氷上で冷却しておいたエッペンドルフチューブに入れ、フタをして攪拌した後、４０℃、５分間反応を行なう。反応は１．５Ｍ酢酸溶液２００μｌを添加して攪拌する事により停止する。そのうちの２００μｌをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定する。p-nitroanilineで作成した検量線をもとに酵素活性を計算する。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのp-nitroanilineを遊離する酵素量を１Ｕｎｉｔと定義する。
（ロイシン-アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性測定）：３６ｍｇのL-Leucine-p-nitiroanilideＨＣｌを２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解したのち、５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１００ｍｌにメスアップした。酵素はＭＱ水にて適宜希釈する。基質溶液８０μｌ、酵素希釈液２０μｌを氷上で冷却しておいたエッペンドルフチューブに入れ、フタをして攪拌した後、４０℃、５分間反応を行なう。反応は１．５Ｍ酢酸溶液２００μｌを添加して攪拌する事により停止する。そのうちの２００μｌをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定する。p-nitroanilineで作成した検量線をもとに酵素活性を計算する。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのp-nitroanilineを遊離する酵素量を１Ｕｎｉｔと定義する。
（Ｘ−プロリル−ジペプチジル-アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）活性測定）：５ｍｇのGly-Pro-MCAを１．６ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ溶液を作成したのち、小分けして凍結保存しておく。使用時にこれを１００ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈し０．１１１ｍＭ溶液を作成し、基質溶液とする。酵素はＭＱ水にて適宜希釈する。基質溶液７２μｌ、酵素希釈液８μｌを氷上で冷却しておいたエッペンドルフチューブに入れ、フタをして攪拌した後、３０℃、１５分間反応を行なう。反応は１．５Ｍ酢酸溶液１６０μｌを添加して攪拌する事により完全に停止する。そのうちの１５０μｌをマイクロプレートに移し、蛍光マイクロプレートリーダーにて蛍光（Ｅｘ３７０ｎｍ、Ｅｍ４４０ｎｍ）を測定する。ＡＭＣ（7-Amino-4-methylcoumarin）で作成した検量線をもとに酵素活性を計算する。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＡＭＣを遊離する酵素量を１Ｕｎｉｔと定義する。
（エンドプロテアーゼ活性測定（アゾカゼイン法））：４％アゾカゼイン（シグマ社製）溶液２．９ｍｌ、１．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）２．９ｍｌを入れ、混合し基質溶液とする。酵素はＭＱ水にて適宜希釈する。基質溶液４０μｌ、酵素希釈液６０μｌを氷上で冷却しておいたエッペンドルフチューブに入れ、フタをして攪拌した後、４０℃、３０分間反応を行う。反応は５％ＴＣＡ溶液を１００μｌ添加して攪拌する事により停止する。室温で５分放置後、再びよく攪拌した後、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。そのうちの１５０μｌをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて３６６ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性は本測定条件下で吸光度を１.０上昇させる酵素反応液に添加した酵素液の酵素濃度を１Ｕｎｉｔ／ｍｌと定義する。例えば、１０ｍｌの酵素液の原液を用いて、本反応系で反応を行い、吸光度が１．０であった場合、この酵素液の１ｍｌあたりのエンドプロテアーゼ活性は１．０Ｕｎｉｔ／ｍｌであり、エンドプロテアーゼ活性の総量は次の様に計算される。１．０Ｕｎｉｔ／ｍｌ×１０ｍｌ＝１０Ｕｎｉｔ。
（β−グルカナーゼ活性測定法（アゾβ−グルカン法））：１％アゾβ−グルカン（メガザイム社製）溶液を基質溶液とする。酵素は４０ｍＭ酢酸Ｎａ、リン酸Ｎａ ｐＨ５．７にて適宜希釈する。沈殿溶液は３０ｇ酢酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏと３ｇ酢酸亜鉛を２５０ｍｌのＭＱ水に溶かしＨＣＬにてｐＨ５．０に調節後、３００ｍｌに調整し、その後７００ｍｌの９５％エタノールを添加しよく混合して作成する。基質溶液２５μｌ、酵素希釈液２５μｌを氷上で冷却しておいたエッペンドルフチューブに入れ、フタをして攪拌した後、４０℃、１０分間反応を行なう。反応は１５０μｌの沈殿溶液の添加後良く攪拌する事により停止する。室温で５分放置後、再びよく攪拌した後、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。その上清１５０μｌをマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて５９０ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性は本測定条件下で吸光度を１．０上昇させる酵素反応液に添加した酵素液の酵素濃度を１Ｕｎｉｔ／ｍｌと定義する。例えば、１０ｍｌの酵素液の原液を用いて、本反応系で反応を行い、吸光度が１．０であった場合、この酵素液の１ｍｌあたりのβ―グルカナーゼ活性は１．０Ｕｎｉｔ／ｍｌであり、β―グルカナーゼ活性の総量は次の様に計算される。１．０Ｕｎｉｔ／ｍｌ×１０ｍｌ＝１０Ｕｎｉｔ。
（精製酵素）
スミチームＦＰの精製フローを図３に示す。精製の結果、スミチームＦＰよりエンドプロテアーゼ３種、エキソペプチダーゼ２種を得た。エンドプロテアーゼ３種は、便宜上それぞれエンドａ、エンドｂ、エンドｃと命名した。エキソ型２種は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）であった。それぞれ、精製した酵素は電気泳動でシングルバンド、もしくはメインバンドレベルまで精製されていた。各種精製酵素画分の共雑酵素活性は表１（各種精製プロテアーゼの活性）に示す通りである。
スミチームＦＰの精製フローを図３に示す。精製の結果、スミチームＦＰよりエンドプロテアーゼ３種、エキソペプチダーゼ２種を得た。エンドプロテアーゼ３種は、便宜上それぞれエンドａ、エンドｂ、エンドｃと命名した。エキソ型２種は、ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）であった。それぞれ、精製した酵素は電気泳動でシングルバンド、もしくはメインバンドレベルまで精製されていた。各種精製酵素画分の共雑酵素活性は表１（各種精製プロテアーゼの活性）に示す通りである。
（各種酵素の同定）
各種精製酵素の耐熱性を評価した結果を図４（各種プロテアーゼの耐熱性評価）に示す。この結果からわかるように、エンドａ、ｂは６０℃でほとんど失活するのに対し、エンドｃはほとんど失活せず、７０℃で失活、更に温度を上げると逆に１００℃で活性が部分的に回復していた。すなわちエンドｃはエンドａ、ｂよりも耐熱性が高かった。また、ＤＡＰも６０℃でほとんど活性を保持していた。ＬＡＰはさらに耐熱性が高く、６５℃でもほとんど活性を保持していた。
各種精製酵素の耐熱性を評価した結果を図４（各種プロテアーゼの耐熱性評価）に示す。この結果からわかるように、エンドａ、ｂは６０℃でほとんど失活するのに対し、エンドｃはほとんど失活せず、７０℃で失活、更に温度を上げると逆に１００℃で活性が部分的に回復していた。すなわちエンドｃはエンドａ、ｂよりも耐熱性が高かった。また、ＤＡＰも６０℃でほとんど活性を保持していた。ＬＡＰはさらに耐熱性が高く、６５℃でもほとんど活性を保持していた。
得られた各種精製酵素の性質を文献情報と照合すると、それぞれAspergillus oryzae由来のＬＡＰ（ロイシン・アミノペプチダーゼ）、ＤＡＰ（Ｘ−プロリル・ジペプチジルアミノペプチダーゼ、別名ＤＡＰIV）、エンドａはセリンタイプのアルカリプロテアーゼ（別名：オリツィン）、エンドｂは中性メタルプロテアーゼＩ、及びエンドｃは耐熱性が高くカゼインに対する反応性が低い中性メタルプロテアーゼＩＩ（別名：デューテロリシン）と推定された。そこで、ＬＡＰ、ＤＡＰ、エンドｂ、ｃについては文献の分子量の情報から相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥでのメインバンドをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、リジルエンドペプチダーゼ（LysC）で限定分解後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マルディ−トフマス）解析により分子量を測定し、ペプチドマスフィンガープリント法によって分子種の特定を行った。その結果を図５〜９（各種プロテアーゼ分子種の特定）に示す。図５はエンドａについて、図６はエンドｂについて、図７はエンドｃについて、図８はＬＡＰについて、図９はＤＡＰについての分子種の特定について示す。
ＬＡＰはAspergillus oryzae由来のＬＡＰ遺伝子の登録がなかったものの、Aspergillus sojae由来ＬＡＰと一致するフラグメントが確認され、ＬＡＰと特定された。ＤＡＰはAspergillus oryzae由来のＤＡＰ（プロリル・ジペプチジルアミノペプチダーゼ）、エンドｂは中性メタルプロテアーゼＩ、及びエンドｃは中性メタルプロテアーゼＩＩ（別名：デューテロリシン）と一致するフラグメントがそれぞれ確認され、特定された。エンドａはＭＳＨを添加したサンプルバッファーで１００℃、３分間加熱した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと分子量５３ｋＤａ、３５ｋＤａにメインバンドが現れ、両者を解析した結果、いずれもAspergillus oryzae由来のアルカリプロテアーゼ（別名：オリツィン）と一致するフラグメントが確認され、特定された。
エンドｃはカゼインへの反応性が低く、特異的に反応する基質としては、Boc-Arg-Val-Arg-Arg-MCAやBoc-Leu-Lys-Arg-MCAなどが報告されているが、粗酵素の状態ではＬＡＰの混入によってエンドａ及びｂでも蛍光を発してしまう。
そこで本発明者らは、エンドｃの耐熱性を利用して、熱処理と阻害剤添加アッセイを組み合わせることにより、エンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出法を開発した。熱処理は６０℃ ２０ｍｉｎ、阻害剤にはエンドａのインヒビターとしてＰＭＳＦを、エンドｂ、ｃのインヒビターとしてＥＤＴＡを用いる。この検出法により、粗酵素の状態でもエンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出が可能となった。エンドａ、ｂ、ｃそれぞれの活性は以下の計算式によって算出できる。
（計算式）：
エンドａ活性＝（通常の活性）−（ＰＭＳＦ添加時の活性）
エンドｂ活性＝（通常の活性）−（ＥＤＴＡ添加時の活性）−（熱処理後の活性）
エンドｃ活性＝（熱処理後の活性）
上記の検出法により、Aspergillus oryzae起源の市販プロテアーゼ製剤のエンド比率を測定した結果を図１０に示す。その結果、スミチームＦＰの全体のエンド活性（アゾカゼイン分解活性）に対する各エンドの比率は、ａ：ｂ：ｃ＝５０：４５：５であった。スミチームＦＰ中に含まれる活性は、ＬＡＰ活性１５００Ｕ／ｇ、ＤＡＰ活性４．０Ｕ／ｇ、エンド活性は１０３４０Ｕ／ｇであり、エンド活性のうち、エンドａ、ｂ、ｃはそれぞれ５１９０Ｕ／ｇ、４５９０Ｕ／ｇ、５６０Ｕ／ｇであった。また、Aspergillus oryzae起源の市販プロテアーゼ製剤の中で、エンドｃを含まないものはない事がわかった。なお、スミチームＦＰの総エンドプロテアーゼ活性をカゼインフォーリン法（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.61, No.4, 710-715,1997、に記載の方法を基本として、反応条件をｐＨ６．０、温度３７℃に改変）で測定した場合の活性は、４３０００Ｕ／ｇであった。
そこで本発明者らは、エンドｃの耐熱性を利用して、熱処理と阻害剤添加アッセイを組み合わせることにより、エンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出法を開発した。熱処理は６０℃ ２０ｍｉｎ、阻害剤にはエンドａのインヒビターとしてＰＭＳＦを、エンドｂ、ｃのインヒビターとしてＥＤＴＡを用いる。この検出法により、粗酵素の状態でもエンドａ、ｂ、ｃの特異的な検出が可能となった。エンドａ、ｂ、ｃそれぞれの活性は以下の計算式によって算出できる。
（計算式）：
エンドａ活性＝（通常の活性）−（ＰＭＳＦ添加時の活性）
エンドｂ活性＝（通常の活性）−（ＥＤＴＡ添加時の活性）−（熱処理後の活性）
エンドｃ活性＝（熱処理後の活性）
上記の検出法により、Aspergillus oryzae起源の市販プロテアーゼ製剤のエンド比率を測定した結果を図１０に示す。その結果、スミチームＦＰの全体のエンド活性（アゾカゼイン分解活性）に対する各エンドの比率は、ａ：ｂ：ｃ＝５０：４５：５であった。スミチームＦＰ中に含まれる活性は、ＬＡＰ活性１５００Ｕ／ｇ、ＤＡＰ活性４．０Ｕ／ｇ、エンド活性は１０３４０Ｕ／ｇであり、エンド活性のうち、エンドａ、ｂ、ｃはそれぞれ５１９０Ｕ／ｇ、４５９０Ｕ／ｇ、５６０Ｕ／ｇであった。また、Aspergillus oryzae起源の市販プロテアーゼ製剤の中で、エンドｃを含まないものはない事がわかった。なお、スミチームＦＰの総エンドプロテアーゼ活性をカゼインフォーリン法（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.61, No.4, 710-715,1997、に記載の方法を基本として、反応条件をｐＨ６．０、温度３７℃に改変）で測定した場合の活性は、４３０００Ｕ／ｇであった。
［遊離アミノ態窒素増強因子・濾過性悪化因子の特定］
遊離アミノ態窒素増強因子と濾過性悪化因子を特定するために、実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行った。糖化終了後、実施例１と同様の方法で麦汁濾過性及び遊離アミノ態窒素量を測定した。精製したエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼを用いた糖化試験の結果を図１１（各種エンドプロテアーゼ添加による遊離アミノ態窒素増強及び濾過性悪化効果）に示す。この結果からわかるように、エンド型もエキソ型もアミノ態窒素増強因子であることを確認した。ただし、エキソ型は単独ではアミノ態窒素がほとんど増加せず、エンド型の添加によって遊離アミノ態窒素の増加が進行した。これは、エンドとエキソの共存によって、遊離アミノ態窒素が増強することを示している。
遊離アミノ態窒素増強因子と濾過性悪化因子を特定するために、実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行った。糖化終了後、実施例１と同様の方法で麦汁濾過性及び遊離アミノ態窒素量を測定した。精製したエンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼを用いた糖化試験の結果を図１１（各種エンドプロテアーゼ添加による遊離アミノ態窒素増強及び濾過性悪化効果）に示す。この結果からわかるように、エンド型もエキソ型もアミノ態窒素増強因子であることを確認した。ただし、エキソ型は単独ではアミノ態窒素がほとんど増加せず、エンド型の添加によって遊離アミノ態窒素の増加が進行した。これは、エンドとエキソの共存によって、遊離アミノ態窒素が増強することを示している。
一方で、エキソ型の添加によって濾過性は改善されたが、エンド型を増強すると濾過性が悪化することがわかった。その中でも、エンドｃは遊離アミノ態窒素増強・濾過性悪化への寄与が大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。実施例２より、エンドｃはアゾカゼイン法ではスミチームＦＰ中エンド活性の５％程度であるが、デューテロリシンはカゼインへの反応性が低いことが報告されており、アゾカゼイン法では見かけ上、エンドｃの活性は少ない。しかし、エンドｃの糖化時の遊離アミノ態窒素増強に対する寄与度は、スミチームＦＰに含まれる全エンド型プロテアーゼのうち、半分程度を占めている事がわかった。また、エンドｃは遊離アミノ態窒素増強効果が強い上に、濾過性悪化への寄与が大きいことがわかった。
［最適比率検討：エンド添加量低減］
実施例３により、エンドプロテアーゼが濾過性悪化因子であることがわかったため、エンド添加量を低減し、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
実施例３により、エンドプロテアーゼが濾過性悪化因子であることがわかったため、エンド添加量を低減し、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
エンド添加量低減糖化試験の結果を図１２〜１３（エンド添加量低減の効果：様々な酵素比率での糖化試験）に示す。図１２は、エンド添加量低減糖化試験（遊離アミノ態窒素）について、図１３は、エンド添加量低減糖化試験（麦汁濾過性）について示す。この結果からわかるように、エンド活性５〜１０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、ＬＡＰの増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化した。これは特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。また、ＤＡＰを増強しても遊離アミノ態窒素がほとんど増加せず、濾過性が悪化することから、エンドが過剰に存在することが原因と考えられる。
一方で、エンド活性を２．５Ｕ／ｇ−大麦まで低減すると、エキソの増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。つまり、エンドが過剰に存在していると、エキソの添加量を増やしても濾過性は改善されず、むしろ悪化してしまうため、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって濾過性を改善するには、エンド活性を２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減する必要があることを見出した。エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強による遊離アミノ態窒素増強及び濾過性改善の両立の可否については、以下の式（式１）によってエキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）増強の効果を算出することにより、簡便な判定が可能となる。
上記の式によってエキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）増強の効果を評価した結果を図１４に示す。この結果より、エンドを２．５Ｕ／ｇ−大麦まで低減するとエキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって濾過性が改善することがわかった。本発明者らは、様々な酵素比率での糖化試験により、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した（表２）。
［最適比率検討：耐熱性エンド低減］
実施例３より、エンドプロテアーゼの中でも、耐熱性エンド（エンドｃ）の寄与が大きかったことから、耐熱性エンド添加量を低減し、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
実施例３より、エンドプロテアーゼの中でも、耐熱性エンド（エンドｃ）の寄与が大きかったことから、耐熱性エンド添加量を低減し、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
耐熱性エンド低減糖化試験の結果を図１５〜１６（耐熱性エンド低減の効果：様々な酵素比率での糖化試験）に示す。図１５は、耐熱性エンド低減糖化試験（アミノ態窒素）について、図１６は、耐熱性エンド低減糖化試験（麦汁濾過性）について示す。この結果からわかるように、エンド活性を５．０Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）とし、エンドｃ比率を２．５〜５．０％とした系では、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増加を確認するとともに、濾過性が悪化した。これは実施例４同様、特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ比率を１．２５％まで低減すると、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。更に、エンドｃ無添加とし、エキソ添加量を増強した際の効果についても検討を行った結果を図１７〜１８に示す。図１７は、耐熱性エンド無添加の効果（様々な酵素比率での糖化試験）について、図１８は、耐熱性エンド無添加糖化試験（麦汁濾過性）について示す。この結果からわかるように、エンド活性を７．５Ｕ／ｇ−大麦とし、エンドａ：ｂ：ｃ＝７０：３０：０で、エキソ（ＬＡＰ及びＤＡＰ）の増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。
また、ＬＡＰを増強してもＤＡＰ無添加の系では遊離アミノ態窒素がほとんど増加しないことを確認した。同様に、ＬＡＰ無添加の系では、ＤＡＰを増強しても遊離アミノ態窒素がほとんど増加しないことを確認した。これも、特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、遊離アミノ態窒素増強にはＬＡＰとＤＡＰの共存が重要であることがわかった。また、ＤＡＰ無添加の系、或いはＬＡＰ無添加の系では、それぞれＬＡＰ、或いはＤＡＰを増強しても濾過性はほとんど改善しないことを確認した。本発明者は、様々な酵素比率での糖化試験により、エンド活性５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときには、耐熱性エンドの添加比率を２．５％未満、望ましくは１．２５％以下に低減する、若しくは耐熱性エンド無添加とし、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した。結果を、表３（耐熱性エンド低減の効果耐熱性エンド低減の効果：エンド活性５．０Ｕ／ｇ−大麦、耐熱性エンド比率１．２５％）、及び、表４（耐熱性エンド無添加の効果：エンド活性７．５Ｕ／ｇ−大麦、耐熱性エンド無添加）に示す。
［最適比率検討：耐熱性エンド単独添加量低減］
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、エンドプロテアーゼを耐熱性エンド（エンドｃ）のみにし、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、エンドプロテアーゼを耐熱性エンド（エンドｃ）のみにし、エキソ添加量を増強した際の効果について検討を行った。実施例２で精製した酵素を用いて実施例１と同様の条件で糖化試験を行い、遊離アミノ態窒素量および麦汁濾過性については実施例１と同様の方法で測定した。
耐熱性エンド単独添加糖化試験の結果を図１９〜２０（耐熱性エンド単独添加量低減の効果）に示す。図１９は、耐熱性エンド単独添加糖化試験（遊離アミノ態窒素）について、図２０は、耐熱性エンド単独添加糖化試験（麦汁濾過性）について示す。この結果からわかるように、エンドｃ活性０．１Ｕ／ｇ−大麦（アゾカゼイン分解活性）では、エキソの増強によって遊離アミノ態窒素が増加するものの、濾過性が悪化することを確認した。これは実施例４、５と同様に、特表２０００−５０４５７１号公報の記載内容とは異なり、新規知見である。一方で、エンドｃ活性０．０５Ｕ／ｇ−大麦では、エキソの増強によって遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることがわかった。本発明者は、様々な酵素比率での糖化試験により、耐熱性エンド活性を０．１Ｕ／ｇ−大麦未満、望ましくは０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減し、ＬＡＰ活性を１．５Ｕ／ｇ−大麦以上、望ましくは３．０Ｕ／ｇ−大麦以上、ＤＡＰ活性を４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上、望ましくは８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上にすることによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善が両立できることを見出した（表５：耐熱性エンド単独添加量低減の効果：エンドｃ活性０．０５Ｕ／ｇ−大麦）。
［起泡タンパク定量］
麦汁中の起泡タンパク（ＬＴＰ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のバンドでは９ｋＤａ付近に位置する。麦汁をグラジェンドゲル（第一化学社製、ＰＡＧミニ「第一」１５／２５）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、９ｋＤａ付近に確認されたバンドをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、リジルエンドペプチダーゼ（Lys Ｃ）で限定分解後、MALDI-TOF/MS（マルディ−トフマス）解析により分子量を測定し、ペプチドマスフィンガープリント法によって分子種の特定を行った。その結果、このバンドが大麦由来のＬＴＰ１(Lipid transfer protein１)である事が確認された。麦汁は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲルを固定化し、サイプロルビー法（インビトロジェン社）により染色し、分子量９ｋＤａのＬＴＰ１のバンドをフルオロイメージャーによって定量した。なお、タンパク定量の標準液としてＢＳＡを用いた。
麦汁中の起泡タンパク（ＬＴＰ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のバンドでは９ｋＤａ付近に位置する。麦汁をグラジェンドゲル（第一化学社製、ＰＡＧミニ「第一」１５／２５）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、９ｋＤａ付近に確認されたバンドをＰＶＤＦ膜にブロッティングし、リジルエンドペプチダーゼ（Lys Ｃ）で限定分解後、MALDI-TOF/MS（マルディ−トフマス）解析により分子量を測定し、ペプチドマスフィンガープリント法によって分子種の特定を行った。その結果、このバンドが大麦由来のＬＴＰ１(Lipid transfer protein１)である事が確認された。麦汁は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲルを固定化し、サイプロルビー法（インビトロジェン社）により染色し、分子量９ｋＤａのＬＴＰ１のバンドをフルオロイメージャーによって定量した。なお、タンパク定量の標準液としてＢＳＡを用いた。
エンド型の添加がＬＴＰに及ぼす影響を評価するために、実施例４で得られた麦汁中の起泡タンパク（ＬＴＰ）を定量した結果を図２１（エンド型の添加がＬＴＰに及ぼす影響）に示す。この結果からわかるように、エンド型の添加によってＬＴＰが分解されていることを確認した。したがって、エンド型は起泡タンパク低減因子であることが明らかとなった。次に、どのエンド分子種がＬＴＰの分解に寄与しているかを評価すべく、実施例３で得られた麦汁中の起泡タンパク（ＬＴＰ）を定量した結果を図２２（各種エンドプロテアーゼ添加がＬＴＰに及ぼす影響）に示す。この結果からわかるように、エンドａ、ｃの添加によってＬＴＰが分解されていることを確認した。一方で、エキソ型およびエンドｂの添加では、ＬＴＰはほとんど分解されなかったことから、起泡タンパク低減因子はエンドａおよびエンドｃであることが明らかとなった。その中でもエンドｃの寄与が大きく、耐熱性があるために糖化中の反応時間がエンドａ、ｂに比べて長くなることが原因と考えられた。
実施例４〜６で得られた麦汁中の起泡タンパク（ＬＴＰ）を定量した結果を図２３（各種エンド比率がＬＴＰに及ぼす影響）に示す。この結果からわかるように、エンド添加量が多い、もしくはエンドｃ添加量が多いほどＬＴＰの分解は進行することがわかった。一方で、エンドｃ無添加およびエンドｃ添加量を低減した系ではＬＴＰが残存していることから、エンド添加量を減らす、もしくは耐熱性エンド添加量を低減することによって、起泡タンパクの低減を抑制できると考えられる。エキソの増強ではＬＴＰはほとんど分解されないことから、本発明者らは、エンド添加量を減らす、もしくは耐熱性エンド添加量を低減し、エキソ型を増強することによって、遊離アミノ態窒素の増強および濾過性の改善だけでなく、起泡タンパクの低減も抑制できることを見出した。
［粗酵素剤の熱処理］
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、市販酵素剤スミチームＦＰをＭＱ水に溶解したものを熱処理した際の酵素活性について検討を実施した。熱処理は６０℃２０分の条件で行った。スミチームＦＰ熱処理試験の結果を図２４に示す。この結果からわかるように、熱処理によってエンドａ、ｂは完全に失活し、エンドｃ、ＬＡＰ、ＤＡＰの活性は維持されていた。
エンドプロテアーゼを低減する手法としては、熱処理による非耐熱性エンドの失活が考えられる。そこで、市販酵素剤スミチームＦＰをＭＱ水に溶解したものを熱処理した際の酵素活性について検討を実施した。熱処理は６０℃２０分の条件で行った。スミチームＦＰ熱処理試験の結果を図２４に示す。この結果からわかるように、熱処理によってエンドａ、ｂは完全に失活し、エンドｃ、ＬＡＰ、ＤＡＰの活性は維持されていた。
Claims (4)
- 麦汁の製造に用いられるプロテアーゼとして、低減化した量のエンドプロテアーゼと増加した量のエキソペプチダーゼからなるプロテアーゼを用い、麦汁中の遊離アミノ酸の増強と起泡性タンパク質の保持、及び、麦汁の濾過性の保持とを図った発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造において、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減された量であるか、又は、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときに、耐熱性エンドプロテアーゼ活性の全体のエンド活性に対する比率が１．２５％以下に低減された量であり、かつ、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかとなるように増加した量であることを特徴とする発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。 - プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が２．５Ｕ／ｇ−大麦以下に低減された量であるか、又は、プロテアーゼのエンドプロテアーゼ含量が５．０〜７．５Ｕ／ｇ−大麦のときに、耐熱性エンドプロテアーゼ活性の全体のエンド活性に対する比率が１．２５％以下に低減された量であり、かつ、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が、８０．０ｍＵ／ｇ−大麦である。 - プロテアーゼのエンドプロテアーゼを耐熱性エンドプロテアーゼのみとし、耐熱性エンドプロテアーゼ含量を０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下とし、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかとなるように増加した量であることを特徴とする請求項２記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が４０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、１．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。 - 耐熱性エンドプロテアーゼ含量を０．０５Ｕ／ｇ−大麦以下とし、エキソペプチダーゼであるロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、及びＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量がそれぞれ、以下のいずれかであることを特徴とする請求項３記載の発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法。
（１）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（２）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、３．０Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が１２０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である、
（３）ロイシン−アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）含量が、４．５Ｕ／ｇ−大麦以上で、かつＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）含量が８０．０ｍＵ／ｇ−大麦以上である。
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