JP4626377B2 - 標的分子の検出方法、遺伝子多型の検出方法、ならびにこれらの検出方法に用いられる基板およびキット - Google Patents
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Description
型を検出する方法、および当該方法に用いられる基板、キット等に関する。
有無や濃度を検出・測定する種々の方法が提案されている。中でも、DNAやタンパク質
等の生体分子が、特定の分子と特異的に結合するという性質を利用したバイオチップが広
く開発されている。マイクロアレイ等の名称でも呼ばれるバイオチップは、標的分子と特
異的に結合するプローブ分子がその表面に固定されており、標的分子を含む試料溶液と接
触させ、必要に応じてインキュベートすることによって、標的分子をその表面に捕捉する
。
、表面プラズモン共鳴法(例えば、特許文献1を参照)、水晶振動子法(例えば、特許文
献2を参照)、電気化学的検出法等によって行うことができる。
せることによって生じるエバネッセント光の共鳴現象であり、特定の波長の光を特定の角
度から金属の薄膜表面に当てると、光子のエネルギーが金属表面の電子に吸収されて反射
されなくなる現象を利用する方法である。金属薄膜が形成された基板表面にプローブ分子
を固定しておくと、標的分子が結合することによって、反射されなくなる入射角度(共鳴
角度)が変化するので、この変化を測定することにより、標的分子を検出・定量すること
ができる。
水晶が共振する現象を利用する方法である。水晶振動子の共振振動数は、表面に物質が結
合するとその質量によって変化することから、水晶振動子の表面にプローブ分子を固定し
ておくことにより、標的分子の結合の有無を共振振動数の変化で検出することができる。
活性な官能基で標識した標的分子が結合することによって、サイクリックボルタモグラム
などで当該標識の有無を検出する方法である。電気化学的に活性な官能基は、プローブ分
子および標的分子が核酸の場合、ハイブリダイゼーションを生じた後でインターカレータ
によって導入することもできる。
ローブ分子の自己組織化単分子膜(Self Assembled Monolayer; SAM)を形成する方法
が用いられている。この方法によれば、まず、プローブ分子にチオール基等のSAMを形
成しやすい官能基を付けておき、このようなプローブ分子を含む溶液に、金、銀、白金等
の金属薄膜を形成した基板を接触させることによって、迅速かつ容易にプローブ分子を固
定することができる。
あり、短時間に大気や溶液中の汚染物質が非特異的に付着してしまうおそれがある。この
ような汚染物質の付着はプローブ分子の吸着を妨げる。バイオチップは、微量の標的物質
の検出を目的としているため、プローブ分子の吸着量にばらつきが生じると、バイオチッ
プとしての信頼性が大きく低下する。
に、生体分子を固相表面に固定する方法が必要とされる場合があり、固相表面の汚染によ
って生体分子が充分に固定されないという問題が生じることがある。
の固定すべき分子をばらつき無く吸着固定させ、結果としてかかる固相基板を用いた検出
・測定方法を再現性良く行うことができる方法を提供することを目的とする。
の非特異的吸着が防止される。そして、被膜が形成された固相表面と、プローブ分子を含
む溶液とを接触させれば、プローブ分子より親和性の低い被膜形成分子に代わってプロー
ブ分子が固相表面に固定される。
ることにより、これらと生物学的特異性により結合する標的分子を高感度に検出・定量す
ることができる。
基、またはジスルフィド基を有することが好ましい。金属表面を有する基板は、各種の検
出・定量方法に好適に用いられ、チオール基、モノスルフィド基、またはジスルフィド基
は、かかる金属表面に対して極めて短時間でSAMを形成することができる。
ることが好ましい。このような分子は、金属表面と非特異的に結合して汚染物質の付着を
防ぐことができる一方で、チオール基よりは金属表面に対する親和性が低く、チオール基
の金属表面への結合を妨げない。
DNA等の核酸やタンパク質も好ましい。これらの核酸やタンパク質もアミノ基、リン酸
基をはじめとするカチオン性官能基およびアニオン性官能基を有するため、金属表面に非
特異的に吸着する一方で、基板に対してより親和性の強いチオール基への置換を阻害しな
い。
プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法によって行われることが好まし
い。これらの方法によれば、金属表面を有する基板に固定されたプローブ分子と標的分子
との結合を、高精度かつ高感度に検出・定量することができる。
また、本発明の別の一態様の核酸における多型を検出する方法は、前記核酸と、プライマーと、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、連鎖反応産物を形成する第1工程と、基体の表面に膜を形成する第2工程と、前記連鎖反応産物と前記基体とを結合させる第3工程と、前記プライマーの伸長反応が前記第1工程において生じたか否かを測定する第4工程と、を含み、前記膜は、前記基体の表面に対する親和性が前記連鎖反応産物の基体結合部位より低いことを特徴とする。
方法に使用可能な基板を意味し、その材料、構成は特に限定されない。測定用基板として
は、各種の測定方法に応じて、光透過性を有するものや、電極基板、表面に金薄膜が形成
された基板等が用いられる。
、水晶振動子法、電気化学的検出法により行うことが好ましい。これらの方法によれば、
伸長反応の有無を、基板表面の被膜の膜厚の変化や、質量の変化として高感度に検出する
ことが可能である。
水晶振動子法用、若しくは電気化学検出法用の基板であって、前記基板表面に、前記基板
表面に対する親和性が前記生体分子より低い被膜形成分子からなる被膜が形成されている
基板を提供する。このような構成によれば、被膜により、大気中または溶液中の汚染物質
が非特異的に付着するのを防ぐことができる一方で、被膜形成分子より基板表面に対する
親和性の高い生体分子は基板表面に吸着させることができる。
分子にチオール基をつけておくことによって、当該生体分子を基板表面に容易に固定する
ことができる。
カチオン性官能基および/またはアニオン性官能基を有する物質を用いることが好ましい
。そして、このような基板は、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、若しくは電気化学
検出法に好適に用いられる。
であって、前記標的分子と特異的に結合するプローブ分子を固定して使用される基板と、
前記固相表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子と、を含むキット
をも包含する。このようなキットによれば、ユーザにおいて所望のプローブ分子を基板表
面に固定する際、予め基板表面に被膜を形成することによって、プローブ分子の固定作業
中に汚染物質が基板表面に付着するのを防ぐことができる。これによって、高感度に再現
性良く検出・定量を行うことができる。
可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、電極基板と、前記電極基板に対する親和性が前記
電極結合部位より低い被膜形成分子と、を含むキットをも提供する。このようなキットに
よれば、ユーザにおいて、予め電極表面に被膜を形成することによって、汚染物質の付着
によって妨げられることなく、電極結合部位を有するPCR産物を電極表面に固定するこ
とができる。これによって、高感度に再現性良く検出を行うことができる。
(第1の実施形態)
説明図である。まず、図1(A)に示すように、基板10の表面(固相表面)に、被膜形
成分子からなる被膜12を形成する。被膜形成分子は、基板10表面に非特異的に付着し
て被膜を形成でき、且つ、プローブ分子よりも基板10表面に対する親和性が低く、プロ
ーブ分子の存在下ではプローブ分子の基板10表面への吸着を妨げない、という条件を満
たす分子である限り、特に限定されず、種々の高分子化合物等を用いることができる。
ブ分子がチオール基を有する場合、被膜形成分子としては、カチオン性官能基および/ま
たはアニオン性官能基を有する分子を用いることが好ましい。このような分子としては、
カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーのほか、DNAやタンパク質といった生体分子
も挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、側鎖あるいは主鎖にアミノ基あるいはイミ
ノ基を有するポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等の合成高分子
や、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、またはこれらの塩(塩酸塩等)を用
いることができる。一方、アニオン性ポリマーとしては、側鎖にカルボキシル基を有する
ポリカルボキシビニル、キサンタンガ、ポリアルギン酸等が用いられる。塩基部分にアミ
ノ基を、骨格部分にリン酸基を有するDNAも本発明に被膜形成分子として好適である。
した高分子にPEG構造を含ませることにより吸着力の調整をすることも好ましい。
を含む溶液1中に浸漬させる。プローブ分子14は被膜12よりも基板10表面に対する
親和性が高く、被膜12に取って代わって基板10表面に吸着固定され、SAM18を形
成する。
的分子を含む可能性を有する試料溶液2と接触させる。図示されたように基板10を溶液
2に浸漬させてもよいし、基板10表面に試料溶液の液滴を配置してもよい。試料溶液2
中に標的分子20が存在すれば、プローブ分子14に特異的に結合し、基板10表面に捕
捉される。プローブ分子14に親和性を有しない分子22は、溶液中に残る。
動子法、電気化学的検出法によって、検出・定量される。表面プラズモン共鳴法による場
合は、基板10として表面に金薄膜が形成された透明基板が、水晶振動子法による場合は
、基板10として水晶振動子が、電気化学的方法による場合は、基板10として電極が用
いられる。
(第2の実施形態)
塩基多型)の検出方法を説明する。SNPとは、DNAの塩基配列に生じる多型のうち、
1つの塩基の置換によって起こる多型をいう。SNPの検出は、特定の疾患へのかかりや
すさや医薬品への反応に関する遺伝的な個人差を知る手がかりとなる。
<ポリメラーゼ連鎖反応>
上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Taqポリメラーゼと
、必要な成分を含む緩衝液と、dNTPs(デオキシヌクレオチド三リン酸)を含む試料
溶液を調製する(詳細は下記参照)。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プ
ライマーのいずれか1種類のプライマーの末端にはチオール基(電極結合部位)が付加さ
れている。なお、以下の説明では下流プライマーの末端にチオール基が付加されている場
合を想定する。
試料溶液の組成
dNTPs (終濃度0.2mM)
上流プライマー (終濃度1.0μM)
下流プライマー(20塩基) (終濃度1.0μM)
10×バッファー (終濃度1×バッファー)
Taqポリメラーゼ (終濃度2unit)
ゲノムDNA (終濃度0.1〜0.2μg)
件下におく。本実施形態では、各プライマーは、部位30に変異を有しない場合のゲノム
DNAの塩基配列に相補的となるように構成されている。従って、部位30にSNPを有
するDNAに対しては、当該プライマーはミスマッチを生じ、安定したハイブリダイゼー
ションを生じさせることができない。
DNAを用いた場合)のPCR反応を説明するための図である。PCR反応を生じさせる
ためには、以下に示す3段階の温度変化をn(例えば30〜35)サイクル繰り返し実行
する必要がある。具体的には、まず、図2(A)および(B)に示すように、第1段階(
熱変性)の温度変化(例えば94〜96℃)によって標的となるSNP部位を含むゲノム
DNA100を熱変性し、一本鎖DNA110、120を得る。ここで、一本鎖DNA1
10、120のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットDNA110と呼び、遺伝子
情報を有しないものを相補鎖DNA120と呼ぶ。
60℃)によって上流プライマー130はターゲットDNA110にアニーリングし、末
端にチオール基150が付加された下流プライマー140は相補鎖DNA120にアニー
リングする。そして、図2(D)に示すように、第3段階(伸長反応)の温度変化(例え
ば72〜74℃)によって上流プライマー130、下流プライマー140は共に伸長され
る。このようなサイクルがnサイクル繰り返されることにより、ターゲットDNA110
、相補鎖DNA120は共に2n倍に増幅される。
合、即ち、部位30にSNPを有する場合のPCR反応を説明するための図である。なお
、本実施形態では、ゲノムDNAと下流プライマーが非相補的な場合を説明するが、ゲノ
ムDNAと上流プライマーが非相補的な場合も同様である。
SNP部位30を有するゲノムDNA100を熱変性し、ターゲットDNA110、相補
鎖DNA120を得る。次に、図3(C)に示すように、第2段階の温度変化によって、
ターゲットDNA110および相補鎖DNA120にプライマーをアニーリングさせる。
ここで、上流プライマー120はターゲットDNA110にアニーリングするが、下流プ
ライマー140は端部においてミスマッチ(具体的には、図3(C)に示す下流プライマ
ー140の塩基「G」と相補鎖DNA120の塩基「T」)が生じているため、相補鎖D
NA120に完全な形でアニーリングできない。
上流プライマー130は伸長されるものの、下流プライマー140は伸長されない。この
ようなサイクルがnサイクル繰り返されることにより、ターゲットDNA110は2n倍
に増幅される一方、相補鎖DNA120は増幅されない。
ーが伸長されるが、SNPが存在する場合、チオール基150が付けられたプライマー1
40は伸長されない。
ができれば、SNPの有無を確認することができる。本実施形態では、表面に金薄膜が形
成された電極に、チオール基150を結合させ、プライマー140からなるSAMを形成
し、インピーダンスを測定することによって、プライマー140の伸長の有無を検出する
。
<被膜の形成>
極表面に被膜を形成し、汚染物質(本実施形態では特にチオール基を有しない伸長された
プライマー130)の非特異的な付着を防ぐ。
性官能基(リン酸基)を含むDNAを用いる。被膜形成分子として用いるDNAの長さは
、上記PCR法に用いられるプライマーの1〜2倍程度の長さとすることが好ましい。こ
のような長さとすることにより、PCR後の溶液に含まれる最も短いDNAの付着も効果
的に妨げることができるのと同時に、チオール基150を有するPCR産物の電極表面へ
の吸着は妨げない。
とによって形成することができる。
<チオール基を有するプライマーの電極表面への結合>
ーダンス測定溶液中に浸漬させる。測定溶液の組成を以下に示す。
測定溶液の組成
PBS(pH7.0) (50mM)
NaCl (1M)
MgCl2 (10mM)
まず、上記測定溶液10mlを調製した後、測定溶液に被膜Bを形成した電極基板A(
本実施形態では電極面積3mm程度の金電極基板)を5分程度浸漬させる。
CR反応終了後の試料溶液を投入し、チオール基により伸長された/またはされなかった
プライマーを電極表面に結合させる。
5は、伸長反応が起こらなかった場合、即ち、SNPが存在した場合を示す。
たはされなかったプライマー140のみが電極Aの表面に吸着固定され、チオール基を有
しないPCR産物130は、被膜に妨げられて電極Aの表面には付着せず、溶液中に残る
。
<電気的測定>
Aに接続されたインピーダンス測定装置50を利用してインピーダンスの容量成分Z’’
(イマージナリーパート)を測定する。測定開始から500秒経過後、測定溶液中に各試
料溶液(1μM、100μl)を投入し(図4(B)、図5(B)参照)、3000秒経
過するまでの間、100Hzで10秒に1回の割合でインピーダンスの容量成分Z’’の
測定を行う。
に固定化される。
伸長反応が起こった場合の測定結果を一点鎖線で示し、伸長反応が起こらなかった場合の
測定結果を点線で示している。また、比較のため、20塩基長のオリゴDNAを電極基板
に固定化し、上記と同じ条件でインピーダンスの容量成分Z’’の測定(比較実験)を行
ったときの測定結果を太実線で示している。
と伸長反応が起こった場合のインピーダンスの容量成分Z’’は大きく異なっている。具
体的には、伸長反応が起こらなかった場合は比較実験とほぼ同様な結果が得られるのに対
し(図5に示す点線、太実線参照)、伸長反応が起こった場合は比較実験と大きく異なる
結果が得られる(図5に示す一点鎖線、太実線参照)。このように、得られるインピーダン
スの容量成分Z’’の大きさを適宜比較することで、伸長反応が起こったか否か(ここで
は特定の塩基配列が存在するか否か)を精度良く検出することができる。
汚染物質が電極A表面に非特異的に付着するのを妨げることができるので、伸長反応の有
無を高感度に再現性良く検出することができ、SNPタイピングに基づいた薬の投与とい
ったテーラーメイド医療に活用することができる。
成された電極を用いても良い。かかる場合には、例えばアミノ基など、電極基板の種類等
に応じて固定化に必要な官能基(電極結合部位)をプライマーの末端に付加すれば良い。
とで伸長反応が生じたか否か(SNP部位に特定の塩基配列が存在するか否か)を検出し
たが、インピーダンスに限らず、電流測定(電気的測定)によって得られる電流値や電荷
量測定(電気的測定)によって得られる電荷量を比較することによって伸長反応が生じた
か否か等を検出するようにしても良い。なお、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法によ
って電極表面の屈折率変化や質量変化を捉えることでプライマー末端に伸張反応が生じた
か否かを検出することも可能であり、さらに、PCR反応時に蛍光分子を取り込ませれば
蛍光観察によって伸長反応が生じたか否か等を光学的に検出することも可能である。
(第3の実施形態)
示す。図7(A)は、表面プラズモン共鳴法に用いられる基板700を示す概略断面図で
あり、ガラス等からなる光透過性基板70の表面に金薄膜72が形成され、さらに、被膜
形成分子からなる被膜74が形成されている。基板70に図中下方から光を照射すると金
薄膜72により反射されるが、特定の角度から照射すると共鳴により反射されなくなる現
象が起こる。被膜により金薄膜72に汚染物質が付着するのを妨げることができる一方、
被膜形成分子よりも金薄膜72に対する親和性の高いプローブ分子は固定することができ
る。金薄膜72にプローブ分子が固定され、さらに標的分子がプローブ分子に結合すると
、反射されなくなる入射角度(共鳴角度)が変化するので、この変化を測定することによ
り、結合の有無や結合した物質の質量を検出・測定することができる。
両面に一対の電極82aおよび82bが対向して取り付けられ、電極82aおよび82b
の表面に被膜84aおよび84bが形成されている。被膜84aおよび84bにより、電
極82aおよび82bに汚染物質が付着するのを妨げることができる一方、被膜形成分子
よりも電極82aおよび82bに対する親和性の高いプローブ分子は固定することができ
る。電極表面にプローブ分子が固定され、さらに標的分子がプローブ分子に結合すると、
水晶振動子80の振動数がその質量によって変化し、この変化を検出することによって、
結合の有無等を検出・測定することができる。
学的検出用基板900は、複数の検出部位90と、検出回路92とを備えており、検出部
位90にはカウンター電極および参照電極が備えられ、これらの電極がそれぞれ個別に検
出回路92に電気的に接続されている。検出部位90の表面は金属からなり、この表面に
それぞれ被膜が形成されている。被膜により、電極表面への汚染物質の付着を妨げること
ができる一方、皮膜形成分子よりも電極表面に親和性の高いプローブ分子は結合させるこ
とができる。電流、電荷量、インピーダンスの変化を検出して、プローブ分子の結合やプ
ローブ分子に対する標的分子の結合を検出・測定することが可能である。
(第4の実施形態)
、および核酸における多型を検出するためのキットである。これらは上述した、第3の実
施形態における基板に被膜を形成される前のものと、被膜を形成するための被膜形成分子
とを含む。このようなキットによれば、ユーザにおいて、被膜形成分子を含む溶液を調製
し、これに、基板(電極基板を含む)を浸漬させることによって、容易にその表面に被膜
を形成することができる。被膜が形成された基板を用いれば、表面に汚染物質が付着する
のを防ぎ、プローブ分子等必要な分子のみを吸着固定させることが可能である。
、この被膜がチオール基を有する分子に置換されることを確認した。
[1]に示すVeratrylamineを含む1mM水溶液に浸漬し、Veratrylamineによる被膜を形成
した。
ylamineによる被膜が形成されたことが確認された。
水溶液に30分浸漬させた。PEGは非特異的な吸着をおこしにくく、水溶性の原子団であ
るためモデルとして適している。チオール基を有するPEGとしては、HO−(CH2−
CH2−O)7−CH2−CH2−SHを用いた。
有するPEGによる皮膜のIRデータを一点鎖線で示す。浸漬30分後のIRデータでは、
Veratrylamineを示すピークが小さくなり、代わって、PEGを示すピーク(矢印3、4
)が出現することが確認され、Veratrylamineによる被膜がPEGに置換されることが示
された。
、この被膜がチオール基を有する分子に置換されることを確認した。
(CH3COOH)を含む5%水溶液に15分浸漬し、被膜を形成した。
酸による被膜が形成されたことが確認された。
水溶液に30分浸漬させた。PEGは非特異的な吸着をおこしにくく、水溶性の原子団であ
るためモデルとして適している。チオール基を有するPEGとしては、HO−(CH2−
CH2−O)7−CH2−CH2−SHを用いた。
するPEGによる皮膜のIRデータを一点鎖線で示す。浸漬30分後のIRデータでは、酢
酸を示すピークが小さくなり、代わって、PEGを示すピーク(矢印7)が出現すること
が確認され、酢酸による被膜がPEGに置換されることが示された。
ブ分子、18…プローブ分子によるSAM、20…標的分子、30…多型が存在する可能
性を有する部位、110、120…一本鎖DNA、130、140…プローブ、150…
チオール基、50…インピーダンス測定装置、700…表面プラズモン共鳴用基板、80
0…水晶振動子用基板、900…電気化学測定用基板
Claims (10)
- 核酸における多型を検出する方法であって、
一端に測定用基板に結合可能な基板結合部位を有するプライマーであって、前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリング可能なプライマーを使用する方法であり、
前記核酸と、前記プライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う第1工程と、
前記ポリメラーゼ連鎖反応産物の基板結合部位と前記測定用基板とを結合させる第2工程と、
前記測定用基板に結合した前記プライマーの伸長反応の有無を測定することによって、多型の有無を検出する第3工程と、を含み、
前記第2工程に先立って、前記測定用基板表面に対する親和性が前記基板結合部位より低い被膜形成分子からなる被膜を形成する、方法。 - 前記第3工程における測定が、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法、または電気化学検出法によって行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記基板が電極基板である、請求項1または2に記載の方法。
- 生体分子をその表面に固定して用いられる、表面プラズモン共鳴法用、水晶振動子法用、または電気化学検出法用の基板であって、
前記基板表面に、前記基板表面に対する親和性が前記生体分子より低い被膜形成分子からなる被膜が形成されている基板。 - 前記基板表面が金属からなることを特徴とする、請求項4に記載の基板。
- 前記被膜形成分子が、カチオン性官能基および/またはアニオン性官能基を有することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 試料溶液中の標的分子を検出および/または定量するためのキットであって、
前記標的分子と特異的に結合するプローブ分子を固定して使用される基板と、
前記基板の表面に対する親和性が前記プローブ分子より低い被膜形成分子と、を含むキット。 - 核酸における多型を検出するためのキットであって、
前記多型を含む可能性を有する領域にアニーリングし、その一端に電極結合部位を有するプライマーと、
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と、
電極基板と、
前記電極基板に対する親和性が前記電極結合部位より低い被膜形成分子と、を含むキット。 - 核酸における多型を検出する方法であって、
前記核酸と、プライマーと、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、連鎖反応産物を形成する第1工程と、
基体の表面に膜を形成する第2工程と、
前記連鎖反応産物と前記基体とを結合させる第3工程と、
前記プライマーの伸長反応が前記第1工程において生じたか否かを測定する第4工程と、
を含み、
前記膜は、前記基体の表面に対する親和性が前記連鎖反応産物の基体結合部位より低いことを特徴とする方法。 - 前記基体は電極を含む、請求項9に記載の方法。
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