JP4622820B2 - Method and apparatus for analyzing glycated protein - Google Patents
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Description
本発明は、高速かつ高精度に糖化ヘモグロビン量を測定する分析方法および装置に関し、健康管理、臨床診断等に資するものである。 The present invention relates to an analysis method and apparatus for measuring the amount of glycated hemoglobin at high speed and with high accuracy, and contributes to health management, clinical diagnosis, and the like.
糖尿病患者の長期間の血糖コントロールの指標に糖化ヘモグロビンが広く用いられている。糖化ヘモグロビンとはヘモグロビンに糖が非酵素的に結合した糖化タンパク質の一種である。糖化ヘモグロビンの中でも特に、ＨｂＡ１ｃと呼ばれる画分はヘモグロビンＡのβ鎖Ｎ末端のバリン残基にグルコースがシッフ塩基を形成してアルジミン（不安定型）となり、さらにアマドリ転位を受けてケトアミン化合物を生成したものである。なおアルジミン構造をとるものを不安定糖化ヘモグロビン、ケトアミン構造をとる場合を安定糖化ヘモグロビンと呼ぶ。なお、アマドリ転位後の前記β鎖のＮ末端はフルクトシルバリン残基となる。 Glycated hemoglobin is widely used as an index for long-term blood glucose control in diabetic patients. Glycated hemoglobin is a kind of glycated protein in which sugar is non-enzymatically bound to hemoglobin. Among the glycated hemoglobins, in particular, a fraction called HbA1c formed a Schiff base at the valine residue at the N-terminus of hemoglobin A to form an aldimine (unstable form), and further undergoes Amadori rearrangement to produce a ketoamine compound. Is. Those having an aldimine structure are called unstable glycated hemoglobin, and those having a ketoamine structure are called stable glycated hemoglobin. The N-terminal of the β chain after Amadori rearrangement is a fructosyl valine residue.
この反応過程に酵素の関与はなく、血漿中のグルコース濃度に応じてその量が増加し、いわゆる血漿中の血糖値が平均的に長期間高い値を示すとＨｂＡ１ｃは高値となる。安定型糖化ヘモグロビンはその赤血球の寿命が尽きるまで消滅しない。一般にヘモグロビン分子の生体内での寿命は２ヶ月程度とされており、その結果、ＨｂＡ１ｃの値は過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映するとされている。そのためＨｂＡ１ｃは長期間の血糖値の平均値の指標として用いられる。一般に血糖値は、検査前の生活態度、食事等により変動しやすい特性を有するが、ＨｂＡ１ｃは長期間の平均値であるため、糖尿病の確定診断、治療のための判断材料として用いるのに適しているとされている。 Enzyme is not involved in this reaction process, and its amount increases according to the glucose concentration in the plasma. When the blood glucose level in the plasma shows a high value on average for a long period of time, HbA1c becomes high. Stable glycated hemoglobin does not disappear until the life of the red blood cells is exhausted. In general, the lifetime of hemoglobin molecules in vivo is about 2 months, and as a result, the value of HbA1c is considered to reflect the average blood glucose level over the past 1 to 2 months. Therefore, HbA1c is used as an index of the average value of blood glucose level over a long period. In general, blood glucose levels tend to vary depending on the lifestyle before meals, meals, etc., but HbA1c is an average value over a long period of time, so it is suitable for use as a judgment material for definite diagnosis and treatment of diabetes. It is said that there is.
そのため、すでに糖化ヘモグロビンについて多種多様の測定方法が提案されている。その代表的なものとして、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、免疫法、酵素法が挙げられる。 Therefore, various measurement methods have already been proposed for glycated hemoglobin. Typical examples include high performance liquid chromatography (HPLC), immunization, and enzymatic methods.
ＨＰＬＣ法は、現在最も多用される方法である。分離カラムによりヘモグロビンを分画し、ＨｂＡ１ｃに相当する保持容量に溶出したピークと、全ピーク面積の比率からＨｂＡ１ｃの存在比率を算出する。いわば相対面積法をとるため、注入容量の精度をある程度無視できるなどの利点がある。しかし装置が大型かつ複雑であり、メンテナンス負荷が大きい等の問題がある。また、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃが区別できないため、あらかじめ不安定型ＨｂＡ１ｃを除去後に分離分析を行わなければならないという欠点を有する（特許文献１）。同時に先天的なヘモグロビンの変異がある場合は、分離パターンが変化して異常値を示す場合がある。また他の生体成分が偶然ＨｂＡ１ｃのピークと重複することによる誤差を含む可能性がある。 The HPLC method is the most frequently used method at present. The hemoglobin is fractionated by a separation column, and the abundance ratio of HbA1c is calculated from the ratio of the peak eluted in the retention volume corresponding to HbA1c and the total peak area. In other words, since the relative area method is used, there is an advantage that the accuracy of the injection capacity can be ignored to some extent. However, there are problems such as a large and complicated apparatus and a heavy maintenance load. Moreover, since unstable type HbA1c and stable type HbA1c cannot be distinguished, it has the fault that a separation analysis must be performed after removing unstable type HbA1c beforehand (patent document 1). At the same time, when there is a congenital hemoglobin mutation, the separation pattern may change and show an abnormal value. In addition, there is a possibility that other biological components may include an error due to an overlap with the peak of HbA1c.
免疫法はＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端付近の構造に対応した抗体を利用することにより、より高精度な分析を、より簡単な機構で達成できる可能性を有する。しかし一般的な免疫分析のように血清を対象とするのではなく、全血を溶血させた検体を対象とするため、非特異反応が起きやすく、また反応を検知するために用いる比色計が汚染されやすいため、必ずしも満足できる精度が得られないことが指摘されている。 The immunization method has a possibility that more accurate analysis can be achieved with a simpler mechanism by using an antibody corresponding to the structure near the N-terminus of the β chain of HbA1c. However, it is not intended for serum as in general immunoassay, but is intended for specimens in which whole blood is hemolyzed, so non-specific reactions are likely to occur, and a colorimeter used to detect the reaction is used. It has been pointed out that satisfactory accuracy cannot always be obtained due to contamination.
一方で酵素法は、糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を何らかの手法で切り出した後、生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸量を糖化ペプチドオキシダーゼや糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いて検出するものである。酵素の選択性を利用することにより、より高精度の分析を実施できる可能性がある。 On the other hand, in the enzymatic method, a glycated peptide or glycated amino acid is cut out from a glycated protein by some technique, and then the amount of glycated peptide or glycated amino acid generated is detected using an enzyme such as glycated peptide oxidase or glycated amino acid oxidase. By using the selectivity of the enzyme, there is a possibility that a more accurate analysis can be performed.
まず、糖化アミノ酸を酵素により測定する方法は特許文献２に記載されている。しかし、糖化タンパク質から糖化アミノ酸を切り出す方法は記載されていない。
First,
のみならず、いまだ未解決の問題点は多い。 There are still many unsolved problems.
まず第１の問題点としては、できる限り迅速に糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を切り出すタンパク質分解酵素が必要となる。同時に活性の高いタンパク質分解酵素は、ヘモグロビンのみならず糖化ペプチドオキシダーゼや糖化アミノ酸オキシダーゼすら分解する可能性があり、ヘモグロビンを選択的に分解する方法が模索されているが、有効な方法は、いまだ見出されていない。 First, as a first problem, a proteolytic enzyme that cuts out a glycated peptide or glycated amino acid as quickly as possible is required. At the same time, highly active proteolytic enzymes may degrade not only hemoglobin but also glycated peptide oxidase and glycated amino acid oxidase, and a method for selectively degrading hemoglobin has been sought. It has not been issued.
第２の問題点は、ヘモグロビンのα鎖とβ鎖はＮ末端アミノ酸がいずれもバリンであり、糖化アミノ酸を検知する場合には、糖化アミノ酸を遊離するタンパク質分解酵素が理想的にはβ鎖のみに作用することが望ましい。しかし、α鎖とβ鎖のように非常に類似した基質に対して、高度の選択性を有するタンパク質分解酵素はいまだ発見されていない。 The second problem is that both the α-chain and β-chain of hemoglobin are valine at the N-terminal amino acid. When detecting glycated amino acids, the proteolytic enzyme that liberates glycated amino acids is ideally only β-chain. It is desirable to act on However, a proteolytic enzyme having a high degree of selectivity with respect to very similar substrates such as α chain and β chain has not yet been discovered.
この問題点に関しては、別の観点からの解決策が提示されている。つまり、タンパク質分解酵素で遊離された糖化アミノ酸を検知するのではなく、糖化ジペプチドまたは糖化ペプチドを検知することによりα鎖とβ鎖の糖化を区別するものである。特に糖化ジペプチドの中で選択的にフルクトシルバリルヒスチジンに作用する酸化酵素が提案されている(特許文献３、４、５)。このフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを利用すれば、タンパク質分解酵素の基質特異性に対する要求事項を減らすことができる。
Regarding this problem, a solution from another viewpoint is presented. That is, the glycation of the α chain and the β chain is differentiated by detecting a glycated dipeptide or a glycated peptide instead of detecting a glycated amino acid released by a proteolytic enzyme. In particular, an oxidase that selectively acts on fructosylvalylhistidine among glycated dipeptides has been proposed (
しかし、特許文献３において、タンパク質分解酵素により処理された試料を糖化ペプチドオキシダーゼまたはＨＰＬＣで測定することにより糖化タンパク質を定量する方法が開示されている。しかしタンパク質分解酵素が糖化タンパク質のみに作用し、糖化ペプチドオキシダーゼに作用しないという別の特異性に関しては何らの検討がなされておらず、実施例においてもタンパク質分解酵素を熱失活し限外ろ過を行う例が示されているのみである。
However,
特許文献４においては、酵素の活性を低分子標準物で測定しており、糖化タンパク質から糖化ペプチドを遊離する方法は開示されていない。 In Patent Document 4, the activity of an enzyme is measured with a low molecular standard, and a method for releasing a glycated peptide from a glycated protein is not disclosed.
特許文献５においては、ストレプトマイセス属由来のタンパク質分解酵素を大過剰に用いて糖化ヘモグロビン中の糖化ペプチドを計ることによりＨｂＡ１ｃを定量する方法が例示されている。しかし、特許文献５に記載されるように、多くの糖化ペプチドオキシダーゼは糖化アミノ酸にも応答する特性がある。従って大過剰のタンパク質分解酵素が存在する場合に、糖化ペプチドと糖化アミノ酸のいずれが反応したかは明瞭ではなく、糖化ペプチドオキシダーゼの特長である、ヘモグロビンβ鎖に対する特異性を完全に発揮させた例はない。
特許文献６においては、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸に作用して過酸化水素を生成する酵素と、その基質を生成するタンパク質分解酵素の組み合わせを検討したものである。本特許において、タンパク質分解酵素の糖化アミノ酸生成活性は、糖化ジペプチドから糖化アミノ酸を遊離する活性として評価され、また、糖化ジペプチドの生成活性は糖化ジペプチドのニトロアニリド誘導体からニトロアニリンを遊離する活性として評価されている。従って、実際の高分子量の糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンから、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸が遊離するかどうかは不明である。実際に本発明で有効とされる植物由来のタンパク質分解酵素であるパパインについて、本願発明者らは有効性を確認することができなかった。
In
特許文献７においては、糖化ジペプチドを遊離する方法として、各種タンパク質分解酵素の例示があるが、実際には糖化ヘキサペプチドから糖化ジペプチドを遊離する方法を検討しており、実際の糖化ヘモグロビンを分解したものではない。また本願発明者らの追試では、バチルス属を除くタンパク質分解酵素、特にパパインやアスペルギルス属のタンパク質分解酵素では応答が全く得られず、バチルス属由来のタンパク質分解酵素でのみ応答するという結果となり、追試することはできなかった。この理由は明らかでないが、特許文献７ではプロテアーゼ分解した際にフルクトシルバリルヒスチジンと同時生成する別の生成物が検出されていると考えられる。
In
あくまで糖化ヘモグロビンを測定する場合には、タンパク質分解酵素の検討に使用する基質は糖化ヘモグロビン自体であることが必要である。また、タンパク質分解酵素を利用する際には、糖化ペプチドのみを検知することが望ましいが、従来、糖化ヘモグロビンを効率的に分解し、かつ必要とされる糖化ペプチドのみを検知する方法は開示されていない。 When measuring glycated hemoglobin to the last, it is necessary that the substrate used for examination of proteolytic enzyme is glycated hemoglobin itself. Further, when using a proteolytic enzyme, it is desirable to detect only a glycated peptide, but conventionally, a method for efficiently degrading glycated hemoglobin and detecting only the required glycated peptide has been disclosed. Absent.
さらに、検体中に含まれるヘモグロビン総量を検知し、糖化ヘモグロビンの比率を簡便かつ正確に算出する方法および装置は従来開示されていない。
本発明の目的は、糖化ヘモグロビン量の高精度な分析方法を提供する。 An object of the present invention is to provide a highly accurate analysis method for the amount of glycated hemoglobin.
また本発明の他の目的は、糖化ヘモグロビンから生成した糖化ジペプチドに特異的なフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体の使用方法および装置を提供し、ＨｂＡ１ｃの定義であるヘモグロビンβ鎖の糖化物の正確な定量を可能とすることである。 Another object of the present invention is to provide a method and an apparatus for using an immobilized form of fructosyl peptide oxidase specific to a glycated dipeptide generated from glycated hemoglobin, and to accurately identify the glycated product of hemoglobin β chain defined by HbA1c. It is to enable quantification.
本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体と、フルクトシルペプチドオキシダーゼの触媒する反応により増減する電気化学的活性物質を検知する機構を用いて、フルクトシルバリルヒスチジン濃度を電気化学的に検知し、フルクトシルバリルヒスチジン量から糖化ヘモグロビンを算出するにあたり、フルクトシルペプチドオキシダーゼ固体化体と検体が接触する前に、糖化ヘモグロビンを含む検体をバチルス属由来のタンパク質分解酵素で処理することを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法を開示する。 The present invention uses an immobilized body in which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valyl histidine is immobilized, and a mechanism for detecting an electrochemically active substance that is increased or decreased by a reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase. Before electrochemically detecting the concentration of fructosyl valyl histidine and calculating glycated hemoglobin from the amount of fructosyl valyl histidine, before contacting the solidified substance of fructosyl peptide oxidase with the sample, remove the glycated hemoglobin-containing sample from the genus Bacillus. Disclosed is a method for analyzing glycated hemoglobin, characterized by treatment with a proteolytic enzyme derived therefrom.
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際のバチルス属由来のタンパク質分解酵素は、中性または酸性に至適ｐＨを有するバチルス属由来のタンパク質分解酵素であることが望ましい。 The proteolytic enzyme derived from the genus Bacillus when processing a specimen containing glycated hemoglobin is desirably a proteolytic enzyme derived from the genus Bacillus having an optimum pH neutral or acidic.
さらに、糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に、検体を陰イオン界面活性剤含有緩衝液と混合し、その混合された検体をバチルス属由来のタンパク質分解酵素で処理することが望ましい。さらにタンパク質分解酵素を化学的に固定化した固定化体と陰イオン界面活性剤と混合した検体を接触させて分解処理することができる。 Furthermore, when processing a specimen containing glycated hemoglobin, it is desirable to mix the specimen with a buffer solution containing an anionic surfactant and treat the mixed specimen with a protease derived from Bacillus. Furthermore, it can be decomposed by bringing a sample mixed with an immobilized surfactant obtained by chemically immobilizing a proteolytic enzyme and an anionic surfactant into contact with each other.
ヘモグロビンの糖化割合は、フルクトシルペプチド量と糖化ヘモグロビンを含む検体の光吸収から求めたヘモグロビン量の比率より算出すればよい。 The glycation ratio of hemoglobin may be calculated from the ratio of the amount of fructosyl peptide and the amount of hemoglobin determined from the light absorption of the sample containing glycated hemoglobin.
また、本発明は前記のタンパク質分解酵素で検体を処理する時間が、フルクトシルバリンに応答し、フルクトシルバリルヒスチジンに応答しないフルクトシルバリン検知機構、および／または少なくとも１種類の遊離アミノ酸を検知できる該アミノ酸検知機構に、糖化ヘモグロビンを含む検体をバチルス属由来のタンパク質分解酵素で処理した検体を接触させたときに、過酸化水素の増加または酸素の減少が観察されない時間範囲内である糖化ヘモグロビンの分析方法を開示する。
これらの分析は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体（１７）と、フルクトシルペプチドオキシダーゼの触媒する反応により増減する電気化学的活性物質を検知する電気化学検出機構（１８）と、糖化ヘモグロビンを含む検体とバチルス属由来のタンパク質分解酵素と任意の時間接触させ、その一部を注入する機構（４、５、７）を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置により実現される。ここで、「任意の時間」とは、ＨｂＡ１ｃが分析可能である限り特に限定されない。検体がタンパク質分解酵素で処理される時間は、フラクトシルバリン検知機構とアミノ酸検知機構の一方又は両方、好ましくは両方を使用して決定することができる。フラクトシルバリン検知機構を用いるのは、タンパク質分解酵素により生じたフラクトシルバリルヒスチジンがさらに分解を受けてフラクトシルバリンにならないようにタンパク質分解酵素による検体の処理時間の上限を定めるためであり、アミノ酸検知機構を用いるのは、処理時間が長くなるとε−フラクトシルリジンが生じ、ε−フラクトシルリジン量が多くなるとフラクトシルバリルヒスチジンの測定量に影響するため、ε−フラクトシルリジン生成量をフラクトシルバリルヒスチジンの測定に影響しない範囲に抑えるためである。具体的には、フラクトシルバリンおよび／またはアミノ酸(特にε−フラクトシルリジン)の発生するまでの時間を測定し、その時間よりも短い検体の処理時間を設定すればよい。
The present invention also provides a fructosyl valine detection mechanism in which the time for treating a sample with the above-mentioned proteolytic enzyme is responsive to fructosyl valine and not responsive to fructosyl valyl histidine, and / or at least one free amino acid Within the time range in which no increase in hydrogen peroxide or decrease in oxygen is observed when the sample containing glycated hemoglobin is contacted with a sample treated with a proteolytic enzyme derived from the genus Bacillus to the amino acid detection mechanism capable of detecting A method for analyzing glycated hemoglobin is disclosed.
These analyzes consist of an immobilized form (17) in which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valylhistidine is immobilized, and an electrochemical that detects an electrochemically active substance that increases or decreases by the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase. By means of a glycated hemoglobin analyzer equipped with a detection mechanism (18) and a mechanism (4, 5, 7) in which a specimen containing glycated hemoglobin and a proteolytic enzyme derived from the genus Bacillus are brought into contact with each other for an arbitrary period of time. Realized. Here, the “arbitrary time” is not particularly limited as long as HbA1c can be analyzed. The time that the specimen is treated with the proteolytic enzyme can be determined using one or both of the fructosyl valine detection mechanism and the amino acid detection mechanism, preferably both. The reason for using the fructosyl valine detection mechanism is to determine the upper limit of the sample processing time with the proteolytic enzyme so that the fructosyl valyl histidine generated by the proteolytic enzyme is further decomposed and does not become fructosyl valine. The detection mechanism is used because ε-fructosyl lysine is produced when the treatment time is increased, and when the amount of ε-fructosyl lysine is increased, the amount of ε-fructosyl lysine is affected. This is to keep it within a range that does not affect the measurement of silvalyl histidine. Specifically, the time until the generation of fructosyl valine and / or amino acid (particularly ε-fructosyl lysine) is measured, and the sample processing time shorter than that time may be set.
フラクトシルバリン検知機構および／またはアミノ酸検知機構を用いて適切なタンパク質分解酵素による検体の処理時間の範囲をいったん決定し、処理条件を一定にすれば、上述の検知機構を使用せずにその処理時間の範囲内で検体を処理することができる。
さらにフルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体（１７）と、フルクトシルペプチドオキシダーゼの触媒する反応により増減する電気化学的活性物質を検知する電気化学検出機構（１８）と、糖化ヘモグロビンを含有する検体を注入する機構（４、５、７）を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置であって、検体を注入する機構の下流にバチルス属由来のタンパク質分解酵素を結合したカラム状リアクターを備えることができる。
Once the range of sample processing time with the appropriate proteolytic enzyme is determined using the fructosyl valine detection mechanism and / or amino acid detection mechanism, and the processing conditions are fixed, the processing can be performed without using the detection mechanism described above. The specimen can be processed within the time range.
Further, an immobilized body (17) on which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valyl histidine is immobilized, and an electrochemical detection mechanism (18) for detecting an electrochemically active substance that increases or decreases by the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase. ) And a glycated hemoglobin analyzer equipped with a mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen containing glycated hemoglobin, wherein a protease derived from the genus Bacillus is bound downstream of the mechanism for injecting the specimen A column reactor can be provided.
フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体（１７）と、フルクトシルペプチドオキシダーゼの触媒する反応により増減する電気化学的活性物質を検知する電気化学検出機構（１８）と、糖化ヘモグロビンを含有する検体を注入する機構（４、５、７）を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置であって、検体を注入する機構（４、５、７）の下流に遊離アミノ酸検知機構またはフルクトシルバリン検知機構を併設することが望ましい。 Immobilized body (17) on which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valylhistidine is immobilized, and electrochemical detection mechanism (18) for detecting electrochemically active substances that increase or decrease due to the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase And a glycated hemoglobin analyzer having a mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen containing glycated hemoglobin, and a free amino acid detection mechanism downstream of the mechanism (4, 5, 7) for injecting the specimen Alternatively, it is desirable to provide a fructosyl valine detection mechanism.
フルクトシルバリルヒスチジンに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼを固定化した固定化体（１７）と、フルクトシルペプチドオキシダーゼの触媒する反応により増減する電気化学的活性物質を検知する電気化学検出機構（１８）と、糖化ヘモグロビンを含有する検体を注入する機構（４、５、７）を備えた糖化ヘモグロビンの分析装置であって、検体を注入する機構（４、５、７）またはその下流に少なくとも、試料の光吸収から求めたヘモグロビン量を算出し、該ヘモグロビン量とフルクトシルペプチド量からヘモグロビンの糖化割合を算出する機構を併設することが望ましい。 Immobilized form (17) on which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valylhistidine is immobilized, and electrochemical detection mechanism (18) for detecting electrochemically active substances that increase or decrease due to the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase And a glycated hemoglobin analyzer equipped with a mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen containing glycated hemoglobin, and at least a sample downstream of the mechanism (4, 5, 7) for injecting the specimen It is desirable to add a mechanism for calculating the amount of hemoglobin obtained from the light absorption of the lysate and calculating the glycation ratio of hemoglobin from the amount of hemoglobin and the amount of fructosyl peptide.
本発明によれば、血液検体中の安定糖化ヘモグロビンを簡便かつ高精度に定量することができる。 According to the present invention, stable glycated hemoglobin in a blood sample can be quantified simply and with high accuracy.
以下、本発明の構成及び好ましい形態についてさらに詳しく説明する。 Hereinafter, the configuration and preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
本発明に使用しうるタンパク質分解酵素は、糖化ヘモグロビンまたはそのフラグメントからＮ末端の糖化ペプチドを生じる作用が大きいものであれば良い。本発明者らが鋭意検討した結果バチルス属由来のタンパク質分解酵素にその大きな作用がみとめられた。また、ヒトヘモグロビンはｐＨ５．０以下では沈殿するので、タンパク質分解酵素が効果的に作用するにはヘモグロビンが十分に溶解できるｐＨ範囲に至適を持つタンパク質分解酵素がより好ましい。好ましくはｐＨ６．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。具体的には、プロテアーゼＮ（天野エンザイム株式会社製）、プロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成株式会社製）、プロタメックス（ノボザイム社製）、ニュートラーゼ（ノボザイム社製）を例示することができる。 Any proteolytic enzyme that can be used in the present invention may be used as long as it has a large effect of generating an N-terminal glycated peptide from glycated hemoglobin or a fragment thereof. As a result of intensive studies by the present inventors, a large effect was found on the protease derived from the genus Bacillus. Moreover, since human hemoglobin precipitates at pH 5.0 or lower, a proteolytic enzyme having an optimum pH range in which hemoglobin can be sufficiently dissolved is more preferable for the proteolytic enzyme to act effectively. Preferably it is pH 6.0-10.0, More preferably, it is pH 6.0-8.0. Specifically, protease N (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), protamex (manufactured by Novozyme), and neutrase (manufactured by Novozyme) can be exemplified.
糖化ヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させる方法としては、まず糖化ヘモグロビンを含む検体を界面活性剤含有緩衝液と混合して反応させた後、その反応液をタンパク質分解酵素溶液またはタンパク質分解酵素が固定化された担体と所定時間接触させる等の方法が挙げられ、何れの方法を用いてもよい。 As a method of allowing proteolytic enzyme to act on glycated hemoglobin, first, a sample containing glycated hemoglobin is mixed with a surfactant-containing buffer and reacted, and then the reaction solution is immobilized by a proteolytic enzyme solution or a proteolytic enzyme. For example, any method may be used, such as a method of contacting the carrier for a predetermined time.
タンパク質分解酵素の濃度、反応ｐＨ及び反応温度等のタンパク質分解酵素の反応条件は、タンパク質分解酵素に応じて適宜選択される。一例として、プロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成株式会社製）を溶液で使用する際には、糖化ヘモグロビンを含む検体の界面活性剤含有緩衝液での処理条件は、処理液中の血球濃度が５〜２０体積％のとき、処理液中のプロチンＰＣ１０Ｆの濃度が０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、反応温度が２０〜５０℃、反応ｐＨは６．０〜９．０を例示できる。 The reaction conditions of the proteolytic enzyme such as the concentration of the proteolytic enzyme, the reaction pH, and the reaction temperature are appropriately selected according to the proteolytic enzyme. As an example, when protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) is used as a solution, the treatment condition of a sample containing glycated hemoglobin with a surfactant-containing buffer solution is such that the blood cell concentration in the treatment solution is 5 to 20 volumes. %, The concentration of protin PC10F in the treatment liquid is 0.1 to 50 mg / ml, the reaction temperature is 20 to 50 ° C., and the reaction pH is 6.0 to 9.0.
バチルス属由来のタンパク質分解酵素の不溶性担体への固定化量は、タンパク量で１〜５０ｍｇ／カラムが望ましく、より好ましくはタンパク量で１〜１０ｍｇ／カラムである。 The amount of the Bacillus-derived proteolytic enzyme immobilized on the insoluble carrier is preferably 1 to 50 mg / column of protein, more preferably 1 to 10 mg / column of protein.
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する界面活性剤には、溶血作用とヘモグロビンの分子構造を変化させる２つの作用が必要である。ヘモグロビンは赤血球内に大部分が存在し、適切な濃度の界面活性剤存在下ではヘモグロビンが赤血球外に放出される。また、ヘモグロビンは通常折りたたまれた状態で存在するが、適切な濃度の界面活性剤中では緩んだ状態で存在し、この作用によりタンパク質分解酵素による分解が容易になると推測される。界面活性剤としては、非イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類[例えばポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル(トリトンＸ−１００)、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル等]やポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類[例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ツイーン４０）等]、陰イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類やアルキル硫酸塩［ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等）］、陽イオン系、両性イオン系があるが、陰イオン系界面活性剤が先に述べた２つの効果が高く、望ましい。その濃度は０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％で、界面活性剤との反応時間は数秒〜１０分程度である。 A surfactant used for processing a specimen containing glycated hemoglobin needs two actions to change the molecular structure of hemolysis and hemoglobin. Most of hemoglobin is present in erythrocytes, and hemoglobin is released out of erythrocytes in the presence of an appropriate concentration of surfactant. In addition, hemoglobin is usually present in a folded state, but is present in a relaxed state in an appropriate concentration of surfactant, and this action is presumed to facilitate degradation by proteolytic enzymes. Surfactants include nonionic polyoxyethylene alkyl ethers [for example, polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton X-100), polyoxyethylene (23) lauryl ether, etc.] and polyoxyethylene sorbitan fatty acids. Esters [eg, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (Tween 40), etc.], anionic polyoxyethylene alkyl ethers and alkyl sulfates [sodium dodecyl sulfate (SDS ) Etc.]], cationic and zwitterionic, but anionic surfactants are desirable because they have the two effects described above. The concentration is 0.05 to 10%, preferably 0.05 to 1%, and the reaction time with the surfactant is about several seconds to 10 minutes.
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に使用する緩衝液は、ヘモグロビンが溶解できるｐＨ範囲の緩衝液であれば特に限定されず、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の公知の緩衝液及びその塩を使用すればよい。緩衝液には塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を適宜添加してもよい。 The buffer solution used when processing the specimen containing glycated hemoglobin is not particularly limited as long as it is a buffer solution in a pH range in which hemoglobin can be dissolved, and known buffers such as phosphate buffer and Tris buffer and salts thereof. Can be used. A salt such as sodium chloride or potassium chloride may be appropriately added to the buffer solution.
タンパク質分解酵素で検体を処理する時間は、フルクトシルバリンに応答し、フルクトシルバリルヒスチジンに応答しないフルクトシルバリン検知機構、または少なくとも１種類の遊離アミノ酸を検知できる該アミノ酸検知機構に、糖化ヘモグロビンを含む検体のバチルス属由来のタンパク質分解酵素処理溶液を接触させたときに、過酸化水素の増加または酸素の減少が観察されない時間範囲内が望ましい。 The time for treating the sample with the proteolytic enzyme is a fructosyl valine detection mechanism that responds to fructosyl valine and does not respond to fructosyl valyl histidine, or the amino acid detection mechanism that can detect at least one free amino acid, It is desirable to be within a time range in which an increase in hydrogen peroxide or a decrease in oxygen is not observed when contacting a proteolytic enzyme treatment solution derived from the genus Bacillus of a specimen containing glycated hemoglobin.
タンパク質分解酵素の作用によって糖化ヘモグロビンから生成した糖化ペプチド、糖化アミノ酸及びアミノ酸は、順次フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及び該アミノ酸オキシダーゼ（順序は問わない）で過酸化水素に変換し、各々のオキシダーゼにより生成した過酸化水素を電気化学的に検出すれば、試料中の糖化ペプチド、糖化アミノ酸及びアミノ酸濃度が各々測定できる。 Glycated peptides, glycated amino acids and amino acids generated from glycated hemoglobin by the action of proteolytic enzymes are sequentially converted to hydrogen peroxide by fructosyl peptide oxidase, fructosyl amino acid oxidase and the amino acid oxidase (regardless of order). If the hydrogen peroxide produced by the oxidase is detected electrochemically, the glycated peptide, glycated amino acid and amino acid concentration in the sample can be measured.
糖化ペプチドに作用するフルクトシルペプチドオキシダーゼとしては、例えば特開２００１−９５５９８号、特開２００３−２３５５８５号、特開２００４−２７５０１３号公報に記載されているフルクトシルペプチドオキシダーゼが挙げられる。 Examples of the fructosyl peptide oxidase acting on the glycated peptide include fructosyl peptide oxidase described in JP-A No. 2001-95598, JP-A No. 2003-235585, and JP-A No. 2004-275013.
これらの他にも糖化ジペプチドに特異的に作用し、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素は、自然界の微生物を探索して得ることもでき、動物あるいは植物由来の酵素を探索しても得ることができる。また、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等の既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等を改変することにより得ることもできる。 In addition to these enzymes, enzymes that specifically act on glycated dipeptides and catalyze reactions that produce hydrogen peroxide can be obtained by searching for natural microorganisms, or by searching for animal or plant-derived enzymes. Obtainable. Further, known modified fructosyl amino acid oxidases such as Corynebacterium, Aspergillus, Fusarium, Gibberella, Penicillium, Bacillus, etc. Can also be obtained.
糖化ヘモグロビンの測定には、糖化ヘモグロビンα鎖Ｎ末端の糖化ペプチドであるフルクトシルバリルロイシンや糖化アミノ酸であるフルクトシルバリン、ε-アミノ基が糖化された糖化リジンには実質的に作用せず、糖化ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドであるフルクトシルバリルヒスチジンに特異的に作用する酵素、フルクトシルペプチドオキシダーゼが好ましい。これはＨｂＡ１ｃがヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化物と定義されているためで、ヘモグロビンα鎖Ｎ末端に由来するフルクトシルバリルロイシンまたはフルクトシルバリン、血清中に含まれるアルブミンが糖化されたものから遊離するε-アミノ基が糖化されたリジン、ヘモグロビンに含まれるリジン糖化物が測定結果に正の誤差を生じる可能性があるためである。 For the measurement of glycated hemoglobin, the glycated hemoglobin α chain N-terminal glycated peptide, fructosyl valyl leucine, the glycated amino acid fructosyl valine, and the glycated lysine with ε-amino group glycated are not effective. In particular, an enzyme that specifically acts on fructosylvalylhistidine, which is a glycated peptide at the N-terminal of the glycated hemoglobin β chain, is preferably fructosyl peptide oxidase. This is because HbA1c is defined as a glycated product of hemoglobin β chain N-terminal, and fructosyl valyl leucine or fructosyl valine derived from hemoglobin α-chain N terminus, albumin contained in serum is glycated This is because lysine obtained by glycation of the ε-amino group released from lysine and lysine glycation contained in hemoglobin may cause a positive error in the measurement result.
しかしながら、特開２００４−２７５０１３号に記載されているように多くのフルクトシルペプチドオキシダーゼは、フルクトシルペプチドのみならず、フルクトシルバリンにも応答する特性を有している。このような場合、測定結果に生成したフルクトシルバリンに由来する正の妨害を生じるため、高精度は得られない。フルクトシルバリンに由来する妨害を除く方法としては、糖化ヘモグロビンのタンパク質分解酵素処理液中のフルクトシルバリンを特異的に検知して差演算する方法、タンパク質分解酵素処理の条件をフルクトシルバリンが生成しない条件で使用する方法が挙げられるが、高精度を得るには後者の方法が望ましい。後者の場合、タンパク質分解酵素処理液中でフルクトシルバリンが検知されないことが重要であり、具体的には、検体注入機構の下流にフルクトシルバリン検知機構を設けて検出値の増減がないことを確認すればよい。このときに使用するフルクトシルバリン検知機構に要求される要件は、フルクトシルペプチドに応答せず、フルクトシルバリンを特異的に検出することであり、このような特性を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体を検体注入機構の下流に配置して、過酸化水素の増減を検知する方法が特に好ましい。 However, as described in JP-A-2004-275013, many fructosyl peptide oxidases have a characteristic of responding not only to fructosyl peptides but also to fructosyl valine. In such a case, since the positive interference derived from the fructosyl valine produced | generated in the measurement result arises, high precision cannot be obtained. As a method of removing interference derived from fructosyl valine, a method of specifically detecting fructosyl valine in a glycated hemoglobin proteolytic enzyme treatment solution and calculating the difference, and the conditions of proteolytic enzyme treatment are determined. Although the method of using on the conditions which phosphorus does not produce | generate is mentioned, the latter method is desirable for obtaining high precision. In the latter case, it is important that fructosyl valine is not detected in the proteolytic enzyme treatment solution. Specifically, a fructosyl valine detection mechanism is provided downstream of the specimen injection mechanism so that the detection value does not increase or decrease. You can confirm that. The requirement of the fructosyl valine detection mechanism used at this time is to detect fructosyl valine specifically without responding to the fructosyl peptide. A method of detecting an increase or decrease in hydrogen peroxide by disposing an immobilized body on which is immobilized downstream of the specimen injection mechanism is particularly preferable.
さらにフルクトシルペプチドオキシダーゼは、ε−フルクトシルリジンや各種アミノ酸に応答する可能性が指摘されている。これらの成分が問題となる場合には、前述のフルクトシルバリンと同様に、問題となる成分が前記処理検体液中で検知されないことが望ましい。ε−フルクトシルリジンの場合には、前述と同様にε−フルクトシルリジンに特異的に作用するオキシダーゼを使用してもよいが、タンパク質分解酵素の処理液中にε−フルクトシルリジンの非糖化物であるリジンが検知されないことで置換してもよく、後者の方が簡便でより望ましい。該アミノ酸の検出には、該アミノ酸を基質とするアミノ酸オキシダーゼを固定化した固定化体を検体注入機構の下流に配置して、過酸化水素の増減を検出する方法が操作や装置構成の簡便性の点から特に好ましい。例として、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼやＬ-リジンオキシダーゼなどの利用が耐熱安定性、感度の点から望ましい。 Further, it has been pointed out that fructosyl peptide oxidase may respond to ε-fructosyl lysine and various amino acids. When these components are problematic, it is desirable that the problematic components are not detected in the processed specimen liquid, as in the case of fructosyl valine described above. In the case of ε-fructosyl lysine, an oxidase that specifically acts on ε-fructosyl lysine may be used in the same manner as described above, but ε-fructosyl lysine is not glycated in the proteolytic enzyme treatment solution. Substitution may be made by not detecting lysine, which is a product, and the latter is simpler and more desirable. For detection of the amino acid, a method for detecting the increase or decrease in hydrogen peroxide by arranging an immobilized body on which the amino acid oxidase having the amino acid as a substrate is immobilized downstream of the specimen injection mechanism is simple in operation and apparatus configuration. This is particularly preferable. For example, use of L-glutamate oxidase or L-lysine oxidase is desirable from the viewpoint of heat stability and sensitivity.
糖化タンパク質を含む検体のタンパク質分解酵素処理液中のフルクトシルバリルヒスチジンを測定する同時に、フルクトシルバリン及び特定のアミノ酸を測定することで、タンパク分解酵素の処理時間を規定できる。すなわち、フルクトシルバリン及び特定のアミノ酸が検出されず、フルクトシルバリルヒスチジンのみが検出される時間の範囲内でタンパク質分解酵素を使用すればよい。 By measuring fructosyl valyl histidine in a proteolytic enzyme treatment solution of a sample containing a glycated protein, and simultaneously measuring fructosyl valine and a specific amino acid, the processing time of the proteolytic enzyme can be defined. That is, a proteolytic enzyme may be used within a time range in which fructosyl valine and a specific amino acid are not detected and only fructosyl valyl histidine is detected.
タンパク質分解酵素やフルクトシルペプチドオキシダーゼやアミノ酸オキシダーゼも固定化して使用すると、繰り返し使用することができ、より好ましい。 Proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase and amino acid oxidase can be used repeatedly and more preferably.
本発明で使用するバチルス属微生物由来のプロテアーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等の酵素固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。酵素固定化体の形状としては、膜状に固定化し白金、金、カーボンなどからなる電極上にのせることもできるし、不溶性担体に固定化し担体をカラムリアクターに充填して用いることもできる。 As enzyme immobilization methods such as proteases derived from Bacillus microorganisms used in the present invention, fructosyl peptide oxidase, amino acid oxidase, etc., known as protein immobilization methods such as physical adsorption method, ion bond method, inclusion method, and covalent bond method However, the covalent bond method is preferable because of its long-term stability. As a method for covalently binding a protein, various methods such as a method using a compound having an aldehyde group such as formaldehyde, glyoxal, and glutaraldehyde, a method using a polyfunctional acylating agent, a method of crosslinking a sulfhydryl group, and the like are used. it can. As the shape of the enzyme-immobilized body, it can be immobilized in a film shape and placed on an electrode made of platinum, gold, carbon or the like, or it can be immobilized on an insoluble carrier and packed in a column reactor for use.
さらに固定化の際に他種の酵素あるいはゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質、ポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化体の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを変更することもできる。酵素を不溶性担体に固定化する場合の担体としては、ケイソウ土、活性炭、アルミナ、酸化チタン、架橋処理デンプン粒子、セルロール系高分子、キチンおよびキトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。 Furthermore, during immobilization, other types of enzymes, proteins such as gelatin and serum albumin, and synthetic polymers such as polyallylamine and polylysine are allowed to coexist to change the properties of the enzyme-immobilized product, that is, membrane strength, substrate permeability, etc. You can also. As the carrier for immobilizing the enzyme on an insoluble carrier, known carriers such as diatomaceous earth, activated carbon, alumina, titanium oxide, cross-linked starch particles, cellulose polymer, chitin and chitosan derivatives can be used.
過酸化水素は公知の方法により直接、間接的に測定することができる。しかし、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化率は約５％と低いので、プロテアーゼ分解によって生じたフルクトシルバリルヒスチジン由来の過酸化水素量が通常よりも少ないことが十分に予想されるため、過酸化水素を高感度で検出する必要がある。また、ヘモグロビン自身が４００〜６００ｎｍ付近に吸収帯を有しているため、公知の方法の中でもこれらの波長領域での過酸化水素の吸光度検出はヘモグロビンの吸収による妨害が大きく、実際の糖化ヘモグロビン測定には適用できない可能性が高い。これらのことから過酸化水素の高感度計測には、アンペロメトリー等の電気化学的な手法を用いるのがより好ましい。
固定化された酵素に試料を一定時間接触させて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しながら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、より高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用いることが望ましい。
Hydrogen peroxide can be measured directly or indirectly by a known method. However, since the saccharification rate of naturally occurring hemoglobin saccharified product is as low as about 5%, it is sufficiently expected that the amount of hydrogen peroxide derived from fructosyl valyl histidine produced by protease degradation is less than usual. It is necessary to detect hydrogen peroxide with high sensitivity. In addition, since hemoglobin itself has an absorption band in the vicinity of 400 to 600 nm, the absorbance detection of hydrogen peroxide in these wavelength regions among the known methods is largely disturbed by the absorption of hemoglobin, and actual glycated hemoglobin measurement There is a high possibility that it is not applicable. For these reasons, it is more preferable to use an electrochemical method such as amperometry for highly sensitive measurement of hydrogen peroxide.
In order to advance the reaction by contacting the sample with the immobilized enzyme for a certain period of time, a batch method in which the reaction is caused while stirring the sample liquid for a certain period of time is possible, but in order to carry out a more accurate measurement. It is desirable to use flow based measurements.
臨床診断指標としてのヘモグロビンの糖化割合の対象であるＨｂＡ１ｃは、全ヘモグロビン中で特定部位が糖化された画分の比率で表現される。そのため、分析に用いる試料中のヘモグロビン濃度が判明すれば、その試料から検出されるフルクトシルバリルヒスチジン量との比率をとればよいことになる。 HbA1c, which is a target of the glycation ratio of hemoglobin as a clinical diagnostic index, is expressed as a ratio of a fraction in which a specific site is glycated in all hemoglobin. Therefore, if the hemoglobin concentration in the sample used for analysis is known, the ratio with the amount of fructosyl valyl histidine detected from the sample can be taken.
ヘモグロビン濃度を測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法、メトヘモグロビン法、アザイドヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等の公知の方法を用いればよいが、中でも種々の酵素に阻害や失活等の影響が少なく、試薬廃棄時に環境に対する負荷が小さいＳＬＳ−ヘモグロビン法が好ましい。ＳＬＳ−ヘモグロビン法は、血液試料を陰イオン系界面活性剤であるアルキル硫酸塩溶液（以後ヘモグロビン測定試薬と表記する）で処理した後、５４０ｎｍでの試料の吸光度変化から算出するものである。アルキル硫酸塩はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）やポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等を適宜選択して使用し、ヘモグロビン測定試薬中には緩衝液や各種塩類を含んでいてもよい。アルキル硫酸塩の濃度は、反応用液中の血球濃度０．２５〜２０体積％に対して０．０５〜１０％、好ましくは０．０５〜１％である。血液試料とヘモグロビン測定試薬の反応は数秒〜数分程度で完了する。 As a method for measuring the hemoglobin concentration, a known method such as cyan methemoglobin method, methemoglobin method, azide hemoglobin method, SLS-hemoglobin method may be used, and among them, the influence of various enzymes such as inhibition or inactivation The SLS-hemoglobin method is preferable because it has a low environmental impact when the reagent is discarded. In the SLS-hemoglobin method, a blood sample is treated with an alkyl sulfate solution (hereinafter referred to as a hemoglobin measuring reagent) that is an anionic surfactant, and then calculated from the change in absorbance of the sample at 540 nm. As the alkyl sulfate, sodium lauryl sulfate (SLS), polyoxyethylene sodium lauryl sulfate, or the like is appropriately selected and used, and the hemoglobin measuring reagent may contain a buffer or various salts. The concentration of the alkyl sulfate is 0.05 to 10%, preferably 0.05 to 1% with respect to the blood cell concentration of 0.25 to 20% by volume in the reaction solution. The reaction between the blood sample and the hemoglobin measuring reagent is completed in about several seconds to several minutes.
ヘモグロビン測定試薬処理液の吸光度を測定する方法としては、キュベットに該試料を分注して特定の波長の吸光度を測定するバッチ法、またはテフロン（登録商標）管をセルとして試料がテフロン（登録商標）管を通過する特定の波長の吸光度変化を測定するフロー法を用いればよく、操作が簡単であることからフロー法がより望ましい。ヘモグロビン濃度の測定は、検体とヘモグロビン濃度測定試薬の反応終了後、反応液の吸光度が安定である時間の範囲内で行えばよい。 As a method of measuring the absorbance of the hemoglobin measurement reagent treatment liquid, a batch method in which the sample is dispensed into a cuvette and the absorbance at a specific wavelength is measured, or a sample is Teflon (registered trademark) using a Teflon (registered trademark) tube as a cell. ) A flow method for measuring the change in absorbance at a specific wavelength passing through the tube may be used, and the flow method is more desirable because of its simple operation. The measurement of the hemoglobin concentration may be performed within the time range in which the absorbance of the reaction solution is stable after completion of the reaction between the specimen and the hemoglobin concentration measuring reagent.
タンパク質分解酵素を作用させる際に使用する界面活性剤含有緩衝液中に、アルキル硫酸塩を含むヘモグロビン測定試薬を同時に共存させ、溶血、ヘモグロビンの変性、ＳＬＳ−ヘモグロビンの形成反応を同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。 A hemoglobin measurement reagent containing an alkyl sulfate may be simultaneously coexisted in a surfactant-containing buffer used when a proteolytic enzyme is allowed to act, and hemolysis, hemoglobin denaturation, and SLS-hemoglobin formation reaction may be simultaneously performed. And may be performed separately.
本発明の１つの好ましい実施形態を図１に示す。緩衝液の流れを形成する機構（１，２）と、検体を注入する機構（４，５，７）、その下流にタンパク質分解酵素固定化体（１４）とヘモグロビン濃度検出用フロー型比色計（１６）と電気化学的活性物質濃度を検知できる電極（１８，２０）を配置し、フルクトシルペプチド検出用電極系（１７，１８）とアミノ酸検出用電極系またはフルクトシルアミノ酸検出用電極系（１９，２０）を構成する。 One preferred embodiment of the present invention is shown in FIG. Mechanism (1,2) for forming a flow of buffer solution, mechanism (4,5,7) for injecting a specimen, a protease immobilized body (14) downstream thereof, and a flow-type colorimeter for detecting hemoglobin concentration (16) and an electrode (18, 20) capable of detecting the electrochemically active substance concentration are arranged, and a fructosyl peptide detection electrode system (17, 18) and an amino acid detection electrode system or fructosyl amino acid detection electrode system ( 19, 20).
具体的には、まず緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液する。試料（６）にニードル（７）を挿入し、バルブ（１０）を閉じ、バルブ（１１）を開けて、シリンジポンプ（１２）を引くことにより試料を計量バルブ（４）の計量ループ（５）に引き込む。次に計量バルブ（４）を切り替え、緩衝液によりループ（５）内に溜まった試料を押し出す。過剰の試料は一旦バルブ（１０）を開けてバルブ（１１）を閉じ、洗浄液（９）をシリンジポンプ（１２）に引き込んだ後、バルブ（１０）を閉じバルブ（１１）を開けて洗浄液を押し出すことにより、廃棄ポット（８）に押し出され、廃液ボトル（２３）に貯留される。注入された試料は緩衝液の流れにのって恒温槽（１３）内に設置されたタンパク質分解酵素固定化酵素カラム（１４）を通り、試料中の糖化タンパク質からフルクトシルペプチドを生成する。タンパク質分解酵素の作用した試料は、緩衝液の流れに従ってさらに下流に設置されたフロー型比色計（１６）を通り、試料中のヘモグロビン濃度が検出された後、フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１７）を通り、そこで生成した過酸化水素が過酸化水素電極（１８）で検知される。続いて該アミノ酸オキシダーゼ固定化カラムまたはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１９）を通り、そこで生成した過酸化水素が下流の過酸化水素電極（２０）により検知される。廃液は背圧コイル（２１）を通り廃液ボトル（２２）に溜まる。血液試料（６）は、直接分析装置内に供給されてもよいが、試料（６）は予めヘモグロビン濃度測定用試薬で処理された後、および／またはタンパク質分解酵素で処理された後装置内に供給されてもよい。分析装置内に血液試料を直接供給する場合には、例えばヘモグロビン濃度測定用試薬とタンパク質分解酵素と一緒に供給し、緩衝液の流路内においてヘモグロビン濃度測定試薬との反応及びタンパク質分解酵素処理されてもよい。フロー型比色計（１６）の吸光度変化と過酸化水素電極（１８）および（２０）の電流値の変化を検知することにより物質濃度を定量する。 Specifically, first, the buffer solution is sent from the buffer solution tank (1) by the pump (2). Insert the needle (7) into the sample (6), close the valve (10), open the valve (11) and pull the syringe pump (12) to pull the sample into the metering loop (5) of the metering valve (4) Pull in. Next, the metering valve (4) is switched, and the sample accumulated in the loop (5) is pushed out by the buffer solution. Excess sample once opens the valve (10) and closes the valve (11), draws the cleaning liquid (9) into the syringe pump (12), then closes the valve (10) and opens the valve (11) to push out the cleaning liquid. As a result, it is pushed out to the waste pot (8) and stored in the waste liquid bottle (23). The injected sample follows the flow of the buffer solution, passes through the protease degrading enzyme column (14) installed in the thermostat (13), and produces fructosyl peptide from the glycated protein in the sample. The sample on which the proteolytic enzyme acts passes through a flow-type colorimeter (16) installed further downstream according to the flow of the buffer solution, and after the hemoglobin concentration in the sample is detected, a fructosyl peptide oxidase immobilized column ( 17), the hydrogen peroxide generated there is detected by the hydrogen peroxide electrode (18). Subsequently, the hydrogen peroxide generated through the amino acid oxidase-immobilized column or fructosyl amino acid oxidase-immobilized column (19) is detected by the downstream hydrogen peroxide electrode (20). The waste liquid passes through the back pressure coil (21) and accumulates in the waste liquid bottle (22). The blood sample (6) may be directly supplied into the analyzer, but the sample (6) is pretreated with a reagent for measuring hemoglobin concentration and / or after being treated with a proteolytic enzyme. It may be supplied. When a blood sample is supplied directly into the analyzer, for example, it is supplied together with a reagent for measuring hemoglobin concentration and a proteolytic enzyme, and is reacted with the hemoglobin concentration measuring reagent and treated with a proteolytic enzyme in the flow path of the buffer solution. May be. The substance concentration is quantified by detecting the change in absorbance of the flow-type colorimeter (16) and the change in the current value of the hydrogen peroxide electrodes (18) and (20).
以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさらに詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１４０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）過酸化水素電極の製造
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロン（登録商標）で被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is of course not limited thereto.
Example 1
(1) Production of fructosyl peptide oxidase-immobilized
(2) Production of hydrogen peroxide electrode The side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm is covered with heat-shrinkable Teflon (registered trademark), and one end of the wire is smoothed with a file and 1500-mm emery paper. Using this platinum wire as a working electrode, a 1 cm square platinum plate as a counter electrode, and a saturated calomel electrode as a reference electrode, electrolytic treatment is performed in 0.1 M sulfuric acid at +2.0 V for 10 minutes. Thereafter, the platinum wire is thoroughly washed with water, dried at 40 ° C. for 10 minutes, immersed in an anhydrous toluene solution of 10% γ-aminopropyltriethoxysilane for 1 hour, and then washed. 20 mg of bovine serum albumin (manufactured by Sigma, Fraction V) is dissolved in 1 ml of distilled water, and glutaraldehyde is added to 0.2% therein. This mixed solution is quickly put on 5 μl of the previously prepared platinum wire and dried and cured at 40 ° C. for 15 minutes. This is a hydrogen peroxide electrode.
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（３）測定装置
図１はフルクトシルペプチド測定装置である。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料５μｌを注入する。タンパク質分解酵素固定化カラム（１４）、フロー型比色計（１６）、第２の固定化酵素カラム（１９）と第２の過酸化水素電極（２０）は配置せず、第１の固定化酵素カラム（１７）にはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム、その下流に過酸化水素電極（１８）を配置する。注入された試料は緩衝液の流れにのって恒温槽（１３）内に設置された混合用配管（１５）を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１７）と過酸化水素電極（１８）を通り、試料中のフルクトシルバリルヒスチジンから過酸化水素を生成し電流値の変化を検知する。
An Ag / AgCl reference electrode was used as the reference electrode, and a conductive pipe was used as the counter electrode.
(3) Measuring apparatus FIG. 1 shows a fructosyl peptide measuring apparatus. The buffer solution is fed from the buffer solution tank (1) by the pump (2), and 5 μl of the sample is injected using the metering valve (4). Proteolytic enzyme immobilization column (14), flow-type colorimeter (16), second immobilization enzyme column (19) and second hydrogen peroxide electrode (20) are not arranged, but first immobilization A fructosyl peptide oxidase immobilization column is disposed on the enzyme column (17), and a hydrogen peroxide electrode (18) is disposed downstream thereof. The injected sample follows the flow of the buffer solution, passes through the mixing pipe (15) installed in the thermostatic chamber (13), is mixed with the temperature adjustment and the buffer solution, and immobilizes the fructosyl peptide oxidase. Through a column (17) and a hydrogen peroxide electrode (18), hydrogen peroxide is generated from fructosyl valyl histidine in the sample, and a change in current value is detected.
この測定装置に使用する緩衝液の組成は、１００ｍＭのリン酸と５０ｍＭの塩化カリウムと1ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが７．０である。 The composition of the buffer used in this measuring apparatus contains 100 mM phosphoric acid, 50 mM potassium chloride, and 1 mM sodium azide, and has a pH of 7.0.
緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度は３０℃であった。
（４）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの特性
（３）の測定装置を用いてフルクトシルグリシン、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジンを５μｌ注入し、フルクトシルペプチドオキシダーゼカラムの特性を調べた結果を以下に示す。
(i)ｐＨ特性
緩衝液のｐＨを６．０、７．０、８．０としたときのフルクトシルグリシン（FG）、フルクトシルバリン（FV）、フルクトシルバリルヒスチジン（FVH）の酸化反応の活性の測定結果を図２に示す。フルクトシルグリシンに対してはｐＨ８．０で高い活性を示し、ｐＨ６．０ではｐＨ８．０の約５０％まで活性が低下した。フルクトシルバリンとフルクトシルバリルヒスチジンに対してはpH６．０、７．０で高い活性を示した。
The flow rate of the buffer solution was 1.0 ml / min, and the temperature of the thermostatic bath was 30 ° C.
(4) Characteristics of fructosyl peptide oxidase immobilized
(i) pH characteristics Oxidation of fructosylglycine (FG), fructosyl valine (FV) and fructosyl valyl histidine (FVH) when the pH of the buffer is 6.0, 7.0, 8.0 The measurement result of the activity of the reaction is shown in FIG. For fructosylglycine, high activity was exhibited at pH 8.0, and at pH 6.0, the activity decreased to about 50% of pH 8.0. It showed high activity against fructosyl valine and fructosyl valyl histidine at pH 6.0 and 7.0.
ｐＨが酸性の場合にフルクトシルグリシンに対する活性が低下したことから、その他の糖化アミノ酸に対しても活性が低くなることが予測される。また、フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルバリンに対する活性はｐＨ７．０で最大であることから、フルクトシルバリルヒスチジンの測定ではｐＨ７．０が至適と判断した。
(ii)基質特異性
フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの基質特異性を表１に示す。表１は各ｐＨでのフルクトシルバリンに対する応答を１００とした場合の相対応答値である。
Since the activity against fructosylglycine was reduced when the pH was acidic, the activity was also expected to be reduced against other glycated amino acids. Moreover, since the activity with respect to fructosyl valyl histidine and fructosyl valine is the maximum at pH 7.0, pH 7.0 was judged to be optimal in the measurement of fructosyl valyl histidine.
(ii) Substrate specificity Table 1 shows the substrate specificity of the fructosyl peptide oxidase-immobilized column. Table 1 shows relative response values when the response to fructosyl valine at each pH is 100.
何れのｐＨでもフルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルバリンに特異的で、α,ε−フルクトシルリジンにはほとんど応答せず、各種アミノ酸と糖類には全く応答しなかった。 It was specific to fructosyl valyl histidine and fructosyl valine at any pH, hardly responded to α, ε-fructosyl lysine, and did not respond to various amino acids and saccharides at all.
(iii)安定性
緩衝液のｐＨを７．０、緩衝液の流速を１．０ｍｌ／分、恒温槽温度を３０℃の条件下で、フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムはフルクトシルバリンに対して１０日間で初期の約５０％まで活性が低下した。
(iii) Stability The fructosyl peptide oxidase-immobilized column is resistant to fructosyl valine under the conditions that the pH of the buffer is 7.0, the flow rate of the buffer is 1.0 ml / min, and the temperature of the thermostat is 30 ° C. In 10 days, the activity decreased to about 50% of the initial value.
使用したフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムはα,ε−フルクトシルリジンには実質的に作用せず、フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルバリンに特異的に作用する。また、フルクトシルバリン及びフルクトシルバリルヒスチジンに対する至適ｐＨが中性または酸性域であるので、糖化タンパク質から糖化ペプチドを生成させるタンパク質分解酵素は中性または酸性域で活性の高いものが望ましい。
（５）血球のプロテアーゼ分解
ヒトヘモグロビンをタンパク質分解酵素で分解し、生成したフルクトシルペプチド測定に中性または酸性域に至適を持つフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムを使用するので、中性または酸性域で活性が高く、フルクトシルバリルヒスチジンを生成するバチルス属タンパク質分解酵素を使用する。
The used fructosyl peptide oxidase immobilization column does not substantially act on α, ε-fructosyl lysine, but acts specifically on fructosyl valylhistidine and fructosyl valine. In addition, since the optimum pH for fructosyl valine and fructosyl valyl histidine is in the neutral or acidic range, it is desirable that the proteolytic enzyme that generates glycated peptide from glycated protein has high activity in the neutral or acidic range. .
(5) Proteolysis of blood cells Since human hemoglobin is decomposed with a proteolytic enzyme and a fructosyl peptide oxidase-immobilized column that is optimal in the neutral or acidic range is used to measure the generated fructosyl peptide, neutral or acidic Bacillus proteolytic enzymes that produce fructosyl valyl histidine are used.
血球はヒト全血を生理食塩水で洗浄後、２０００ｇで遠心分離して得た。このようにして得た血球２００μLを陰イオン界面活性剤である０．５％ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．８）７５０μｌに加えて溶血させた後、バチルス属タンパク質分解酵素である３２０ｍｇ／ｍｌプロチンＰＣ１０F（大和化成株式会社製）５０μｌを添加し、３７℃で反応させた。このプロテアーゼ処理液を１、３、５、７、９、２０、３０、４０、１００分反応後、（３）の測定装置にプロテアーゼ処理液５μｌを注入して試料中のフルクトシルバリルヒスチジンを測定した。結果を図３に示す。 Blood cells were obtained by washing human whole blood with physiological saline and centrifuging at 2000 g. After 200 μL of the blood cells thus obtained was added to 750 μl of 0.5% polyoxyethylene sodium lauryl sulfate aqueous solution (pH 6.8) as an anionic surfactant and hemolyzed, 320 mg / day of Bacillus proteolytic enzyme was then added. 50 μl of ml protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. After reacting this protease-treated solution for 1, 3, 5, 7, 9, 20, 30, 40, 100 minutes, 5 μl of protease-treated solution was injected into the measuring device of (3), and fructosyl valyl histidine in the sample was added. It was measured. The results are shown in FIG.
同条件下の血球溶血液と血球が存在しない酵素ブランク溶液では、フルクトシルバリルヒスチジンが全く検出されないことから、使用したプロテアーゼの作用により短時間でフルクトシルバリルヒスチジンが遊離していることがわかる。本プロテアーゼはヒトヘモグロビンからフルクトシルバリルヒスチジンを遊離するのに効果的に作用している。
（６）ＨｂＡ１ｃ常用標準物質のＨｂＡ１ｃ測定
バチルス属プロテアーゼと本測定装置を用いて糖化率の異なるＨｂＡ１ｃ常用標準物質（福祉・医療技術振興会製）３点を測定した。
Fructosylvalylhistidine is not detected at all in the enzyme blank solution without hemolyzed blood and blood cells under the same conditions. Recognize. This protease effectively acts to release fructosyl valyl histidine from human hemoglobin.
(6) HbA1c measurement of HbA1c common standard substance Using the Bacillus genus protease and this measuring apparatus, three HbA1c standard standard substances (manufactured by the Welfare and Medical Technology Promotion Association) with different saccharification rates were measured.
ＨｂＡ１ｃ常用標準物質の調製は添付文書に従って行った。調製したＨｂＡ１ｃ常用標準物質溶液６０μｌを０．５％ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム水溶液(ｐＨ６．８)２２５μｌで溶血させた後、３２０ｍｇ／ｍｌプロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成株式会社製）１５μｌを添加し、３７℃で８．５、３０分間反応させた。反応終了後、（３）の測定装置にプロテアーゼ処理液を５μｌ注入して試料中のフルクトシルバリルヒスチジン濃度を測定した。
The HbA1c standard was prepared according to the package insert. The prepared HbA1c
また、プロテアーゼ処理液中のヘモグロビン濃度の測定には、ヘモグロビンＢ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を使用し、添付文書に従って測定を行った。 In addition, hemoglobin concentration in the protease treatment solution was measured using hemoglobin B-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the package insert.
ＨｂＡ１ｃ常用標準物質３レベル（ＨｂＡ１ｃ値：５．０８±０．１２％、５．８０±０．１３％、１０．６５±０．２５％）において、測定されたフルクトシルバリルヒスチジン濃度とヘモグロビン濃度の比（ＦＶ／Ｈｂ）を算出した結果を図４に示す。 Fructosylvalyl histidine concentration and hemoglobin measured at 3 standard levels of HbA1c standard (HbA1c values: 5.08 ± 0.12%, 5.80 ± 0.13%, 10.65 ± 0.25%) The results of calculating the concentration ratio (FV / Hb) are shown in FIG.
プロテアーゼ反応８．５分で相関係数０．９９６４（ｙ＝０．８８７ｘ−０．１５５）、３０分で相関係数０．９９９１（ｙ＝１．６２ｘ−１．１７）の良好な直線関係が得られた。
比較例１
起源、至適ｐＨ、メーカー等の異なるプロテアーゼを用いて血球溶血液のプロテアーゼ分解を検討した。
Good linear relationship with a correlation coefficient of 0.9964 (y = 0.887x-0.155) at 8.5 minutes and a correlation coefficient of 0.9991 (y = 1.62x-1.17) at 30 minutes was gotten.
Comparative Example 1
Proteolysis of hemolyzed blood was examined using different proteases of different origins, optimum pH, and manufacturers.
使用したタンパク分解酵素は、天野エンザイム株式会社製のウマミザイムＧ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ペプチダーゼＲ、ニューラーゼＦ３Ｇ、ノボザイム製のフレーバーザイム、ニュートラーゼ、プロタメックスである。 The proteolytic enzymes used were Amamizyme G, Amano Enzyme Co., Ltd., Protease A “Amano” G, Protease M “Amano” G, Protease N “Amano” G, Peptidase R, Newase F3G, Flavorzyme from Novozyme, Neutase, Protamex.
実施例１（５）と同様にして血球溶血液を上記の各種タンパク質分解酵素の反応液中濃度が約１ｍｇ／ｍｌ相当となるように添加して調製後、３７℃で４０分反応させた。反応終了後、実施例１（３）の測定装置にプロテアーゼ処理液５μｌ注入した。結果を表２に示す。表中の○は２０μＭ以上のフルクトシルバリルヒスチジンの検出値が得られたもの、×は検出値が得られなかったものを表している。 In the same manner as in Example 1 (5), hemolyzed blood was added so that the concentration of the above various proteolytic enzymes in the reaction solution was equivalent to about 1 mg / ml, and then reacted at 37 ° C. for 40 minutes. After completion of the reaction, 5 μl of protease treatment solution was injected into the measuring apparatus of Example 1 (3). The results are shown in Table 2. In the table, ◯ indicates that a detection value of fructosyl valyl histidine of 20 μM or more was obtained, and × indicates that a detection value was not obtained.
全血中のヘモグロビン濃度は通常１２０〜１６０ｇ／Ｌの範囲で、本実験条件では約５倍に希釈されるため、反応溶液中でのヘモグロビン濃度は２４〜３２ｇ／Ｌとなる。さらに正常なヒトのＨｂＡ１ｃ値が５％程度であるので、反応用液中のフルクトシルバリルヒスチジンは最大１９〜２５μＭ程度と推測される。従って、２０μＭ以上のフルクトシルバリルヒスチジンが検出された場合には、分解率が高いと言える。 The hemoglobin concentration in whole blood is usually in the range of 120 to 160 g / L, and is diluted about 5 times under the present experimental conditions, so the hemoglobin concentration in the reaction solution is 24 to 32 g / L. Furthermore, since the normal human HbA1c value is about 5%, the fructosyl valyl histidine in the reaction solution is estimated to be about 19 to 25 μM at maximum. Therefore, when fructosyl valyl histidine of 20 μM or more is detected, it can be said that the degradation rate is high.
タンパク質分解酵素処理液のpHが中性付近の条件下では、バチルス属のタンパク質分解酵素で大きな検出値が得られたが、その他の酵素ではフルクトシルバリルヒスチジンが検出されなかった。これは、中性付近でタンパク質分解酵素の作用により、ヒト血球からフルクトシルバリルヒスチジンを生成させるのに、バチルス属タンパク質分解酵素が有効であることを示している。
実施例2
実施例１で示したように、バチルス属由来のタンパク質分解酵素を使用すればヒト血球からフルクトシルバリルヒスチジンを生成させることができる。しかし、フルクトシルバリルヒスチジンの検出に使用するフルクトシルペプチドオキシダーゼは、各種アミノ酸及び糖類には全く応答せず、フルクトシルバリンにも応答することが示された。高精度なＨｂＡ１ｃ測定を行うためには、タンパク質分解酵素処理液中にフルクトシルバリン及びε−フルクトシルリジンすなわちＬ−リジンが生成しないタンパク質分解酵素処理時間以内で行わなければならない。この目的のためにプロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成株式会社製）をタンパク質分解酵素溶液として使用した場合に関するタンパク質分解酵素の処理時間の検討結果の詳細を以下に示す。
（１）フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１と同様にフルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）固定化カラムを作製した。
（２）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様にして耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをホルミル化する。ホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン株式会社製）を１８ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液４００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムとする。
（３）Ｌ−リジンオキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１（１）と同様にして耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをホルミル化する。ホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＬ−リジンオキシダーゼを５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液５０μＬを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しＬ−リジンオキシダーゼ固定化カラムとする。
（４）過酸化水素電極の製造方法
実施例１と同様に過酸化水素電極を作製した。
（５）測定装置
実施例１と同様に、図１のフルクトシルペプチド測定装置を使用した。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、計量バルブ（４）を用いて試料５μｌを注入する。タンパク質分解酵素固定化カラム（１４）とフロー型比色計（１６）は配置せず、第１の固定化酵素カラム（１７）にはフルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム、その下流に過酸化水素電極（１８）、第２の固定化酵素カラム（１９）にＬ−リジンオキシダーゼ固定化カラムまたはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムと第２の過酸化水素電極（２０）を配置する。注入された試料は緩衝液の流れにのって恒温槽（１３）内に設置された混合用配管（１５）を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化カラム（１７）と過酸化水素電極（１８）を通り、試料中のフルクトシルバリルヒスチジンから過酸化水素を生成し電流値の変化を検知する。試料はさらに下流のＬ−リジンオキシダーゼ固定化カラムまたはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１９）と過酸化水素電極（２０）を通り、試料中のＬ−リジンまたはフルクトシルバリンが過酸化水素に変換されて電流値の変化を検知する。
Under the conditions where the pH of the proteolytic enzyme treatment solution was near neutral, a large detection value was obtained with a protease belonging to the genus Bacillus, but fructosyl valyl histidine was not detected with other enzymes. This indicates that Bacillus proteolytic enzymes are effective in producing fructosylvalylhistidine from human blood cells by the action of proteolytic enzymes near neutrality.
Example 2
As shown in Example 1, fructosyl valyl histidine can be produced from human blood cells by using a protease derived from the genus Bacillus. However, it was shown that the fructosyl peptide oxidase used for detection of fructosyl valyl histidine does not respond to various amino acids and saccharides at all, but also responds to fructosyl valine. In order to perform highly accurate HbA1c measurement, it must be performed within a proteolytic enzyme treatment time in which fructosyl valine and ε-fructosyl lysine, that is, L-lysine are not produced in the proteolytic enzyme treatment solution. For this purpose, details of the examination results of the proteolytic enzyme processing time in the case of using Protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) as the proteolytic enzyme solution are shown below.
(1) Production of fructosyl peptide oxidase immobilization column A fructosyl peptide oxidase (manufactured by Kikkoman Corporation) immobilization column was prepared in the same manner as in Example 1.
(2) Production of fructosyl amino acid oxidase-immobilized column In the same manner as in Example 1 (1), 150 mg of refractory brick (30 to 60 mesh) is formylated. 400 μl of a solution obtained by dissolving fructosyl amino acid oxidase (manufactured by Kikkoman Co., Ltd.) at a concentration of 18 units / ml in a pH 7.0, 100 mM sodium phosphate buffer solution is brought into contact with formylated refractory bricks at 0 to 4 ° C. for 1 day. Leave to fix. This enzyme-immobilized carrier is packed in a column having an inner diameter of 3.5 mm and a length of 30 mm to obtain a fructosyl amino acid oxidase-immobilized column.
(3) Production of L-lysine oxidase-immobilized column In the same manner as in Example 1 (1), 150 mg of refractory brick (30 to 60 mesh) is formylated. A formylated refractory brick is brought into contact with 50 μL of a solution prepared by dissolving L-lysine oxidase at a concentration of 50 units / ml in a pH 7.0, 100 mM sodium phosphate buffer, and allowed to stand at 0 to 4 ° C. for 1 day for immobilization. This enzyme-immobilized carrier is packed in a column having an inner diameter of 3.5 mm and a length of 30 mm to obtain an L-lysine oxidase-immobilized column.
(4) Method for Producing Hydrogen Peroxide Electrode A hydrogen peroxide electrode was produced in the same manner as in Example 1.
(5) Measuring apparatus As in Example 1, the fructosyl peptide measuring apparatus of FIG. 1 was used. The buffer solution is fed from the buffer solution tank (1) by the pump (2), and 5 μl of the sample is injected using the metering valve (4). The proteolytic enzyme immobilization column (14) and the flow-type colorimeter (16) are not arranged, the first immobilization enzyme column (17) is a fructosyl peptide oxidase immobilization column, and a hydrogen peroxide electrode downstream thereof. (18) An L-lysine oxidase immobilized column or fructosyl amino acid oxidase immobilized column and a second hydrogen peroxide electrode (20) are arranged on the second immobilized enzyme column (19). The injected sample follows the flow of the buffer solution, passes through the mixing pipe (15) installed in the thermostatic chamber (13), is mixed with the temperature adjustment and the buffer solution, and immobilizes the fructosyl peptide oxidase. Through a column (17) and a hydrogen peroxide electrode (18), hydrogen peroxide is generated from fructosyl valyl histidine in the sample, and a change in current value is detected. The sample further passed through the downstream L-lysine oxidase immobilized column or fructosyl amino acid oxidase immobilized column (19) and the hydrogen peroxide electrode (20), and the L-lysine or fructosyl valine in the sample was converted to hydrogen peroxide. It is converted and the change of the current value is detected.
この測定装置に使用する緩衝液の組成は、１００ｍＭのリン酸と５０ｍＭの塩化カリウムと1ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが７．０である。 The composition of the buffer used in this measuring apparatus contains 100 mM phosphoric acid, 50 mM potassium chloride, and 1 mM sodium azide, and has a pH of 7.0.
緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度は３０℃であった。
（６）血球のタンパク質分解酵素処理溶液中の生成物の測定
血球溶血液にｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解したプロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成株式会社製）溶液を添加して、３７℃で所定時間反応させたタンパク分解酵素処理液を（５）の測定装置に５μｌ注入し、各反応時間での試料中のフルクトシルバリルヒスチジン濃度とフルクトシルバリン濃度とＬ−リジン濃度を同時に測定した。
The flow rate of the buffer solution was 1.0 ml / min, and the temperature of the thermostatic bath was 30 ° C.
(6) Measurement of products in proteolytic enzyme treatment solution of blood cells A solution of protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) dissolved in pH 7.0, 100 mM sodium phosphate buffer was added to the hemolyzed hemolyzed blood, and the temperature was 37 ° C. 5 μl of the proteolytic enzyme treatment solution reacted for a predetermined time in (5) is injected into the measuring device, and the fructosyl valyl histidine concentration, fructosyl valine concentration and L-lysine concentration in the sample at each reaction time are simultaneously measured. It was measured.
血球はヒト全血を生理食塩水で洗浄後、２０００ｇで遠心分離して得た。このようにして得た血球２４０μLを陰イオン界面活性剤である０．５％ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．８）９００μｌに加えて溶血させた後、バチルス属タンパク質分解酵素である３２０ｍｇ／ｍｌプロチンＰＣ１０F（大和化成株式会社製）６０μｌを添加し、３７℃で反応させた。このタンパク質分解酵素処理液を１、３、５、７、９、２０、３０、６０、１２０分反応後、その一部を採取して（５）の測定装置に５μｌを注入して、試料中のフルクトシルバリルヒスチジン（ＦＶＨ）、フルクトシルバリン（ＦＶ）、Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）濃度を測定した結果を図５に示す。 Blood cells were obtained by washing human whole blood with physiological saline and centrifuging at 2000 g. After 240 μL of the blood cells thus obtained was added to 900 μl of 0.5% polyoxyethylene sodium lauryl sulfate aqueous solution (pH 6.8) as an anionic surfactant and hemolyzed, 320 mg / day of Bacillus proteolytic enzyme was added. 60 μl of ml protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. After reacting this proteolytic enzyme treatment solution for 1, 3, 5, 7, 9, 20, 30, 60, 120 minutes, a part of the sample was collected, and 5 μl was injected into the measuring device in (5). The results of measuring the fructosyl valyl histidine (FVH), fructosyl valine (FV), and L-lysine (Lys) concentrations are shown in FIG.
フルクトシルバリルヒスチジンはタンパク質分解酵素処理時間が２０分以上で一定値に到達したが、フルクトシルバリンとＬ−リジンは３０分以上の処理で検出され、時間の増加とともに検出値も増加した。このことから本条件下においては、プロチンＰＣ10Ｆの処理時間が３０分未満においてフルクトシルバリンやε−フルクトシルリジンによる正の妨害を受けることなく、フルクトシルバリルヒスチジンを測定することができる。プロチンＰＣ１０Ｆの処理時間が２０分のときに、ヘモグロビン濃度を測定し、検出されたフルクトシルバリルヒスチジン濃度との比率を算出すると４．８０％ととなり、免疫法で測定されたＨｂＡ１ｃ値４．３％と一致した。 Fructosylvalylhistidine reached a constant value after 20 minutes or more of proteolytic enzyme treatment, but fructosyl valine and L-lysine were detected by treatment for 30 minutes or more, and the detection value increased with increasing time. . Therefore, under this condition, fructosyl valyl histidine can be measured without being interfered with by fructosyl valine or ε-fructosyl lysine when the treatment time of protin PC10F is less than 30 minutes. When the treatment time of protin PC10F was 20 minutes, the hemoglobin concentration was measured, and the ratio with the detected fructosyl valyl histidine concentration was 4.80%, and the HbA1c value measured by the immunization method was 4. Agreed with 3%.
本発明によれば、血液検体中の安定糖化ヘモグロビンを簡便且つ正確に定量することができ、糖尿病の検査を容易に行うことができる。 According to the present invention, stable glycated hemoglobin in a blood sample can be quantified easily and accurately, and a test for diabetes can be easily performed.
１ 緩衝液槽
２ 緩衝液送液ポンプ
３ ダンパー
４ 計量バルブ
５ 計量ループ
６ 試料管
７ 試料吸引ニードル
８ 廃棄ポット
９ 洗浄液槽
１０ バルブ
１１ バルブ
１２ シリンジポンプ
１３ 恒温槽
１４ タンパク質分解酵素固定化カラム
１５ 混合用配管
１６ フロー型比色計
１７ 第１の固定化酵素カラム
１８ 過酸化水素電極
１９ 第２の固定化酵素カラム
２０ 過酸化水素電極
２１ 背圧コイル
２２ 廃液ボトル
２３ 廃液ボトル
DESCRIPTION OF
10
Claims (5)
フルクトシルペプチドオキシダーゼ固定化体と検体が接触する前に、糖化ヘモグロビンを含む検体をバチルス属由来のタンパク質分解酵素で処理すること、
フルクトシルペプチド量と、試料の光吸収から求めたヘモグロビン量の比率をとり、該比率よりヘモグロビンの糖化割合を算出すること、及び
糖化ヘモグロビンを含む検体をバチルス属由来のタンパク質分解酵素で処理する時間が、フルクトシルバリンに応答し、フルクトシルバリルヒスチジンに応答しないフルクトシルバリン検知機構、および／またはＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の少なくとも１種を検知できるアミノ酸検知機構に、該タンパク質分解酵素で処理した検体を接触させたときに、フルクトシルバリンおよび／またはＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の少なくとも１種の検知量の変化が観察されない時間範囲内であることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。 Fructosylvalylhistidine is used to immobilize fructosyl peptide oxidase and a mechanism to detect electrochemically active substances that increase or decrease due to the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase. In electrochemically detecting the silvalyl histidine concentration,
Before fructosyl peptide oxidase fixed embodying the analyte is contacted, treating the specimen containing a glycosylated hemoglobin proteolytic enzyme derived from Bacillus,
Taking the ratio of the amount of fructosyl peptide and the amount of hemoglobin determined from the light absorption of the sample, calculating the glycation ratio of hemoglobin from the ratio, and
Fructosylvaline detection mechanism that does not respond to fructosyl validine, and / or L-lysine and L -Detection amount of at least one kind of fructosyl valine and / or L-lysine and L-glutamic acid when a sample treated with the proteolytic enzyme is brought into contact with an amino acid detection mechanism capable of detecting at least one kind of glutamic acid A method for analyzing glycated hemoglobin , which is within a time range in which no change is observed .
検体を注入する機構（４、５、７）の下流にＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の少なくとも１種の検知機構またはフルクトシルバリン検知機構を併設すること、及び
検体を注入する機構（４、５、７）またはその下流に少なくとも、試料の光吸収から求めたヘモグロビン量を算出し、該ヘモグロビン量とフルクトシルペプチド量からヘモグロビンの糖化割合を算出する機構を備えたことを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析装置。 Immobilized form (17) on which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valylhistidine is immobilized, and electrochemical detection mechanism (18) for detecting electrochemically active substances that increase or decrease due to the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase When contacting a sample with proteolytic enzymes from Bacillus species including glycated hemoglobin, a spectrometer of glycated hemoglobin including a mechanism (4,5,7) for injecting a part,
Providing at least one detection mechanism for L-lysine and L-glutamic acid or a fructosyl valine detection mechanism downstream of the mechanism (4, 5, 7) for injecting the specimen; and
A mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen or a mechanism for calculating the glycation ratio of hemoglobin from the amount of hemoglobin and the amount of fructosyl peptide is calculated at least downstream of the mechanism (4, 5, 7). A glycated hemoglobin analyzer characterized by the above .
検体を注入する機構（４、５、７）の下流にＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の少なくとも１種の検知機構またはフルクトシルバリン検知機構を併設すること、及び
検体を注入する機構（４、５、７）またはその下流に少なくとも、試料の光吸収から求めたヘモグロビン量を算出し、該ヘモグロビン量とフルクトシルペプチド量からヘモグロビンの糖化割合を算出する機構を備えたことを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析装置。 Immobilized form (17) on which fructosyl peptide oxidase acting on fructosyl valylhistidine is immobilized, and electrochemical detection mechanism (18) for detecting electrochemically active substances that increase or decrease due to the reaction catalyzed by fructosyl peptide oxidase And a glycated hemoglobin analyzer equipped with a mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen containing glycated hemoglobin, and a column in which a protease derived from the genus Bacillus is bound downstream of the mechanism for injecting the specimen An apparatus for analyzing glycated hemoglobin, comprising a reactor in a shape ,
Providing at least one detection mechanism for L-lysine and L-glutamic acid or a fructosyl valine detection mechanism downstream of the mechanism (4, 5, 7) for injecting the specimen; and
A mechanism (4, 5, 7) for injecting a specimen or a mechanism for calculating the glycation ratio of hemoglobin from the amount of hemoglobin and the amount of fructosyl peptide is calculated at least downstream of the mechanism (4, 5, 7). A glycated hemoglobin analyzer characterized by the above .
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