JP4609897B2 - Collagen composition and method for producing the same - Google Patents

Description

本発明はコラーゲン組成物、特に生体内に埋め込まれるコラーゲン組成物、中でも美容整形材料として生体内に埋め込まれるコラーゲン組成物に関する。   The present invention relates to a collagen composition, particularly a collagen composition to be implanted in a living body, and more particularly to a collagen composition to be implanted in a living body as a cosmetic material.

コラーゲンは、部分的に螺旋構造（コラーゲン螺旋）を有するタンパク質または糖タンパク質である。そして、コラーゲンは、無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、特に皮膚から多く抽出される。このようなコラーゲンには構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、更に同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する。中でも、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型は殆どの結合組織に存在し、生体内に最も多量に存在するコラーゲンである。特に、コラーゲンは、腱、真皮及び骨に多く、工業的には、これらの部位から抽出される場合が多い。ＩＩ型は軟骨を形成するコラーゲンである。ＩＩＩ型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。ＩＶ型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割を果たしている。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、４分子で構成される網目状会合体を形成し、基底膜における細胞分化に関与していると言われる。コラーゲン線維は上記コラーゲン分子の自己集合体であり、コラーゲン分子が直列かつ並列にパッキングされた特異的な線維構造を有する。工業的には酸、アルカリ、あるいはタンパク質分解酵素を用いて組織内コラーゲン線維から可溶化されたコラーゲンが作成される。可溶性コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体にまで微細化されていて、水あるいは塩水溶液に溶解して均一な透明溶液を形成する。一度可溶化されたコラーゲン分子は条件次第では試験管内でコラーゲン線維を再形成することが知られている。この現象は線維化（fibril formationあるいはfibrillation）と呼ばれる。コラーゲンに熱を加えるとコラーゲンの三重螺旋構造がほぐれ、各々のポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物を与える。そのような構造変化を起こす温度は変性温度と呼ばれ、熱変性物はゼラチンと呼ばれる。ゼラチンはコラーゲンに比べ水溶性が高い他に、生体内プロテアーゼに対する感受性が高いことが知られている。溶媒の条件によってはゼラチンがコラーゲン螺旋構造を部分的に回復することが知られている。ゼラチンはコラーゲン線維形成能を失っているが、部分的にコラーゲン螺旋構造を回復させることでコラーゲン線維形成能を回復できることが知られている。コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では３８℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では２０℃を下回る場合もある。   Collagen is a protein or glycoprotein having a partially helical structure (collagen helix). A large amount of collagen is extracted from invertebrate or vertebrate tissues, particularly skin. The existence of 19 types of such collagen has been reported due to the difference in structure, and there are several different molecular species in collagen classified into the same type. Among them, type I, II, type III and type IV collagen are mainly used as raw materials for biomaterials. Type I is the collagen that is present in most connective tissues and is present in large amounts in living organisms. In particular, collagen is abundant in tendons, dermis and bones, and industrially, it is often extracted from these sites. Type II is collagen that forms cartilage. Type III is often present at the same site as type I, although in small quantities. Type IV is collagen that forms the basement membrane. Types I, II and III exist in the body as collagen fibers and mainly play a role of maintaining the strength of tissues or organs. Type IV does not have the ability to form fibrosis, but forms a network aggregate composed of four molecules and is said to be involved in cell differentiation in the basement membrane. A collagen fiber is a self-assembly of the above-mentioned collagen molecules, and has a specific fiber structure in which collagen molecules are packed in series and in parallel. Industrially, collagen solubilized from collagen fibers in tissue is prepared using acid, alkali, or proteolytic enzyme. Soluble collagen is refined to an aggregate of several molecules or less of collagen molecules, and dissolves in water or an aqueous salt solution to form a uniform transparent solution. It is known that collagen molecules once solubilized re-form collagen fibers in a test tube depending on conditions. This phenomenon is called fibril formation or fibrillation. When heat is applied to collagen, the triple helix structure of collagen is loosened, and each polypeptide chain gives a heat-denatured product having a random coil shape. The temperature causing such a structural change is called a denaturing temperature, and the heat-denatured product is called gelatin. Gelatin is known to have higher water solubility than collagen and high sensitivity to in vivo proteases. It is known that gelatin partially recovers the collagen helical structure depending on the solvent conditions. Gelatin has lost collagen fiber-forming ability, but it is known that collagen fiber-forming ability can be recovered by partially recovering the collagen helical structure. Collagen denaturation temperature is lowest when in solution. Collagen is generally obtained from biological materials, but the denaturation temperature of collagen obtained from living organisms is said to be closely related to the living environment temperature of the living organism. The denaturation temperature of collagen in an aqueous solution is around 38 ° C. in mammals, but fish is generally lower than mammals, and in particular, it may be below 20 ° C. in cold-flowing fish such as salmon.

コラーゲンは優れた保湿性を有し、ヒアルロン酸などの他の生体由来保湿剤に比べ収量が多く安価である為に、化粧品原料として有効に用いられる。又、細胞の接着や増殖を促す、抗原性が低い、生体親和性が高い、生分解性である等の多くの優れた性質から、細胞実験用材料および医療用材料など様々な用途に有効に使用される。これらの目的でコラーゲンが使用される場合、水溶液、綿状物、フィルム、スポンジ、ゲルなど用途に応じて種々の形態で使用される。特に、コラーゲンゲルは細胞担体、医療用材料、美容整形材料などに有効に用いられており、近年では再生医療における重要なマテリアルとして盛んに研究されている。   Collagen has excellent moisturizing properties and is effectively used as a raw material for cosmetics because it has a higher yield and is less expensive than other biologically derived moisturizing agents such as hyaluronic acid. In addition, it has many excellent properties such as cell adhesion and proliferation, low antigenicity, high biocompatibility, and biodegradability. used. When collagen is used for these purposes, it is used in various forms such as aqueous solution, cotton-like material, film, sponge, gel and the like. In particular, collagen gel is effectively used for cell carriers, medical materials, cosmetic materials, and the like, and has been actively studied as an important material in regenerative medicine in recent years.

上記コラーゲンゲルの原料となるコラーゲンは、従来、その殆どが牛皮など家畜の組織から採取されている。ところで、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）問題が顕在化し、牛皮由来を含む家畜由来の原料を用いたコラーゲンが人間に用いられた場合、上記病原体の感染の恐れが指摘されるに至った。そこで、安全性と資源量等の観点から、魚由来コラーゲンが化粧品材料や食品材料として脚光を浴びている。又、細胞担体や医療用材料・美容整形材料のコラーゲンゲルの原料としても、魚由来コラーゲンを用いることが重要になりつつある。   Conventionally, most of the collagen used as the raw material for the collagen gel has been collected from livestock tissues such as cowhide. By the way, in recent years, the problem of BSE (bovine spongiform encephalopathy) has become apparent, and when collagen using a raw material derived from livestock including that derived from cowhide is used in humans, the risk of infection with the pathogen has been pointed out. Therefore, from the viewpoint of safety and the amount of resources, fish-derived collagen is in the spotlight as cosmetic materials and food materials. In addition, it is becoming important to use fish-derived collagen as a raw material for collagen gel of cell carriers, medical materials, and cosmetic materials.

コラーゲンゲルを作製する方法としては大きく３種類に分けることが出来る。
（１）コラーゲン溶液に架橋剤を導入し、溶液をゲル化する方法。
（２）コラーゲン溶液に架橋を惹起する光線を照射し、溶液をゲル化する方法。
（３）コラーゲン溶液に中性緩衝液を加えてコラーゲンの線維化を惹起させ、コラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルを得る方法。 There are three main methods for producing collagen gel.
(1) A method in which a crosslinking agent is introduced into a collagen solution to gel the solution.
(2) A method of irradiating a collagen solution with a light beam causing cross-linking to gel the solution.
(3) A method of obtaining a gel composed of a collagen fiber network by adding a neutral buffer to a collagen solution to induce collagen fibrosis.

上記（１）の方法については、例えばコラーゲン溶液に化学架橋剤を混合してゲル化させた眼科用コラーゲンゲル成形物、グリコサミノグリカンとコラーゲンの混合溶液を水溶性カルボジイミドで架橋した組織再生マトリックス用ゲルなどが知られている。（２）の方法については、例えば窒素で十分に置換したコラーゲン溶液に紫外線を照射すると、コラーゲン溶液がゲル化することが報告されている。（３）の方法については、例えばサメ由来コラーゲン溶液と中性緩衝液を混合してコラーゲンの線維化を惹起させることにより得られるコラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルが知られている。   Regarding the method of (1) above, for example, an ophthalmic collagen gel molded product obtained by mixing a chemical crosslinking agent into a collagen solution and gelling, or a tissue regeneration matrix obtained by crosslinking a mixed solution of glycosaminoglycan and collagen with a water-soluble carbodiimide. Gels for use are known. Regarding the method (2), for example, it is reported that when a collagen solution sufficiently substituted with nitrogen is irradiated with ultraviolet rays, the collagen solution gels. Regarding the method (3), for example, a gel composed of a collagen fiber network obtained by mixing a shark-derived collagen solution and a neutral buffer solution to induce collagen fibrosis is known.

ところで、上記３種類のゲル化方法によって魚由来コラーゲンから作製したコラーゲンゲルは、ゲル強度、熱安定性や生体内安定性が不十分で、医療用材料・美容整形材料の用途においてはゲルの収縮や崩壊の恐れとか、生体内吸収性が高すぎる恐れが有った。   By the way, collagen gel prepared from fish-derived collagen by the above three types of gelation methods has insufficient gel strength, thermal stability and in-vivo stability. There was a risk of disintegration or in vivo absorption.

そこで、近年、魚由来コラーゲンゲルの強度および熱安定性を大幅に向上させる技術として、コラーゲンを線維化させる工程に架橋剤を共存させ、コラーゲン線維内に架橋結合を導入させる技術が提案されている。魚由来コラーゲンの変性温度は一般的に低く、工業的に生産されている魚由来コラーゲンの変性温度は３０℃以下であり、上記技術において用いられている魚由来コラーゲンの変性温度は１９℃程度である。これらの魚由来コラーゲンから上記方法でコラーゲンゲルを作製すると、生体内温度である３７℃において部分的に変性し、ゲルの収縮や崩壊を来たす恐れや、生体内で速やかに吸収される恐れが有り、魚由来コラーゲンから医療用材料・美容整形材料としてのコラーゲンゲルを作成する方法としては必ずしも十分ではなかった。   Therefore, in recent years, as a technique for greatly improving the strength and thermal stability of the collagen collagen derived from fish, a technique has been proposed in which a crosslinking agent is allowed to coexist in the process of fibrosis of collagen to introduce cross-linking into collagen fibers. . The denaturation temperature of fish-derived collagen is generally low, the denaturation temperature of industrially produced fish-derived collagen is 30 ° C. or less, and the denaturation temperature of fish-derived collagen used in the above technique is about 19 ° C. is there. If a collagen gel is prepared from these fish-derived collagens by the above method, it may be partially denatured at 37 ° C., the in vivo temperature, causing the gel to contract or collapse, or may be rapidly absorbed in vivo. However, it has not always been sufficient as a method for producing a collagen gel as a medical material or cosmetic material from fish-derived collagen.

このような問題を解決する為、即ち、高い強度・熱安定性・生体内安定性を有するコラーゲンゲルを提供する為、変性温度が３０℃以上である魚鱗由来コラーゲンを含むコラーゲン溶液に対して架橋剤と線維化剤を添加しゲル化させることを特徴とするコラーゲンゲルの作成方法が提案（特開２００６−２５７０１３号公報）されている。
特開２００６−２５７０１３号公報 In order to solve such problems, that is, to provide a collagen gel having high strength, thermal stability, and in vivo stability, the collagen solution containing a fish scale-derived collagen having a denaturation temperature of 30 ° C. or higher is crosslinked. A method for producing a collagen gel characterized in that a gelling agent and a fiberizing agent are added and gelled has been proposed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-257013).
JP 2006-257003 A

ところで、従来のコラーゲンゲルは、耐久性が劣るものであった。例えば、従来のコラーゲンゲルをマウスに注入して経過を観察すると、注入部に形成された脹らみが長期間に亘っては維持されて無いことが判って来た。   By the way, the conventional collagen gel was inferior in durability. For example, when a conventional collagen gel is injected into a mouse and the progress is observed, it has been found that the swelling formed in the injection portion is not maintained for a long period of time.

従って、本発明が解決しようとする第１の課題は、耐久性に富むコラーゲン組成物を提供することである。特に、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富み、医療用材料・美容整形材料として好適なコラーゲン組成物を提供することである。   Therefore, the first problem to be solved by the present invention is to provide a collagen composition with high durability. In particular, it is to provide a collagen composition which is rich in shape stability, heat stability and in-vivo stability and is suitable as a medical material or cosmetic material.

前記の課題は、
架橋コラーゲンと、乳糖とを含有してなり、
前記架橋コラーゲンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである
ことを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。 The above issues are
It contains cross-linked collagen and lactose ,
The cross-linked collagen is solved by a collagen composition characterized in that it is collagen cross-linked by 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride .

特に、
架橋コラーゲンと、乳糖とを含有し、
前記架橋コラーゲン１００重量部に対して前記乳糖が１〜３０重量部であり、
前記架橋コラーゲンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである
ことを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。 In particular,
Contains cross-linked collagen and lactose,
Ri said lactose 1-30 parts by der respect to the cross-linked collagen 100 parts by weight,
The cross-linked collagen is solved by a collagen composition characterized in that it is collagen cross-linked by 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride .

又、上記のコラーゲン組成物であって、コラーゲンが魚由来コラーゲンであることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。   Moreover, it is solved by the collagen composition described above, wherein the collagen is fish-derived collagen.

又、上記のコラーゲン組成物であって、生体内に埋め込まれて使用される材料であることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。   Moreover, it is solved by the collagen composition described above, which is a material used by being embedded in a living body.

又、上記のコラーゲン組成物であって、生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料であることを特徴とするコラーゲン組成物によって解決される。   Moreover, it is solved by the collagen composition described above, which is a cosmetic material that is used by being implanted in a living body.

又、コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法によって解決される。 In addition, a gelation step of adding a cross-linking agent to the collagen solution to gel,
This is solved by a method for producing a collagen gel composition, comprising the step of adding lactose to gelled collagen.

又、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法であって、
コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法によって解決される。 Moreover, it is a manufacturing method of said collagen gel composition,
A gelation step of adding a cross-linking agent to the collagen solution and gelling;
This is solved by a method for producing a collagen gel composition, comprising the step of adding lactose to gelled collagen.

又、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法であって、乳糖添加工程で添加される乳糖は濃度が０．５〜１０％の乳糖水溶液であることを特徴とするコラーゲン組成物の製造方法によって解決される。   In addition, the method for producing a collagen gel composition as described above, wherein the lactose added in the lactose addition step is an aqueous lactose solution having a concentration of 0.5 to 10%. Is done.

架橋コラーゲンと乳糖とを含有するコラーゲン組成物は、体内に埋め込まれた状態にても、長期間に亘って、その状態が保持されていた。すなわち、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富んだものであった。   Even when the collagen composition containing cross-linked collagen and lactose is embedded in the body, the state is maintained for a long period of time. That is, it was rich in shape stability, thermal stability, and in vivo stability.

尚、乳糖が用いられても、架橋されていないコラーゲンが用いられたに過ぎないコラーゲン組成物の場合、架橋コラーゲンが用いられても、乳糖が用いられてないコラーゲン組成物の場合には、形状安定性・熱安定性・生体内安定性に富むと言う本願発明の特長が奏せられてなかった。例えば、本発明のコラーゲン組成物は、３７℃（人間の体温）においても、所定の粘性を保っており、変化が無かったのに対して、乳糖の代わりにブドウ糖を用いた場合には、粘性を失ってしまい、本発明の特長が到底に得られないものであった。   In the case of a collagen composition in which lactose is used or only non-crosslinked collagen is used, in the case of a collagen composition in which cross-linked collagen is used or lactose is not used, The feature of the present invention that it is rich in stability, thermal stability and in-vivo stability was not achieved. For example, the collagen composition of the present invention maintained a predetermined viscosity even at 37 ° C. (human body temperature) and did not change, whereas when glucose was used instead of lactose, the viscosity was The characteristics of the present invention could not be obtained at all.

尚、架橋コラーゲンと乳糖との割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して乳糖が１〜３０重量部である場合、形状安定性・熱安定性・生体内安定性が特に奏されるものであった。特に好ましい割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して乳糖が６〜２５重量部の場合であった。   The ratio of cross-linked collagen to lactose is particularly excellent in shape stability, thermal stability, and in-vivo stability when lactose is 1 to 30 parts by weight per 100 parts by weight of cross-linked collagen. It was. A particularly preferred ratio was when lactose was 6 to 25 parts by weight per 100 parts by weight of crosslinked collagen.

架橋コラーゲンは、前述の通り、各種の手法で得られる。但し、架橋剤によって架橋させたコラーゲンが特に好ましいものであった。中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンが最も好ましいものであった。例えば、グルタルアルデヒドによって架橋されたコラーゲンと乳糖とからなるコラーゲン組成物と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンと乳糖とからなるコラーゲン組成物とを対比すると、後者のコラーゲン組成物の方が形状安定性・熱安定性・生体内安定性に優れていた。   Cross-linked collagen can be obtained by various methods as described above. However, collagen crosslinked by a crosslinking agent was particularly preferred. Among them, collagen crosslinked with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide · hydrochloride was most preferable. For example, a collagen composition composed of collagen and lactose crosslinked with glutaraldehyde, and a collagen composition composed of collagen and lactose crosslinked with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride. In contrast, the latter collagen composition was superior in shape stability, thermal stability, and in vivo stability.

そして、コラーゲンとして魚由来のコラーゲンを用いた場合には、牛由来のコラーゲンを用いた場合のＢＳＥ問題の心配も無い。   When fish-derived collagen is used as the collagen, there is no concern about the BSE problem when cow-derived collagen is used.

すなわち、本発明になるコラーゲン組成物は、医療用材料・美容整形材料として安全性が高く非常に好適なものである。   That is, the collagen composition according to the present invention is highly suitable as a medical material or cosmetic material because of its high safety.

本発明はコラーゲン組成物である。特に、生体内に埋め込まれて使用される材料としてのコラーゲン組成物である。中でも、生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料としてのコラーゲン組成物である。そして、架橋コラーゲンと乳糖とを含有する。架橋コラーゲンと乳糖との割合は、架橋コラーゲン１００重量部に対して、特に、乳糖が１〜３０重量部（中でも、６〜２５重量部）である。架橋コラーゲンは、特に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである。すなわち、架橋剤として、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系、或いはイミダゾール系の架橋剤が用いられるものの、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩や、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩などの水溶性カルボジイミド系のものが好ましかった。中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩が最も好ましいものであった。コラーゲンは、特に、魚由来コラーゲンである。   The present invention is a collagen composition. In particular, it is a collagen composition as a material used by being implanted in a living body. Among them, it is a collagen composition as a cosmetic material used by being implanted in a living body. And it contains cross-linked collagen and lactose. The ratio of cross-linked collagen and lactose is 1-30 parts by weight (particularly, 6-25 parts by weight) of lactose with respect to 100 parts by weight of cross-linked collagen. Cross-linked collagen is, in particular, collagen cross-linked with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride. That is, although an aldehyde-based, carbodiimide-based, epoxide-based, or imidazole-based crosslinking agent is used as the crosslinking agent, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride or 1-cyclohexyl-3 Water-soluble carbodiimides such as-(2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide sulfonates were preferred. Of these, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was most preferable. Collagen is in particular fish-derived collagen.

又、本発明はコラーゲンゲル組成物の製造方法である。特に、上記のコラーゲンゲル組成物の製造方法である。そして、コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程を有する。かつ、ゲル化工程でゲル化されたゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程を有する。乳糖添加工程では、乳糖の濃度が０．５〜１０％（特に、１％以上、更には２．５％以上。８％以下、更には７％以下。）の乳糖水溶液が用いられる。   Moreover, this invention is a manufacturing method of a collagen gel composition. In particular, it is a manufacturing method of said collagen gel composition. And it has the gelatinization process of adding a crosslinking agent to a collagen solution, and making it gelatinize. And it has the lactose addition process which adds lactose to the gelatinized collagen gelatinized at the gelatinization process. In the lactose addition step, a lactose aqueous solution having a lactose concentration of 0.5 to 10% (particularly 1% or more, further 2.5% or more, 8% or less, and further 7% or less) is used.

以下、更に具体的に説明する。   More specific description will be given below.

［実施例１］
［魚由来のコラーゲンの作成］
（１） ヒラメのリン酸緩衝液でのホモジナイズ処理
凍結されたヒラメの皮をピンセット・鋏で取り、細かく切った。このヒラメの皮の細片８５ｇに１０００ｍＬのリン酸緩衝液（リン酸一水素二ナトリウム２１．７ｇとリン酸二水素一カリウム０．７８ｇとを水に加えて１０００ｍＬとしたもの）を加え、ホモジナイズした。同リン酸緩衝液で１時間洗浄し、静置後、上澄み液をガーゼで濾過し、水で洗浄（１回の洗浄時間は１時間）を２回した。
（２） ペプシン処理
上記のヒラメ溶液にペプシン０．２ｇを加え、更に０．５Ｍ酢酸溶液を加えて１０００ｍＬとし、そして５℃で２４時間攪拌した。
（３） コラーゲンの精製
ペプシン処理を終えた溶液を１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行い、可溶性上清を分取した。この可溶性上清を０．７ＭのＮａＣｌ／０．５Ｍ酢酸溶液で５℃で２４時間掛けて透析した。 [Example 1]
[Making fish-derived collagen]
(1) Homogenization treatment with flounder phosphate buffer Frozen flounder skin was removed with tweezers and scissors and cut into pieces. To 85 g of this flounder skin strip, add 1000 mL of phosphate buffer (21.7 g of disodium monohydrogen phosphate and 0.78 g of dipotassium dihydrogen phosphate to water to 1000 mL) and homogenize. did. After washing with the same phosphate buffer for 1 hour and allowing to stand, the supernatant was filtered with gauze and washed twice with water (one washing time was 1 hour).
(2) Pepsin treatment 0.2 g of pepsin was added to the above-mentioned flounder solution, and a 0.5 M acetic acid solution was added to make 1000 mL, followed by stirring at 5 ° C. for 24 hours.
(3) Purification of collagen The solution after the treatment with pepsin was ultracentrifuged under conditions of 100000 g × 1 hour, and the soluble supernatant was collected. The soluble supernatant was dialyzed against 0.7 M NaCl / 0.5 M acetic acid solution at 5 ° C. for 24 hours.

この透析液を１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を０．５Ｍ酢酸に２４時間掛けて溶解させ、この後で１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離した。そして、上清を０．０５Ｍとなるよう０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、そして緩衝能を持たせた上でｐＨメータで測定しながらｐＨが７．４となるように５ＭのＮａＯＨを加えて中和した。尚、この時、ゲル化が起きないようにする為、ｐＨが４．８〜５．０に長時間留まらないように注意する。   The dialysate is ultracentrifuged under conditions of 100,000 g × 1 hour, the supernatant is discarded, and the precipitate is dissolved in 0.5 M acetic acid over 24 hours. Thereafter, the supernatant is dissolved under conditions of 100,000 g × 1 hour. Centrifuged. Then, 0.5 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) is added so that the supernatant becomes 0.05 M, and the pH is 7.4 while measuring with a pH meter after having buffering ability. 5M NaOH was added to neutralize. At this time, care is taken not to stay at a pH of 4.8 to 5.0 for a long time in order to prevent gelation.

次に、４．４ＭのＮａＣｌを加え、１晩に亘る攪拌後に、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。そして、沈殿物を２．４ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出（１晩×２回）後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。次いで、この沈殿物を１．０ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出（１晩×２回）後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行い、上清を得た。この上清液はコラーゲンを含むことから、分取して濃度を測定した処、１．３８％であった。   Next, 4.4 M NaCl was added, and after ultracentrifugation overnight, ultracentrifugation was performed under conditions of 100,000 g × 1 hour. Then, the precipitate was extracted with 2.4 M NaCl / 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) (overnight × 2 times), and then ultracentrifugated under conditions of 100,000 g × 1 hour. . Next, this precipitate was extracted with 1.0 M NaCl / 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) (overnight x 2 times), and then ultracentrifuged under conditions of 100,000 g x 1 hour. A supernatant was obtained. Since this supernatant liquid contains collagen, it was 1.38% after fractionation and concentration measurement.

このコラーゲン含有溶液（ａ溶液）２．５ｍＬを、予め、１．０ＭのＮａＣｌ／０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を移動相として充填したゲル濾過カラムに添加した。そして、出て来た溶液を廃棄し、カラム上端に溶液が無くなってから、カラムの上端に移動相３ｍＬを加え、ゲル濾過し、濾過された液３ｍＬを採取し、更に０．２２μｍのメンブランフィルターを通過させた。
このようにしてコラーゲン溶液を得た。 2.5 mL of this collagen-containing solution (solution a) was previously added to a gel filtration column packed with 1.0 M NaCl / 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) as a mobile phase. Then, the solution that has come out is discarded, and after there is no solution at the upper end of the column, 3 mL of mobile phase is added to the upper end of the column, gel filtration is performed, 3 mL of the filtered solution is collected, and a 0.22 μm membrane filter Was passed.
In this way, a collagen solution was obtained.

［コラーゲンゲルの作成］
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）を１％の割合で上記のコラーゲン溶液に添加・溶解させ、５℃で４日間掛けて反応を行わせた。得られた反応物に水を加えて洗浄した後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。この操作を３回繰り返した。 [Creation of collagen gel]
EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride) was added to and dissolved in the collagen solution at a rate of 1%, and the reaction was carried out at 5 ° C. for 4 days. Water was added to the obtained reaction product for washing, and then ultracentrifugation was performed under conditions of 100,000 g × 1 hour. This operation was repeated three times.

得られた沈殿物２ｇに乳糖水溶液（１％，４．７％，１０％）を７０ｍＬ加え、室温で、一晩振とうし、得られた反応物に水を加えて洗浄した。この後、１０００００ｇ×１時間の条件下で超遠心分離を行った。そして、沈殿物を凍結乾燥し、水分を半分除去した。   70 mL of a lactose aqueous solution (1%, 4.7%, 10%) was added to 2 g of the obtained precipitate, shaken overnight at room temperature, and water was added to the obtained reaction product to wash it. Thereafter, ultracentrifugation was performed under conditions of 100,000 g × 1 hour. The precipitate was lyophilized to remove half of the water.

［マウスへの注入］
上記のようにして得られた乳糖処理のＥＤＣ架橋魚由来コラーゲンをヌードマウスの背部皮下に０．３ｇ注入した。又、比較の為、乳糖処理していないＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン（水分を凍結乾燥により半分除去）をヌードマウスの背部皮下に０．３ｇ注入した。そして、注入部の状況を目視で観察したので、その結果を表−１に示す。 [Injection into mice]
0.3 g of collagen derived from lactose-treated EDC cross-linked fish obtained as described above was injected subcutaneously into the back of nude mice. For comparison, 0.3 g of collagen derived from EDC cross-linked fish not treated with lactose (water was removed by freeze-drying) was subcutaneously injected into the back of nude mice. And since the condition of the injection | pouring part was observed visually, the result is shown in Table-1.

表−１
観察結果
１％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン ２２日間皮下に膨れ保持
４．７％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン ９０日以上皮下に膨れ保持
１０％乳糖溶液処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン ６日間皮下に膨れ保持
乳糖溶液未処理ＥＤＣ架橋魚由来コラーゲン ４日間皮下に膨れ保持

表−１から判る通り、本発明になる乳糖処理された架橋コラーゲンは、体内において、長期間に亘って維持されるものである。 Table-1
Observation result 1% lactose solution treated collagen from EDC cross-linked fish 22 days subcutaneously swollen and retained 4.7% lactose solution treated EDC cross-linked fish derived collagen 90 days and above retained swollen subcutaneously 10% lactose solution treated EDC cross-linked fish derived collagen 6 days subcutaneous Bulge retention Lactose solution untreated EDC cross-linked fish collagen Collagen for 4 days

As can be seen from Table 1, the lactose-treated crosslinked collagen according to the present invention is maintained in the body for a long period of time.

［実施例２］
実施例１におけるコラーゲン含有溶液（ａ溶液）２．５ｍＬを、予め、注射用水を移動相として充填したゲル濾過カラムに添加した。そして、出て来た溶液を廃棄し、カラム上端に溶液が無くなってから、カラムの上端に注射用水の移動相３ｍＬを加え、ゲル濾過し、濾過された液３ｍＬを採取し、更に０．２２μｍのメンブランフィルターを通過させた。このようにしてコラーゲン溶液を得た。 [Example 2]
2.5 mL of the collagen-containing solution (solution a) in Example 1 was added in advance to a gel filtration column filled with water for injection as a mobile phase. Then, the solution that has come out is discarded, and after there is no solution at the upper end of the column, 3 mL of a mobile phase of water for injection is added to the upper end of the column, gel filtration is performed, and 3 mL of the filtered solution is collected. The membrane filter was passed through. In this way, a collagen solution was obtained.

上記のようにして得られたコラーゲン溶液を基にして実施例１と同様に行った処、実施例１と同様な結果が得られた。すなわち、本発明になる乳糖処理された架橋コラーゲンは、体内において、長期間に亘って維持されるものであった。   When the same procedure as in Example 1 was performed based on the collagen solution obtained as described above, the same result as in Example 1 was obtained. That is, the cross-linked collagen treated with lactose according to the present invention was maintained in the body for a long period of time.

［実施例３］
実施例１において、架橋剤として用いたＥＤＣの代わりに、グルタルアルデヒドを用いて同様に行った。 [Example 3]
In Example 1, it carried out similarly using glutaraldehyde instead of EDC used as a crosslinking agent.

その結果は、ＥＤＣを用いた場合よりも劣るものであった。例えば、粘性が僅かで、淡黄色を呈するものであった、但し、乳糖水溶液による処理がなされていないものに比べると、良好なものであった。

代 理 人 宇 高 克 己 The results were inferior to those using EDC. For example, the viscosity was slight and the color was light yellow, but it was better than that not treated with an aqueous lactose solution.

Representative Katsumi Udaka

Claims (11)

架橋コラーゲンと、乳糖とを含有してなり、
前記架橋コラーゲンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである
ことを特徴とするコラーゲン組成物。 It contains cross-linked collagen and lactose ,
The collagen composition, wherein the crosslinked collagen is collagen crosslinked with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride . 架橋コラーゲンと、乳糖とを含有し、
前記架橋コラーゲン１００重量部に対して前記乳糖が１〜３０重量部であり、
前記架橋コラーゲンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩によって架橋されたコラーゲンである
ことを特徴とするコラーゲン組成物。 Contains cross-linked collagen and lactose,
Ri said lactose 1-30 parts by der respect to the cross-linked collagen 100 parts by weight,
The collagen composition, wherein the crosslinked collagen is collagen crosslinked with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride . コラーゲンが魚由来コラーゲンである
ことを特徴とする請求項１又は請求項２のコラーゲン組成物。 The collagen composition according to claim 1 or 2, wherein the collagen is fish-derived collagen. 生体内に埋め込まれて使用される材料である
ことを特徴とする請求項１〜請求項３いずれかのコラーゲン組成物。 The collagen composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the collagen composition is used by being embedded in a living body. 生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料である
ことを特徴とする請求項１〜請求項４いずれかのコラーゲン組成物。 The collagen composition according to any one of claims 1 to 4, which is a cosmetic material used by being implanted in a living body. コラーゲン溶液に架橋剤を添加してゲル化させるゲル化工程と、
ゲル化コラーゲンに乳糖を添加する乳糖添加工程
とを有することを特徴とするコラーゲンゲル組成物の製造方法。 A gelation step of adding a cross-linking agent to the collagen solution and gelling;
A method for producing a collagen gel composition, comprising the step of adding lactose to gelled collagen. 乳糖添加工程で添加される乳糖は濃度が０．５〜１０％の乳糖水溶液である
ことを特徴とする請求項６のコラーゲン組成物の製造方法。 The method for producing a collagen composition according to claim 6, wherein the lactose added in the lactose addition step is a lactose aqueous solution having a concentration of 0.5 to 10%. 架橋剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩である
ことを特徴とする請求項６又は請求項７のコラーゲン組成物の製造方法。 The method for producing a collagen composition according to claim 6 or 7, wherein the crosslinking agent is 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride. コラーゲンが魚由来コラーゲンである
ことを特徴とする請求項６〜請求項８いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。 The method for producing a collagen composition according to any one of claims 6 to 8, wherein the collagen is fish-derived collagen. 生体内に埋め込まれて使用される材料の製造方法である
ことを特徴とする請求項６〜請求項９いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。 The method for producing a collagen composition according to any one of claims 6 to 9, which is a method for producing a material to be used by being implanted in a living body. 生体内に埋め込まれて使用される美容整形材料の製造方法である
ことを特徴とする請求項６〜請求項１０いずれかのコラーゲン組成物の製造方法。 The method for producing a collagen composition according to any one of claims 6 to 10, wherein the method is a method for producing a cosmetic material to be used by being implanted in a living body.