JP4603798B2 - Novel oligonucleotide adapters and primers - Google Patents
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Description
本発明は、新規のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーに関する。本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーは、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離（例えば、染色体ウォーキング）に用いることができる。 The present invention relates to novel oligonucleotide adapters and primers. The oligonucleotide adapters and primers of the present invention can be used for isolation of adjacent regions of known DNA sequences (for example, chromosome walking).
公知ＤＮＡ配列に隣接する未知ＤＮＡ配列の単離及び機能解析は、例えば、染色体ウォーキング（chromosome walking）、又はプロモーター領域若しくはタグ付きＤＮＡの隣接配列の単離などに重要である。公知ＤＮＡ配列領域からその隣接領域への「ウォーキング」のために、種々の改良ＰＣＲ法が開発されてきた。公知の改良ＰＣＲ法としては、例えば、断片化したゲノムＤＮＡを環状化させることを特徴とするインバースＰＣＲ法、断片化したゲノムＤＮＡにアダプターを連結させることを特徴とするライゲーション介在（ligation-mediated）ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）法、あるいは、ランダムプライマーを使用することを特徴とするランダムプライマー（randomly primed）ＰＣＲ法などが知られている。 Isolation and functional analysis of unknown DNA sequences adjacent to known DNA sequences are important, for example, for chromosome walking, or isolation of adjacent sequences of promoter regions or tagged DNA. Various improved PCR methods have been developed for “walking” from a known DNA sequence region to its adjacent region. Known improved PCR methods include, for example, an inverse PCR method characterized by circularizing fragmented genomic DNA, and a ligation-mediated method characterized by linking an adapter to the fragmented genomic DNA. A PCR (LM-PCR) method or a randomly primed PCR method using a random primer is known.
しかしながら、これらの公知方法では、巨大ゲノムを有する生物に適用する場合、ＰＣＲを実施する際に使用する鋳型ＤＮＡの複雑性に起因する多くの非特異的配列（すなわち、ノイズ配列）が増幅されるため、更に簡易かつ効率的なウォーキング方法が求められていた。
前記ＬＭ−ＰＣＲ法（非特許文献１）は、それ以外の公知方法と比較すれば、ノイズ配列の発生が少ない方法ではあるが、ゲノムＤＮＡ断片へのアダプター結合率が低いこと、そして、非特異的な増幅を更に抑えることが課題であった。
However, these known methods amplify many non-specific sequences (ie, noise sequences) due to the complexity of the template DNA used when performing PCR when applied to organisms with large genomes. Therefore, a simpler and more efficient walking method has been demanded.
The LM-PCR method (Non-Patent Document 1) is a method that generates less noise sequences than other known methods, but has a low adapter binding rate to genomic DNA fragments, and non-specificity. It was a problem to further suppress general amplification.
本発明者は、巨大なゲノムを有する生物、例えば、ユリ（ゲノムサイズ＝３６０〜９００億塩基対；ヒトのゲノムサイズは３４億塩基対）から、公知の構造遺伝子に対するプロモーター領域を単離するために、ＬＭ−ＰＣＲ法を含む各種公知方法を用いて染色体ウォーキングを実施したが、所望のＤＮＡ配列を得ることはできなかった。この理由は、ＰＣＲを実施する際に鋳型として使用するＤＮＡ試料及びその中に含まれる標的ＤＮＡ断片に関して、ゲノムサイズが巨大になるに従って、著しく複雑性が増すためである。
これまで報告のあった植物は、例えば、アラビドプシス（Arabidopsis taliana）、イネ、エンドウ、アブラナ属（brassica）、又はタバコであるが、最も大きなゲノムサイズを有するタバコでも約４４億塩基対である。
本発明者は、このような巨大ゲノムを有する生物からでもプロモーター領域を取得することのできる方法を鋭意探求したところ、特定の条件を満たすアダプター及びプライマーを用いることにより、前記プロモーター領域を含むＤＮＡ配列を取得することができることを新たに見出した。
In order to isolate a promoter region for a known structural gene from an organism having a large genome, such as a lily (genome size = 360 to 90 billion base pairs; human genome size is 3.4 billion base pairs). Furthermore, chromosome walking was performed using various known methods including the LM-PCR method, but a desired DNA sequence could not be obtained. This is because the complexity of the DNA sample used as a template when performing PCR and the target DNA fragment contained therein increases significantly as the genome size increases.
The plants that have been reported so far are, for example, Arabidopsis taliana, rice, pea, brassica, or tobacco, although tobacco with the largest genome size is about 4.4 billion base pairs.
The present inventor has eagerly searched for a method capable of obtaining a promoter region even from an organism having such a large genome. By using adapters and primers that satisfy specific conditions, the DNA sequence containing the promoter region can be obtained. Newly found that you can get.
従って、本発明の課題は、従来技術の欠点を解消し、標的ＤＮＡ断片の含有率が著しく低いＤＮＡ試料であっても、公知ＤＮＡ配列の隣接領域を単離することが可能な、新規のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーを提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to solve the disadvantages of the prior art and to provide a novel oligo that can isolate a contiguous region of a known DNA sequence even in a DNA sample having a significantly low target DNA fragment content. It is to provide nucleotide adapters and primers.
前記課題は、本発明による、
（Ａ）（ａ）長鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記長鎖オリゴヌクレオチドの３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチドアダプターであって、
（Ｂ）前記オリゴヌクレオチドアダプターにおける前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列
からなる突出末端であり、
（Ｃ）前記長鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（Ｄ）前記短鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドアダプター
により解決することができる。
Said subject is according to the invention,
An oligonucleotide adapter comprising (A) (a) a long oligonucleotide and (b) a short oligonucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the 3 ′ end region of the long oligonucleotide,
(B) A partial sequence of a base sequence complementary to the base sequence of the 5 ′ protruding end generated by digesting the 5 ′ end of the short oligonucleotide in the oligonucleotide adapter with a restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end A protruding end consisting of
(C) For the long oligonucleotide,
(1) without forming a 3 ′ terminal homodimer,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −6.5 kcal / mol or more,
(3) Even if the intramolecular hairpin structure is not formed or formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more,
(D) For the short oligonucleotide:
(1) without forming a 3 ′ terminal homodimer,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −4.9 kcal / mol or more,
(3) The intramolecular hairpin structure is not formed, or even if it is formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more, which can be solved by the oligonucleotide adapter .
本発明のオリゴヌクレオチドアダプターの好ましい態様によれば、配列番号１で表される塩基配列からなる長鎖オリゴヌクレオチドと、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなる短鎖オリゴヌクレオチドとからなる。 According to a preferred embodiment of the oligonucleotide adapter of the present invention, a long oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a short oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, Consists of.
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチドアダプターにおける長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記部分塩基配列に関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマーに関する。
Further, the present invention is an oligonucleotide primer comprising a partial base sequence of a long oligonucleotide in the oligonucleotide adapter, with respect to the partial base sequence,
(1) The 3 ′ end homodimer is not formed, or even if it is formed, the free energy in the homodimer is −2.6 kcal / mol or more,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −4.6 kcal / mol or more,
(3) The oligonucleotide primer is characterized in that an intramolecular hairpin structure is not formed, or even if formed, free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more.
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの好ましい態様によれば、配列番号４で表される塩基配列、あるいは、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの別の好ましい態様によれば、前記オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列における各塩基に関して、最隣接熱力学法により各塩基毎に決定される各自由エネルギーについて、５’末端側領域における自由エネルギーの平均値が、３’末端側領域における自由エネルギーの平均値よりも低い。
According to a preferred embodiment of the oligonucleotide primer of the present invention, it comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the sequence consisting of the 11th to 35th bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
According to another preferred embodiment of the oligonucleotide primer of the present invention, for each base in the nucleotide sequence of the oligonucleotide primer, for each free energy determined for each base by the nearest neighbor thermodynamic method, the 5 ′ end region The average value of free energy at is lower than the average value of free energy in the 3 ′ end region.
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチドアダプターと、前記オリゴヌクレオチドプライマーとを用いることを特徴とする、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法に関する。
更に、本発明は、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法であって、
（１）ＤＮＡ試料を、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）により生成した各ＤＮＡ断片の５’突出末端を、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する工程、
（３）前記工程（２）により得られた各ＤＮＡ断片に、前記オリゴヌクレオチドアダプターを連結する工程、
（４）前記工程（３）により得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、前記オリゴヌクレオチドプライマー２種類と、前記公知ＤＮＡ配列に特異的なプライマー２種類とを用いて、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程
を含むことを特徴とする、前記単離方法に関する。
The present invention also relates to a method for isolating a region adjacent to a known DNA sequence, wherein the oligonucleotide adapter and the oligonucleotide primer are used.
Furthermore, the present invention is a method for isolating adjacent regions of a known DNA sequence,
(1) digesting a DNA sample with a restriction enzyme that produces a 5 ′ overhang,
(2) a step of partially filling the 5 ′ protruding end of each DNA fragment generated by the step (1) with
(3) linking the oligonucleotide adapter to each DNA fragment obtained by the step (2),
(4) Nested polymerase chain reaction is carried out using each of the DNA fragments obtained in the step (3) as a template, using the two oligonucleotide primers and the two primers specific to the known DNA sequence. The method comprising the steps of:
本発明によれば、標的ＤＮＡ断片の含有率が著しく低いＤＮＡ試料であっても、公知ＤＮＡ配列の隣接領域を単離することが可能である。従って、本発明によれば、巨大ゲノムを有する生物であっても、例えば、染色体ウォーキングが可能であり、プロモーター領域を取得することができる。 According to the present invention, it is possible to isolate a flanking region of a known DNA sequence even in a DNA sample having a remarkably low target DNA fragment content. Therefore, according to the present invention, even an organism having a huge genome can perform, for example, chromosome walking, and a promoter region can be obtained.
ところで、現在までに膨大な数のＤＮＡ塩基配列が決定され、その配列情報はデータベースとして保存されているが、ヒト又はマウス等の一部の生物を除き、多くの生物種においてはその多くはｃＤＮＡライブラリーに由来する構造遺伝子の情報である。これは、ゲノム上の非翻訳領域の大部分が、構造遺伝子と比較して意味のない情報であり、その塩基配列を決定するためのコストを考慮すると、構造遺伝子と比較してプライオリティーが低くなるためである。しかしながら、構造遺伝子の情報が蓄積されるに従って、それらの発現調節に影響を与えるプロモーター領域の単離及び機能解析は益々重要なものとなってきている。既に取得済みの多くのｃＤＮＡライブラリーから、各構造遺伝子の塩基配列情報を取得し、本発明方法を実施することにより、多くのプロモーター領域を、簡易かつ高効率で単離することが可能である。 By the way, an enormous number of DNA base sequences have been determined so far, and the sequence information is stored as a database, but most of them are cDNAs in many species except for some organisms such as humans and mice. Information on structural genes derived from the library. This means that most of the untranslated region on the genome is meaningless information compared to the structural gene, and its priority is lower than that of the structural gene in consideration of the cost for determining its base sequence. It is to become. However, as information on structural genes is accumulated, isolation and functional analysis of promoter regions that affect their expression regulation are becoming increasingly important. By acquiring the nucleotide sequence information of each structural gene from many cDNA libraries that have already been obtained and carrying out the method of the present invention, it is possible to easily and efficiently isolate many promoter regions. .
本発明による、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法は、公知のＬＭ−ＰＣＲ法の改良発明であり、本発明の主たる特徴は、これに限定されるものではないが、特定の条件を満たす本発明のオリゴヌクレオチドアダプター（以下、単にアダプターと称する）及びプライマーを用いることにある。以下、本発明方法（以下、ＬＭ−ＰＣＲ法とも称する）について図１に沿って説明した後、本発明のアダプター及びプライマーについて説明する。 The method for isolating a contiguous region of a known DNA sequence according to the present invention is an improvement of the known LM-PCR method, and the main features of the present invention are not limited thereto, but satisfy a specific condition. The oligonucleotide adapter (hereinafter simply referred to as adapter) and primer of the present invention are used. Hereinafter, after explaining the method of the present invention (hereinafter also referred to as LM-PCR method) with reference to FIG. 1, the adapter and primer of the present invention will be explained.
［１］本発明による、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法
ＬＭ−ＰＣＲ法では、始めに、ＤＮＡ試料（例えば、ゲノムＤＮＡ又はクローン化ＤＮＡ）を制限酵素で消化する［消化工程；例えば、図１における工程（Ａ）］。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記制限酵素として、５’突出末端を生じさせる制限酵素［図１におけるＤＮＡ（ｂ）参照］を使用する。例えば、図１では、制限酵素ＢａｍＨＩ（認識配列ＧＧＡＴＣＣ）を使用しており、ＢａｍＨＩ消化［工程（Ａ）］により二本鎖ＤＮＡ断片［ＤＮＡ（ｂ）］を生じさせる。前記ＤＮＡ（ｂ）を構成する両鎖は、それぞれ、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を有する。
[1] Method for isolating adjacent region of known DNA sequence according to the present invention In the LM-PCR method, first, a DNA sample (eg, genomic DNA or cloned DNA) is digested with a restriction enzyme [digestion step; Step (A) in FIG. In the LM-PCR method of the present invention, a restriction enzyme [see DNA (b) in FIG. 1] that generates a 5 ′ protruding end is used as the restriction enzyme. For example, in FIG. 1, the restriction enzyme BamHI (recognition sequence GGATCC) is used, and a double-stranded DNA fragment [DNA (b)] is generated by BamHI digestion [step (A)]. Both strands constituting the DNA (b) each have a 5 ′ protruding end consisting of the base sequence GATC.
本発明方法における消化工程で使用する制限酵素は、５’突出末端を生じさせる制限酵素である限り、特に限定されるものではないが、消化後の５’突出末端の塩基長が４塩基以上であり、後述する充填工程を実施した後の５’突出末端の塩基長が３塩基以上である制限酵素が好ましい。
例えば、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩを挙げることができる。塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素としては、例えば、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、又はＡｖｒIIを挙げることができる。
The restriction enzyme used in the digestion step in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end, but the base length of the 5 ′ protruding end after digestion is 4 bases or more. There is preferred a restriction enzyme in which the base length of the 5 ′ protruding end after carrying out the filling step described later is 3 bases or more.
For example, examples of the restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end consisting of the base sequence GATC include BamHI, BglII, BclI, and Sau3AI. Examples of restriction enzymes that generate a 5 ′ protruding end consisting of the base sequence CTAG include SpeI, NheI, XbaI, and AvrII.
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記消化工程の後、５’突出末端を有するＤＮＡ断片の前記５’突出末端を、適当なデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する［充填工程；例えば、図１における工程（Ｂ）］。例えば、図１に示す工程（Ｂ）では、クレノウ酵素とデオキシグアノシン５’−三リン酸とを用いて、ＤＮＡ（ｂ）を構成する各鎖の３’末端（Ｇ）にＧを付加することによって、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を、塩基配列ＴＡＧからなる５’突出末端に改変する。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程を実施することにより、後述するアダプター連結工程において、制限酵素で断片化されたＤＮＡ断片同士が再連結するのを防止することができ、その結果、ＤＮＡ断片とアダプターとの連結効率を向上させることができる。
In the LM-PCR method, after the digestion step, the 5 ′ protruding end of a DNA fragment having a 5 ′ protruding end is partially filled with an
通常のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記クレノウ酵素として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたもの（５’→３’ｅｘｏ−；なお、弱い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を使用するが、本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の欠失（５’→３’ｅｘｏ−）に加え、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も欠失（３’→５’ｅｘｏ−）させたクレノウ酵素を使用することが好ましい。 In a normal LM-PCR method, the Klenow enzyme lacks 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity (5 ′ → 3′exo − ; has a weak 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity) However, in the LM-PCR method of the present invention, in addition to the deletion of 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity (5 ′ → 3′exo − ), the 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity is also deleted (3 It is preferable to use the Klenow enzyme which has been subjected to '→ 5' exo − ).
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程の後、得られた各ＤＮＡ断片に、長鎖オリゴヌクレオチド及び短鎖オリゴヌクレオチドからなるアダプターを連結する［アダプター連結工程；例えば、図１における工程（Ｃ）］。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程を実施するので、制限酵素で断片化されたＤＮＡ断片同士が再連結するのを防止することができ、その結果、ＤＮＡ断片とアダプターとの連結効率を向上させることができる。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法で用いる本発明のアダプターについては、後述する。 In the LM-PCR method, after the filling step, an adapter comprising a long oligonucleotide and a short oligonucleotide is linked to each of the obtained DNA fragments [adapter linking step; for example, step (C) in FIG. 1]. . In the LM-PCR method of the present invention, since the filling step is carried out, it is possible to prevent re-ligation of DNA fragments fragmented with restriction enzymes, and as a result, the efficiency of ligation between the DNA fragment and the adapter. Can be improved. The adapter of the present invention used in the LM-PCR method of the present invention will be described later.
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記アダプター連結工程の後、得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、ネステッドＰＣＲを実施する［ネステッドＰＣＲ工程；例えば、図１における工程（Ｄ）及び（Ｅ）］。ネステッドＰＣＲでは、１組のプライマーセットを用いて第１回目のＰＣＲを実施した後、前記プライマーセットの内側に位置する別のプライマーセットを用いて第２回目のＰＣＲを実施する。ＬＭ−ＰＣＲ法におけるネステッドＰＣＲ工程では、標的とする１つの公知ＤＮＡ配列に対して、アダプターの塩基配列に基づいて設計されるアダプタープライマー（ＡＰ）２種類と、標的とする公知ＤＮＡ配列に基づいて設計される特異的プライマー（ＳＰ）２種類とを使用する。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法で用いる本発明のアダプタープライマーについては、後述する。 In the LM-PCR method, after the adapter ligation step, nested PCR is carried out using the obtained DNA fragments as templates [nested PCR step; for example, steps (D) and (E) in FIG. 1]. In the nested PCR, the first PCR is performed using one primer set, and then the second PCR is performed using another primer set located inside the primer set. In the nested PCR step in the LM-PCR method, two types of adapter primers (AP) designed based on the base sequence of the adapter and one target known DNA sequence and one target known DNA sequence are used. Two types of specific primers (SP) to be designed are used. The adapter primer of the present invention used in the LM-PCR method of the present invention will be described later.
例えば、図１におけるＤＮＡ（ｄ）を鋳型とする場合には、アダプタープライマーとして、アダプターの一方の鎖（長鎖オリゴヌクレオチド）における外側（すなわち、５’側）の部分塩基配列からなるアダプタープライマー（ＡＰ１）と、その内側（すなわち、３’側）の部分塩基配列を含む［所望により、制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）認識配列を含む］アダプタープライマー（ＡＰ２）とを使用することができる。一方、特異的プライマーとして、公知ＤＮＡ配列の一方の鎖における適当な部分塩基配列からなる特異的プライマー（ＳＰ１）と、その内側の部分塩基配列を含む特異的プライマー（ＳＰ２）とを使用することができる。 For example, when DNA (d) in FIG. 1 is used as a template, an adapter primer consisting of a partial base sequence on the outside (ie, 5 ′ side) of one strand (long oligonucleotide) of the adapter is used as an adapter primer ( AP1) and an adapter primer (AP2) containing a partial base sequence inside (ie, 3 ′ side) [optionally containing a restriction enzyme (eg, NotI) recognition sequence] can be used. On the other hand, as a specific primer, a specific primer (SP1) comprising an appropriate partial base sequence in one strand of a known DNA sequence and a specific primer (SP2) comprising a partial base sequence inside thereof may be used. it can.
図１における工程（Ｄ）では、ＤＮＡ（ｄ）を鋳型とし、プライマーＡＰ１及びプライマーＳＰ１をプライマーセットとして、ネステッドＰＣＲの第１回ＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ（ｅ）を増幅することができる。続く工程（Ｅ）では、得られたＤＮＡ（ｅ）を鋳型とし、プライマーＡＰ２及びプライマーＳＰ２をプライマーセットとして、ネステッドＰＣＲの第２回ＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ（ｆ）を増幅することができる。 In step (D) in FIG. 1, DNA (e) can be amplified by performing the first PCR of nested PCR using DNA (d) as a template and primers AP1 and SP1 as a primer set. . In the subsequent step (E), the DNA (f) can be amplified by performing the second PCR of the nested PCR using the obtained DNA (e) as a template and the primer AP2 and the primer SP2 as a primer set. it can.
本発明のＬＭ−ＰＣＲ法を実施することにより最終的に増幅されるＤＮＡ断片［例えば、図１におけるＤＮＡ（ｆ）］には、標的とした公知ＤＮＡ配列の一部（すなわち、一方の末端とプライマーＳＰ２とに挟まれた領域）と共に、前記公知ＤＮＡ配列に隣接する未知領域とが含まれる。前記隣接領域は、前記公知ＤＮＡ配列との境界と、消化工程で用いた制限酵素の認識配列とに挟まれた領域である。 The DNA fragment finally amplified by carrying out the LM-PCR method of the present invention [eg, DNA (f) in FIG. 1] contains a part of the known known DNA sequence (ie, one end and As well as an unknown region adjacent to the known DNA sequence. The adjacent region is a region sandwiched between the boundary with the known DNA sequence and the restriction enzyme recognition sequence used in the digestion step.
［２］本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマー
これまで述べたように、本発明方法では、本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーを使用する。本発明のアダプター及びプライマーは、公知のアダプター及びプライマーと異なる、以下に説明する特定条件を満たす必要があるため、それ自体、新規のアダプター及びプライマーである。
[2] Oligonucleotide adapter and primer of the present invention As described above, the oligonucleotide adapter and primer of the present invention are used in the method of the present invention. The adapter and primer of the present invention are different from known adapters and primers, and need to satisfy the specific conditions described below.
本発明のアダプターは、
（Ａ）（ａ）長鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記長鎖オリゴヌクレオチドの３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなり、
（Ｂ）アダプターを形成させた場合に、前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列からなる突出末端であり、
（Ｃ）前記長鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（Ｄ）前記短鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
なお、自由エネルギーは温度に依存するため、本明細書におけるアダプターに関する自由エネルギーの各値は、特に断らない限り、アダプターを用いた連結反応（例えば、アダプター連結工程）の一般的な実施温度（例えば、１６℃）における算出値である。
The adapter of the present invention
(A) (a) a long oligonucleotide, and (b) a short oligonucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the 3 ′ end region of the long oligonucleotide,
(B) When an adapter is formed, a base sequence complementary to the base sequence of the 5 ′ protruding end generated by digesting the 5 ′ end of the short oligonucleotide with a restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end A protruding end consisting of a partial sequence of
(C) For the long oligonucleotide,
(1) without forming a 3 ′ terminal homodimer,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −6.5 kcal / mol or more,
(3) Even if the intramolecular hairpin structure is not formed or formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more,
(D) For the short oligonucleotide:
(1) without forming a 3 ′ terminal homodimer,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −4.9 kcal / mol or more,
(3) The intramolecular hairpin structure is not formed, or even if it is formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more.
In addition, since free energy depends on temperature, unless otherwise specified, each value of free energy related to the adapter in the present specification is a general execution temperature (for example, adapter coupling step) of the coupling reaction using the adapter (for example, adapter coupling step). , 16 ° C.).
本発明のアダプターにおける前記条件（Ａ）について、長鎖オリゴヌクレオチドの塩基数は、本発明のアダプターが満たすべき各種条件を満足することができる限り、特に限定されるものではないが、通常、３０〜５０であり、好ましくは３３〜４５であり、より好ましくは３６〜４０である。 Regarding the condition (A) in the adapter of the present invention, the number of bases of the long oligonucleotide is not particularly limited as long as various conditions to be satisfied by the adapter of the present invention can be satisfied. It is -50, Preferably it is 33-45, More preferably, it is 36-40.
また、短鎖オリゴヌクレオチドの塩基数は、本発明のアダプターが満たすべき各種条件を満足することができる限り、特に限定されるものではないが、通常、８〜２０であり、好ましくは１０〜１８であり、より好ましくは１２〜１７である。短鎖オリゴヌクレオチドは、長鎖オリゴヌクレオチドとアダプターを形成させた場合に、二重鎖部分を構成する部分（３’末端を含む大部分）と、５’突出末端となる部分（５’末端）とからなる。 Further, the number of bases of the short oligonucleotide is not particularly limited as long as various conditions to be satisfied by the adapter of the present invention can be satisfied, but is usually 8 to 20, preferably 10 to 18. More preferably, it is 12-17. When a short oligonucleotide is formed into an adapter with a long oligonucleotide, the portion constituting the double-stranded portion (most portion including the 3 ′ end) and the portion serving as the 5 ′ overhanging end (5 ′ end) It consists of.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｂ）において、「５’突出末端を生じさせる制限酵素」とは、本発明方法における消化工程で使用する前述の「５’突出末端を生じさせる制限酵素」を意味し、本発明方法における消化工程において先述した説明がそのまま当てはまる。 In the condition (B) in the adapter of the present invention, the “restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end” means the above-mentioned “restriction enzyme that generates a 5 ′ protruding end” used in the digestion step in the method of the present invention. However, the explanation described above in the digestion step in the method of the present invention is applied as it is.
短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端（すなわち、５’突出末端となる部分）は、前記制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列からなる。前記部分配列としては、前記制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列から、その５’末端の塩基１又は数個が欠失した配列を挙げることができる。前記部分配列は、１〜３塩基であることが好ましく、２〜３塩基であることがより好ましい。 The 5 'end of the short oligonucleotide (that is, the portion that becomes the 5' overhanging end) consists of a partial sequence of a base sequence that is complementary to the base sequence of the 5 'overhanging end produced by digestion with the restriction enzyme. Examples of the partial sequence include a sequence in which one or several bases at the 5 ′ end are deleted from a base sequence complementary to the base sequence at the 5 ′ protruding end generated by digestion with the restriction enzyme. . The partial sequence is preferably 1 to 3 bases, and more preferably 2 to 3 bases.
例えば、５’突出末端を生じさせる制限酵素が、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩ）である場合には、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列はＧＡＴＣであり、その相補的な塩基配列はＧＡＴＣである［図１におけるＤＮＡ（ｂ）参照］ので、短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端の塩基配列は、例えば、ＡＴＣ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＧＡＴＣ）から、その５’末端の塩基１個（Ｇ）が欠失した配列；図１におけるアダプター参照］、又はＴＣ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＧＡＴＣ）から、その５’末端の塩基２個（ＧＡ）が欠失した配列］であることができる。 For example, when the restriction enzyme that generates the 5 ′ protruding end is a restriction enzyme that generates the 5 ′ protruding end consisting of the base sequence GATC (for example, BamHI, BglII, BclI, or Sau3AI), the restriction enzyme generates the restriction enzyme. Since the base sequence at the 5 ′ protruding end is GATC and its complementary base sequence is GATC [see DNA (b) in FIG. 1], the base sequence at the 5 ′ end of the short oligonucleotide is, for example, ATC [That is, a sequence in which one base (G) at its 5 ′ end is deleted from a base sequence (GATC) complementary to the base sequence at the 5 ′ protruding end generated by the restriction enzyme; see the adapter in FIG. 1], Or TC [that is, two bases at the 5 ′ end from the base sequence complementary to the base sequence at the 5 ′ protruding end produced by the restriction enzyme (GATC) GA) can be an array of deleted].
また、５’突出末端を生じさせる制限酵素が、塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（例えば、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、又はＡｖｒII）である場合には、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列はＣＴＡＧであり、その相補的な塩基配列はＣＴＡＧであるので、短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端の塩基配列は、例えば、ＴＡＧ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＣＴＡＧ）から、その５’末端の塩基１個（Ｃ）が欠失した配列］、又はＡＧ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＣＴＡＧ）から、その５’末端の塩基２個（ＣＴ）が欠失した配列］であることができる。 In addition, when the restriction enzyme that generates the 5 ′ protruding end is a restriction enzyme that generates the 5 ′ protruding end consisting of the base sequence CTAG (for example, SpeI, NheI, XbaI, or AvrII), the restriction enzyme generates the restriction enzyme. Since the base sequence at the 5 ′ protruding end is CTAG and its complementary base sequence is CTAG, the base sequence at the 5 ′ end of the short oligonucleotide is, for example, TAG [that is, 5 ′ generated by the restriction enzyme] Sequence obtained by deleting one base (C) at its 5 ′ end from the base sequence complementary to the base sequence at the protruding end (CTAG)], or AG [that is, the base at the 5 ′ protruding end generated by the restriction enzyme A sequence obtained by deleting two bases (CT) at the 5 ′ end from a base sequence complementary to the sequence (CTAG)].
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（１）に示すように、長鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがない。本明細書において「３’末端ホモダイマー」とは、２つの同一のオリゴヌクレオチドから最も安定的な３’末端ホモダイマーを形成させた場合に、相補的塩基対形成を行う塩基が連続する領域（但し、３’末端の塩基を含む領域に限る）の塩基数が２以上であるダイマー［例えば、後述の式（Ｖ）で表される３’末端ホモダイマー］を意味する。 As shown in the conditions (C) and (1) in the adapter of the present invention, the long oligonucleotide does not form a 3 'terminal homodimer. As used herein, “3′-end homodimer” refers to a region in which bases that form complementary base pairs are continuous when the most stable 3′-end homodimer is formed from two identical oligonucleotides (provided that It means a dimer [for example, a 3 ′ terminal homodimer represented by the formula (V) described later] having 2 or more bases (limited to a region containing a base at the 3 ′ terminal).
アダプターの一方の鎖が３’末端ホモダイマーを形成する傾向がある場合、所望のアダプター構造をとらない可能性がある。しかも、３’末端ホモダイマーが形成された状態でＰＣＲを実施すると、３’末端ホモダイマーにおける一本鎖部分が鋳型となって、５’→３’方向へのＤＮＡ合成が行われるため、所望のアダプター構造の形成にとって不利である。本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。 If one strand of the adapter tends to form a 3 'terminal homodimer, it may not take the desired adapter structure. Moreover, when PCR is carried out with the 3 ′ end homodimer formed, DNA synthesis in the 5 ′ → 3 ′ direction is performed using the single-stranded portion of the 3 ′ end homodimer as a template. It is disadvantageous for the formation of the structure. Since the long oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not form a 3 'terminal homodimer, it can take a desired adapter structure together with the short oligonucleotide.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（２）について、長鎖オリゴヌクレオチドの最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。前記自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であると、安定なホモダイマーを形成する傾向が高くなり、所望のアダプター構造をとらない可能性がある。 Regarding the conditions (C) and (2) in the adapter of the present invention, when the most stable homodimer of a long-chain oligonucleotide is formed, the free energy in the homodimer, more specifically, it contains no mismatch and is continuous. Among the sequences of base pairs that form hydrogen bonds, the free energy in the longest base pair sequence is −6.5 kcal / mol or more, preferably −6 kcal / mol or more, more preferably −5. It is 5 kcal / mol or more. If the free energy is less than -6.5 kcal / mol, the tendency to form a stable homodimer increases, and the desired adapter structure may not be formed.
前記自由エネルギーは、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 3746-3750又はProc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 9373-9377に記載の方法により算出することができ、より具体的には、本明細書に記載の各数値は、市販のソフトウェア（OLIGOTMPrimer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いて算出した値である。 The free energy can be calculated, for example, by the method described in Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 3746-3750 or Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 9373-9377, Specifically, each numerical value described in the present specification is a value calculated using commercially available software (OLIGO ™ Primer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.).
公知のアダプター（例えば、ＬＭ−ＰＣＲ法に用いる公知アダプター）は、ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片のクローニングの便宜を考慮して、その配列中に制限酵素認識部位を含むことが一般的である。ほとんどの制限酵素認識部位は少なくとも４〜６個の塩基からなるパリンドローム構造を有するため、制限酵素認識部位を含む公知アダプターは、前記制限酵素認識部位により安定的なホモダイマーを形成する。それに対して、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、安定なホモダイマーを形成することがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。 Known adapters (for example, known adapters used in the LM-PCR method) generally include a restriction enzyme recognition site in the sequence in consideration of the convenience of cloning of DNA fragments obtained by PCR amplification. . Since most restriction enzyme recognition sites have a palindromic structure consisting of at least 4 to 6 bases, known adapters containing restriction enzyme recognition sites form stable homodimers with the restriction enzyme recognition sites. On the other hand, since the long oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not form a stable homodimer, it can take a desired adapter structure together with the short oligonucleotide.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（３）に示すように、長鎖オリゴヌクレオチドは、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
ヘアピン構造の解析は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 9373-9377又はNucleic Acids Res. 16, 11725-11735に記載の方法により算出することができ、より具体的には、市販のソフトウェア（OLIGOTMPrimer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いて解析することができる。なお、ヘアピン構造における自由エネルギーは、ヘアピンループのステムとループ長より計算される自由エネルギーの和である。
As shown in the conditions (C) and (3) in the adapter of the present invention, the long oligonucleotide does not form an intramolecular hairpin structure, or even if it is formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal. / Mol or more.
Analysis of the hairpin structure can be calculated, for example, by the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9373-9377 or Nucleic Acids Res. 16, 11725-11735, more specifically, Analysis can be performed using commercially available software (OLIGO ™ Primer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.). The free energy in the hairpin structure is the sum of the free energies calculated from the hairpin loop stem and loop length.
また、本明細書において「分子内ヘアピン構造を形成しない」とは、ステム領域の塩基長が３塩基以上のヘアピン構造を形成しないことを意味する。本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、安定なヘアピン構造をとることがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。 In the present specification, “does not form an intramolecular hairpin structure” means that a hairpin structure having a stem region with a base length of 3 or more bases is not formed. Since the long oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not take a stable hairpin structure, it can take a desired adapter structure together with the short oligonucleotide.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（１）に示すように、短鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがない。本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。 As shown in the condition (D) (1) in the adapter of the present invention, the short oligonucleotide does not form a 3 'terminal homodimer. Since the short oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not form a 3 'terminal homodimer, it can take a desired adapter structure together with the long oligonucleotide.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（２）について、短鎖オリゴヌクレオチドの最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であり、より好ましくは−３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、安定なホモダイマーを形成することがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
Regarding the conditions (D) and (2) in the adapter of the present invention, when the most stable homodimer of a short oligonucleotide is formed, the free energy in the homodimer, more specifically, it contains no mismatch and is continuous. Among the base pair sequences that form hydrogen bonds, the free energy in the longest base pair sequence is −4.9 kcal / mol or more, preferably −4.4 kcal / mol or less, more preferably − It is 3.9 kcal / mol or more.
Since the short oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not form a stable homodimer, it can take a desired adapter structure together with the long oligonucleotide.
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（３）に示すように、短鎖オリゴヌクレオチドは、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、安定なヘアピン構造をとることがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。 As shown in the condition (D) (3) in the adapter of the present invention, the short oligonucleotide does not form an intramolecular hairpin structure, or even if it is formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal. / Mol or more. Since the short oligonucleotide constituting the adapter of the present invention does not take a stable hairpin structure, it can take a desired adapter structure together with the long oligonucleotide.
本発明のプライマーは、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列（以下、長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列と称する）を含み、前記部分塩基配列に関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
なお、本明細書におけるプライマーに関する自由エネルギーの各値は、特に断らない限り、２５℃における算出値である。
The primer of the present invention includes a partial base sequence of a long oligonucleotide constituting the adapter of the present invention (hereinafter referred to as a long base oligonucleotide-derived partial base sequence).
(1) The 3 ′ end homodimer is not formed, or even if it is formed, the free energy of the 3 ′ end region for performing complementary base pairing is −2.6 kcal / mol or more,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −4.6 kcal / mol or more,
(3) The intramolecular hairpin structure is not formed, or even if it is formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more.
In addition, each value of the free energy regarding the primer in this specification is a calculated value in 25 degreeC unless there is particular notice.
本発明のプライマーにおける前記条件（１）に示すように、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、３’末端ホモダイマーを形成することがないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−２．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定した３’末端ホモダイマーを形成することがないため、プライマーダイマーの生成が起こらない。 As shown in the above-mentioned condition (1) in the primer of the present invention, the partial base sequence derived from the long oligonucleotide in the primer of the present invention does not form a 3 ′ end homodimer or is complementary even if formed. The free energy of the 3 ′ end region for performing basic base pairing is −2.6 kcal / mol or more, preferably −2.1 kcal / mol or more, more preferably −1.6 kcal / mol or more. Since the primer of the present invention does not form a stable 3 'terminal homodimer, generation of primer dimer does not occur.
本発明のプライマーにおける前記条件（２）について、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列の最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−４．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定なホモダイマーを形成することがないため、アダプターに対する高いアニール効率を得ることができる。 Regarding the condition (2) in the primer of the present invention, when the most stable homodimer of the partial base sequence derived from the long oligonucleotide in the primer of the present invention is formed, the free energy in the homodimer, more specifically, The free energy in the longest base pair sequence among base pair sequences that do not contain mismatches and continuously form hydrogen bonds is −4.6 kcal / mol or more, preferably −4.1 kcal / mol or more. Yes, more preferably -3.6 kcal / mol or more. Since the primer of the present invention does not form a stable homodimer, high annealing efficiency for the adapter can be obtained.
本発明のプライマーにおける前記条件（３）について、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定なヘアピン構造をとることがないため、アダプターに対する高いアニール効率を得ることができる。 Regarding the condition (3) in the primer of the present invention, the partial base sequence derived from the long-chain oligonucleotide in the primer of the present invention does not form an intramolecular hairpin structure, or even if formed, the free energy in the hairpin structure is 0.8 kcal / mol or more. Since the primer of the present invention does not have a stable hairpin structure, high annealing efficiency for the adapter can be obtained.
本発明のプライマーにおいて、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列に由来する塩基配列の塩基長は、本発明のプライマーが満たすべき各種条件を満足する限り、特に限定されるものではないが、通常、１８〜３０塩基である。 In the primer of the present invention, the base length of the base sequence derived from the partial sequence of the long oligonucleotide constituting the adapter of the present invention is not particularly limited as long as various conditions to be satisfied by the primer of the present invention are satisfied. Usually, it is 18-30 bases.
本発明のプライマーは、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列のみからなることもできるし、あるいは、前記部分配列と、その５’末端に付加した付加配列（例えば、制限酵素認識部位を含む配列）とからなる配列であることもできる。本発明のプライマーを本発明のＬＭ−ＰＣＲ法におけるネステッドＰＣＲ工程に使用する場合、第１回ＰＣＲに用いるプライマーとしては［図１における工程（Ｄ）及びプライマーＡＰ１参照］、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列のみからなるプライマーが好ましく、第２回ＰＣＲに用いるプライマーとしては［図１における工程（Ｅ）及びプライマーＡＰ２参照］、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列と、その５’末端に付加した付加配列（例えば、制限酵素認識部位を含む配列）とからなるプライマーが好ましい。 The primer of the present invention may consist of only the partial sequence of the long oligonucleotide, or the partial sequence and an additional sequence (for example, a sequence containing a restriction enzyme recognition site) added to the 5 ′ end thereof. It can also be an array consisting of When the primer of the present invention is used in the nested PCR step in the LM-PCR method of the present invention, the primer used in the first PCR [see step (D) and primer AP1 in FIG. A primer consisting only of a partial sequence is preferable. As a primer used in the second PCR [see step (E) and primer AP2 in FIG. 1], the partial sequence of the long oligonucleotide and an addition added to the 5 ′ end thereof A primer consisting of a sequence (for example, a sequence containing a restriction enzyme recognition site) is preferred.
本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列における各塩基に関して、最隣接熱力学法（Breslauer,K.J., Frank,R., Blocker,H. and Marky,L.A. (1986) A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad.Sci.USA, 83, 37）により各塩基毎に決定される各自由エネルギー（ΔＧ値）について、プライマー全体を見渡した場合に、５’末端側領域の自由エネルギーが、３’末端側領域の自由エネルギーよりも低いことが好ましい。例えば、プライマーにおける５’末端側の１／３（より好ましくは１／２）の領域に含まれる各塩基の自由エネルギーの平均値が、プライマーにおける３’末端側の１／３（より好ましくは１／２）の領域に含まれる各塩基の自由エネルギーの平均値よりも低いことが好ましい。また、５’末端の自由エネルギーが低く、３’末端に行くに従って自由エネルギーが高くなり（すなわち、安定性が減少する）、３’末端では適当なΔＧ（例えば、−９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）より多少安定性の低い値で終了することが好ましい。 The partial nucleotide sequence derived from the long-chain oligonucleotide in the primer of the present invention is the nearest neighbor thermodynamic method (Breslauer, KJ, Frank, R., Blocker, H. and Marky, LA ( 1986) A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad. Sci. USA, 83, 37). When overlooked, it is preferable that the free energy of the 5 ′ end region is lower than the free energy of the 3 ′ end region. For example, the average value of the free energy of each base contained in the region of 1/3 (more preferably 1/2) on the 5 ′ end side of the primer is 1/3 (more preferably 1) on the 3 ′ end side of the primer. / 2) is preferably lower than the average value of the free energy of each base contained in the region. In addition, the free energy at the 5 ′ end is low, and the free energy increases (ie, the stability decreases) toward the 3 ′ end. From the appropriate ΔG (for example, −9.0 kcal / mol) at the 3 ′ end. It is preferable to end with a somewhat low stability value.
最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーに関して、プライマーにおける自由エネルギーが低い領域ほど、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合力が高くなるので、前記条件を満たすプライマーは、５’末端側領域の結合力が３’末端側領域の結合力よりも強くなる。ここで、ＰＣＲにより５’→３’方向のＤＮＡ合成が開始されるためには、プライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡと結合することが必須である。前記条件を満たすプライマーは、３’末端が鋳型ＤＮＡと結合する条件下では、当然、５’末端側領域も結合しており、従って、その全塩基配列に亘ってプライマーと鋳型ＤＮＡとが結合するため、配列特異性を向上させることができる。
一方、前記条件を満たさないプライマー、例えば、５’末端側領域の結合力が３’末端側領域の結合力よりも弱い場合には、３’末端が鋳型ＤＮＡと結合する条件下では、５’末端側領域が鋳型ＤＮＡと結合していない場合があり、この場合、３’末端側領域でのみ配列特異性を保証しているため、配列特異性が低い。
Regarding the free energy of each base determined by the nearest neighbor thermodynamic method, the lower the free energy in the primer, the higher the binding force between the primer and the template DNA. Is stronger than the binding force in the 3 ′ end region. Here, in order to initiate 5 ′ → 3 ′ direction DNA synthesis by PCR, it is essential that the 3 ′ end of the primer binds to the template DNA. A primer that satisfies the above conditions naturally also binds to the 5 ′ end region under conditions where the 3 ′ end binds to the template DNA, and thus the primer and the template DNA bind throughout the entire base sequence. Therefore, sequence specificity can be improved.
On the other hand, a primer that does not satisfy the above conditions, for example, when the binding force of the 5 ′ end region is weaker than the binding force of the 3 ′ end region, 5 ′ In some cases, the terminal region is not bound to the template DNA. In this case, the sequence specificity is guaranteed only in the 3 ′ terminal region, so that the sequence specificity is low.
本発明のアダプターを本発明のＬＭ−ＰＣＲ法に使用する場合、前記アダプターは、前記条件（１）〜（３）を満たす本発明のプライマー２種類と一緒に使用するため、前記アダプター自身が前記条件（１）〜（３）に相当する条件を満たすことが好ましい。
すなわち、本発明のアダプターは、本発明のアダプターに関する前記条件（Ａ）〜（Ｄ）に加えて、
（Ｅ）アダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドが、その塩基配列中に、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
部分塩基配列を、少なくとも２つ含む
ことが好ましい。
When the adapter of the present invention is used in the LM-PCR method of the present invention, the adapter is used together with two kinds of primers of the present invention that satisfy the conditions (1) to (3). It is preferable that the conditions corresponding to the conditions (1) to (3) are satisfied.
That is, the adapter of the present invention has the above-mentioned conditions (A) to (D) relating to the adapter of the present invention,
(E) The long oligonucleotide constituting the adapter is in its base sequence,
(1) The 3 ′ end homodimer is not formed, or even if it is formed, the free energy of the 3 ′ end region for performing complementary base pairing is −2.6 kcal / mol or more,
(2) When the most stable homodimer is formed, the free energy in the homodimer is −4.6 kcal / mol or more,
(3) It is preferable not to form an intramolecular hairpin structure or to include at least two partial base sequences having free energy in the hairpin structure of 0.8 kcal / mol or more.
本発明のアダプターは、本発明のアダプターに関する前記条件（Ａ）〜（Ｄ）［好ましくは前記条件（Ａ）〜（Ｅ）］を満たす限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる制限酵素の種類等に応じて適宜決定することができる。より具体的には、例えば、用いる制限酵素の認識部位の塩基配列等を考慮して、長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列を設計し、３’末端ホモダイマーの形成の有無、最も安定的なホモダイマーを形成させた場合の自由エネルギー、そして、分子内ヘアピン構造の形成の有無を検討することにより、長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列を絞り込むことができる。これらの項目の検討は、例えば、市販のソフトウェア（例えば、OLIGOTM Primer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いることにより、容易に判定することができる。得られた長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列から、更に、短鎖オリゴヌクレオチド及びプライマーを設計し、同様にして、各種条件を検討することにより、本発明のアダプターを形成する長鎖オリゴヌクレオチド及び短鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせ、並びに本発明のプライマーを取得することができる。 The adapter of the present invention is not particularly limited as long as the conditions (A) to (D) [preferably the conditions (A) to (E)] regarding the adapter of the present invention are satisfied. It can be appropriately determined according to the type of the above. More specifically, for example, considering the base sequence of the recognition site of the restriction enzyme to be used, a candidate base sequence of a long-chain oligonucleotide is designed, and the presence or absence of the 3 ′ end homodimer is formed, and the most stable homodimer is determined. By examining the free energy in the case of formation and the presence or absence of the formation of an intramolecular hairpin structure, candidate base sequences of long-chain oligonucleotides can be narrowed down. Examination of these items can be easily determined by using commercially available software (for example, OLIGO ™ Primer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.). From the candidate nucleotide sequences of the obtained long-chain oligonucleotides, short-chain oligonucleotides and primers are further designed, and various conditions are examined in the same manner, whereby the long-chain oligonucleotides and short-chains forming the adapter of the present invention are examined. Combinations of strand oligonucleotides as well as the primers of the present invention can be obtained.
本発明のアダプターの長鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｆと称する）を挙げることができる。配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆは、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（Ｉ）：
（３）式（II）：
(1) does not form a 3 ′ terminal homodimer,
(2) Formula (I):
(3) Formula (II):
本発明のアダプターの短鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｒ１と称する）又は配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｒ２と称する）を挙げることができる。 Examples of the short oligonucleotide of the adapter of the present invention include, for example, an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as RW-R1) or an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3. (Hereinafter referred to as RW-R2).
配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（III）：
（３）ヘアピン構造を形成しない。
The oligonucleotide RW-R1 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is
(1) does not form a 3 ′ terminal homodimer,
(2) Formula (III):
(3) Does not form a hairpin structure.
また、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（IV）：
（３）ヘアピン構造を形成しない。
The oligonucleotide RW-R2 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is
(1) does not form a 3 ′ terminal homodimer,
(2) Formula (IV):
(3) Does not form a hairpin structure.
本発明のアダプターとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１との組み合わせ（短鎖オリゴヌクレオチドであるＲＷ−Ｒ１の５’末端の塩基配列はＡＴＣ）、又は配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２との組み合わせ（短鎖オリゴヌクレオチドであるＲＷ−Ｒ２の５’末端の塩基配列はＴＡＧ）を挙げることができる。 As an adapter of the present invention, for example, a combination of an oligonucleotide RW-F having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide RW-R1 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (short-chain oligonucleotide) The base sequence at the 5 ′ end of RW-R1 is ATC), or the oligonucleotide RW-F consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide RW-R2 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (The base sequence at the 5 ′ end of RW-R2 which is a short-chain oligonucleotide is TAG).
本発明のプライマーとしては、例えば、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＷＰ１と称する）又は配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＷＰ２と称する）若しくは配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。配列番号４で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１番〜２２番までの塩基からなる配列に相当する。また、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４番〜３８番までの塩基からなる配列に相当し、配列番号５で表される塩基配列における３番〜１０番の塩基からなる配列は、制限酵素ＮｏｔＩの認識配列である。
As the primer of the present invention, for example, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as WP1) or an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (hereinafter referred to as WP2). Or the oligonucleotide containing the sequence | arrangement which consists of the 11th-35th base in the base sequence represented by
配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ１は、
（１）式（Ｖ）：
（２）式（VI）：
（３）ヘアピン構造を形成しない。
また、最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーを、図２に示す。図２に示す各ΔＧ値は、５塩基長のサブシークエンスブロック内の各塩基のΔＧ値の合計である（温度＝２５℃）。配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ１では、５’末端側領域における各塩基の自由エネルギーは概ね−９〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）の範囲内にあり、３’末端側領域における各塩基の自由エネルギーは概ね−６〜−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）の範囲内にあり、５’末端側領域における自由エネルギーは、３’末端側領域における自由エネルギーよりも低い。
Oligonucleotide WP1 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is
(1) Formula (V):
(2) Formula (VI):
(3) Does not form a hairpin structure.
Moreover, the free energy of each base determined by the nearest neighbor thermodynamic method is shown in FIG. Each ΔG value shown in FIG. 2 is the sum of the ΔG values of the bases in the 5-base-long subsequence block (temperature = 25 ° C.). In the oligonucleotide WP1 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, the free energy of each base in the 5 ′ terminal region is generally in the range of −9 to −10 kcal / mol (temperature = 25 ° C.), and 3 ′ The free energy of each base in the terminal region is approximately in the range of −6 to −7 kcal / mol (temperature = 25 ° C.), and the free energy in the 5 ′ terminal region is more than the free energy in the 3 ′ terminal region. Low.
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ２は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（VII）：
（３）ヘアピン構造を形成しない。
また、最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーを、図３に示す。
Oligonucleotide WP2 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is
(1) does not form a 3 ′ terminal homodimer,
(2) Formula (VII):
(3) Does not form a hairpin structure.
Moreover, the free energy of each base determined by the nearest neighbor thermodynamic method is shown in FIG.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《実施例１：植物ゲノムＤＮＡを試料とする公知ＤＮＡ配列の上流領域の単離及び配列決定》
本実施例では、以下に示す手順に従って、イネ（Oryza glaberrima；ゲノムサイズ＝４４０Ｍｂ）、タバコ（Nicotiana tabacum；ゲノムサイズ＝４，４３４Ｍｂ）、及びユリ（Lilium regale；ゲノムサイズ＝３１，０００Ｍｂ）由来のゲノムＤＮＡを試料とし、それぞれ、ζグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ζglutathione S-transferase；以下、ＧＳＴＺと略称する) 遺伝子（Genbank accession No. AB121668）、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase gene；以下、ＡＬＳと略称する）遺伝子（Genbank accession No. X07645）、及びＭＡＤＳボックス（MADS-box；以下、ＬＲＤＥＦと略称する）遺伝子（Genbank accession No. AB071378）の各上流領域を単離した。
<< Example 1: Isolation and sequencing of upstream region of known DNA sequence using plant genomic DNA as sample >>
In this example, according to the procedure shown below, derived from rice (Oryza glaberrima; genome size = 440 Mb), tobacco (Nicotiana tabacum; genome size = 4,434 Mb), and lily (Lilium regale; genome size = 31,000 Mb). Using genomic DNA as a sample, ζ-glutathione S-transferase (hereinafter abbreviated as GSTZ) gene (Genbank accession No. AB121668), acetolactate synthase gene (hereinafter abbreviated as ALS) gene, respectively (Genbank accession No. X07645) and each upstream region of a MADS-box (hereinafter abbreviated as LRDEF) gene (Genbank accession No. AB071378) were isolated.
（１）アダプター及びプライマーの設計及び調製
本実施例で使用したアダプター及びプライマー並びにその塩基配列を図４に示す。
本発明のアダプターとしては、長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆ（配列番号１）と短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１（配列番号２）との組み合わせからなるアダプター（以下、アダプター１と称する）、及び長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２（配列番号３）との組み合わせからなるアダプター（以下、アダプター２と称する）を使用した。アダプタープライマーとしては、本発明のプライマーであるプライマーＷＰ１（配列番号４）及びプライマーＷＰ２（配列番号５）を使用した。プライマーＷＰ２は、その５’末端にＮｏｔＩ認識配列を有する。
前記公知遺伝子に関する特異的プライマーとしては、イネＧＳＴＺ遺伝子についてはプライマーＧＳＴＺ１（配列番号６）及びプライマーＧＳＴＺ２（配列番号７）を、タバコＡＬＳ遺伝子についてはプライマーＡＬＳ１（配列番号８）及びプライマーＡＬＳ２（配列番号９）を、ユリＬＲＤＥＦ遺伝子についてはプライマーＤＥＦ１（配列番号１０）及びプライマーＤＥＦ２（配列番号１１）を使用した。
長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆの５’末端を脱リン酸化し、短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１及びＲＷ−Ｒ２の各３’末端の水酸基を一級アミノ基でブロッキングした。
(1) Design and preparation of adapters and primers FIG. 4 shows the adapters and primers used in this example and their base sequences.
The adapter of the present invention includes an adapter (hereinafter referred to as adapter 1) composed of a combination of a long oligonucleotide RW-F (SEQ ID NO: 1) and a short oligonucleotide RW-R1 (SEQ ID NO: 2), and a long chain. An adapter (hereinafter referred to as adapter 2) composed of a combination of oligonucleotide RW-F and short oligonucleotide RW-R2 (SEQ ID NO: 3) was used. As the adapter primer, primer WP1 (SEQ ID NO: 4) and primer WP2 (SEQ ID NO: 5), which are primers of the present invention, were used. Primer WP2 has a NotI recognition sequence at its 5 ′ end.
Specific primers relating to the known gene include primer GSTZ1 (SEQ ID NO: 6) and primer GSTZ2 (SEQ ID NO: 7) for rice GSTZ gene, primer ALS1 (SEQ ID NO: 8) and primer ALS2 (SEQ ID NO: 8) for tobacco ALS gene. 9) For the lily LRDEF gene, primer DEF1 (SEQ ID NO: 10) and primer DEF2 (SEQ ID NO: 11) were used.
The 5 ′ end of the long oligonucleotide RW-F was dephosphorylated, and the hydroxyl group at each 3 ′ end of the short oligonucleotides RW-R1 and RW-R2 was blocked with a primary amino group.
（２）ゲノムＤＮＡ試料の調製と各種酵素処理（制限酵素消化、部分的末端充填、及びアダプター連結）
各植物由来のゲノムＤＮＡは、ＣＴＡＢ法［Rogers, O. S. and J. A. Bendich (1988) Extraction of DNA from plant tissues. In: Gelvin, S.B., R.A. Schiliperoort and D.P.S. Verma (eds.) Plant molecular biology manual. Kluwer Academic Pulblishers, Dordrecht Boston London A6:1-10.］により、各植物から抽出した。
(2) Preparation of genomic DNA samples and various enzyme treatments (restriction enzyme digestion, partial end filling, and adapter ligation)
Genomic DNA derived from each plant is obtained by the CTAB method [Rogers, OS and JA Bendich (1988) Extraction of DNA from plant tissues. In: Gelvin, SB, RA Schiliperoort and DPS Verma (eds.) Plant molecular biology manual. Kluwer Academic Pulblishers , Dordrecht Boston London A6: 1-10.].
イネゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）、タバコゲノムＤＮＡ（４００ｎｇ）、ユリゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）を、それぞれ、各制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，ＢｃｌＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＳｐｅＩ，ＮｈｅＩ，又はＸｂａＩ）１０ユニットにより３７℃（ＢｃｌＩのみ５５℃）で６時間反応させることにより、完全に消化した。これらの制限酵素は、すべて、４塩基の５’突出末端を生じさせた。
Rice genomic DNA (200 ng), tobacco genomic DNA (400 ng), and lily genomic DNA (500 ng) were converted to 37 ° C. (BclI only 55) by 10 units of each restriction enzyme (BamHI, BglII, BclI, Sau3AI, SpeI, NheI, or XbaI), respectively. C.) for 6 hours to complete digestion. All of these restriction enzymes produced a 4
得られた各反応液の内、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（以下、ＧＡＴＣ型制限酵素と称する。具体的には、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩ）で消化した反応液については、ｄＧＴＰの存在下にて、クレノウ酵素（３’→５’ｅｘｏ−；NEW ENGLAND）１ユニットにより部分的な充填（fill in）反応を実施した。また、塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（以下、ＣＴＡＧ型制限酵素と称する。具体的には、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、又はＸｂａＩ）で消化した反応液については、ｄＣＴＰの存在下にて、クレノウ酵素（３’→５’ｅｘｏ−）１ユニットにより部分的な充填（fill in）反応を実施した。 Among the obtained reaction solutions, digestion was performed with a restriction enzyme (hereinafter referred to as GATC type restriction enzyme, specifically BamHI, BglII, BclI, or Sau3AI) that generates a 5 ′ protruding end consisting of the base sequence GATC. The reaction solution was partially filled in with 1 unit of Klenow enzyme (3 ′ → 5′exo − ; NEW ENGLAND) in the presence of dGTP. A reaction solution digested with a restriction enzyme (hereinafter referred to as CTAG type restriction enzyme, specifically SpeI, NheI, or XbaI) that generates a 5 ′ protruding end consisting of the base sequence CTAG is in the presence of dCTP. The partial fill in reaction was carried out with 1 unit of Klenow enzyme (3 ′ → 5′exo − ).
充填反応を実施した後、各反応液を７５℃で２０分間加熱することにより、クレノウ酵素活性を失活させた。
ＧＡＴＣ型制限酵素で処理した反応液については、前記実施例１（１）で調製したアダプター１（ＲＷ−Ｆ及びＲＷ−Ｒ１が各々１００ｐｍｏｌ）と市販のライゲーションキット（Ligation high；TOYOBO）とを用いて１５時間反応させることにより、部分的に末端を充填された制限酵素断片化ＤＮＡと前記アダプター１とを連結させた。
一方、ＣＴＡＧ型制限酵素で処理した反応液については、前記実施例１（１）で調製したアダプター２（ＲＷ−Ｆ及びＲＷ−Ｒ２が各々１００ｐｍｏｌ）と市販のライゲーションキット（Ligation high；TOYOBO）とを用いて１５時間反応させることにより、部分的に末端を充填された制限酵素断片化ＤＮＡと前記アダプター２とを連結させた。
After carrying out the filling reaction, the Klenow enzyme activity was deactivated by heating each reaction solution at 75 ° C. for 20 minutes.
For the reaction solution treated with the GATC type restriction enzyme, the
On the other hand, for the reaction solution treated with the CTAG type restriction enzyme, the
（３）ネステッドＰＣＲ、クローニング、及び配列決定
前記実施例１（２）で得られた、アダプター連結ＤＮＡ断片を含有する各反応液から１μＬを取り、それらを水１００μＬでそれぞれ希釈したものを、以下の第１回ＰＣＲの鋳型として使用した。第１回ＰＣＲは、実施例１（１）で調製した各特異的プライマー（ＧＳＴＺ１、ＡＬＳ１、又はＤＥＦ１）とプライマーＷＰ１との組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼ（KOD DNA polymerase；TOYOBO）とを使用して実施した。また、ＰＣＲ条件としては、ホットスタート法を採用し、変性処理（９４℃、２分間）の後、９４℃（３０秒間）、６５℃（３０秒間）、及び６８℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。
(3) Nested PCR, Cloning, and
第１回ＰＣＲを実施して得られた各反応液から１μＬをとり、それぞれ５０倍希釈したものを、次の第２回ＰＣＲの鋳型として使用した。第２回ＰＣＲは、実施例１（１）で調製した各特異的プライマー（ＧＳＴＺ２、ＡＬＳ２、又はＤＥＦ２）とプライマーＷＰ２との組み合わせを使用したこと、そして、ＰＣＲのサイクルを３０回としたこと以外は、第１回ＰＣＲと同様にして実施した。 1 μL of each reaction solution obtained by carrying out the first PCR was diluted 50 times and used as a template for the next second PCR. The second PCR was performed using a combination of each specific primer (GSTZ2, ALS2, or DEF2) prepared in Example 1 (1) and the primer WP2, and the PCR cycle was 30 times. Was performed in the same manner as the first PCR.
得られた各反応液を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドを可視化した。
前記電気泳動の結果を図５（イネ）、図６（タバコ）、及び図７（ユリ）にそれぞれ示す。図５〜図７において、レーン１〜レーン７は、それぞれ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、及びＸｂａＩを制限酵素として用いた場合の結果である。図５及び図６におけるレーンＭは分子量マーカーであり、図７におけるレーンＭ１及びＭ２は、それぞれ、φX174/HaeIII 分子量マーカー及びλDNA/HindIII 分子量マーカーである。
Each reaction solution obtained was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and DNA bands were visualized by ethidium bromide staining.
The results of the electrophoresis are shown in FIG. 5 (rice), FIG. 6 (cigarette), and FIG. 7 (lily), respectively. 5 to 7,
得られたＤＮＡバンドを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、pBluescript SK(-) プラスミドベクターのＨｉｎｃII及びＮｏｔＩ部位間に連結した。各ＤＮＡバンドの塩基配列を、それぞれの両端から、ＤＮＡシークエンサー（ABI PRISMTM 3100 DNA sequencer）を用いて決定した。 The resulting DNA band was digested with the restriction enzyme NotI and ligated between the HincII and NotI sites of the pBluescript SK (−) plasmid vector. The base sequence of each DNA band was determined from both ends using a DNA sequencer (ABI PRISM ™ 3100 DNA sequencer).
イネ及びタバコについては、得られたＤＮＡバンドの３’末端領域の塩基配列と、公知ＤＮＡ配列（イネＧＳＴＺ遺伝子又はタバコＡＬＳ遺伝子）の５’末端領域の塩基配列とが完全に一致した。
ユリについて比較した結果を図８に示す。得られたＤＮＡバンドの３’末端領域の塩基配列（図８において記号ＰＲＯで示す配列）と、公知ＤＮＡ配列（ユリＬＲＤＥＦ遺伝子）の５’末端領域の塩基配列（図８において記号ＤＥＦで示す配列）とが、一塩基を除いて一致した。
これらの結果から明らかなように、イネ及びタバコだけでなく、全生物中、最も巨大なゲノムサイズを有する生物の１つであるユリからも、公知ＤＮＡ配列の隣接領域をクローニングすることができた。
For rice and tobacco, the base sequence of the 3 ′ end region of the obtained DNA band completely matched the base sequence of the 5 ′ end region of a known DNA sequence (rice GSTZ gene or tobacco ALS gene).
FIG. 8 shows the result of comparison on the lily. The base sequence of the 3 ′ end region of the obtained DNA band (sequence indicated by the symbol PRO in FIG. 8) and the base sequence of the 5 ′ end region of the known DNA sequence (lily LRDEF gene) (sequence indicated by the symbol DEF in FIG. 8) ) Matched with the exception of one base.
As is clear from these results, the flanking region of the known DNA sequence could be cloned not only from rice and tobacco, but also from lily, one of the largest genomes in all organisms. .
本発明のアダプター及びプライマーは、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離（例えば、染色体ウォーキング）の用途に適用することができる。 The adapter and primer of the present invention can be applied to the use of isolation of adjacent regions of a known DNA sequence (for example, chromosome walking).
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１〜５で表される各塩基配列は、それぞれ、アダプターＲＷ−Ｆ、アダプターＲＷ−Ｒ１、アダプターＲＷ−Ｒ２、プライマーＷＰ１、及びプライマーＷＰ２である。 The numerical heading <223> in the sequence listing below describes the “Artificial Sequence”. Each base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 5 is an adapter RW-F, an adapter RW-R1, an adapter RW-R2, a primer WP1, and a primer WP2.
Claims (6)
（１）ＤＮＡ試料を、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）により生成した各ＤＮＡ断片の５’突出末端を、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する工程、
（３）前記工程（２）により得られた各ＤＮＡ断片に、配列番号１で表される塩基配列からなる長鎖オリゴヌクレオチドと、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなる短鎖オリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチドアダプターを連結する工程、
（４）前記工程（３）により得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列と、その５’末端に付加した制限酵素認識部位を含む配列とからなるオリゴヌクレオチドプライマー、あるいは、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、前記公知ＤＮＡ配列に特異的なプライマー２種類とを用いて、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程
を含むことを特徴とする、前記単離方法。 A method for isolating adjacent regions of a known DNA sequence comprising:
(1) digesting a DNA sample with a restriction enzyme that produces a 5 ′ overhang,
(2) a step of partially filling the 5 ′ protruding end of each DNA fragment generated by the step (1) with deoxyribonucleoside 5′-triphosphate,
(3) Each DNA fragment obtained by the step (2) is divided into a long oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a short sequence consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. Linking an oligonucleotide adapter comprising a strand oligonucleotide,
(4) Using each DNA fragment obtained in the step (3) as a template, an oligonucleotide primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and Nos. 11 to 35 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 An oligonucleotide primer comprising a sequence consisting of a base number and a sequence containing a restriction enzyme recognition site added to the 5 ′ end, or consisting of bases 11 to 35 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 The said isolation method characterized by including the process of performing a nested polymerase chain reaction using the oligonucleotide primer which consists of a sequence | arrangement, and two types of primers specific for the said well-known DNA sequence.
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