JP4601264B2 - 大腸菌におけるBsaI制限エンドヌクレアーゼ及びBsaIメチラーゼのクローニング及び発現方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、BsaI制限エンドヌクレアーゼ(BsaIエンドヌクレアーゼ又はBsaI)並びにBsaIメチルトランスフェラーゼ(BsaIメチラーゼ、M.BsaIA及びM.BsaIB、又はM.BsaIAB)をコードする組換えDNA、並びに該組換えDNAを含有する大腸菌細胞におけるBsaIエンドヌクレアーゼ及びBsaIメチラーゼの発現に関する。
【0002】
【従来の技術】
BsaIエンドヌクレアーゼは、Bacillus stearothermophilus(バチラス・ステアロサーモフィルス)6−55(ニューイングランド・バイオラボズの株収集#481;マサチューセッツ州バーバリ)株に見出される。 それは、2本鎖DNA配列5’GGTCTC3’N1/N5に結合し、N1(上の鎖)及びN5(下の鎖)にて下流の配列を切断し、4塩基5’側にはみ出した末端を生じる(/ホスホジエステル結合の切断を指す)。BsaIメチラーゼ(M.BsaIA及びM.BsaIB)も同じ株に見出される。M.BsaIAは、下の鎖(5’GAGACC3’)のアデニンを修飾するアデニンメチラーゼであると思われる。M.BsaIBは、C5メチラーゼであり、BsaI部位の上の鎖を修飾するものと思われる。
【0003】
II型制限エンドヌクレアーゼは細菌及び一部のウイルス中に自然に存在する酵素の部類である。制限エンドヌクレアーゼは、他の細菌/ウイルスタンパク質から単離した場合には、実験室において分子クローニングや遺伝子の特性分析のためにDNA分子を小さな断片に切断するのに使用することができる。
【0004】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子上の特定のヌクレオチドの配列(「制限配列」)を認識し、結合する。いったん結合すると、それらは、認識配列の中で(例えば、BamHI)、一方の側で(例えば、SapI)、又は両側で(例えば、TspRI)分子を切断する。異なった制限エンドヌクレアーゼは異なった認識配列に対して親和性を有する。今日までに調べられた何百もの細菌種の中で、独特の特異性を持つ211を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている(例えば、非特許文献1参照。)。
【0005】
制限エンドヌクレアーゼは一般的にはそれが発見された細菌に基づいて命名される。従って、例えば、Deinococcus radiophilus種は、DraI、DraII、及びDraIIIと命名された3つの異なった制限エンドヌクレアーゼを生じる。このような酵素はそれぞれ、配列5’TTT/AAA3’、5’PuG/GNCCpy3’及び5’CACNNN/GTG3’を認識する。一方、Escherichia coliRY13は、配列5’G/AATTC3’を認識するたった1つの酵素、EcoRIしか生じない。
【0006】
細菌/ウイルスの制限−修飾(R−M)システムの第2の構成成分は、メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌がそれ自体のDNAを保護し、外来DNAから区別することができる手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、それに結合するが、DNAを切断する代わりに、メチル基を付加することによって配列の中で特定のヌクレオチドを1つ化学的に修飾する(C5メチルシトシン、N4メチルシトシン、又はN6メチルアデニン)。メチル化の後、その認識配列は同起源の制限エンドヌクレアーゼによってはもはや切断されない。細菌細胞のDNAは、修飾メチラーゼの活性化によって常に完全に修飾されている。従って、DNAは内在性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感応性である。修飾されていない、従って識別可能な外来のDNAだけが制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感応性がある。DNA複製の間及びその後では、通常、半メチル化されたDNA(一方の鎖でメチル化されたDNA)は、同起源の制限消化に対しても抵抗性がある。
【0007】
組換えDNA技術の進歩によって、今や、遺伝子をクローン化し、酵素を大量に過剰生産することが可能である。10−3〜10−4の低い頻度で存在する場合、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、ゲノムのDNAライブラリ、すなわち、ショットガン法に由来するクローンの集団の中で、かかるクローンを識別するための効率的な方法を開発することである。好ましくは、望ましい稀少なクローンが生き残る一方で、非メチラーゼ挿入を伴った望ましくないクローンが破壊されるように、該方法は選択されるべきである。
【0008】
多数のII型制限修飾システムがクローン化されている。最初のクローニング方法では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定する又は選択する手段としてバクテリオファージの感染が用いられた(EcoRII:例えば、非特許文献2参照。HhaII:例えば、非特許文献3参照。PstI:例えば、非特許文献4参照。)。細菌における制限−修飾システムの発現によって細菌は、バクテリオファージによる感染に抵抗することが可能になるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を持つ細胞は、原則として、ファージにさらされたゲノムDNAライブラリからの生き残りとして選択的に単離される。しかしながら、この方法では成功率が限定されることが判った。具体的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、選択的生き残りを達成するために十分なファージ抵抗性を必ずしも与えないことが判明した。
【0009】
もう1つのクローニングへのアプローチには、当初、プラスミド由来の大腸菌にクローニングするベクターとして特徴付けされた転移システムが関与する(EcoRV:例えば、非特許文献5参照。PaeR7:例えば、非特許文献6、非特許文献7参照。例えば、非特許文献8参照。Tsp45I:例えば、非特許文献9参照。)。
【0010】
第3のアプローチは、メチラーゼ遺伝子の活性発現について選択することである(メチラーゼ選抜)[例えば、特許文献1及び非特許文献10(BsuRI)参照。]。制限−修飾遺伝子は互いに密着していることが多いので、両遺伝子を同時にクローニングできることが多い。この選抜によって必ずしも完全な制限システムが得られるとは限らないが、しかし、その代わりメチラーゼ遺伝子だけが得られる(BspRI:例えば、非特許文献11参照。BcnI:例えば、非特許文献12参照。BsuRI:例えば、非特許文献13参照。MspI:例えば、非特許文献14参照。)。
【0011】
ごく最近の方法として、dinD::lacZ融合を含んだ大腸菌の指示株に基づいて大腸菌の中に熱安定性の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする、「エンドブルー法」が開示されている(例えば、特許文献2及び非特許文献15参照。)。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによって誘発されたDNAの損傷に続く大腸菌のSOS反応シグナルを利用する。この方法によって多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子(TaqI、Tth111I、BsoBI、Tfヌクレアーゼ)がクローニングされている(特許文献2参照。)。この方法の欠点は、同起源のメチラーゼ遺伝子を欠如するために、場合によっては制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する陽性の青色クローンを培養するのが難しいということである。
【0012】
修飾される位置及び塩基に基づいて主として3群のDNAメチラーゼがある(C5シトシンメチラーゼ、N4シトシンメチラーゼ、及びN6アデニンメチラーゼ)。N4シトシンメチラーゼ及びN6アデニンメチラーゼは、アミノ−メチルトランスフェラーゼである(例えば、非特許文献16参照。)。メチラーゼによってDNAにおける制限部位が修飾される(メチル化される)と、それは、同起源の制限エンドヌクレアーゼによる消化に抵抗性となる。同起源ではないメチラーゼによるメチル化によっても、制限消化に対してDNA部位を抵抗性にすることができることがある。例えば、Dcmメチラーゼの5’CCWGG3’(W=A又はT)の修飾によってPspGIの制限消化に対してDNAを抵抗性にすることができる。もう1つの例は、CpGメチラーゼはCGの2ヌクレオチドを修飾し、NotI消化に対してNotI部位(5’GCGGCCGC3’)を不応性にすることができる(ニューイングランドバイオラボズのカタログ2000−01の220ページ;マサチューセッツ州、バーバリ)。従って、特定のDNA配列を修飾して、制限酵素によってそれを切断できないようにするツールとしてメチラーゼを使うことができる。
【0013】
II型メチラーゼ遺伝子は多数の配列決定された細菌ゲノム(GenBank、http://www.ncbi.nlm.nih.gov;及びRebase、http://rebase.neb.com/rebase)に見出されている。メチラーゼ遺伝子に隣接するORFの直接クローニング及び過剰発現によって新規の特異性を持った制限酵素が得られた(例えば、非特許文献17参照。)。新しいII型の制限酵素及びメチラーゼ及びそれらのイソ制限酵素をスクリーニング/クローニングする新しい方法として微生物ゲノムの掘り起こしが浮かんだ。
【0014】
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組換え分子を創る有用なツールなので、組換えDNA技術を介して大量の制限酵素を生産する細菌株を入手するための強い商業的関心がある。かかる過剰発現株は、酵素の精製作業も簡略化するはずである。
【0015】
【非特許文献1】
Roberts and Macelis,Nucl.Acids Res.,27:312-313,1999
【非特許文献2】
Kosykh et al.,Mol.Gen.Genet.,178:717-719,1980
【非特許文献3】
Mann et al.,Gene 3:97-112,1978
【非特許文献4】
Walder et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,78:1503-1507,1981
【非特許文献5】
Bougueleret et al.,Nucl.Acids Res.,12:3659-3676,1984
【非特許文献6】
Gingeras and Brooks,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 80:402-406,1983
【非特許文献7】
Theriault and Roy,Gene 19:355-359,1982
【非特許文献8】
PvuII:Blumenthal et al.,J.Bacteriol.,164:501-509,1985
【非特許文献9】
Wayne et al.,Gene 202:83-88,1997
【非特許文献10】
Kiss et al.,Nucl.Acids Res.,13:6403-6421,1985
【非特許文献11】
Szomolanyi et al.,Gene 10:219-225,1980
【非特許文献12】
Janulaitis et al.,Gene 20:197-204,1982
【非特許文献13】
Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119,1983
【非特許文献14】
Walder et al.,J.Biol.Chem.,258:1235-1241,1983
【非特許文献15】
Fomenkov et al.,Nucl.Acids Res.,22:2399-2403,1994
【非特許文献16】
Malone et al.,J.Mol.Biol.,253:618-632,1995
【非特許文献17】
Kong et al.,Nucl.Acids Res.,28:3216-3223,2000
【特許文献1】
米国特許第5,200,333号
【特許文献2】
米国特許第5,498,535号
【0016】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、BsaI制限エンドヌクレアーゼ並びにBsaIメチラーゼをコードする組換えDNAと、該組換えDNAを含んでなる大腸菌細胞を用いたBsaIエンドヌクレアーゼ及びBsaIメチラーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【0017】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ゲノムDNAから逆PCR及び直接PCRによる増幅によってバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)6−55に由来するBsaI制限エンドヌクレアーゼ(bsaIR)を大腸菌でクローニングする方法に関する。逆PCRのプライマー配列は、メチラーゼ選抜に由来するBsaIメチラーゼ遺伝子(bsaIMB)に基づく。
標準のメチラーゼ選抜法によってbsaIM遺伝子をクローニングするのは難しいことが判明した。修飾されたクローニングベクターpRRS(ApR)を用いてApoI、Sau3AI及びNlaIIIの部分ゲノムDNAライブラリを構築した。BsaI処理とメチラーゼ選抜の結果、メチラーゼ陽性クローンは同定されなかった。選抜効率を高めるためにBsaI消化の後に第2段階として緑豆ヌクレアーゼ処理を行なうことにより、DNA末端を破壊し、β−ラクタマーゼ遺伝子を不活化した。この追加工程によってメチラーゼ選抜の効率は高められ、20のBsaI抵抗性クローンを生じた。
【0018】
特に、R−Mシステムでは、制限遺伝子は普通、同起源のメチラーゼ遺伝子の近傍に位置するので、逆PCRを用いて、bsaIMB遺伝子を取り囲む隣接するDNAをクローニングした。bsaIMB遺伝子の両側でオープンリーディングフレーム(ORF)を同定した。第2のメチラーゼ遺伝子が上流で見出され、制限遺伝子が下流で見い出された。
【0019】
BsmAI部位(5’GTCTC)は、BsaI部位(5’GGTCTC)と重なり合い、M.BsmAIは、BsaIの消化から大腸菌の染色体DNAを保護している。大腸菌においてbsaIR遺伝子を発現させるために、同起源ではないメチラーゼ遺伝子、bsmAIM遺伝子(M1::M2融合)を先ずpBR322にクローニングし、T7を発現する宿主ER2566を事前に修飾した。bsaIR遺伝子をPCRで増幅し、適合する末端でpACYC−T7terに連結し、事前に修飾した宿主ER2566を形質転換した[pBR322−BsmAIM]。形質転換体を培養し、IPTG誘導の細胞抽出物にてBsaIエンドヌクレアーゼ活性を検出した。高いBsaI活性を持つ3つのクローンを配列決定し、クローン#5が野生型配列を含むことを確認した。
【0020】
同起源のメチラーゼ遺伝子を用いてさらに2つの発現株を構築した;ER2566[pBR−BsaIMA&B,pACYC−T7ter−BsaIR]又はER2683[pACYC−BsaIMA&B,pUC19−BsaIR]。細胞の湿重量グラム当りさらなるBsaI単位を生じた株はなかった。従って、同起源ではないメチラーゼで修飾した株、ER2566[pBR322−BsmAIM1M2,pACYC−T7ter−BsaI]をBsaI産生株として用いた。
【0021】
【発明の実施の形態】
ApoI、Sau3AI及びNlaIIIのゲノムDNAライブラリからM.BsaI陽性クローンを単離するのは困難であった。ApoI、Sau3AI及びNlaIIIのプラスミドDNAライブラリをBsaIで処理した後、消化したDNAをER2502に導入してM.BsaI陽性クローンをスクリーニングした。しかしながら、36のApR生き残りをスクリーニングした後、M.BsaI陽性クローンは同定されなかった。BsaIの処理効率を高め、形質転換のバックグランドを減らすために、BsaIで消化したDNAをさらに緑豆ヌクレアーゼで処理した。このヌクレアーゼは末端の4塩基を外し、β−ラクタマーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームのシフトを生じるので、ApR遺伝子を不活化する。この戦略はbsaIMB遺伝子のクローニングで上手く行くことが判った。
【0022】
下記の工程に従って、大腸菌においてbsaIMA、bsaIMB、及びbsaIRの遺伝子がより好ましくクローニングされ、発現する方法を以下に示す。
【0023】
[1]ゲノムDNAライブラリの構築及びメチラーゼ選抜
Bacillus stearothermophilus(バチラス・ステアロサーモフィルス)6−55からゲノムDNAを調製し、制限酵素、ApoI、Sau3AI及びNlaIIIで消化した。2つのBsaI部位で修飾したpRRSベクターを用いてゲノムDNAライブラリを構築した。連結したDNAを形質転換により、制限マイナス大腸菌ER2502コンピテント細胞に導入した。およそ104の形質転換体をプールして0.5L培養で一晩増殖させた。キアゲンマキシ(Qiagen Maxi)カラムにより1次プラスミドDNAライブラリを調製し、BsaI及び緑豆ヌクレアーゼで処理した。消化に続いて、プラスミドをER2502に導入した。ApRの生き残りからプラスミドを調製し、BsaI消化に対する抵抗性についてスクリーニングした。抵抗性クローンは、DNAの配列決定により真のメチラーゼ陽性クローンとして同定された。pUC19プライマーと特製のプライマーによって挿入物全体の配列決定を行った。1188bpのORFが1つ見出され、bsaIMBと命名され、予測分子量44.4kDaを持つ395個のアミノ酸をコードしていた。M.BsaIBは、その他のC5メチラーゼと広範な相同性を示した。しかしながら、保存されたモチーフIX及びXは、C末端の代わりにN末端に位置している。逆PCRを用いて、隣接するDNA配列を増幅した。5回の逆PCRの後、さらに2つの遺伝子が同定された。上流の遺伝子、BsaIMAは、1710bpであり、65.7kDaの予測分子量を持つアミノ−メチルトランスフェラーゼ(569アミノ酸)をコードしている。
【0024】
[2]逆PCRによるbsaIR遺伝子のクローニング
bsaIMB遺伝子のDNA配列に基づいて逆PCRのプライマーを作製した。4〜6塩基の認識配列を持つ制限酵素でゲノムDNAを消化し、自己連結した。逆PCRの鋳型として環状DNA分子を用いた。bsaIMBの下流の逆PCR産物を得て、ゲル精製し、配列を決定した。bsaIMB遺伝子の下流に1635bpのORFを見出した。このORFをbsaIR遺伝子と命名した。それは、予測分子量63.7kDaを持つ544のアミノ酸をコードしている。
【0025】
[3]事前修飾した宿主を構築するための、pBR322へのbsmAIM遺伝子のクローニング
BsmAIの認識配列(5’GTCTC’)はBsaIの認識配列(5’GGTCTC3’)と重なり合うので、M.BsmAIはBsaIの消化に対して、大腸菌の染色体DNA及びプラスミドDNAを交叉保護する。先ず、M.BsaAIを過剰発現させ、予め修飾された発現宿主を構築する努力が払われた(2001年9月20日に出願され、受理された米国特許出願番号09/957,005のBsmAIの制限−修飾)。
【0026】
2つのプライマーを用いたPCRによりゲノムDNAからbsmAIM遺伝子を増幅した。PCRのDNAをNheI及びSphIで消化し、適合する末端にてpBR322に連結した。大腸菌におけるbsaIR遺伝子の過剰発現のために、予め修飾した宿主ER2566[pBR322−BsmAIM]を用いた。
【0027】
[4]T7発現ベクター、pACYC−T7terにおけるbsaIR遺伝子の発現
bsaIR遺伝子を含有するBamHI断片をpACYC−T7ter発現ベクターにクローニングした。連結したDNAを予め修飾した宿主、ER2566[pBR322−BsmAIM]に形質転換により導入した。ApRCmR形質転換体を培養し、IPTGで誘導した。IPTG誘導した細胞抽出物の上清にて組換えBsaIの活性が検出された。高いBsaI活性を持つそれらのクローンからプラスミドを抽出した。挿入物の配列を決定した後、野生型配列を持つクローンを安定性試験及びBsaIエンドヌクレアーゼの精製に用いた。
【0028】
[5]同起源のメチラーゼで修飾した宿主におけるbsaIR遺伝子の発現
同起源のメチラーゼ遺伝子を用いて第2の発現株:ER2566[pBR−BsaIMA&B,pACYC−T7ter−BsaIR]を構築した。この発現クローンからの組換えBsaIの収量は、細胞の湿重量のg当り0.7〜1.4×106単位のBsaIと概算された。第1の発現株、ER2566[pBR322−BsmAIM1M2,pACYC−T7ter−BsaIR]は、細胞の湿重量のg当り1.0〜2.0×106単位のBsaIを生じる。bsaIMA及びbsaIMBの遺伝子がpACYC184から発現され、bsaIR遺伝子がpUC19か発現される第3の発現株:ER2683[pACYC−BsaIMA&B,pUC19−BsaIR]も構築した。この株も細胞の湿重量g当りさらに少ないBsaI単位を生じた。従って、BsaI産生株として、前記[4]に記載される株ER2556[pBR322−BsmAIM1M2,pACYC−T7ter−BsaI]を用いた。
【0029】
[6]BsaI制限エンドヌクレアーゼの精製
大腸菌のタンパク質を変性させるために55℃にて1時間、加熱処理を行うことによって、組換えBsaIエンドヌクレアーゼを含有するIPTG誘導した細胞抽出物を精製した。遠心により熱変性したタンパク質を取り除いた。ヘパリン−セファロース及びDEAEセルロースのカラムを介したクロマトグラフィによってBsaI活性を持つ上清をさらに精製した。精製したBsaIタンパク質をSDS−PAGEで分析し、組換えBsaIタンパク質のN末端の配列を決定して最初の20のアミノ酸残基を得た。実際のアミノ酸配列は、DNAのコーディング配列に基づいて予測されたアミノ酸配列に完全に一致していた。
【0030】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。本実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるのであって、その限定として解釈されるものではない。
上記及び以下で引用される参考文献は、参考として本明細書に組み入れられる。
【0031】
実施例1 大腸菌におけるBsaI制限−修飾システムのクローニング
(1)ゲノムDNAの調製及びゲノムDNAの制限消化及びゲノムDNAライブラリの構築
以下の工程から成る常法に従って、Bacillus stearothermophilus(バチラス・ステアロサーモフィルス)6−55(ニューイングランド・バイオラボズのコレクション#481;マサチューセッツ州バーバリ)からゲノムDNAを調製した。:
a)リゾチーム(最終2mg/ml)、スクロース(最終1%)及び50mMのトリス−HCl(pH8.0)の添加による細胞溶解
b)10%SDS(最終濃度0.1%)の添加による細胞溶解
c)1%のトリトンX−100及び62mMのEDTA、50mMのトリス−HCl(pH8.0)の添加によるさらなる細胞溶解
d)フェノール−CHCl3によるDNAの抽出3回(等容量)及びCHCl3による抽出1回
e)4リットルのTE緩衝液に対するDNA透析3回
f)RNA分解酵素処理によるRNAの除去、及び95%エタノールによるゲノムDNAの沈殿、70%エタノールによる洗浄、真空乾燥及びTE緩衝液中への再懸濁。
【0032】
繰り返し2倍希釈によって制限酵素ApoIを希釈した。種々の量のApoI(2、1、0.5、0.25、0.125、0.061単位)により50℃にて30分間、9mgのゲノムDNAを部分的に消化した。0.5、0.25及び0.125単位のApoIで良好な部分消化が達成された。3〜10kbの範囲の、ApoIで部分消化したゲノムDNA断片をゲル精製して、適合する末端にてCIP処理したpRRSベクターに連結した。pRRSベクターは、SspI部位にBsaIリンカーを挿入することにより修飾されている。この修飾の目的は、メチラーゼ選抜の効率を高めるためである。ゲノムDNAにおける部分消化はSau3AI及びNlaIIIによっても行った(Sau3AIの2、1、0.5、0.25、0.125、0.061単位及びNlaIIIの0.12、0.06、0.03、0.015、0.0075単位)。再び、3〜10kbの範囲のDNA断片をゲル精製し、それぞれBamHI及びSphIで消化したpRRSに連結した。連結したDNAをエレクトロポレーションによりER2502細胞を電気的コンピテント細胞に形質転換するのに用いた。Apプレート(100μg/mlAp)上でApR形質転換体を選抜した。
【0033】
(2)メチラーゼ選抜法によるbsaIMBのクローニング
ApoI、NlaIII、及びSau3AIのライブラリから10,000を超えるApR形質転換体が得られた。 コロニーをすべてプールして1リットルのLB+Ap中にて一晩培養して増殖させた。キアゲンマキシ−プレップキット(Qiagen Maxi-prep kit)によってプラスミドDNAを調製した。100単位のBsaIを50℃にて2時間、0.8ng〜0.2mgのライブラリDNAで処理した。処理したプラスミドDNAを用いてER2502を再形質転換し、Apプレート上で平板培養した。生き残りのApR形質転換体を選抜した。36のコロニーを2mlのLB+Apに接種し、一晩培養した。キアゲンスピンカラムによってプラスミドDNAを調製し、BsaIの消化に対する抵抗性についてスクリーニングした。36のプラスミドはいずれもBsaI消化に抵抗性を示さなかった。
【0034】
メチラーゼ選抜の効率を高めるために、プラスミドライブラリのBsaI消化の後、消化したプラスミドをさらに100単位の緑豆ヌクレアーゼで37℃にて1時間処理した。緑豆ヌクレアーゼは、はみ出している4塩基を除いた後、ApR耐性遺伝子を破壊した(β−ラクタマーゼ遺伝子の中での4塩基の欠失はこの遺伝子を不活化する)。同一のプラスミドライブラリをBsaIで処理して2つに分けた。片方のDNAをさらに緑豆ヌクレアーゼで処理した。両方のDNA試料を用いてER2502コンピテント細胞を形質転換した。緑豆ヌクレアーゼ処理したDNAは、処理していないDNAよりも5倍少ない形質転換体を生じることが判った。緑豆ヌクレアーゼ処理したDNAからの36個各々の形質転換体を取り出し、2mlのLB+Apに接種し、一晩培養した。プラスミドDNAを調製し、BsaI消化及びアガロースゲル電気泳動により分析した。スクリーニングした36のうち20が抵抗性を示した。単離物#7、#8、#10、#12及び#13は、HindIII消化による1.3kbの共通するHindIII断片を有する。この共通するHindIII断片をpUC19にサブクローニングし、配列を決定して、C5メチラーゼをコードすることを見出した。この遺伝子は1188bpであり、M.BsaIBをコードするbsaIMB遺伝子と命名した。BsaIの認識配列は非対称性なので、第2のメチラーゼがこのR−Mシステムに存在するはずであると予測された。
【0035】
(3)隣接するDNAの逆PCR増幅と配列の決定並びにbsaIR遺伝子の同定
II型のR−M遺伝子は通常、互いに近傍に位置するのでbsaIMB遺伝子に隣接するDNA配列を増幅することに努力が払われた。4〜6bpの認識配列を持つ制限酵素によってB.ステアロサーモフィルス6−55のゲノムDNAを消化し、bsaIMB遺伝子及び隣接するDNAを包含するDNA断片を同定した。それぞれ、AatII、AseI、BamHI、BssHII、DraI、HaeII、MfeI、NcoI、NdeI、NspI、PstI、SacI、SpeI、SspI、XbaI及びXhoIによって、B.ステアロサーモフィルスのゲノムDNAを消化した。ゲノムDNAを低濃度(2mg/ml)にて自己連結し、連結した環状分子を逆PCRの鋳型として用いた。
逆PCRのプライマーは以下の配列である:
【0036】
5’−agataaattagctcttacttgagcttc−3’(258−98)(SEQ ID NO:7)
5’−ggagagcacatataccgaagttag−3’(258−99)(SEQ ID NO:8)
【0037】
逆PCRの条件は以下のとおりである:
ベント(Vent)(登録商標)(exo−)DNAポリメラーゼを用いて94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル実施。
NdeI鋳型の中に1.2kbの逆PCR産物が見出された。1.2kbの断片をゲル精製し、プライマー258−98及び99により直接配列決定し、およそ700bpの新しいDNA配列を創製した。
【0038】
以下の配列を持つ逆PCR用プライマーの第2のセットを合成した:
5’−gctcttcagtgtattttgtatctc−3’(259−137)(SEQ ID NO:9)
5’−tgagaattggattcgaagcactta−3’(259−138)(SEQ ID NO:10)
【0039】
逆PCRの鋳型として、AatII、AseI、BamHI、BssHII、DraI、HaeII、MfeI、NcoI、NdeI,NspI、PstI、SacI、SpeI、SspI、XbaI、及びXhoIで消化し、自己連結したDNA分子を用いた。
逆PCRの条件は以下のとおりである:
ディープベント(Deep Vent)(登録商標)(exo−)DNAポリメラーゼを用いて94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル実施した。
DraI鋳型の中に600bpの逆PCR産物が見出された。600bpの断片をゲル精製し、プライマー259−137及び138により直接配列決定し、およそ200bpの新しいDNA配列を創製した。
【0040】
以下の配列を持つ逆PCR用プライマーの第3のセットを合成した:
5’gagatagagtatattgaaatacta3’(259−139)(SEQ ID NO:11)
5’ttacccatggcgggtttgtaatac3’(259−140)(SEQ ID NO:12)
【0041】
逆PCRの鋳型として、AatII、AseI、BamHI、BssHII、DraI、HaeII、MfeI、NcoI、NdeI,NspI、PstI、SacI、SpeI、SspI、XbaI、及びXhoIで消化し、自己連結したDNA分子を用いた。
逆PCRの条件は以下のとおりである:
ディープベント(Deep Vent)(登録商標)(exo−)DNAポリメラーゼを用いて94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル実施した。
AseI鋳型の中に650bpの逆PCR産物が見出された。650bpの断片をゲル精製し、プライマー259−139及び140により直接配列決定し、およそ400bpの新しいDNA配列を創製した。
【0042】
以下の配列を持つ逆PCR用プライマーの第4のセットを合成した:
5’tctgcagaacaagggcctgggtgg3’(264−210)(SEQ ID NO:13)
5’catattggtcctatttcccttggt3’(264−211)(SEQ ID NO:14)
【0043】
B.ステアロサーモフィルスのゲノムDNAをそれぞれ、AciI、ApoI、BsaWI、BspHI、BstBI、HincII、HindIII、NlaIII、RsaI、SpeI、SspI、TaqI、TfiI、Tsp45I、及びXmnIで消化した。ゲノムDNA断片を低濃度(2μg/ml)にて自己連結し、連結した環状分子を逆PCRの鋳型として用いた。
逆PCRの条件は以下のとおりである:
ベント(Vent)(登録商標)(exo−)DNAポリメラーゼ及びTaqDNAポリメラーゼを用いて94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル実施。
SspI鋳型の中に1.2kbの逆PCR産物が見出された。1.2kbの断片をゲル精製し、プライマー264−210及び211により直接配列決定し、およそ540bpの新しいDNA配列を創製した。
【0044】
以下の配列を持つ逆PCR用プライマーの第5のセットを合成した:
5’caatttaaccaagtatctaaatcg(270−223)(SEQ ID NO:15)
5’ttctgtttatattccgagtgaacc(270−224)(SEQ ID NO:16)
【0045】
AciI、ApoI、BsaWI、BspHI、BstBI、HincII、HindIII、NlaIII、RsaI、SpeI、SspI、TaqI、TfiI、Tsp45I、及びXmnIで消化し、自己連結した環状分子を、逆PCRの鋳型として用いた。
逆PCRの条件は以下のとおりである:
ベント(Vent)(登録商標)(exo−)DNAポリメラーゼを用いて94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル実施。
ApoI、RsaI及びTaqI鋳型の中にそれぞれ、0.9、1.6及び1.2kbの逆PCR産物が見出された。1.2kbの断片をゲル精製し、プライマー270−223及び224により直接配列決定し、およそ600bpの新しいDNA配列を創製した。
【0046】
最初のメチラーゼ陽性クローンの5回の逆PCR及び配列決定の後、2つの更なるORFが上流と下流に見出された。上流のORFは、bsaIMAと命名され、M.BsaIA、アデニンメチルトランスフェラーゼをコードしていた。他のアミノメチラーゼとの、アミノ酸配列の比較に基づいて、M.BsaAメチラーゼはγ型のN6Aメチラーゼに属する。
【0047】
C5メチラーゼの中では、保存されたアミノ酸ブロックIX及びXはタンパク質のC末端に位置する。保存されたブロックI〜VIII及び可変領域はブロックIX及びXの前に位置する。しかしながら、M.BsaIBでは、C5メチラーゼのブロックIX及びXは、N末端に位置し、2つのブロックの環状順列を示している。かかる環状順列は、BssHIIメチラーゼで見出されている。
【0048】
bsaIMA及びbsaIMB遺伝子の下流に1635bpのORFが見出された。このORFはbsaIR遺伝子と命名された。それは、予測分子量63.7kDaを持つ544アミノ酸のタンパク質をコードしている(図4)。以下に立証するように、それは、BsaI制限エンドヌクレアーゼをコードしている正真正銘のR遺伝子である。
【0049】
(4)bsmAIM1M2遺伝子のpBR322へのクローニング及び事前修飾した宿主の構築
BsmAIの認識配列(5’GTCTC’)は、BsaIの認識配列(5’GGTCTC3’)と重なり合っているので、M.BsmAIは、BsaIの消化に対して大腸菌染色体のDNAを交差保護する。先ずM.BsmAIを過剰発現させて事前修飾した発現宿主を構築する努力が払われた。M.BsmAIはM1とM2の融合体である(BsmAI制限−修飾特許出願、2001年9月20日に出願された米国特許出願、出願番号09/957,005)。BsmAI制限−修飾に関する特許出願は米国において係属中である。
【0050】
以下の配列を有する2つのプライマーを合成した:
5’GGTGGTGCTAGCGGAGGTAAATAAATGAAAGAAAACACAGAAATTAATATAGAT3’(253−245、下線のヌクレオチドはNheI部位)(SEQ ID NO:17)
5’GGTGGTGCATGCCTAATATATTTCTTGGTACGTCATTTT3’(253−246、下線のヌクレオチドはSphI部位)(SEQ ID NO:18)
【0051】
95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で4分間を25サイクルのPCR条件下で、プライマー253−245及び253−246を用いたPCRにおいてゲノムDNAからbsmAIM遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラムを介してPCRのDNAを精製し、NheI及びSphIで消化した。低融点アガロースゲルでPCR断片を再び精製し、適合する末端でpBR322に連結した。連結したプラスミドでER2566(T7発現株、NEBのコレクション)を形質転換した。ApR形質転換体をプールし、プラスミドDNAを調製した。プラスミド混合物をBsmAIエンドヌクレアーゼで処理し、ER2566細胞に再形質転換した。6つのクローンのうち4つが正しい挿入物サイズを有し、BsmAIの消化に抵抗性であることが判った。大腸菌におけるbsaIR遺伝子の発現に事前修飾した宿主ER2566[pBR322−BsmAIM]を用いた。
【0052】
(5)T7発現ベクターpACYC−T7terにおけるbsaIR遺伝子の発現
安定した発現クローンを構築するために、中程度のコピー数のベクターpBR322からbsmAIM遺伝子を発現させ、低コピー数のベクターpACYC−T7terからbsaIR遺伝子を発現させた。ベクターpACYC−T7terは、T7プロモータ、CmR遺伝子、lacI遺伝子、p15A複製開始点、及び潜在性大腸菌プロモータからのランオフ転写を減らすためのT7プロモータの上流の転写ターミネータの4コピーを含有する。
【0053】
PCRによるbsaIR遺伝子の増幅のために、NdeI及びBamHIの制限部位をそれぞれ正方向及び逆方向のPCRプライマーに導入した。プライマーは以下の配列を有する:
5’GGTGGTCATATGGGAAAAAAAGCTGAATATGGA3’(271−161、下線のヌクレオチドはNdeI部位)(SEQ ID NO:19)
5’GGTGGTGGATCCTCATTAATCTAAATCTGCAAATGT3’(271−162、下線のヌクレオチドはBamHI部位)(SEQ ID NO:20)。
【0054】
ベント(登録商標)DNAポリメラーゼとプライマー271−161及び162を用い、95℃で1分間、50℃で1.5分間、72℃で1.5分間を25サイクルの条件下でPCRによりbsaIR遺伝子を増幅した。PCR産物をキアゲンスピンカラムで精製し、NdeI及びBamHIにより一晩消化した。低融点アガロースゲル及びβ−アガラーゼ処理により精製した後、エタノールとNaOAcによりDNAを沈殿させた。適合する末端によりPCRのDNAをCIP処理したpACYC−T7terに連結した。連結したDNAにより事前に修飾した宿主ER2566[pBR322−BsmAIM]を形質転換し、ApRCmRの形質転換体を選抜した。次いで個々の形質転換体を選択し、Ap(100μg/ml)及びCm(33μg/ml)を加えた10mlのLBにて後期対数増殖期まで培養し、IPTG(最終0.5mM)で3時間誘導した。BsaI活性について36の細胞抽出物を測定した。7つのクローン(#2、#3、#5、#18、#21、#25及び#32)が高いBsaI活性を示した。高い活性のクローンからの3つのプラスミド(#2、#3、#5)の配列を決定し、#5が野生型配列を有することが判明し、その後のBsaIエンドヌクレアーゼタンパク質の大規模精製にそれを用いた。
【0055】
(6)事前に修飾された宿主を構築するためのbsaIMA及びbsaIMB遺伝子のpBR322へのクローニング
以下の配列を持つ2つのプライマーを合成した。
5’GGTGGTGGATCCGGAGGTAAATAAATGAGTAATGCTAAAAGTTTCTCT3’(270−148、下線のヌクレオチドはBamHI部位)(SEQ ID NO:21)
5’GGTGGTGCATGCTTATATTATCGCTAAACTGCTCAA3’(270−150、下線のヌクレオチドはSphI部位)(SEQ IDNO:22)
【0056】
プライマー270−148及び270−150を用い、95℃で1分間、55℃で1.5分間、72℃で4分間を25サイクルのPCR条件を用いたPCRにてベント(登録商標)DNAポリメラーゼによりゲノムDNAからbsaIMA及びbsaIMBの遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラムを介してPCRのDNAをゲル精製し、BamHI及びSphIで消化した。低融点アガロースゲルでPCR断片を再び精製し、適合する末端でpBR322に連結した。連結したプラスミドでER2566(T7発現株、NEBの株コレクション)を形質転換した。ApR形質転換体をプールしてプラスミドDNAを調製した。BsaIエンドヌクレアーゼをプラスミド混合物で処理し、ER2566細胞を再形質転換した。プラスミドDNAを再び調製し、BsaIエンドヌクレアーゼにより消化した。3つのクローンのうち1つが正しいサイズの挿入物を有し、BsaIの消化に抵抗性であることが判った。大腸菌におけるbsaIR遺伝子の発現に、事前修飾した宿主ER2566[pBR322−BsaIMA&B]を用いた。
【0057】
前記[4]で単離したプラスミド、pACYC−T7ter−BsaIRを形質転換によりER2566[pBR322−BsaIMA&B]に導入した。ApR及びCmRのコロニーを選抜し、形質転換体をAp及びCmを加えた10mlのLBにて一晩増殖させた。Ap及びCmを加えた500mlのLBに10mlの細胞を接種し、5時間培養した。0.5mMのIPTG(最終濃度)を加えた後、細胞増殖を3時間継続した。細胞を回収し、超音波破砕用緩衝液に再浮遊した。超音波破砕により細胞溶解を完了し、細胞の破片は遠心により除いた。細胞抽出物を希釈し、T7DNAについて測定した。この発現クローンからの組換えBsaIの収量は、0.7〜1.4x106単位のBsaI/細胞の湿重量gと概算された。前出の発現株ER2566[pBR322−BsmAIM1M2、pACYC−T7ter−BsaIR]からの組換えBsaIの活性は、1.0〜2.0x106単位のBsaI/細胞の湿重量gと概算された。bsaIMA及びbsaIMB遺伝子がpACYC184から発現され、bsaIR遺伝子がpU19から発現される第3の発現株も構築した。この株も湿重量のg当りさらに少ないBsaI単位を生成した。従って、BsaI産生株として、株ER2556[pBR322−BsmAIM1M2、pACYC−T7ter−BsaIR]を用いた。
【0058】
(7)BsaIエンドヌクレアーゼの精製
20mlの超音波破砕用緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH7.8、10mMのβ−メルカプトエタノール)に再浮遊した4グラムのIPTG誘導細胞を超音波破砕することによって細胞抽出物を調製した。15k rpmにて30分間遠心することにより細胞破片を取り除いた。BsaI活性を測定した。細胞抽出物を55℃にて1時間加熱し、大腸菌の温度に不安定なタンパク質を変性させた。遠心により変性したタンパク質を除いた。上清を20mlのヘパリンセファロースカラムに流した。低塩緩衝液(20mMのトリス−HCl、pH7.5、50mMのNaCl、10mMのβ−メルカプトエタノール、0.1mMのEDTA)による大量の洗浄の後、0.05M〜1MのNaCl濃度勾配により分画を溶出した。λDNAの活性測定により決定されるBsaIエンドヌクレアーゼを含有する分画をプールし、DEAEセファロース装填用緩衝液(20mMトリス−HCl、pH7.5、50mMのNaCl、10mMのβ−メルカプトエタノール、0.1mMのEDTA)で一晩透析した。透析後、同じ緩衝液で平衡化したDEAEセファロースカラムにタンパク質混合物を装填した。0.05M〜1MのNaCl濃度勾配で分画を溶出し、精製したBsaIを含有する分画をプールした。組換えBsaIをSDS−PAGEで分析した。それは、>92%均質であると推定された(図6)。合計106単位の機能的に精製されたBsaIが得られた。ゲル上のBsaIタンパク質の見かけの分子サイズは61kDaであると思われ、予想サイズの63.7kDaよりもやや小さかった。組換えBsaIエンドヌクレアーゼの正確な開始アミノ酸を決定するために、精製タンパク質をN−末端配列決定解析にかけた。タンパク質は正しいN末端アミノ酸配列:(M)GKKAEYGQGHPIFLEYAEQ (SEQ ID NO:23)を含有することが確認された。
【0059】
アミノ酸残基の組成及び側鎖の変化のような要因から移動度の差異が生じる可能性がある。
【0060】
株ER2566[pBR322−BsmAIM、pACYC−T7ter−BsaIR]は、ブタペスト条約の諸条件のもと、2002年3月26日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ATCC受入番号PTA−4181を受領した。
【0061】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、BsaI制限−修飾システムの遺伝子構成を示す。bsaIMAはBsaIメチラーゼ1遺伝子;bsaIMBはBsaIメチラーゼ2遺伝子;bsaIRはbsaI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子である。
【図2】図2は、M.BsaIA遺伝子(bsaIMA、1710bp)のDNA配列(SEQ ID NO:1)及びそれがコードするアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を示す。
【図3】図3は、M.BsaB遺伝子(bsaIMB、1188bp)のDNA配列(SEQ ID NO:3)及びそれがコードするアミノ酸配列(SEQ ID NO:4)を示す。
【図4】図4は、BsaIエンドヌクレアーゼ遺伝子(bsaIR、1635bp)のDNA配列(SEQ ID NO:5)及びそれがコードするアミノ酸配列(SEQID NO:6)を示す。
【図5】図5は、細胞抽出物を用いた組換えBsaI制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイ結果を示す。レーン1は、陽性対照で、精製した天然のBsaIにより消化したT7DNA;レーン2〜11は、組換えBsaIエンドヌクレアーゼを含有する希釈した細胞抽出物で処理したT7DNA;レーン2〜11の希釈係数は、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200である。レーン12は、1kbのDNAサイズマーカー。
【図6】図6は、SDS−PAGゲル上の精製した組換えBsaIエンドヌクレアーゼタンパクで、レーン1は、広範囲のタンパク質サイズマーカー;レーン2は、精製した組換えBsaIエンドヌクレアーゼ(組換えBsaIエンドヌクレアーゼの見かけのサイズ=61kDa;予測されたサイズ=63.7kDa)。
Claims (8)
- 配列番号6に示されるアミノ酸配列をコードするDNAを含んでなる、BsaI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたDNA。
- 配列番号5に示される塩基配列を含んでなる、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1又は2に記載のBsaI制限エンドヌクレアーゼをコードするDNAを含んでなる組換えDNAベクター。
- ATCC番号PTA−4181株から入手し得るプラスミドpBR322内に挿入されたBsmAIメチラーゼをコードするDNAをさらに含んでなる、請求項3に記載の組換えDNAベクター。
- 配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列をコードするbsaIメチラーゼ遺伝子をさらに含んでなる、請求項3に記載の組換えDNAベクター。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のベクターで形質転換された形質転換細胞。
- ATCC番号PTA−4181株である請求項6に記載の形質転換細胞。
- エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に好適な条件下にて、請求項6又は7に記載の形質転換細胞を培養することを含んでなる、組換えBsaI制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
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Families Citing this family (6)
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10313883A (ja) * | 1997-03-12 | 1998-12-02 | New England Biolabs Inc | 大腸菌でのBssHII制限酵素のクローニング及び生産方法 |
US6066487A (en) * | 1999-05-07 | 2000-05-23 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of BsrFI restriction endonuclease in E. coli |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2168478A (en) * | 1984-11-26 | 1986-06-18 | Scan Limited M | Analysis of protein etc using mass spectrometry |
US5221518A (en) * | 1984-12-14 | 1993-06-22 | Mills Randell L | DNA sequencing apparatus |
US5064754A (en) * | 1984-12-14 | 1991-11-12 | Mills Randell L | Genomic sequencing method |
US5200333A (en) | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
CA1340806C (en) * | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
US5003059A (en) * | 1988-06-20 | 1991-03-26 | Genomyx, Inc. | Determining DNA sequences by mass spectrometry |
US5174962A (en) * | 1988-06-20 | 1992-12-29 | Genomyx, Inc. | Apparatus for determining DNA sequences by mass spectrometry |
US4879214A (en) * | 1988-11-15 | 1989-11-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences |
US5187085A (en) * | 1990-09-28 | 1993-02-16 | Applied Biosystems, Inc. | Nucleic acid sequence analysis with nucleoside-5'-o-(1-thiotriphosphates) |
WO1992013629A1 (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-20 | Wayne State University | A method for analyzing an organic sample |
US5424184A (en) * | 1991-05-08 | 1995-06-13 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA sequence-based HLA class I typing method |
WO1994016101A2 (en) * | 1993-01-07 | 1994-07-21 | Koester Hubert | Dna sequencing by mass spectrometry |
US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
WO1994021822A1 (en) * | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Sequenom, Inc. | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
US5552278A (en) * | 1994-04-04 | 1996-09-03 | Spectragen, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
US5498535A (en) | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
US5700642A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
US5830655A (en) * | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
US5869242A (en) * | 1995-09-18 | 1999-02-09 | Myriad Genetics, Inc. | Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms |
CZ293215B6 (cs) * | 1996-08-06 | 2004-03-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje |
-
2002
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-
2003
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
JPH10313883A (ja) * | 1997-03-12 | 1998-12-02 | New England Biolabs Inc | 大腸菌でのBssHII制限酵素のクローニング及び生産方法 |
US6066487A (en) * | 1999-05-07 | 2000-05-23 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of BsrFI restriction endonuclease in E. coli |
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