JP4599483B2 - スタッガード(staggered)ライゲーションを使用して核酸配列を増幅する方法 - Google Patents
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Description
本願は、開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年5月9日提出の米国仮出願60/469,383号の利益を主張する。
マイクロアレイ技術は、遺伝子発現プロファイルを作製し、分析するための強力なツールとなっている。しかし、一般に、マイクロアレイ発現分析は、入手できないことが多いRNAを大量に必要とする(Wang et al.,BioTechniques 34:394−400(2000)参照)。この問題を克服するためにいくつかのRNA増幅技法が開発されている。しかし、これらの技法は、一般に、増幅バイアスとして知られている現象を受ける(例えば、米国特許第6,582,906号参照)。これらの場合には、増幅されたRNA分子集団は、元の試料に存在するRNA分子集団との比例を示さない。
出願人らは、2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターが、スタッガード(「付着末端」としても知られている)ライゲーション反応において第1のcDNAの3’末端に結合している核酸鋳型からセンスRNA(sRNA)を作製するための方法を発明した。出願人らは、スタッガードライゲーション反応によるcDNA第1鎖の3’末端へのプロモーターの結合は、平滑末端ライゲーション反応による結合より効率がよく、従来技術の方法によって得られるものと比べて、mRNA転写物混合物中の各mRNA転写物の相対量をより良く反映するsRNA分子を作製することを発見した。
本発明は、sRNA分子を作製するための方法とキットに関する。「sRNA分子」、「mRNA分子」および「cDNA分子」は、各々、一分子、単一種の複数の分子および異なる種の複数の分子を含むことが意図されている。本発明の方法は、1本鎖cDNA分子の3’末端にオリゴデオキシヌクレオチドテイルを結合するステップと、そのセンス鎖がオリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含有する1本鎖3’末端オーバーハングを含有する2本鎖プロモーターにオリゴデオキシヌクレオチドテイルをライゲーションするステップとを含む。3’オリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含有する3’末端オーバーハングを使用すると、効率的なスタッガードライゲーションにとって適切にプロモーターおよびcDNA分子を配向する。次いで、得られるプロモーター含有1本鎖cDNAを、RNAポリメラーゼによるインビトロにおける転写反応に使用して、sRNAを作製する。このようなsRNA分子は、1本鎖cDNAが得られる元のmRNA転写物の増幅されたコピーに相当する。
cDNA第1鎖を合成するためには、RNAquous(登録商標)キット(アンビオン)を使用して精製した1〜10μlのラット脳総RNA(最高1μg)を2μlのオリゴdT24プライマー(50ng/μl)(5’−TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT−3’;配列番号:4)と混合し、RNaseフリー水で11μlにした。RNA/プライマー混合物を80℃において10分間加熱し、速やかに氷上で1〜2分冷却した。次いで、混合物を9μlのマスター混合物溶液と混合して、最終容量を、50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMジチオスレイトール(DTT)、0.5mMの各dNTP、10U Superase−In(商標)(アンビオン)および200U Superscript(商標)II逆転写酵素(インビトロジェン)を含む20μlにした。混合物を短時間遠心分離し、42℃において2時間インキュベーションした。0.5M NaOH/50mM EDTAの3.5μlを添加して、65℃で15分間加熱することによって反応を停止した。短時間の遠心分離後、反応を1M Tris−HCl、pH7.5で中和して、1×TE、pH8.0で50μlに調整した。製造業者のプロトコールによりMinElute(商標)PCR精製キット(キアゲン)を使用して反応液を精製した。cDNA第1鎖分子は、製造業者により提供された10μlのEB緩衝液で溶出した。
cDNA第1鎖分子を80℃において10分間加熱し、速やかに氷上で1〜2分冷却した。次いで、cDNA分子の10μlを15μlのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、6.5μl RNaseフリー水、1× テイル付加緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.0、10mM MgCl2)、1.5mM dTTPおよび30U ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(インビトロジェン)を含む25μlにした。混合物を短時間遠心分離し、37℃において30分間インキュベーションした。65℃で15分間加熱し、室温において1〜2分間冷却することによって反応を停止した(以下のライゲーション反応の加熱段階に直接進む場合には、この段階を省略してもよい)。
オリゴdT−テイル付加cDNA分子を95〜100℃において10分間加熱して、速やかに氷上で1〜2分冷却した。4部のライゲーションミックス希釈干渉液(395mM Tris−HCl、pH7.5、30mM MgCl2、30mM ATP)を1部の6×ライゲーションミックスと合わせることによって6×ライゲーションミックスの1:5希釈液を調製した。希釈した6×ライゲーションミックスは、5’リン酸化T7ライゲーションオリゴ(7ng/μl)(5−CCC TAT AGT GAG TCG TAT TA−3’;配列番号:5)およびT7 dA ブリッジオリゴ(13.1ng/μl)(5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA AAA AAA AAA−3’;配列番号:6)を、395mM Tris−HCl、pH7.5、30mM MgCl2、30mM ATP中に含有する。2つのオリゴは、一緒にアニーリングすると、3’ポリdAセンス鎖オーバーハングを有する2本鎖T7プロモーターを作製する。次いで、テイル付加したcDNA分子の25μlを5μlの希釈した6×ライゲーションミックスおよび2μl(2U)T4 DNAリガーゼ(インビトロジェン)と混合した。混合物を短時間遠心分離し、23℃において30分間インキュベーションした。0.5M EDTAの3.5μlを添加し、65℃までの温度で10分間加熱することによって反応を停止した。1×TE、pH8.0で反応液を50μlに調整した。製造業者のプロトコールにより、MinElute(商標)PCR精製キットを使用して反応液を精製した。T7プロモーターとライゲーションしたcDNA分子は10μlのEB緩衝液で溶出した。
2μlのT7 dAブリッジオリゴ(50ng/μl)(配列番号:6)をT7プロモーター−ライゲーションしたcDNA分子に添加し、RNase−水で容量を16μlに調整した。混合物を95℃において10分間加熱し、速やかに2分間氷冷した。次いで、混合物を37℃において10〜15分間加熱し、次いで24μlのマスター混合物溶液と混合し、最終容量を、1×反応緩衝液、5mM各rNTPおよび2μlのT7 RNAポリメラーゼ(MEGAscript(商標)転写キット、アンビオン)を含む40μlにした。混合物を短時間遠心分離し、37℃のヒートブロックで5分間インキュベーションし、次に37℃のハイブリダイゼーション用エアーオーブンにおいて6〜14時間インキュベーションした。製造業者のプロトコールによりRneasy(登録商標)キットを使用して、増幅したsRNA分子を精製した。sRNA分子は50μlのRNaseフリー水に溶出し、同じ溶出液で再溶出し、波長比260/280でUV−分光測定法で定量した。
オリゴdT24プライマー(50ng/μl)、
ランダム9merプライマー(250ng/μl)
dNTPミックス(各10 mM)、
Superase−In(商標)(アンビオン)、
dTTPテイル付加ミックス(10mM);
10×テイル付加緩衝液(100mM Tris−HCl、pH7.0、100mM MgCl2);
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(15〜30U/μl)、
5’リン酸化T7ライゲーションオリゴ(35ng/μl)およびT7dAブリッジオリゴ(65.6ng/μl)を395mM Tris−HCl、pH7.5の溶液、30mM MgCl2、30mM ATPを含有する6×ライゲーションミックス、
ライゲーションミックス希釈緩衝液(395mM Tris−HCl、pH7.5、30mM MgCl2、30mM ATP)、
T7dAブリッジオリゴ(50ng/μl)、
T4DNAリガーゼ(1U/μl)、および
ヌクレアーゼフリー水。
Claims (38)
- センスRNA分子を作製するための方法であって、
5’末端および3’末端を有する1本鎖cDNA分子を提供するステップと、
前記1本鎖cDNA分子の3’末端にオリゴデオキシヌクレオチドテイルを結合するステップと、
センス鎖およびアンチセンス鎖を有する2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターを提供するステップであって、前記センス鎖が、前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに相補的な配列を含む1本鎖3’末端オーバーハングを含むステップと、
前記3’末端オーバーハング配列と相補的塩基対形成することによって、前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに前記2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターをアニーリングするステップと、
前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルの3’末端に前記2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターのアンチセンス鎖の5’末端をライゲーションするステップと、
前記2本鎖プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを使用してRNA転写を開始し、センスRNA分子を作製するステップと、
を含む方法。 - 前記1本鎖cDNA分子を提供するステップが、5’末端および3’末端を有するmRNA転写物を提供するステップと、前記mRNA転写物から1本鎖cDNA分子を合成するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1本鎖cDNA分子の合成が、前記mRNA転写物とRNaseH-逆転写酵素を反応させるステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記1本鎖cDNA分子の合成が、前記mRNA転写物とオリゴdTプライマーを反応させるステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記1本鎖cDNA分子の合成が、前記mRNA転写物とランダムプライマーを反応させるステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルに結合するステップの前に、1本鎖cDNA分子を精製するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記1本鎖cDNA分子を精製するステップの前に、前記mRNA転写物を分解するステップをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記1本鎖cDNA分子を精製するステップの前に、前記mRNA転写物が分解されない、請求項6に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルがホモポリマーテイルである、請求項1に記載の方法。
- 前記ホモポリマーテイルがポリdTテイルである、請求項9に記載の方法。
- 前記オリゴデオキシヌクレオチドテイルが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、前記1本鎖cDNA分子の3’末端に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターがT7、T3またはSP6プロモーターである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターがT7プロモーターである、請求項12に記載の方法。
- 前記1本鎖3’末端オーバーハングがアデノシン塩基の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ライゲーションが、T4DNAリガーゼを使用して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA転写が、T7RNAポリメラーゼを使用して開始される、請求項1に記載の方法。
- RNA転写を開始する前に、第2のcDNA鎖を合成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のcDNA鎖がDNAポリメラーゼを使用して合成される、請求項17に記載の方法。
- 前記第2のcDNA鎖が、前記RNAポリメラーゼプロモーターのセンス鎖の3’末端オーバーハングの伸長によって合成される、請求項17に記載の方法。
- 前記第2のcDNA鎖がランダムプライマーを使用して合成され、ランダム−プライミングされた第2のcDNA断片鎖を作製する、請求項17に記載の方法。
- RNA転写を開始する前に、ランダム−プライミングされた前記第2のcDNA断片鎖が互いにライゲーションする、請求項20に記載の方法。
- 得られるセンスRNA分子を増幅するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記センスRNA分子の増幅が、オリゴdTとランダムプライマーの組み合わせを使用して開始される、請求項22に記載の方法。
- 前記得られるセンスRNA分子がポリAテイルを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリAテイルが、ポリAポリメラーゼを使用して結合される、請求項24に記載の方法。
- 前記得られるセンスRNA分子を逆転写し、それによって1本鎖cDNA分子を作製するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写が、検出可能であるように標識されたヌクレオチドを1本鎖cDNA分子に組み入れることを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記検出可能であるように標識されたヌクレオチドが蛍光色素を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記蛍光色素がcy3またはcy5である、請求項28に記載の方法。
- 前記得られるcDNA分子に少なくとも1つの検出可能な標識を結合するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 前記検出可能であるように標識されたcDNAを、核酸マイクロアレイに接触させるステップをさらに含む、請求項27、28、29または30に記載の方法。
- 前記mRNA転写物が哺乳類起源である、請求項2に記載の方法。
- 前記mRNA転写物がヒト起源である、請求項2に記載の方法。
- 前記mRNA転写物が、生物起源から単離される、請求項2に記載の方法。
- 2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターのセンス鎖が1本鎖3’末端オーバーハング配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターと、前記2本鎖プロモーターを使用してセンスRNA分子を作製するための取扱説明物を含み、
前記2本鎖RNAポリメラーゼプロモーターの1本鎖3’末端オーバーハング配列に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドテイルを1本鎖cDNA分子の3’末端に結合するための少なくとも1つの酵素と、前記2本鎖プロモーターを前記cDNA分子の3’末端にライゲーションするための少なくとも1つの酵素をさらに含む、
少なくとも1つのセンスRNA分子を作製するためのキット。 - ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとT4DNAリガーゼをさらに含む、請求項35に記載のキット。
- オリゴdTプライマー、ランダムプライマー、dNTP、およびRNase阻害剤をさらに含む、請求項36に記載のキット。
- DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項37に記載のキット。
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