JP4595517B2 - Biosensor, its inspection device, and its inspection method - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中の測定対象物を定量するバイオセンサ、およびその検査装置、ならびにその検査方法に関するものである。より詳細には、バイオセンサの製造工程において、バイオセンサ試薬層に担持された酵素の位置や量を観察しやすくすることで、品質を高精度に管理できる技術に関する。 The present invention relates to a biosensor that quantifies a measurement object in a biological sample, an inspection device thereof, and an inspection method thereof. More specifically, the present invention relates to a technique capable of managing the quality with high accuracy by making it easy to observe the position and amount of the enzyme carried on the biosensor reagent layer in the biosensor manufacturing process.
バイオセンサとは、微生物、酵素、抗体、DNA、RNA等の生物材料の分子認識能を利用し、生物材料を分子識別素子として応用した、試料液中の基質含有量を定量するセンサである。即ち、生物材料が目的の基質を認識したときに起こる反応、例えば微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光等、を利用して、試料液中に含まれる基質を定量するのである。そして各種バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、例えば、グルコース、アルコール、乳酸、コレステロール、アミノ酸用のバイオセンサである酵素センサは医療計測や食品工業に利用されている。この酵素センサは、例えば検体である試料液に含まれる基質と酵素などとの反応により生成する電子によって電子伝達体を還元し、測定装置がその電子伝達体の還元量を電気化学的に計測することにより、検体の定量分析を行うようになっている。 A biosensor is a sensor that uses the molecular recognition ability of biological materials such as microorganisms, enzymes, antibodies, DNA, RNA, etc., and applies the biological material as a molecular identification element to quantify the substrate content in a sample solution. That is, the substrate contained in the sample solution is quantified using a reaction that occurs when the biological material recognizes the target substrate, for example, oxygen consumption due to respiration of microorganisms, enzyme reaction, luminescence, and the like. Among various biosensors, enzyme sensors are being put to practical use. For example, enzyme sensors that are biosensors for glucose, alcohol, lactic acid, cholesterol, and amino acids are used in the medical measurement and food industries. This enzyme sensor, for example, reduces an electron carrier by electrons generated by a reaction between a substrate contained in a sample solution that is a specimen and an enzyme, and the measuring device electrochemically measures the reduction amount of the electron carrier. Thus, the quantitative analysis of the specimen is performed.
このようなバイオセンサについて様々な形態のものが提案されている。従来のバイオセンサについて以下に説明する。図4はバイオセンサの分解斜視図である。ポリエチレンテレフタレート等からなる絶縁性の基板1(以下、単に「基板」とする。)の表面には、例えば金やパラジウムなどの貴金属やカーボン等の電気伝導性物質からなる導体層が、スクリーン印刷法やスパッタリング蒸着法によって形成されている。導体層は基板1全面または少なくとも一部に形成されていればよい。中央部に空気孔2が設けられた絶縁性の基板3は、切欠部4を有するスペーサ5を基板1との間に挟み込んで、基板1と一体に配置される。
Various types of biosensors have been proposed. A conventional biosensor will be described below. FIG. 4 is an exploded perspective view of the biosensor. On the surface of an insulating substrate 1 (hereinafter simply referred to as “substrate”) made of polyethylene terephthalate or the like, a conductor layer made of an electrically conductive material such as noble metal such as gold or palladium or carbon is screen printed. Or by sputtering deposition. The conductor layer may be formed on the entire surface of the substrate 1 or at least a part thereof. An
基板1上には、複数のスリットによって導体層が分割されて対電極6、測定電極7及び検知電極8が形成されている。なお、各電極は基板1の少なくとも一部に形成されていればよく、また、測定装置と各電極との接続はリード線であってもよい。
On the substrate 1, a conductive layer is divided by a plurality of slits to form a
スペーサ5は基板1上の対電極6、測定電極7および検知電極8を覆うように配置され、スペーサ5の前縁部中央に設けられた長方形の切欠部4によって試料供給路が形成される。また、試料供給路の先端は試料液の入口であり、入口に点着された試料液は、毛細管現象によって略水平方向に空気孔2に向かって吸引される。
The spacer 5 is disposed so as to cover the
試薬層9はスペーサ5の切欠部4から露出している対電極6、測定電極7および検知電極8に、酵素、電子受容体、必要であれば親水性高分子等を含有する試薬を滴下後、乾燥させることで形成される。
The reagent layer 9 is formed by dropping a reagent containing an enzyme, an electron acceptor, and, if necessary, a hydrophilic polymer on the
ここで酵素としては、グルコースオキシターゼ、アルコールオキシダーゼ、ラクテートオキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アスコルビン酸オキシターゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼのいずれかもしくはこれらを組み合わせて用いることができる。 Here, the enzymes include glucose oxidase, alcohol oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, peroxidase, uricase, hexokinase, glucokinase, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, glucose dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase Any of lactate dehydrogenase or a combination thereof can be used.
電子受容体としては、フェリシアン化カリウムが好ましいが、フェリシアン化カリウム以外にもp−ベンゾキノン及びその誘導体、フェナジンメトルサルフェート、メチレンブルー、フェロセン及びその誘導体などを用いることができる。 As the electron acceptor, potassium ferricyanide is preferable, but in addition to potassium ferricyanide, p-benzoquinone and derivatives thereof, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and derivatives thereof can be used.
このようなバイオセンサシステムは、とりわけ、試料液として人体の血液、また、基質として血液中に含まれるグルコース、アルコール、乳酸、コレステロールの含有量を定量することに適している。人体の体液中に含まれる基質の定量は、特定の生理的異常の診断や治療において非常に重要である。 Such a biosensor system is particularly suitable for quantifying the content of glucose, alcohol, lactic acid, and cholesterol contained in human blood as a sample solution and blood as a substrate. The quantification of the substrate contained in the body fluid of the human body is very important in the diagnosis and treatment of specific physiological abnormalities.
この酸化還元酵素と電子受容体が試料供給路に吸引された試料液に溶解し、測定溶液となる。試料液中の基質との間で酵素反応が進行し電子受容体が還元される。反応後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる電流値から試料液中の基質濃度が測定される。このような一連の反応は、試料供給路で進行し、対電極6、測定電極7及び検知電極8によって電気化学的変化に伴う電流値が読み取られることになる。
The oxidoreductase and the electron acceptor are dissolved in the sample solution sucked into the sample supply path to form a measurement solution. The enzyme reaction proceeds with the substrate in the sample solution, and the electron acceptor is reduced. After the reaction, the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized, and the substrate concentration in the sample solution is measured from the current value obtained at this time. Such a series of reactions proceeds in the sample supply path, and the current value accompanying the electrochemical change is read by the
このように構成されたバイオセンサにおける試料液の基質の定量方法について図5を参照しつつ説明する。 A method for quantifying the substrate of the sample solution in the thus configured biosensor will be described with reference to FIG.
図5は、バイオセンサシステムを示す斜視図で、バイオセンサ10とバイオセンサ10を着脱自在に装着する測定装置11である。バイオセンサ10の先端に位置する試料点着部12に点着された試料中に含まれる基質の量が測定装置11によって定量されるようになっている。
FIG. 5 is a perspective view showing the biosensor system, which is a
測定装置11は、例えば、バイオセンサ10を着脱自在に装着する挿入部13、バイオセンサ10の試料点着部12に点着された試料液中に含まれる基質の定量結果を表示する表示部14を有している。
The
本バイオセンサシステムを用いて、試料液中の基質含有量を定量するには、まず、ユーザはバイオセンサ10を測定装置11に挿入後、バイオセンサ10の電極に測定装置11によって一定電圧が印加された状態で、試料液を試料点着部12に供給する。点着された試料液がバイオセンサ10の内部に吸引されて試薬層の溶解が始まる。測定装置11は、バイオセンサ10の電極間に生じる電気的変化を検知して定量動作を開始するようになっている。
In order to quantify the substrate content in the sample solution using this biosensor system, first, the user inserts the
ところで、上記従来のバイオセンサの製造工程において、最も品質に影響するのが試薬滴下の工程である。殊に試薬の量や位置のばらつきは製品性能に影響を及ぼす要因となるため、試薬滴下工程における品質管理は厳密に行う必要がある。これまでに試薬滴下工程の検査方法として、例えば滴下直後のバイオセンサ基板に光を照射し、基板と滴下液との境界部分を画像処理によって迅速に識別する方法等がある(特許文献1参照)。
ところで、近年、バイオセンサの性能や測定精度に対する市場の要求が高まり、バイオセンサの品質管理もより厳しいチェックが望まれている。バイオセンサにおいて、品質に最も影響を及ぼすのは、試薬層の体積や、位置であるが、これらに加えて、殊に試薬層内の酵素量や酵素の位置を一定に保つことが極めて重要となることがわかってきた。これは近年、バイオセンサの性能において測定時間の短縮化が望まれており、そのため従来まではあまり重要視されていなかった各試薬の拡散速度がより重要となってきたためである。殊に酵素の拡散速度は、性能に最も影響する要因であり、そのため試薬層内の酵素量や酵素の位置を一定に保つことが、バイオセンサの品質に関して重要となる。 By the way, in recent years, market demand for the performance and measurement accuracy of biosensors has increased, and more stringent checks are desired for quality control of biosensors. In biosensors, the volume and position of the reagent layer have the greatest effect on quality, but in addition to these, it is extremely important to keep the amount of enzyme and the position of the enzyme constant in particular. I have found out that This is because in recent years, it has been desired to shorten the measurement time in the performance of the biosensor, and therefore the diffusion rate of each reagent, which has not been regarded as important so far, has become more important. In particular, the diffusion rate of the enzyme is the factor that most affects the performance. Therefore, keeping the amount of enzyme and the position of the enzyme in the reagent layer constant is important with respect to the quality of the biosensor.
しかしながら上記従来の検査方法では試薬全体像の検査であるため、試薬内の組成物である酵素の量や、酵素の位置までは検査することができなかった。そこで製造工程内検査による新たな解決手段が望まれていた。 However, in the above conventional inspection method, since the whole reagent is inspected, the amount of enzyme as a composition in the reagent and the position of the enzyme could not be inspected. Therefore, a new solution by inspection within the manufacturing process has been desired.
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、バイオセンサの製造工程内において、試薬液乾燥後の試薬層内に形成される酵素の量および位置を確認でき、工程上の負荷をかけずに品質安定化を実現できるバイオセンサを提供することを目的とする。 The present invention solves the above-described conventional problems, and in the biosensor manufacturing process, the amount and position of the enzyme formed in the reagent layer after the reagent solution is dried can be confirmed, and there is no burden on the process. An object is to provide a biosensor capable of realizing quality stabilization.
従来の課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、メディエータもしくは酸化還元系発色色素と1種類以上の酵素とを少なくとも含む試薬層が、絶縁基板上に形成されたバイオセンサであって、前記酵素のうち少なくとも1種類は、1種類以上のヘム色素を結合あるいは内包しており、前記ヘム色素を有する酵素の色が前記試薬層中のほかの組成物とは異なる色に呈していることを特徴としたものである。 In order to solve the conventional problems, the biosensor of the present invention is a biosensor in which a reagent layer containing at least a mediator or a redox coloring dye and one or more enzymes is formed on an insulating substrate, At least one of the enzymes binds or includes one or more heme dyes, and the color of the enzyme having the heme dye is different from that of the other compositions in the reagent layer. It is characterized by.
本発明の検査装置は、バイオセンサのうち試薬層が形成された領域を撮像する撮像手段と、前記撮像手段からの画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算する演算手段とを備えることを特徴としたものである。 The inspection apparatus according to the present invention includes an imaging unit that images a region in which a reagent layer is formed in a biosensor, an area of the reagent layer based on an image from the imaging unit, and a heme dye from the image And calculating means for calculating the area of the colored portion or calculating the distribution of the enzyme having the heme dye.
本発明の検査方法は、バイオセンサのうち試薬層が形成された領域の撮像画像に基づいて前記試薬層の面積を演算し、前記画像の中からヘム色素による呈色部分の面積を演算するか、または前記ヘム色素を有する酵素の分布を演算するようにしたことを特徴としたものである。 In the inspection method of the present invention, the area of the reagent layer is calculated based on a captured image of an area of the biosensor where the reagent layer is formed, and the area of the colored portion due to the heme dye is calculated from the image. Alternatively, the distribution of the enzyme having the heme pigment is calculated.
本発明のバイオセンサによれば、バイオセンサにおける試薬層内の酵素の量および位置を容易に確認でき、工程上の負荷をかけずに品質安定化を実現できるバイオセンサを提供することができる。 According to the biosensor of the present invention, it is possible to provide a biosensor capable of easily confirming the amount and position of the enzyme in the reagent layer in the biosensor and realizing quality stabilization without applying a load on the process.
本発明者らは、バイオセンサの試薬層中でもほかの組成物と区別できる酵素を鋭意検討した結果、ピロロキノリンキノンとヘムCの両方を有したキノヘモプロテインである、Pseudomonas putida由来アルコールデヒドロゲナーゼ(以下、単に「ADH」とする。)に着目した(J Bacteriol 1995 May;177(9):2442−50.参照)。Pseudomonas putidaは例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源部門より分譲依頼することで得られる。この菌株を常法に従い培養、遠心分離を行い、例えばゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することで、ADHを得ることができる。このADHが有するヘムCは、強い赤色色素であり、バイオセンサ内の乾燥試薬層中でも赤色を保ったまま結晶となることを見出した。 As a result of intensive studies on an enzyme that can be distinguished from other compositions even in the reagent layer of the biosensor, the present inventors have found that Pseudomonas putida-derived alcohol dehydrogenase (hereinafter referred to as Pseudomonas putida) is a quinohemoprotein having both pyrroloquinoline quinone and heme C. , Simply “ADH”) (see J Bacteriol 1995 May; 177 (9): 2442-50.). Pseudomonas putida can be obtained, for example, by requesting a sale from the National Institute of Technology and Evaluation / Biogenetic Resource Department. ADH can be obtained by culturing and centrifuging this strain according to a conventional method and purifying the strain by, for example, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like. It has been found that heme C possessed by this ADH is a strong red pigment and becomes a crystal while maintaining the red color even in the dry reagent layer in the biosensor.
以下に、本発明のバイオセンサの実施の形態を、ADHを試薬層内に含むアルコールセンサを例として図面とともに詳細に説明する。 Hereinafter, an embodiment of the biosensor of the present invention will be described in detail with reference to the drawings by taking an alcohol sensor including ADH in the reagent layer as an example.
(実施の形態1)
図1は、本発明の一実施の形態におけるキノヘモプロテインバイオセンサの試薬担持部分を拡大した模式図を示す。図4で説明したバイオセンサのうち、基板部分の平面図であり、図中の符号は、図4と対応している。
(Embodiment 1)
FIG. 1 shows an enlarged schematic view of a reagent-carrying portion of a kinohemoprotein biosensor according to an embodiment of the present invention. FIG. 5 is a plan view of a substrate portion of the biosensor described in FIG. 4, and the reference numerals in the drawing correspond to FIG. 4.
図1に示した電極基板は、ポリエチレンテレフタレート製の基板表面にパラジウムをスパッタリング蒸着し、レーザートリミングによって電極パターンを描画したものである。
この電極基板の短手方向の幅は6.6mmである。ADH、フェリシアン化カリウム、硫酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、試薬層を構成する組成物を溶解させた水溶液を調製し、該水溶液を電極基板上に滴下した。その後乾燥させて水分を揮発させ、試薬層を形成した。
The electrode substrate shown in FIG. 1 is obtained by sputtering palladium on a polyethylene terephthalate substrate surface and drawing an electrode pattern by laser trimming.
The width of the electrode substrate in the short direction is 6.6 mm. An aqueous solution in which the composition constituting the reagent layer such as ADH, potassium ferricyanide, magnesium sulfate, sodium carboxymethyl cellulose, etc. was dissolved was prepared, and the aqueous solution was dropped onto the electrode substrate. Thereafter, it was dried to volatilize water, and a reagent layer was formed.
ADHの試薬組成の割合は、画像処理装置にて他の組成物と色彩の違いを区別できる0.1%〜60%、より好ましくは目視にて他の組成物と区別できる1.0%〜60%である。他の組成物の割合は、フェリシアン化カリウムが20〜80%、より好ましくは45〜65%、硫酸マグネシウムが15〜70%、より好ましくは25〜55%、カルボキシメチルセルロースナトリウムが0.01〜7.5%、より好ましくは0.05〜3%である。また滴下する水溶液の量は0.5〜3.0マイクロリットル、より好ましくは1.0〜2.5マイクロリットルである。乾燥温度4℃〜60℃、より好ましくは15℃〜40℃である。 The ratio of the ADH reagent composition is 0.1% to 60% in which the color difference from other compositions can be distinguished by an image processing apparatus, and more preferably 1.0% to which it can be visually distinguished from other compositions. 60%. The ratio of the other composition is 20 to 80%, more preferably 45 to 65% for potassium ferricyanide, 15 to 70%, more preferably 25 to 55% for magnesium sulfate, and 0.01 to 7% for sodium carboxymethylcellulose. 5%, more preferably 0.05 to 3%. The amount of the aqueous solution to be dropped is 0.5 to 3.0 microliters, more preferably 1.0 to 2.5 microliters. The drying temperature is 4 ° C to 60 ° C, more preferably 15 ° C to 40 ° C.
図1において、乾燥状態の試薬層は対電極6、測定電極7および検知電極8上に担持されている。試薬層19に含まれるADHは強い赤色色素であるヘムCを有しているため、フェリシアン化カリウムと混在した状態であっても識別が可能となる。図1においては、試薬層の外縁部には、フェリシアン化カリウムの黄色結晶15とは明らかに異なるADHの赤色結晶16が集中し目視で確認することができた。
In FIG. 1, the dry reagent layer is carried on the
この赤色結晶16を画像検査装置で追跡すれば、試薬層内の酵素量、酵素位置を製造工程内で非破壊的に判別することが可能となり、製品をロスすることなく検査を行うことができる。具体的には図2に示したとおり、前記バイオセンサが縦横に複数繋がったシート17を搬送装置18によって移動させ、前記試薬層19が予め定められた測定位置を通過するとき、前記試薬層19をカメラ20にて撮影し、その画像を画像処理装置にて色彩の違いを解析し、前記試薬層全体の面積と前記ADHの赤色結晶16の面積を演算することで、バイオセンサ一枚毎に酵素量を検査することができる。同時に前記試薬層全体の中心点を解析し、中心点から赤色結晶16までの距離および座標を演算することで、試薬層内のADHの分布を検査することができ、前記面積と座標からバイオセンサ1枚毎に合否判別をすることができる。合否判別は、例えば面積であれば、試薬層全体に対する赤色結晶16の面積の割合が試薬組成の割合と同等、分布であれば、赤色結晶16の内径と外径が基準値以内、且つ内径円の内側には赤色結晶が無い等、面積と分布の片方もしくは両方に基準を設ければ良く、任意に仕様基準を設定することができる。
If this
以上のように、本実施の形態1においてはADHをバイオセンサ上に担持することで、酵素位置,酵素量を製造工程内で検査することが可能となり、バイオセンサにおいて品質安定化を達成することができる。 As described above, in the first embodiment, by supporting ADH on the biosensor, it is possible to inspect the enzyme position and the amount of enzyme within the manufacturing process, and achieve quality stabilization in the biosensor. Can do.
なお、本実施の形態1ではADH酵素で説明したが他のキノヘモプロテインや他のヘム色素を含む酵素でも同様な効果が期待され、本実施の形態1に限定されるものではない。 In addition, although this Embodiment 1 demonstrated ADH enzyme, the same effect is anticipated also with the enzyme containing another quino hemoprotein and another heme pigment | dye, and it is not limited to this Embodiment 1. FIG.
同様に、本実施の形態1ではバイオセンサ基板をポリエチレンテレフタレートで説明したが、他の合成樹脂やガラス等、絶縁性のものであればよく、本実施の形態1に限定されるものではない。 Similarly, in the first embodiment, the biosensor substrate has been described with polyethylene terephthalate. However, the biosensor substrate may be any other insulating material such as synthetic resin or glass, and is not limited to the first embodiment.
同様に、本実施の形態1ではバイオセンサ電極材料をパラジウムで説明したが、金や白金等の貴金属もしくはカーボン等の電気伝導性物質であればよく、本実施の形態1に限定されるものではない。 Similarly, although the biosensor electrode material has been described as palladium in the first embodiment, it may be a noble metal such as gold or platinum or an electrically conductive substance such as carbon, and is not limited to the first embodiment. Absent.
同様に、本実施の形態1ではバイオセンサ電極の形成方法をレーザートリミングで説明したが、電気伝導性物質を含むペーストを印刷する等の方法を用いてもよく、本実施の形態1に限定されるものではない。 Similarly, in the first embodiment, the method for forming the biosensor electrode has been described by laser trimming. However, a method such as printing a paste containing an electrically conductive substance may be used, and the method is limited to the first embodiment. It is not something.
同様に、本実施の形態1ではメディエータをフェリシアン化物イオンで説明したが他のP−ベンゾキノン及びその誘導体、フェナジンメトルサルフェート、メチレンブルー、フェロセン及びその誘導体等でも同様な効果が期待され、本実施の形態1に限定されるものではない。 Similarly, in the first embodiment, the mediator has been described using ferricyanide ions, but other P-benzoquinone and its derivatives, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and its derivatives are expected to have the same effect. It is not limited to Form 1.
また、メディエータ以外にも、電気化学的手法とは異なり光学的に分析対象物を検出する際に使用されるテトラゾリウム及びその誘導体や、N−スルホプロピルアニリン誘導体等の酸化還元系発色試薬を用いても同様に酵素の識別が可能であり、メディエータのみに限定されるものではない。 In addition to mediators, unlike electrochemical methods, tetrazolium and its derivatives used when optically detecting an analyte, and redox coloring reagents such as N-sulfopropylaniline derivatives are used. Similarly, the enzyme can be identified and is not limited to the mediator.
また、平面状の基板以外にも、ガーゼ、繊維綿等の含浸材でも同様な効果が期待される。図3は、ガーゼ21に前記試薬を1分間含浸させ前記条件にて乾燥させたもので、ADHの赤色結晶22はガーゼ内に点在してなることが示された。前記カメラと前記画像処理装置にて、ガーゼ内に占めるADHの面積と分布を割り出すことができる。
In addition to the planar substrate, the same effect is expected with an impregnating material such as gauze and fiber cotton. FIG. 3 shows that the
本発明にかかるバイオセンサは、バイオセンサにおける乾燥試薬層内に担持された酵素等のタンパク質の位置,量を検査装置で判定することが可能となるため、バイオセンサにおける製造工程内の品質安定化に有用である。 The biosensor according to the present invention makes it possible to determine the position and amount of a protein such as an enzyme supported in a dry reagent layer in the biosensor with an inspection device, so that quality stabilization in the manufacturing process of the biosensor is achieved. Useful for.
1、3 絶縁性の基板
2 空気孔
4 切欠部
5 スペーサ
6 対電極
7 測定電極
8 検知電極
9、19 試薬層
10 バイオセンサ
11 測定装置
12 試料点着部
13 挿入部
14 表示部
15 フェリシアン化カリウムの黄色結晶
16、22 ADHの赤色結晶
17 バイオセンサが複数繋がったシート
18 搬送装置
20 カメラ
21 ガーゼ
DESCRIPTION OF
Claims (10)
A method for inspecting the biosensor according to any one of claims 1 to 8, wherein an area of the reagent layer is calculated based on a captured image of a region where the reagent layer is formed in the biosensor, An inspection method, wherein an area of a colored portion by a heme dye is calculated from the image or a distribution of an enzyme having the heme dye is calculated.
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