JP4590957B2 - Method for promoting ligation reaction by DNA ligase and DNA ligase composition - Google Patents
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Description
本発明は，分子生物学の分野に属する。さらに詳しくはＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を促進させる方法、および、そのようなＤＮＡリガーゼ組成物に関する。 The present invention belongs to the field of molecular biology. More particularly, the present invention relates to a method for promoting a ligation reaction by DNA ligase and such a DNA ligase composition.
分子生物学の分野では，ＤＮＡ組換え体の作製において２本鎖ＤＮＡ断片の連結にＤＮＡリガーゼを利用することは，周知の技術であり，従来よりＴ４ ＤＮＡリガーゼ，大腸菌ＤＮＡリガーゼ等が用いられている。また，ＰＣＲ産物のクローニングも分子生物学の分野では一般的に実施されている方法である。ＰＣＲ産物とはＤＮＡポリメラーゼを用いて目的遺伝子断片を短時間に増幅する技術であるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られた多量の目的ＤＮＡ分子のことである。このようにして得られた目的のＤＮＡ分子を適当なベクターに連結してクローニングすることは，分子生物学の分野においては，遺伝子の構造及び機能解析を行う上で極めて重要である。 In the field of molecular biology, the use of DNA ligase for the ligation of double-stranded DNA fragments in the production of DNA recombinants is a well-known technique, and conventionally T4 DNA ligase, E. coli DNA ligase, etc. have been used. Yes. In addition, cloning of PCR products is also a method commonly performed in the field of molecular biology. A PCR product is a large amount of target DNA molecules obtained by the PCR (polymerase chain reaction) method, which is a technique for amplifying a target gene fragment in a short time using a DNA polymerase. In order to analyze the structure and function of a gene, it is extremely important in the field of molecular biology to link the target DNA molecule thus obtained to an appropriate vector for cloning.
従来よりＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結反応の効率向上のために種々の改良が検討されてきた。たとえば，ＤＮＡ連結反応時に，ポリエチレングリコール，およびポリアミン，１価カチオン，２価カチオンなどのいずれか１つを添加する方法が開示されている（たとえば，特許文献１を参照）。
また，一般的にＰＣＲ産物をクローニングするには，増幅された２本鎖ＤＮＡの３’末端にヌクレオチドを１個（ｄＡ）付加する形で生成させ，一方、ベクターＤＮＡの３’末端にも同様にヌクレオチドを１個（ｄＡと相補的なｄＴ）付加させておき，各々の突出末端の相補性を利用して連結させるＴ−Ａクローニングという方法が知られている（たとえば、特許文献２およびそのファミリーとしてＵＳ５４８７９９３、ＵＳ５８２７６５７などを参照）。
現在、プラスミドベクターＤＮＡの３’末端にｄＴを付加させたものは、一般的にＴ−ベクターと呼ばれている。Ｔ−ベクターは様々な遺伝子研究用試薬を取り扱う会社から販売されており、また、各研究者が自ら比較的簡単に作製することもできる。例えば、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）を制限酵素ＥｃｏＲＶの様な平滑末端を生じる制限酵素で切断し、これと同時にアルカリフォスファターゼにて３’末端を脱リン酸化した後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと高濃度のｄＴＴＰを加え、７２℃，３０分間反応してプラスミドベクターの３’末端にｄＴを付加してＴ−ベクターを調製することが
できる。
Currently, a plasmid vector DNA having dT added to the 3 ′ end is generally called a T-vector. T-vectors are sold by companies that handle various genetic research reagents, and each researcher can make them relatively easily. For example, the plasmid vector pBluescriptSK (+) is cleaved with a restriction enzyme that produces a blunt end such as the restriction enzyme EcoRV, and at the same time, the 3 ′ end is dephosphorylated with alkaline phosphatase, and then Taq DNA polymerase and a high concentration of dTTP are used. And react for 30 minutes at 72 ° C. to add dT to the 3 ′ end of the plasmid vector to prepare a T-vector.
また，このＴ−Ａクローニングでは通常ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとして良く知られているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが使用されるが，Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは生成する２本鎖ＤＮＡの末端にｄＡを付加するのでＴ−Ａクローニングでは有利である反面，エキソヌクレアーゼ活性を持たないため，ＰＣＲで生成する増幅ＤＮＡ産物には取り込まれたヌクレオチドの誤りが多く，正確性を欠くのが欠点である。ここで，エキソヌクレアーゼ活性とは，１本鎖ＤＮＡの３’側あるいは５’側から順次ヌクレオチド単位で分解する活性のことである。 In this TA cloning, Taq DNA polymerase which is well known as a DNA polymerase usually used for PCR is used. Since Taq DNA polymerase adds dA to the end of the double-stranded DNA to be produced, TA Although it is advantageous in cloning, it does not have exonuclease activity. Therefore, the amplified DNA product generated by PCR has many incorporated nucleotide errors, and it lacks accuracy. Here, the exonuclease activity is an activity that sequentially degrades in nucleotide units from the 3 'side or 5' side of single-stranded DNA.
これに対して，本発明者らはエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いるＴ−Ａクローニング方法を開発し特許出願を行った（たとえば、特許文献３を参照）。この方法では，エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いるため，生成するＰＣＲ産物のＤＮＡ末端は平滑末端となる。このままではＴ−Ａクローニングに供することができないため，ＰＣＲ後にエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制しておき，ＤＮＡ末端にヌクレオチドを１個付加させる反応を行わせ，Ｔ−Ａクローニングに供する。こうすることにより，正確な塩基配列を持ったＰＣＲ産物のＴ−Ａクローニングが可能となる。
本発明は従来技術のこのような課題を背景になされたものであり、ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結効率の高いライゲーション方法を提供すること、および、そのような効率の高いライゲーション反応を可能にするＤＮＡリガーゼ組成物を提供するものである。 The present invention has been made against the background of such problems in the prior art, and provides a ligation method with high DNA ligation efficiency using DNA ligase, and a DNA ligase that enables such a highly efficient ligation reaction. A composition is provided.
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＤＮＡ連結反応時にベタインを共存させることによりＤＮＡ連結効率を高めることができることを見出し，本発明を完成するに至った。
即ち本発明は，（１）ベタインを含むことを特徴とするＤＮＡリガーゼ組成物である。該組成においてさらに、２価金属イオン、動物血清タンパク質から選ばれる少なくとも１つ以上を含有する緩衝液を含有しても良いし、動物血清タンパク質が牛血清タンパク質であってもよい。あるいは、該組成物は、ライゲーション反応用の組成物、下記（３）に記載のクローニング方法用の組成物、あるいは、ＬＣＲ法用の組成物でありうる。
また本発明は、（２）ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とするＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を促進させる方法である。該方法においてさらに、２価金属イオン，動物血清タンパク質から選ばれる少なくとも１つ以上を含有する緩衝液を共存しても良いし、動物血清タンパク質が牛血清タンパク質であってもよい。あるいは、該方法は、下記（３）に記載のクローニング方法や、ＬＣＲ法の一部を構成する方法でありうる。
また本発明は、（３）ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングする方法において、ＤＮＡ連結反応時に、ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とする、ＰＣＲ産物をクローニングする方法である。
また本発明は、（４）下記組成を含む、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングするキットである。
（ａ）ＤＮＡリガーゼ
（ｂ）ベタインを含む緩衝液
（ｃ）プラスミドベクターまたはファージベクター
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the presence of betaine during the DNA ligation reaction can increase the DNA ligation efficiency, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is (1) a DNA ligase composition comprising betaine. The composition may further contain a buffer containing at least one selected from divalent metal ions and animal serum proteins, and the animal serum proteins may be bovine serum proteins. Alternatively, the composition may be a composition for ligation reaction, a composition for the cloning method described in (3) below, or a composition for the LCR method.
The present invention also relates to (2) a method for promoting a ligation reaction by DNA ligase, which comprises performing a DNA ligase reaction in the presence of betaine. In this method, a buffer containing at least one selected from divalent metal ions and animal serum proteins may coexist, and the animal serum protein may be bovine serum protein. Alternatively, the method may be a cloning method described in (3) below or a method constituting a part of the LCR method.
The present invention also relates to (3) a method of directly cloning a PCR product into a plasmid vector or phage vector, wherein the PCR product is cloned in the presence of betaine during the DNA ligation reaction. Is the method.
The present invention is also (4) a kit for directly cloning a PCR product into a plasmid vector or phage vector, comprising the following composition.
(A) DNA ligase (b) buffer containing betaine (c) plasmid vector or phage vector
本発明により、ＤＮＡ連結効率の高いライゲーション方法、および、そのような効率の高いライゲーション反応を可能にするＤＮＡリガーゼ組成物を提供できる。それによって、遺伝子工学領域におけるＤＮＡ連結反応の効率を顕著に向上させ，ひいてはＰＣＲ産物のクローニングの効率をも著明に向上させることができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a ligation method having a high DNA ligation efficiency and a DNA ligase composition that enables such a highly efficient ligation reaction. Thereby, the efficiency of the DNA ligation reaction in the genetic engineering region can be remarkably improved, and thus the efficiency of cloning of the PCR product can be remarkably improved.
以下、本発明を詳細に説明する。
ＤＮＡリガーゼとは，２本鎖ＤＮＡの５’リン酸末端と他の２本鎖ＤＮＡの５’水酸基末端との間でホスホジエステル結合を形成させる酵素であり，ＣｏｆａｃｆｏｒとしてＡＴＰを要求し、相補的塩基を持つＤＮＡどうし、平滑末端（Ｂｌａｎｔ Ｅｎｄ）どうしのいずれをも連結することができるＴ４ ＤＮＡリガーゼや，ＮＡＤを要求し、相補的塩基を持つＤＮＡどうしのみを連結する大腸菌ＤＮＡリガーゼなどが良く知られており、市販のものを容易に入手できる。そのほか耐熱性ＤＮＡリガーゼとしてストラタジーン社のＰｆｕ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社のＡｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（商品名）などが市販され、また、近年になって超好熱始原菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（アエロパイラム・ペルニックス）由来のものなどが報告されている。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
DNA ligase is an enzyme that forms a phosphodiester bond between the 5′-phosphate end of double-stranded DNA and the 5′-hydroxyl end of other double-stranded DNA, requires ATP as a cofacfor, and is complementary Well known are T4 DNA ligase that can ligate both DNA with bases and blunt ends, and E. coli DNA ligase that requires NAD and ligates only DNAs with complementary bases. Are commercially available. In addition, Pfu DNA ligase from Stratagene, Ampligase DNA Ligase (trade name) from Epicentre, etc. are commercially available as thermostable DNA ligases, and in recent years, they are derived from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix (Aeropyram pernicus) Etc. have been reported.
本発明で用いられるＤＮＡリガーゼとしてはどのようなリガーゼでも良いが，クローニングなど通常の遺伝子組み換えにおけるライゲーションの用途で好ましいのはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。 Although any ligase may be used as the DNA ligase used in the present invention, T4 DNA ligase is preferred for use in ligation in normal gene recombination such as cloning.
ところで、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列を増幅、検出する方法として、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）法が報告されている（たとえば、非特許文献１または２、および特許文献４を参照）。あるいは、別の方法としてギャップ充填ＬＣＲ法が報告されている（たとえば、特許文献５を参照）。
本願発明はこのような用途にも適用できると思われるが、その場合は耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることが好ましい。
ＬＣＲ法では、標的ＤＮＡの（＋）鎖（センス鎖）および（−）鎖（アンチセンス鎖）にそれぞれアニーリングする２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブ、計４種類のプローブを用いて反応を行う。具体的には、まず、４種類のプローブと鋳型ＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡリガーゼを含む反応液を（加熱）変性させ、それぞれを１本鎖に分離させる。続く冷却操作により、１本鎖に分離した鋳型ＤＮＡに２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブがアニーリングする。さらに、耐熱性ＤＮＡリガーゼによって隣り合うオリゴヌクレオチドプローブが連結する。この一連の反応を繰り返すことによってライゲーション産物（オリゴヌクレオチドプローブの連結産物）、すなわち標的ＤＮＡ配列が指数関数的に増幅される。
このとき、隣接するオリゴヌクレオチドプローブの３´末端が鋳型ＤＮＡと完全に相補的な場合にのみライゲーション反応が起こり、このライゲーション産物を鋳型にして標的ＤＮＡの特異的な増幅が起こるが、二つのオリゴヌクレオチドプローブの境界部位に鋳型とのミスマッチがあると、ライゲーションは起こらず、ＤＮＡの増幅は起こらない。
ＬＣＲで増幅した産物の確認は、ＤＮＡ色素（エチジウムブロマイドなど）で染色する方法や免疫複合体反応を利用する方法など、種々の公知の方法を利用できる。
Although it seems that this invention can be applied also to such a use, in that case, it is preferable to use heat-resistant DNA ligase.
In the LCR method, the reaction is performed using two types of adjacent probes, two types of oligonucleotide probes that anneal to the (+) strand (sense strand) and (−) strand (antisense strand) of the target DNA, respectively. . Specifically, first, a reaction solution containing four types of probes, template DNA, and heat-resistant DNA ligase is denatured (by heating), and each is separated into single strands. By the subsequent cooling operation, two adjacent oligonucleotide probes are annealed to the template DNA separated into single strands. Furthermore, adjacent oligonucleotide probes are linked by thermostable DNA ligase. By repeating this series of reactions, the ligation product (ligation product of oligonucleotide probes), that is, the target DNA sequence is exponentially amplified.
At this time, the ligation reaction occurs only when the 3 ′ end of the adjacent oligonucleotide probe is completely complementary to the template DNA, and specific amplification of the target DNA occurs using this ligation product as a template. If there is a mismatch with the template at the boundary site of the nucleotide probe, ligation does not occur and DNA amplification does not occur.
Various known methods such as a method of staining with a DNA dye (such as ethidium bromide) and a method of using an immune complex reaction can be used to confirm the product amplified by LCR.
ベタインというのは１つの分子中に陽イオンとしての第４級アンモニウムと、陰イオンとしてのカルボン酸を持った化合物の一般名であり、溶液中では双性イオンとして存在する。本発明においてはグリシンベタイン（トリメチルグリシン）が特に好ましく用いられる。ベタインをＤＮＡリガーゼ組成物に添加する濃度としては０．０１Ｍ以上が好ましく、特に好ましいのは０．５〜２Ｍの範囲である。 Betaine is a general name for a compound having quaternary ammonium as a cation and carboxylic acid as an anion in one molecule, and exists as a zwitterion in a solution. In the present invention, glycine betaine (trimethylglycine) is particularly preferably used. The concentration of betaine added to the DNA ligase composition is preferably 0.01M or more, and particularly preferably in the range of 0.5 to 2M.
本発明を好適に実施するには、さらに２価金属イオンおよび動物血清タンパク質から選ばれる物質の内、いずれか１つもしくは両者を添加することが好ましい。２価値金属イオンには、例えばＣａ++、Ｍｇ++、Ｍｎ++などが挙げられるが、特にＭｇ++が好ましい。ＤＮＡリガーゼ組成物としてはこれらをたとえばＭｇＣｌ2などの金属塩の形で添加する。添加する濃度としては、０．１ｍＭ以上が好ましく、特に１．０〜２０ｍＭが好適である。 In order to suitably carry out the present invention, it is preferable to add one or both of substances selected from divalent metal ions and animal serum proteins. Examples of the divalent metal ion include Ca ++ , Mg ++ , and Mn ++, and Mg ++ is particularly preferable. These are added as a DNA ligase composition in the form of a metal salt such as MgCl 2 . The concentration to be added is preferably 0.1 mM or more, particularly preferably 1.0 to 20 mM.
動物血清タンパク質とは、主にウサギ、ウシ、マウスなどの哺乳動物の血清タンパク質であり、アルブミン、グロブリンなどのタンパク質が挙げられる。本発明において特に好ましい動物血清タンパク質はウシ血清アルブミンである。これらの動物血清タンパク質をＤＮＡリガーゼ組成物に添加する濃度としては、０．０００１重量％以上であって、特に０．０１〜０．０５重量％が反応に好適な濃度である。 Animal serum proteins are mainly serum proteins of mammals such as rabbits, cows, and mice, and include proteins such as albumin and globulin. A particularly preferred animal serum protein in the present invention is bovine serum albumin. The concentration at which these animal serum proteins are added to the DNA ligase composition is 0.0001% by weight or more, and particularly 0.01 to 0.05% by weight is a suitable concentration for the reaction.
これらを適当な緩衝液、例えばｐＨ７．０から８．０のトリスー塩酸緩衝液などに添加してＤＮＡリガーゼ組成物を構成する。 These are added to an appropriate buffer, for example, Tris-HCl buffer having a pH of 7.0 to 8.0 to constitute a DNA ligase composition.
本発明はまた、このようなＤＮＡリガーゼ組成物を用いたＰＣＲ産物のクローニング方法でもある。本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いてＰＣＲ産物をクローニングするには、まず、標的とするＤＮＡおよびその一部と相補的な塩基配列を有するプライマーとを準備し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いてＰＣＲを行う。この際、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼも用いることができるが、その場合はＰＣＲ後に、例えば前記エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを特異的に阻害する抗体などを添加して前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制しておき、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどにより増幅で生成した２本鎖ＤＮＡの末端にｄＡを付加させる。このようにして最終的には末端にｄＡが１個付加されたＰＣＲ産物を得ることができる。次にベクターとしてはプラスミドベクター、ファージベクターなどいずれでも良いが、好適にクローニングを実施するためには、適当な制限酵素を用いて切断し、ｄＴの突出末端を持ったベクターを作製し、前記に取得したＰＣＲ産物と、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を混合してＤＮＡの連結反応を行わせる。所望の標的ＤＮＡがクローニングされた形質転換体を得るには、前記のＤＮＡ連結反応物を大腸菌に形質転換し、ベクターのマーカーを利用して生育してくる大腸菌コロニーを選別することにより達成することができる。本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いることにより、従来ＴＡクローニングで得られていた効率と比べて大幅に効率を増大することが可能となる。
例えば、挿入ＤＮＡとしてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによりλＤＮＡ由来の０．５ｋｂ、 １ｋｂ、 ２ｋｂのＤＮＡ断片を用いた実施例７の実験の場合、従来のＴＡクローニング効率より約１１〜６７％の効率を増大することが可能となる。
The present invention is also a method for cloning a PCR product using such a DNA ligase composition. In order to clone a PCR product using the DNA ligase composition according to the present invention, first, a target DNA and a primer having a base sequence complementary to a part thereof are prepared, and PCR is performed using Taq DNA polymerase or the like. I do. In this case, a DNA polymerase having exonuclease activity can also be used. In this case, after PCR, for example, an antibody that specifically inhibits the DNA polymerase having exonuclease activity is added to increase the activity of the DNA polymerase. Then, dA is added to the end of the double-stranded DNA generated by amplification with Taq DNA polymerase or the like. Thus, a PCR product having one dA added at the end can be finally obtained. Next, the vector may be either a plasmid vector or a phage vector, but in order to carry out the cloning appropriately, it is cut with an appropriate restriction enzyme to prepare a vector having a protruding end of dT. The obtained PCR product and the DNA ligase composition according to the present invention are mixed to perform a DNA ligation reaction. Obtaining a transformant in which the desired target DNA has been cloned is achieved by transforming the DNA ligation reaction product into E. coli and selecting E. coli colonies that grow using the vector marker. Can do. By using the DNA ligase composition according to the present invention, the efficiency can be greatly increased as compared with the efficiency conventionally obtained by TA cloning.
For example, in the case of the experiment of Example 7 using 0.5 kb, 1 kb, and 2 kb DNA fragments derived from λDNA by Taq DNA polymerase as the inserted DNA, the efficiency should be increased by about 11 to 67% from the conventional TA cloning efficiency. Is possible.
本発明において「ライゲーション反応が促進される」ことは、「ＤＮＡ連結効率が高まる」ということで示される。リガーゼのＤＮＡ連結活性を確認するためには種々の公知の方法が用いられうるが、例えば特許文献１の明細書２ページ右下１６行−３ページ左下７行に例示されているように、各リガーゼの反応に適した条件において、適当な基質を一定時間内に連結させる酵素量を単位として評価することができる。あるいは、実際に連結したＤＮＡの分子数またはＤＮＡの重量を計測することにより、確かめることができる。例えば、ＡというＤＮＡ分子とＢというＤＮＡ分子を連結して生まれたＡ＋ＢというＤＮＡ分子を定量することにより「ライゲーション反応の促進効果」を確かめることができる。以上のような定量実験ではラジオアイソトープを用いたトレーサー実験が一般的に行われている。 In the present invention, “the ligation reaction is promoted” is indicated by “the DNA ligation efficiency is increased”. Various known methods can be used for confirming the DNA ligation activity of ligase. For example, as exemplified in the specification, page 2, lower right line 16-page 3, lower left line 7 of Patent Document 1, Under the conditions suitable for the ligase reaction, the amount of enzyme that binds an appropriate substrate within a predetermined time can be evaluated as a unit. Alternatively, it can be confirmed by measuring the number of DNA molecules actually linked or the weight of DNA. For example, the “ligation reaction promoting effect” can be confirmed by quantifying the DNA molecule A + B produced by linking the DNA molecule A and the DNA molecule B. In the above quantitative experiment, a tracer experiment using a radioisotope is generally performed.
本発明において「ライゲーション反応が促進される」ことは、ＤＮＡリガーゼ反応がその全工程の一部を構成する方法において該方法の効率が向上することによっても示される。例えば、ＰＣＲ産物をクローニングする方法における「クローニング効率の向上」、あるいは、ＬＣＲ法における「増幅効率の向上」（増幅産物の生成量の増大や増幅時間の短縮など）などによっても示されうる。 In the present invention, “the ligation reaction is promoted” is also indicated by an improvement in the efficiency of the method in which the DNA ligase reaction constitutes a part of the whole process. For example, it can also be indicated by “improving cloning efficiency” in a method of cloning a PCR product, or “improving amplification efficiency” in the LCR method (increase in the amount of amplification product generated, shortening of amplification time, etc.).
本発明において、クローニングの効率とは形質転換された宿主細胞に現れる表現型を識別した上で、全ての形質転換体における外来ＤＮＡが挿入されたことを示す表現型を有する形質転換体の割合として表される。好ましくは、外来ＤＮＡ挿入部位がβ―ガラクトシダーゼ遺伝子内に存在するベクターを用いてクローニングを行い、形質転換させた大腸菌をβ―ガラクトシダーゼの基質を含む培地上でコロニー形成させた後、コロニーの青白を判定し、全コロニーに対する白コロニーの割合として求める。なお、クローニングの効率向上は、同じクローニング効率を得るために要する時間を短縮することによっても示されうる。 In the present invention, cloning efficiency refers to the ratio of transformants having a phenotype indicating that foreign DNA has been inserted in all transformants after identifying the phenotypes that appear in transformed host cells. expressed. Preferably, cloning is performed using a vector in which the foreign DNA insertion site is present in the β-galactosidase gene, and the transformed E. coli is colonized on a medium containing a substrate of β-galactosidase, and then the colony is turned blue or white. Determine and obtain as the ratio of white colonies to all colonies. The improvement in cloning efficiency can also be shown by shortening the time required to obtain the same cloning efficiency.
次に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to this.
実施例１
ＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加によるクローニング効率に及ぼす影響を検討
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）４単位を、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、 ０２ｍＭ ＡＴＰ、 ２０μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）緩衝液に溶解した組成物を調製した（ベタイン（−）組成物）。 次に、この組成物にベタインを終濃度１．０Ｍとなるように添加した組成物を調製した（ベタイン（＋）組成物）。
一方、 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて、プライマーλ−ｆ（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’）とλ０．５−ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’）を用いてＰＣＲを行い、λＤＮＡの０．５ｋｂ ＤＮＡ断片を調製し、前記の２種類のＤＮＡリガーゼ組成物を用いて自製化したＴベクターと２４℃、１時間反応させた。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを添加しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合は、クローニング効率が約３０％向上していた（表１）。
Example 1
Examination of the effect of betaine addition on cloning efficiency in DNA ligase reaction 4 units of T4 DNA ligase (Toyobo), 66 mM containing 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 02 mM ATP, 20 μg / ml bovine serum albumin (BSA) A composition dissolved in Tris-HCl (pH 7.6) buffer was prepared (betaine (−) composition). Next, a composition in which betaine was added to this composition to a final concentration of 1.0 M was prepared (betaine (+) composition).
On the other hand, PCR was performed with Taq DNA polymerase using primers λ-f (5′-GATGGAGTTCGTTCCGTACAACT-3 ′) and λ0.5-r (5′-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3 ′), and a 0.5 kb DNA fragment of λDNA Was prepared and reacted with a T vector produced using the above-mentioned two kinds of DNA ligase compositions at 24 ° C. for 1 hour. Using this reaction product, E. coli JM109 was transformed and cultured in an LB medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, 1 mM IPTG, and the resulting colonies were observed. As a result, the cloning efficiency was improved by about 30% when the DNA ligase composition according to the present invention was used compared to the DNA ligase composition to which no betaine was added (Table 1).
実施例２
ハイフィディリィティーＰＣＲ産物のＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加によるクローニング効率に及ぼす影響を検討
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）にてプライマーλ−ｆとλ２−ｒ（５’−ＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＴＣ−３’）を用いてＰＣＲを行い、λＤＮＡの２ｋｂ断片を増幅した。増幅後の反応液にそのまま、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼを特異的に中和抑制する抗体（東洋紡績製）とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを添加して、６０℃、 ３０分間反応させることにより、ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡを付加させた。次に、この反応液を実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物にて、２４℃、１時間、Ｔベクターとのリガーゼ反応を行った後、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合は、クローニング効率が約２０％向上していた（表２）。
Example 2
Examination of the effect of high- fidelity PCR products on the cloning efficiency of betaine addition in DNA ligase reaction Primers λ-f and λ2-r (5′-GATAGCTGTCGGTCATAGACTC-3 ′) with KOD-Plus-DNA polymerase (manufactured by Toyobo) ) Was used to amplify a 2 kb fragment of λDNA. An antibody (specifically manufactured by Toyobo) and Taq DNA polymerase that specifically neutralizes KOD-Plus-DNA polymerase and Taq DNA polymerase are added to the amplified reaction solution as it is, and reacted at 60 ° C. for 30 minutes. DA was added to the 3 ′ end. Next, this reaction solution was subjected to a ligase reaction with a T vector at 24 ° C. for 1 hour in the DNA ligase composition not containing betaine described in Example 1 and the DNA ligase composition containing betaine. Using this reaction product, E. coli JM109 was transformed and cultured in an LB medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, 1 mM IPTG, and the resulting colonies were observed. As a result, when the DNA ligase composition according to the present invention was used for the DNA ligase composition not containing betaine, the cloning efficiency was improved by about 20% (Table 2).
実施例３
ＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加による反応時間短縮の検討
実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、Ｔベクターを用いて、反応温度１６℃にて反応時間を変化して反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物ではベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と同レベルのクローニング効率を得るためには、２時間の反応時間が必要であった。これに対して、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、反応時間１５〜３０分で十分なリガーゼ反応が行われているようであり、既にクローニング効率が上限に達していた。（表３、図１）。
Example 3
Examination of reaction time reduction by addition of betaine in DNA ligase reaction DNA ligase composition not containing betaine and DNA ligase composition containing betaine as described in Example 1 and the same λ0.5 kb amplified DNA fragment and T vector were used. The reaction was carried out at a reaction temperature of 16 ° C. while changing the reaction time. Next, E. coli JM109 was transformed with this reaction product, and cultured on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, 1 mM IPTG, and the resulting colonies were observed. As a result, a DNA ligase composition not containing betaine required a reaction time of 2 hours in order to obtain the same level of cloning efficiency as a DNA ligase composition containing betaine. On the other hand, when the DNA ligase composition containing betaine according to the present invention is used, it seems that a sufficient ligase reaction is performed in a reaction time of 15 to 30 minutes, and the cloning efficiency has already reached the upper limit. It was. (Table 3, FIG. 1).
実施例４．
ベタイン添加によるリガーゼ反応時間の短縮の検討２
実施例１に記載のベタインを含有する緩衝液と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、Ｔベクターを用いて、反応温度１６℃にて反応時間を変化してリガーゼ反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、反応時間２分でも十分なリガーゼ反応が行われており、既にクローニング効率が上限に達していた（表４）。
Example 4
Study of shortening ligase reaction time by adding betaine 2
Using the buffer containing betaine described in Example 1, the same λ0.5 kb amplified DNA fragment, and the T vector, the ligase reaction was carried out at a reaction temperature of 16 ° C. while changing the reaction time. Next, E. coli JM109 was transformed with this reaction product, and cultured on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, 1 mM IPTG, and the resulting colonies were observed. As a result, a sufficient ligase reaction was performed even with a reaction time of 2 minutes, and the cloning efficiency had already reached the upper limit (Table 4).
実施例５．
ライゲーション反応におけるベタイン至適濃度検討
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて増幅したＰＣＲ産物と自製化したＴベクターを用いて、実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物に一定量のベタインを添加して、１６℃、 ５分間ライゲーション反応を行った。なお、λ１ｋｂ ＤＮＡ断片の増幅では、プライマーλ−ｆとλ１−ｒ（５’−ＧＣＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＧＣＡＡ−３’）を使用した。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、λＤＮＡ由来の０．５ｋｂ、λ１ｋｂのいずれの増幅産物を挿入ＤＮＡにした場合でも、終濃度０．５〜３Ｍのベタイン濃度でクローニング効率を増大する効果が見られた。そして、いずれの挿入ＤＮＡを用いた場合でも、その至適濃度は１Ｍであった。（表５、表６）。
Examination of optimum concentration of betaine in ligation reaction Using a PCR product amplified with Taq DNA polymerase and a self-made T vector, a certain amount of betaine was added to the DNA ligase composition containing no betaine described in Example 1. The ligation reaction was performed at 16 ° C. for 5 minutes. In the amplification of the λ1 kb DNA fragment, primers λ-f and λ1-r (5′-GCGTACCTTTGTTCTACGGGCAA-3 ′) were used. Next, E. coli JM109 was transformed with this reaction product, and cultured on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, 1 mM IPTG, and the resulting colonies were observed. As a result, even when either 0.5 kb or λ1 kb amplification product derived from λDNA was used as the inserted DNA, the effect of increasing the cloning efficiency was observed at a final concentration of 0.5 to 3 M betaine. And even if which insertion DNA was used, the optimal density | concentration was 1M. (Table 5, Table 6).
実施例６．
ポリエチレングリコール含有ライゲーションバッファーにおけるベタイン添加によるクローニング効率向上の検討
プロメガ社ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ添付の２ｘ バッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ、１０％ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）に１Ｍ ベタインを添加することにより、クローニング効率に変化が見られるか、実施例５と同様のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて増幅したλ１ｋｂのＰＣＲ産物と自製化したＴベクターを用いて検討した。ライゲーション反応は２４℃、５分あるいは２４℃、６０分行ない、その反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌ、 １ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。添付の２ｘ バッファーだけを用いた場合でも、反応時間５分でライゲーション反応は最大に達しているようであり、反応時間を伸ばすことによるクローニング効率の増大は見られなかった。一方、添付の２ｘ バッファーに１Ｍベタインを添加した場合には、クローニング効率が１．３倍〜１．５倍増大していた。以上の結果から、従来よりライゲーション効率を高める効果が明らかにされているアルコール類に加え、ベタインの様なアミノ酸類似体を添加することによりクローニング効率が更に増大できることが明らかとなった。（表７）。
Example 6
Examination of cloning efficiency improvement by addition of betaine in ligation buffer containing polyethylene glycol 2x buffer (60 mM Tris-HCl (pH 7.8), 20 mM MgCl 2 , 20 mM DTT, 2 mM ATP, 10% polyethylen glycol attached to Promega pGEM-T Vector System Whether or not the cloning efficiency was changed by adding 1M betaine to (1) was examined using a PCR product of λ1 kb amplified with Taq DNA polymerase similar to Example 5 and a self-made T vector. The ligation reaction is performed at 24 ° C. for 5 minutes or at 24 ° C. for 60 minutes, and the reaction solution is used to transform E. coli JM109, and the ligation reaction is performed on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin, 0.01% X-gal, and 1 mM IPTG. And the resulting colonies were observed. Even when only the attached 2 × buffer was used, the ligation reaction seemed to reach the maximum at a reaction time of 5 minutes, and the cloning efficiency was not increased by extending the reaction time. On the other hand, when 1 M betaine was added to the attached 2 × buffer, the cloning efficiency was increased 1.3 to 1.5 times. From the above results, it has been clarified that the cloning efficiency can be further increased by adding an amino acid analog such as betaine in addition to alcohols that have been clarified to increase the ligation efficiency. (Table 7).
実施例７．
市販Ｔベクターを用いたＴＡクローニングにおけるベタイン添加による効率への影響
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲを行い、先の実施例と同じプライマーを用いてλＤＮＡの０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、実施例１と同様のライゲーション反応液組成にて、市販Ｔベクター（プロメガ社、ｐＧＥＭ−Ｔ）と２４℃、１時間反応させた。この反応物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生育するコロニーを観察した。その結果、ベタインを添加しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、クローニング効率がそれぞれ４５％、 ６７％、１１％向上していた（表８）。
Example 7
Effect on efficiency of betaine addition in TA cloning using commercially available T vector PCR was performed with Taq DNA polymerase, and 0.5 kb, 1 kb and 2 kb DNA fragments of λ DNA were prepared using the same primers as in the previous examples. The same ligation reaction solution composition as in Example 1 was reacted with a commercially available T vector (Promega, pGEM-T) at 24 ° C. for 1 hour. Using this reaction product, E. coli DH5α was transformed and cultured on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin and 0.01% X-gal, and growing colonies were observed. As a result, when the DNA ligase composition containing betaine according to the present invention was used in comparison with the DNA ligase composition to which no betaine was added, the cloning efficiencies were improved by 45%, 67% and 11%, respectively ( Table 8).
実施例８．
市販Ｔベクターを用いたＴＡクローニングにおけるベタイン添加による反応時間への影響
実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、市販Ｔベクター（プロメガ社、ｐＧＥＭ−Ｔ）を用いて、反応温度２４℃にて反応時間を変化して反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２００μｇ／ｍｌ アンピシリン、 ０．０１％ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生育するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物では、反応時間を延長することにより、クローニング効率が増大する傾向が見られた。一方、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、反応時間５分でも十分なリガーゼ反応が行われているようであり、既にクローニング効率が上限に達していた。（表９、図２）。
Example 8 FIG.
Effect on reaction time by addition of betaine in TA cloning using commercially available T vector The DNA ligase composition not containing betaine and the DNA ligase composition containing betaine described in Example 1 are similar to λ0. Using a 5 kb amplified DNA fragment and a commercially available T vector (Promega, pGEM-T), the reaction was carried out at a reaction temperature of 24 ° C. while changing the reaction time. Next, Escherichia coli DH5α was transformed with this reaction product and cultured on an LB agar medium containing 200 μg / ml ampicillin and 0.01% X-gal, and growing colonies were observed. As a result, the DNA ligase composition not containing betaine tended to increase the cloning efficiency by extending the reaction time. On the other hand, when the DNA ligase composition containing betaine according to the present invention was used, it seems that sufficient ligase reaction was carried out even with a reaction time of 5 minutes, and the cloning efficiency had already reached the upper limit. (Table 9, FIG. 2).
本発明のＤＮＡリガーゼ組成物はＤＮＡの連結反応の効率を著しく向上させるため、一般的にＤＮＡのクローニングにおいて形質転換体の取得効率を改善することができる。特にＰＣＲ産物の直接クローニングにおいてはこれまでしばしばＤＮＡリガーゼの効率が悪く低い形質転換率であったものが、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いることにより、大幅に改善される。 Since the DNA ligase composition of the present invention significantly improves the efficiency of DNA ligation reaction, generally, the efficiency of obtaining a transformant can be improved in cloning of DNA. In particular, in direct cloning of PCR products, the efficiency of DNA ligase, which has often been low so far, has been greatly improved by using the DNA ligase composition according to the present invention.
Claims (3)
（ａ）ＤＮＡリガーゼ
（ｂ）０．５〜２Ｍのベタインを含む緩衝液
（ｃ）プラスミドベクターまたはファージベクター A kit for TA cloning a PCR product into a plasmid vector or phage vector, comprising the following composition.
(A) DNA ligase (b) Buffer containing 0.5-2M betaine (c) Plasmid vector or phage vector
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