JP4588695B2 - リパーゼの安定的な変異体 - Google Patents
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Description
置換前 置換後 位置
N V 166
A D 132
A V 68
L P 114
R S 147
V A 144
N D 120
したがって、本発明の主たる実施形態は、耐熱性、耐有機溶媒性、かつ耐高pH性を有し、かつ、分子量19443の配列番号2と、分子量19515の配列番号3と、分子量19456.9の配列番号4と、分子量19487の配列番号5と、分子量19470.9の配列番号6とを有する、新規のリパーゼ遺伝子変異体に関する。
(a)枯草菌からリパーゼ遺伝子を分離および精製するステップと、
(b)ステップ(a)において分離したリパーゼ遺伝子をベクターpJO290にクローニングするステップと、
(c)ステップ(a)において分離したリパーゼ遺伝子から、配列番号13を有するフォワードプライマーJOFと、配列番号14を有するリバースプライマーJORとを使用して、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発によって遺伝子変異体を生成するステップと、
(d)ステップ(c)において得た遺伝子変異体をプラスミドベクターpJO290にクローニングするステップと、
(e)ステップ(d)においてクローニングした遺伝子変異体を大腸菌JM109においてライゲーションを行うステップと、
を有する方法に関する。
適切なベクター中のリパーゼを発現している大腸菌細胞から、リパーゼを精製した。精製では、基本的に、フェニルセファロース(phenyl-sepharose)カラムに細胞ライセートを通過させた後、Mono−Sカラムに通過させる。リパーゼは、凝集しやすいタンパク質であり、タンパク質の凝集を避けるためタンパク質濃度を5mg/mL以下に維持することに特に注意した。リパーゼの精製は、小さな変更はあるが基本的に以前に記載されているように実行した(非特許文献31)。バチルス株(Bacillus strain)の培養濾液由来のリパーゼ、または大腸菌ライセート由来のリパーゼは、同じように処理した。野生型タンパク質および大腸菌からの変異タンパク質を精製する目的で、lipA遺伝子または突然変異遺伝子をpET21bにクローニングした。このためには、完全長の成熟タンパク質に対応する遺伝子を、プライマーPrNdeI(フォワードプライマー)(5’−CCATGATTACGCATATGGCTGAACACAA−3’)およびJOFによって増幅した。フォワードプライマーは、組換えNdeI部位(engineered NdeI site)を有している。さらに、このフォワードプライマーによって、リパーゼ遺伝子の先頭に、NdeI認識配列の一部であるATG配列の形で開始コドンが導入された。このことによって、枯草菌の培養上清から精製したタンパク質で見られるN末端のアラニンのすぐ前に、大腸菌に発現した成熟タンパク質ではメチオニンが導入された。野生型タンパク質と突然変異体とを増幅し、NdeIおよびBamHIで消化し、NdeIおよびBamHIで消化したpET−21bとライゲーションした。ライゲーションミックス(ligationmix)を大腸菌DH5αにトランスフォームし、プラスミドミニプレップ(plasmid miniprep)および制限消化によって導入されたクローンを選択した(図1および図2)。
リパーゼは、界面活性酵素(interfacially active enzyme)として知られている種類の酵素に属している。これらの酵素は、基質モノマーに対する活性は非常にわずかであるが、乳化状態のトリグリセリドや単分子膜などの不溶性基質に対しては、活性が劇的に増加する。この特性は、可溶性基質モノマーに対して作用する他の酵素と、リパーゼとが異なる点である。リパーゼの天然基質であるトリグリセリドは、単純な色原性分析を行う目的には好都合ではない。純粋なリパーゼの活性は、場合によっては、pHに感応する色素を使用してpHの変化を検出することによってモニターすることができる。しかしながら、そのような分析では、酵素源がライセートであり、pHを変化させうる別のプロセスが存在するときには、結果が複雑なものとなる。活性をモニターする目的には、p−ニトロフェニルエステルが最も都合がよい。短鎖エステルである酢酸p−ニトロフェニル(p-nitrophenyl acetate)と、長鎖エステルであるオレイン酸p−ニトロフェニル(PNPO)とを、一般的な合成方法(後述する)によって合成した。本分析においては、TritonX−100を可溶化剤として用いて、不溶性エステルであるPNPOを使用した。TritonX−100およびPNPOの共ミセル(co-micelle)は、バックグラウンドの加水分解量は少なく、また、高温においても安定であった。リパーゼの変異体をスクリーニングするための96ウェルプレート分析は、多数のサンプルをスクリーニングする目的に非常に有用であるが、活性の定量化はおおよそのものとなる。96ウェルスクリーニングにおいて得られた有望候補すべてを、チューブ分析(tube assay)において確認した。チューブ分析では、サンプル数は少ないが、比活性をより正確に計算することができる。
リパーゼ分析用に、以下の色原性基質を合成した。
1)オレイン酸p−ニトロフェニル
2)ステアリン酸p−ニトロフェニル(p-nitrophenylstearate)
3)カプリル酸p−ニトロフェニル(p-nitrophenylcaprylate)
脂肪酸、N,N’−メチルテトライルビスシクロヘキサミン(N,N'-methyltetrayl biscyclohexamine:ジシクロヘキシルカルボジイミド、DCC)、N,N’−ジメチルアミノピリジン(N,N'-dimethylamino pyridine:DMAP)、およびp−ニトロフェニルのモル比は、1:1:1:2であった。脂肪酸を、20mLの無水DCMと数mLのクロロホルムとが入った丸底フラスコに入れた。混合物を2分間攪拌した後、DCCを加えた。白い沈殿物が形成された。この後、DMAPを加えた。その後、p−ニトロフェニルを加えると、黄色の沈殿物が形成された。反応容器を窒素で満たし、5時間攪拌した。反応の進行を、薄膜クロマトグラフィーでモニターした。反応の完了後、無水状態までDCMを蒸発させ、カラムクロマトグラフィによってエステルを精製した(シリカゲルカラム、石油エーテル−アセトンによる溶出)。生成物の純度および特性を、1H−NMR分光法によって確認した。
変異PCRによって生成したPCR産物をクローニングしたものから得られたコロニーを、別の同様のプレートに植え継ぎ(patched on)、25μg/mLのクロラムフェニコールおよび0.2%グルコースを含む200μLの2XYTを含むマイクロタイタープレートの個別のウェル中で同時に植菌した。200rpmで継続的に振動させながら、マイクロタイタープレート中で24時間にわたり細胞を成長させた。24時間後、各ウェルからの5μLの培養液をとり、25μg/mLのクロラムフェニコールを含有する200μLの2XYTを入れた別のマイクロタイタープレートの対応するウェルに加えた。3時間成長させた後、培養物を1mMのIPTGで発現誘導した。さらに3時間後、各ウェルからの25μLの培養液をとり、25μLのリン酸緩衝液(pH7.0)を入れた2枚の新たなマイクロタイタープレートの対応するウェルに入れた。プレートのうちの1枚を、高温に20分間さらし、氷上で15分間冷やした後、室温にした。他方のプレートは、室温で保持した。上述したように調合した25μLのPNPO−TritonX−100基質溶液を、各ウェルに加えた。プレートを37℃でインキュベートし、ELISAリーダーで405nmにおける吸光度を所定の時間間隔で記録した。野生型タンパク質(または生成元の親)の活性の20%未満を示すクローンは、以降の検討から除外した。高温にさらした後の各クローンの残留活性を計算した。最高の残留活性を示したクローンを、次の段階のスクリーニング用として選択した。
マイクロタイタープレートレベルのスクリーニングにおいて最高の残留活性を示したコロニーを、25μg/mLのクロラムフェニコールおよび0.2%グルコースを含む5mLの2XYT培養液中で、12時間成長させた。この一晩成長させた培養液のうちの100μLを25μg/mLのクロラムフェニコールおよび0.2%グルコースを含む10mLの2XYTに植菌した。2.5時間成長させた後、1.5mMのIPTGによって培養している細菌の遺伝子発現を誘導し、さらに2.5時間後に回収した。細胞ペレットをSTEによって洗浄し、1mLの0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)中で再懸濁した。ブランソン社製の超音波処理機で、細胞の懸濁液に対し、間にそれぞれ1分間の冷却時間を含む30秒の4回のパルスを与え、超音波処理を行った。サンプルの超音波処理および冷却中は、チューブを氷上に維持した。超音波処理したサンプルを、15,000rpmで45分間遠心分離し、得られた上清を分析に使用した。上清を250μLの4つのアリコート(試料)に分けた。3つのアリコートを高温にさらし、4番目のアリコートを氷上に保持した。チューブを高温に20分間さらし、氷上で冷却し、4℃、15,000rpmで遠心分離した。室温になるまで放置した後、酵素活性を分析した。p−ニトロフェニルを基質として使用し、細胞ライセート内のリパーゼの活性をリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で室温にて求めた。酵素の活性は、時間の経過に伴う405nmにおける吸光度の変化を追跡することによって測定した。リパーゼ遺伝子が含まれていない以外は上述したものと同じように処理した細胞ライセートを使用して、大腸菌細胞ライセート中のオレイン酸p−ニトロフェニルのバックグラウンドの加水分解量を求めた。酵素の活性値からバックグラウンドの加水分解量の値を減じた。Lowry法によって細胞ライセート内の総タンパク質量を求め、それを使用して活性を標準化した。
酵素を高温にさらした後、室温にて活性を分析することにより、通常は、酵素の耐熱性が分析される。高温では、タンパク質は変性し、不可逆的に折りたたみ構造が壊れる。耐熱性の酵素は、熱変性を起こりにくくするさらなる安定化相互作用を持つ。残っている活性を残留活性といい、残留活性は、温度の上昇にともなって減少し、また、特定の温度においては時間の経過にともなって減少する。プログラマブルなサーマルサイクラー(GeneAmp PCR system 9700)を用いて、サンプルの温度を正確に制御することができるように0.2mlの薄壁PCRチューブの中で、精製したタンパク質の熱処理を行った。0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に0.05mg/mLの濃度になるようにタンパク質を用意した。各チューブに、25μLのタンパク質サンプルを入れた。タンパク質を必要な時間だけ加熱し、4℃で20分間冷却し、遠心分離し、室温にした後、酵素活性を分析した。加熱処理した20μLのタンパク質サンプルを、2mMの酢酸p−ニトロフェニルを含む1mLの0.05Mリン酸ナトリウム(pH7.2)に加えた。405nmにおける吸光度の増大の割合をモニターし、酵素の活性を25℃で測定した。一般的には、不活性化は、活性の80%以上が失われてしまうまで続く。時間に対する対数(残留活性)のプロットは線形であった。不活性化の速度定数(kinact)を傾きから取得し、半減期をt1/2=log2/kinactとして計算した。得られた様々な突然変異体の半減期は図面(図6および図7)に示してあり、この場合、PNPAを基質として使用して残留活性を求めた。酵素の突然変異体は、55℃にさらした。図8は、基質としてオリーブオイルを使用した場合の、3つの突然変異体の残留活性に関して得られたデータを示している。活性は、pHスタット機器を使用して測定した。このデータは、突然変異体に見られる耐熱性の向上が基質および分析の特性には依存しないことを示している。
適切な量の不溶性のp−ニトロフェニルエステルとTritonX−100の重量をガラスバイアル中で計り、エステルがTritonX−100に完全に溶解するまで磁気攪拌子によって混合した。攪拌しながら緩衝液をゆっくり加えて、0.4mMのp−ニトロフェニルエステルと40mMのTritonX−100を含む2×ストック溶液を調合した。このようにして調合した基質溶液は、見た目は透明であった。水溶性の酢酸p−ニトロフェニルの100×基質原液をアセトン中で調整し、各反応には2mMの酢酸p−ニトロフェニルを使用した。TritonX−100が存在していない状態で反応を行い、動態パラメータを求めるための測定のすべては、この反応系によって行った。
オリーブオイルを用いての分析は、pHスタット機器によって行った。リパーゼが作用すると、プロトンが放出されるために反応溶媒のpHが下がる。pHの低下は、既知の量のアルカリを加えることによって中和することができる。アルカリを加える割合は、リパーゼの活性を表す。リパーゼの基質は、アラビアゴム(0.5%)、オリーブオイル、およびCaCl2を混合することによって調整した。均一なエマルジョンが得られるまで、混合物に対して浴槽中で超音波処理を行った。各分析には10mLの基質を使用した。分析の開始時、アルカリを加えることによって基質のpHを8.4にした。1mg/mLの酵素溶液を10mL加えることによって反応を開始させた。反応速度は、時間に対するアルカリ量の曲線の傾きから計算した。アルカリとして1Nの水酸化ナトリウム溶液を使用した。
枯草菌由来のLipAの配列(その生成物が本発明における対象のリパーゼ遺伝子である)は、公開されている。枯草菌では、LipAが細胞の外に放出されることを助けるシグナル配列が配列のN末端に存在するため、LipA遺伝子産物は培養液に分泌される。バチルス属の分子生物学は研究が進んでおり、それらはグラム陽性株である。形質転換、クローニング、遺伝子発現など分子生物学上の一般的な手法について、バチルス属での研究は、大腸菌と比較すると遅れている(非特許文献31、非特許文献32)。最も難しいのは、バチルス属の菌をプラスミドによって形質転換することである。効率は、大腸菌と比較すると桁違いに低い。さらに、観察される効率は、電気穿孔法によって検出できるのみであり、この方法は比較的厳しい(harsher)方法である。大腸菌では、形質転換効率が高く、再現性があり、そしてプラスミドの選択肢は広い。様々な遺伝子操作を行う目的で、大腸菌を使用した。
本発明における重要なステップは、遺伝子に変異を導入する能力にある。生成される変異は、機能的に有効な変異体を得るのに「十分である」必要がある。酵素は、数百万年の時間を経て進化してきたものであり、この過程の中で、有害な突然変異を試してそれを回避したり、有益な突然変異を試して組み込んだりしてきた。また、遺伝子の突然変異のほとんどは、サイレント、すなわち、突然変異によってアミノ酸配列が変化しない変異と考えられている。ランダム変異導入法においては、遺伝子配列中の変異として、非サイレントな突然変異につながる変異、および、遺伝子産物が機能しなかったり形成できなかったりする過度な変異を得ることが重要である。変異PCRに基づく変異導入法は、リパーゼの活性について十分な変異を得られるように最適化する必要がある。定方向進化法が有効なものとなるかどうかは、この変数を制御することに強く依存する。本発明の実施例において使用する手法は、公開されている手法を修正したものである。
改良したPCR法によって、pET−21bにクローニングしたリパーゼ遺伝子に対して部位特異的突然変異誘発を行った(ChenおよびArnold(1991年))。それぞれの置換について、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し(ミスマッチプライマー)、5’PCRプライマーと3’PCRプライマーとの間で鎖の伸長を開始させた。最初のPCRにおいては、ミスマッチプライマーと3’プライマーとを使用して、新しい塩基置換を含むDNA断片を生成した。この断片を、アガロースゲル電気泳動法によってテンプレートおよびプライマーから分離して精製し、それを、第2のPCRにおいて5’プライマーと一緒に新しい3’プライマーとして使用し、完全長の生成物を生成した。変異タンパク質を発現させる目的で、この生成物をpET−21bにクローニングした。
リパーゼ遺伝子の位置910における固有の制限部位HaeIIを使用することによって、クローン2−8G10および野生型から突然変異遺伝子配列5を作成した。T7プロモータープライマーおよびT7ターミネータープライマーを使用して、2種類のタンパク質をコードする遺伝子をPCRによって増幅した。PCR産物をゲル抽出法によって精製し、HaeIIおよびNdeIで消化した。上のバンドと下のバンドは、それぞれ、タンパク質のC末端ドメインとN末端ドメインに対応する。クローン2−8G10由来の上のバンドと野生型タンパク質からの下のバンドとを溶出させた。分子量の大きい断片を、BamHIによって消化して精製した。NdeI−HaeII断片(野生型由来)と、HaeII−BamHI断片(2−8G10由来)と、NdeIおよびHaeIIによって切断されたpET−21bを含む3点でライゲーションを行った。ライゲーションミックスをDH5αにトランスフォームし、形質転換したものを選択した。DNAシーケンシングによって遺伝子の配列を確認した。
すべての動態測定は、水溶性の基質酢酸p−ニトロフェニルを用いて、サーモスタット式の分光光度計を使用して行った。様々な濃度における酢酸p−ニトロフェニルの25℃における加水分解の初期速度を、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で求めた。Kmおよびkcatの値を、対応するラインウィーバー・バーク・プロットから導いた。野生型および突然変異体によって得られた動態パラメータを図9に示す。
様々な溶媒の存在下におけるリパーゼおよびその突然変異体の活性を調べた。テストした有機溶媒は、アセトニトリル、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドであった。活性の分析は、基質としてPNPAを使用して行った。緩衝溶液(50mM、pH8.0)中に様々な割合(v/v)で有機溶媒を含む溶液に基質(2mM)を溶解させ、濃度0.246mg/mLになるようにリパーゼを加えることによって反応を開始させた。410nmにおける吸光度の増大として活性をモニターし、曲線の最初の傾きを使用して比活性を計算した。図10および図11は、アセトニトリルを用いた場合に得られたデータを示している。
ここまで、本発明の典型的な実施形態を説明してきたが、本明細書の開示内容は典型的なものに過ぎず、当業者は本発明の範囲内で様々な変更、適合化、および修正を行うことができることに留意されたい。したがって、本発明は、本明細書に説明した特定の実施形態に限定されない。
Claims (45)
- 分子量19443の配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19515の配列番号17のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19456.9の配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19487の配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および分子量19470.9の配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドである、リパーゼ変異体。
- 45〜95℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55〜90℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項2記載のリパーゼ変異体(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、6〜685分の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、7〜677分の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.50〜2.5mMの範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.63〜1.96mMの範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、4.5×10−2〜8.5×10−2min−1の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、5×10−2〜8.1×10−2min−1の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4×10−2〜10×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4.1×10−2〜9.7×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体は、アセトニトリル、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドから成る群から選択される有機溶媒の存在下においた後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記残留活性は、前記有機溶媒を含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 使用される有機溶媒は、アセトニトリルである、請求項12記載のリパーゼ変異体。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で25〜100%の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記残留活性は、20%のアセトニトリルを含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で28.7〜85.5%の範囲にある、請求項1記載のリパーゼ変異体(ここで、前記残留活性は、前記有機溶媒を含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- リパーゼ変異体の発現系であって、ベクター中に存在する、配列番号2の塩基配列、配列番号3の塩基配列、配列番号4の塩基配列、配列番号5の塩基配列、および配列番号6の塩基配列からなる群から選択される塩基配列からなるリパーゼ遺伝子変異体を有する、発現系。
- 前記リパーゼ変異体は、45〜95℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項16記載の発現系(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体は、55〜90℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項17記載の発現系(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、6〜685分の範囲にある、請求項16記載の発現系(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、7〜677分の範囲にある、請求項19記載の発現系(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.50〜2.5mMの範囲にある、請求項16記載の発現系(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.63〜1.96mMの範囲にある、請求項21記載の発現系(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、4.5×10−2〜8.5×10−2min−1の範囲にある、請求項16記載の発現系(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、5×10−2〜8.1×10−2min−1の範囲にある、請求項23記載の発現系(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4×10−2〜10×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項16記載の発現系(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4.1×10−2〜9.7×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項25記載の発現系(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体は、アセトニトリル、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドから成る群から選択される有機溶媒の存在下においた後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項16記載の発現系(ここで、前記残留活性は、前記有機溶媒を含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 使用される有機溶媒は、アセトニトリルである、請求項27記載の発現系。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で25〜100%の範囲にある、請求項16記載の発現系(ここで、前記残留活性は、20%のアセトニトリルを含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で28.7〜85.5%の範囲にある、請求項29記載の発現系(ここで、前記残留活性は、20%のアセトニトリルを含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 分子量19443の配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19515の配列番号17のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19456.9の配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、分子量19487の配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および分子量19470.9の配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選択されるリパーゼ変異体の発現系を組む方法であって、
(a)枯草菌バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)からlipA遺伝子を分離および精製するステップと、
(b)ステップ(a)において分離したlipA遺伝子をベクターにクローニングするステップと、
(c)ステップ(a)において分離したlipA遺伝子から、配列番号13の塩基配列からなるフォーワードプライマーJOFと、配列番号14の塩基配列からなるリバースプライマーJORとを使用して、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発によって遺伝子変異体を生成するステップと、
(d)ステップ(c)において得た前記遺伝子変異体をプラスミドベクターにクローニングするステップと、
(e)ステップ(d)においてクローニングした前記遺伝子変異体を大腸菌JM109においてライゲーションを行うステップと、
を含んでいる、方法。 - 前記リパーゼ変異体は、45〜95℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項31記載の方法(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体は、55〜90℃で加熱処理した後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項32記載の方法(ここで、前記残留活性は、加熱処理されたリパーゼのオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、6〜685分の範囲にある、請求項31記載の方法(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 55℃で加熱処理したときの前記リパーゼ変異体のT1/2値は、7〜677分の範囲にある、請求項34記載の方法(ここで、前記T1/2値は、55℃で加熱処理された前記リパーゼ変異体のオレイン酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.50〜2.5mMの範囲にある、請求項31記載の方法(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のKm値は、0.63〜1.96mMの範囲にある、請求項36記載の方法(ここで、前記Km値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、4.5×10−2〜8.5×10−2min−1の範囲にある、請求項31記載の方法(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat値は、5×10−2〜8.1×10−2min−1の範囲にある、請求項38記載の方法(ここで、前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4×10−2〜10×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項31記載の方法(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体のkcat/Km値は、4.1×10−2〜9.7×10−2mM−1min−1の範囲にある、請求項40記載の方法(ここで、前記Km値および前記kcat値は、前記リパーゼ変異体の酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を25℃、pH7.2で測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体は、アセトニトリル、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドから成る群から選択される有機溶媒の存在下においた後の残留活性がバチルス・ズブチリス由来の野生型のLipAよりも高い、請求項31記載の方法(ここで、前記残留活性は、前記有機溶媒を含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 使用される有機溶媒は、アセトニトリルである、請求項42記載の方法。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で25〜100%の範囲内である、請求項31記載の方法(ここで、前記残留活性は、20%のアセトニトリルを含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
- 前記リパーゼ変異体の残留活性は、アセトニトリルの存在下で28.7〜85.5%の範囲内である、請求項44記載の方法(ここで、前記残留活性は、20%のアセトニトリルを含むpH8.0の緩衝液中で30分間インキュベートした後の、リパーゼの酢酸p−ニトロフェニルに対する酵素活性を測定して得られるものである)。
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