JP4583356B2 - Method for measuring interaction between coupling element, biosensor and biological material - Google Patents

Description

本発明は、生体物質間の相互作用を検出するための結合素子、バイオセンサ及び生体物質間の相互作用測定方法に関するもので、詳細には、脂質膜たんぱく質をレセプターと、これをリガンドとする物質との相互作用をより正確に測定するためのものである。   The present invention relates to a binding element for detecting an interaction between biological materials, a biosensor, and a method for measuring an interaction between biological materials, and more specifically, a substance using a lipid membrane protein as a receptor and a ligand as a receptor It is for measuring the interaction with the more accurately.

本明細書において、生体物質というのは、生命現象にかかわる物質一般を指す。生体物質としては、核酸、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、単糖、２単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど多種多様な物質が挙げられる。生命科学の分野では生体物質ごとの特性を明らかにし、生命現象を再構築することで生命現象全体を理解できると考えられてきたため、様々な分離法や検出法によって支えられてきた。一方で、20世紀後半より急速に発展したゲノム研究をはじめとするオーミクス研究では、生命現象を構成する要因は遺伝子だけでも数万に及び、これ以外にもゲノム情報に依存せず機能する物質間での相互作用は膨大な数にのぼることが明らかになりつつある。このため、生命現象は生体物質間の複雑な相互作用の結果により構築されているという古典的な解釈が再浮上している。
複雑な生体物質間の相互作用を理解するためには、個々の素反応を詳細に解析し、理解することが不可欠で、膜タンパク質をレセプターとする生体物質間の相互作用を解析することも非常に重要な意味を持つ。細胞は細胞膜によって外部と遮断されているが、完全な不透過膜ではなく外部からの色々な刺激を受け（受容）生命現象における重要な機能を担っている。生体膜の機能の多くは脂質中に存在する膜タンパク質が担っており、これらは全タンパク質の30%を占めている。つまり、情報伝達やイオン輸送、薬剤***等の細胞機能は膜タンパク質が担っており、新規薬剤の開発や病気の原因を特定するために、膜タンパク質と相互作用をする物質を解析することは重要な技術である。
生体物質の相互作用を検出する方法としては、溶液系の反応場で検出する方法と固相表面を反応場とし測定する方法がある。前者の方法では、分子間が相互作用した際に生じる熱量を測定する等温滴定カロリメトリー法、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によって分子の構造変化をモニターする方法、蛍光共鳴エネルギー転移法が挙げられる。また、共焦点レーザーを用いてごく微小領域の蛍光を検出し、その蛍光強度の揺らぎの速さから分子の大きさに関する情報を求め、相互作用を検出する方法がある。
固相表面を反応場として生体物質間相互作用を検出する方法として、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子を利用した方法が挙げられる。表面プラズモン共鳴センサは、金属薄膜に全反射する光を入射した際に生じる微弱なエネルギー波（エバネッセント波）が誘電体と接触している金属表面における粗密波と共鳴する事で全反射光が減衰する現象（表面プラズモン共鳴現象）を応用する。表面プラズモン共鳴現象は金属薄膜表面の誘電率によって入射光の角度が変化するため、生体物質間の相互作用を金属薄膜表面の誘電率変化としてモニターする事ができる。水晶振動子は、水晶板の圧電効果を利用し、水晶板に一定の電圧を印加することで一定の周波数で発振する素子を用いる。水晶板表面に負荷される質量や粘性及び弾性の変化によって周波数が変化し、生体分子が相互作用した際に生じる質量負荷の変化を周波数として検出することができる。この他に、表面の屈折率を計測するエリプソメーター、二面編波式干渉法、表面弾性波を利用した方法がある。これら固相表面を反応場として生体物質間相互作用を検出する方法では、測定試料を蛍光等の標識をすることなく測定することができるため、有効な手段である。 In this specification, a biological substance refers to a general substance related to a life phenomenon. Biological substances include nucleic acids, RNA such as mRNA, oligopeptides such as amino acids, dipeptides and tripeptides, polypeptides such as proteins, saccharides such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides, and hormones such as steroids. And various substances such as neurotransmitters such as noradrenaline, dopamine and serotonin, other endocrine disruptors, various drugs, potassium, sodium, chloride ions, hydrogen ions. In the field of life science, it has been thought that it is possible to understand the whole life phenomenon by clarifying the characteristics of each biological substance and reconstructing the life phenomenon, and thus it has been supported by various separation methods and detection methods. On the other hand, in omics research, including genome research that has developed rapidly since the latter half of the 20th century, there are tens of thousands of factors that make up life phenomena, and there are other functions between substances that do not depend on genomic information. It is becoming clear that there are a huge number of interactions. For this reason, the classical interpretation that life phenomena are constructed by the result of complex interactions between biological materials has resurfaced.
In order to understand the interactions between complex biological materials, it is essential to analyze and understand each elementary reaction in detail, and it is also very important to analyze the interactions between biological materials that use membrane proteins as receptors. It has an important meaning. Although the cells are blocked from the outside by the cell membrane, they are not completely impermeable membranes, but receive various stimuli from the outside and have an important function in (receptive) life phenomena. Many of the functions of biological membranes are carried by membrane proteins present in lipids, which account for 30% of all proteins. In other words, membrane proteins are responsible for cell functions such as information transmission, ion transport, and drug excretion, and it is important to analyze substances that interact with membrane proteins in order to develop new drugs and identify the cause of diseases. Technology.
As a method for detecting the interaction of biological substances, there are a method for detecting in a solution reaction field and a method for measuring using a solid phase surface as a reaction field. Examples of the former method include an isothermal titration calorimetry method for measuring the amount of heat generated when molecules interact with each other, a method for monitoring molecular structural changes by nuclear magnetic resonance (NMR), and a fluorescence resonance energy transfer method. Further, there is a method of detecting an interaction by detecting fluorescence in a very small region using a confocal laser, obtaining information on the size of the molecule from the speed of fluctuation of the fluorescence intensity.
Examples of a method for detecting an interaction between biological substances using a solid phase surface as a reaction field include a surface plasmon resonance method and a method using a crystal resonator. The surface plasmon resonance sensor attenuates the total reflected light by resonating the weak energy wave (evanescent wave) generated when the totally reflected light is incident on the metal thin film with the dense wave on the metal surface in contact with the dielectric. Apply the phenomenon (surface plasmon resonance phenomenon). In the surface plasmon resonance phenomenon, since the angle of incident light changes depending on the dielectric constant of the metal thin film surface, the interaction between biological materials can be monitored as the dielectric constant change of the metal thin film surface. The crystal resonator uses an element that oscillates at a constant frequency by applying a constant voltage to the crystal plate using the piezoelectric effect of the crystal plate. The frequency changes due to changes in mass, viscosity, and elasticity loaded on the quartz plate surface, and a change in mass load that occurs when biomolecules interact can be detected as a frequency. In addition, there are an ellipsometer for measuring the refractive index of the surface, a two-sided knitting wave interferometry, and a method using surface acoustic waves. The method of detecting the interaction between biological materials using the solid surface as a reaction field is an effective means because the measurement sample can be measured without labeling such as fluorescence.

上記した生体物質間相互作用検出手段によれば、特異性、親和性、動力学解析、熱力学パラメータに関する情報を得ることができ、結合メカニズム或いは複合体形成に関与する知見を得ることができる。例えば、抗体のエピトープマッピングやリガンドとレセプターの結合特性を知ることが可能で、治療候補薬のスクリーニングなどにも応用されている。 According to the above-described biological substance interaction detection means, information on specificity, affinity, dynamic analysis, and thermodynamic parameters can be obtained, and knowledge relating to the binding mechanism or complex formation can be obtained. For example, it is possible to know the epitope mapping of an antibody and the binding characteristics of a ligand and a receptor, and it is also applied to screening for therapeutic candidates.

そのなかでも、脂質膜たんぱく質であるレセプターとリガンド物質との相互作用では、脂質膜たんぱく質はリン脂質と複合体を形成していることから脂質表面自体が反応場となり、複雑な相互作用を示すことが知られており、リガンド、レセプター間のより正確な相互作用を計測する手段が求められている。   Among them, in the interaction between the receptor, which is a lipid membrane protein, and a ligand substance, since the lipid membrane protein forms a complex with phospholipid, the lipid surface itself becomes a reaction field and shows a complex interaction. There is a need for a means for measuring a more accurate interaction between a ligand and a receptor.

そこで、本発明は、リガンド物質と脂質膜たんぱく質であるレセプターとの相互作用をより正確な動力学解析や親和性解析を行うための新しい測定系を提供することを目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a new measurement system for performing more accurate kinetic analysis and affinity analysis of the interaction between a ligand substance and a receptor which is a lipid membrane protein.

本発明は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果、次の通り解決手段を見いだした。
本発明の結合素子は、請求項１に記載の通り、脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定するために使用される結合素子であって、前記リガンド物質は脂質に結合され、結合定数が１×１０ ^３ 以上である安定状態の複合体であることを特徴とする。
また、請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の結合素子において、前記脂質は粒子状のリポソームであることを特徴とする。
また、本発明のバイオセンサは、請求項３に記載の通り、請求項１に記載の結合素子の前記脂質側を、固相表面の物理的特性の変化を測定可能なセンサの前記固相表面に固定化したことを特徴とする。
また、本発明の生体物質間相互作用の測定方法は、請求項４に記載の通り、脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記レセプターを固相表面に固定化して、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上である安定状態の複合体である結合素子とし、前記レセプターと前記リガンド物質との反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする。
また、本発明の生体物質間相互作用の測定方法は、請求項５に記載の通り、脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子の前記脂質側を固相表面に固定化し、前記レセプターと前記リガンド物質との反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする。
また、本発明の生体物質間相互作用の測定方法は、請求項６に記載の通り、脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記レセプターを固相表面に設け、前記リガンド物質を脂質に結合させることにより得られる結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子と、前記レセプターとの反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする。
また、本発明の生体物質間相互作用の測定方法は、請求項７に記載の通り、脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子とし、前記レセプターに蛍光物質を標識して、蛍光相間分光法により前記結合素子と前記レセプターとの結合を測定することを特徴とする。 As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present invention has found a solving means as follows.
The binding element of the present invention is a binding element used for measuring the interaction between a receptor that is a lipid membrane protein and the ligand substance, as defined in claim 1, wherein the ligand substance binds to lipid. And a stable state complex having a coupling constant of 1 × 10 ³ or more .
The present invention described in claim 2 is characterized in that, in the coupling element according to claim 1, the lipid is a particulate liposome.
Moreover, the biosensor of the present invention is the solid phase surface of the sensor capable of measuring a change in physical properties of the solid phase surface on the lipid side of the binding element according to claim 1 as described in claim 3. It is characterized by being fixed to.
The method for measuring an interaction between biological substances according to the present invention is a method for measuring an interaction between a receptor which is a lipid membrane protein and the ligand substance as defined in claim 4, wherein the receptor is immobilized on a solid phase. Immobilizing the ligand substance to a lipid to form a binding element that is a complex in a stable state having a binding constant of 1 × 10 ³ or more, and reacting the receptor with the ligand substance on the solid phase surface It measures based on the change of the physical characteristic of.
In addition, the method for measuring an interaction between biological substances according to the present invention is a method for measuring an interaction between a receptor which is a lipid membrane protein and the ligand substance, as defined in claim 5, wherein the ligand substance is a lipid. The lipid side of the binding element, which is a complex in a stable state having a binding constant of 1 × 10 ³ or more, is immobilized on the solid phase surface, and the reaction between the receptor and the ligand substance is performed on the physical surface of the solid phase surface. It is characterized in that it is measured on the basis of a change in mechanical characteristics.
The method for measuring an interaction between biological substances according to the present invention is a method for measuring an interaction between a receptor which is a lipid membrane protein and the ligand substance as described in claim 6, wherein the receptor is immobilized on a solid phase. The physical property of the solid phase surface is determined by reacting the binding element, which is provided on the surface, and is a complex in a stable state with a binding constant of 1 × 10 ³ or more obtained by binding the ligand substance to lipid. It measures based on the change of this, It is characterized by the above-mentioned.
The biological substance interaction measuring method of the present invention is a method for measuring an interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance as defined in claim 7, wherein the ligand substance is a lipid. A binding element that is a complex in a stable state with a binding constant of 1 × 10 ³ or more, and the receptor is labeled with a fluorescent substance, and the binding between the binding element and the receptor is measured by fluorescence phase spectroscopy. It is characterized by doing.

本発明によれば、リガンドが脂質に安定して結合している複合体を結合素子としたため、脂質膜たんぱく質であるレセプターとの相互作用を解析する際には、リガンドと脂質との相互作用を相殺して考えることができる。これにより、より正確な脂質膜たんぱく質のレセプターとリガンドとの相互作用解析が可能となる。また、リガンド物質が脂質との複合体を結合素子として用いることにより、質量や誘電率変化を検出する測定系において感度を高めることができる。   According to the present invention, since the complex in which the ligand is stably bound to the lipid is used as the binding element, when analyzing the interaction with the receptor, which is a lipid membrane protein, the interaction between the ligand and the lipid is determined. Can be offset. This enables a more accurate analysis of the interaction between the receptor of the lipid membrane protein and the ligand. Further, by using a complex of a ligand substance and lipid as a binding element, sensitivity can be increased in a measurement system that detects a change in mass or dielectric constant.

上記の通り、本発明は、特定の脂質組成に対して特異的な構造をした、脂質膜たんぱく質をレセプターとするリガンド物質を、脂質と安定して結合させて素子としたものである。   As described above, the present invention provides a device in which a ligand substance having a structure specific to a specific lipid composition and having a lipid membrane protein as a receptor is stably bound to a lipid.

前記脂質とは、長鎖脂肪酸或いは炭化水素鎖を持つ生物体内に存在或いは生物由来の分子であればよく、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質に分類されるものを含むものである。
前記脂質膜タンパク質とは、脂質膜中および膜表面に存在することにより特異的な構造をとり、活性を持つタンパク質であれば制限はなく、例えば、オピオイドκレセプタや、ロドプシンスーパーファミリー等が挙げられる。
前記リガンド物質とは、前記膜たんぱく質であるレセプターと結合する能力をもつ物質であればよく、例えば、天然にはオピオイドペプチド等が挙げられる。このほかに人工的に機能化された合成物質で膜たんぱく質レセプターと特異的に結合する物もこれに含める。 The lipid may be any molecule that exists or is derived from a living organism having a long-chain fatty acid or a hydrocarbon chain, and includes those classified into simple lipids, complex lipids, and derived lipids.
The lipid membrane protein has a specific structure by being present in the lipid membrane and on the membrane surface, and is not limited as long as it is an active protein. Examples thereof include an opioid κ receptor and the rhodopsin superfamily. .
The ligand substance may be any substance having the ability to bind to the receptor that is the membrane protein, and examples thereof include naturally an opioid peptide. In addition, synthetic substances that have been artificially functionalized and that specifically bind to membrane protein receptors are also included.

次に、本発明の結合素子、即ち、リガンド物質と脂質との複合体を調整するための条件を決定する方法について説明する。
まず、リガンド物質と脂質とが複合体として安定であるためには、互いの親和性が高い必要がある。この親和性を解析するためにセンサを使用する。使用するセンサとしては、リガンド物質と脂質との親和性（結合性）を測定することができるようなQCMセンサや表面プラズモンセンサ等のセンサであれば特に制限するものではないが、ここでは特開２００４−１５０８７９号公報に記載されている構造のQCMセンサを使用することとする。QCMセンサは、AT-cutの水晶振動子を容量600 μLの試料室底面に配置したもので、感度0.64 ng/cm²である。 Next, a method for determining conditions for adjusting the binding element of the present invention, that is, the complex of the ligand substance and the lipid will be described.
First, in order for the ligand substance and the lipid to be stable as a complex, the affinity for each other needs to be high. Sensors are used to analyze this affinity. The sensor to be used is not particularly limited as long as it is a sensor such as a QCM sensor or a surface plasmon sensor that can measure the affinity (binding property) between a ligand substance and a lipid. The QCM sensor having the structure described in 2004-150879 is used. The QCM sensor is an AT-cut crystal unit placed on the bottom of a 600 μL sample chamber and has a sensitivity of 0.64 ng / cm ² .

このQCMセンサの固相表面に、脂質を固定化する。方法としては、アビジンビオチン相互作用や化学的な結合を利用し、リポソーム中にこれらの反応物若しくは官能基を導入したものを用意してリポソームの状態で固定化する方法（非特許文献１：Biochemistry 38,15659-15665(1999)）、検出器固相表面に脂質の単層や二重層として固定化する方法（非特許文献２：Biochimica et Biophysica Acta 1462,89-108(1999)）、脂質を溶媒に溶解後にセンサ表面に塗布、乾燥させてフィルムとして固定化する方法（非特許文献３：Anal. Chem. 62, 1431-1438(1990)）がある。本明細書においては、単層膜を固定化する方法について説明するが、他の方法を用いても同様の結果を得ることが可能である。   Lipids are immobilized on the solid phase surface of this QCM sensor. As a method, using avidin-biotin interaction or chemical bonding, a method in which these reactants or functional groups are introduced into liposomes and immobilized in the state of liposomes (Non-patent Document 1: Biochemistry). 38, 15659-15665 (1999)), a method of immobilizing lipid on the detector solid surface as a monolayer or bilayer (Non-patent Document 2: Biochimica et Biophysica Acta 1462,89-108 (1999)), There is a method of immobilizing as a film by applying to a sensor surface after being dissolved in a solvent and drying (Non-Patent Document 3: Anal. Chem. 62, 1431-1438 (1990)). In this specification, a method for immobilizing a single layer film will be described, but similar results can be obtained by using other methods.

次に、リガンド物質として副腎皮質刺激ホルモンであるACTHを例として説明する。
ACTHは生物種間で共通の24残基のペプチドで、以下ACTH(1-24)と表記する。ACTHはメラノコルチン受容体（melanocortin receptor: MC-R）の5種類のサブタイプ(MC1〜MC5)のうち、MC3レセプターに対して相互作用することが知られている。ACTH(1-24)は、化学合成の技術であるF-moc固相法を用いて合成した。このペプチドは等電点が８前後で、pHが中性の状態において弱塩基性の特徴を示す。そこで、中性脂質であるDimyristoyl phosphatidylcholine(以下「DMPC」と省略する。)と酸性脂質であるDimyristoyl phosphatidylglycerol（以下「DMPG」と省略する。）から構成される混合膜で、ACTH(1-24)が最も親和性が高くなる脂質組成を調べる。 Next, ACTH, which is an adrenocorticotropic hormone, will be described as an example of the ligand substance.
ACTH is a 24-residue peptide common among species, and is hereinafter referred to as ACTH (1-24). ACTH is known to interact with the MC3 receptor among the five subtypes (MC1 to MC5) of the melanocortin receptor (MC-R). ACTH (1-24) was synthesized using the F-moc solid phase method, which is a chemical synthesis technique. This peptide has a weak basic character at an isoelectric point of around 8 and a neutral pH. Therefore, ACTH (1-24) is a mixed membrane composed of neutral lipid Dimyristoyl phosphatidylcholine (hereinafter abbreviated as “DMPC”) and acidic lipid Dimyristoyl phosphatidylglycerol (hereinafter abbreviated as “DMPG”). Investigate the lipid composition with the highest affinity.

図１を使用して更に具体的に説明する。同図（ａ）は、QCMセンサ１０１を用いて脂質１０５とACTH(1-24)１０６の親和性を計測する概念図である。
AT-cut水晶板１０２上に配置された金電極１０３は、酸素プラズマ及び硫酸と過酸化水素水の混合液（３：１(w/w)）によりあらかじめ洗浄し、その後のセンサ１０１表面に１ｍＭのn-Octadecanethiol溶液をキャストし、１時間、室温で静置する。これにより、金電極１０３表面にn-Octadecanethiolの自己組織化膜１０４が形成され、センサ１０１表面（自己組織化膜１０４の表面）が疎水性となる。
次に、Small unilamellar vesicle（以下、「SUV」と省略する。）と呼ばれる状態の脂質１０５を、1 mMの濃度で500μLのphosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.4溶液（以下「PBS溶液」と省略する。）に溶かし、これをセンサ１０１上の自己組織化膜１０４に接触させることにより、自己組織化膜１０４に脂質１０５を単層状態で固定化することができる。SUVは従来の手法を用いて作製すればよく、脂質のフィルムを緩衝液に懸濁後、超音波で小胞にすることによって作製することができる。
脂質１０５を固定化した、QCMセンサにリガンド物質であるACTH(1-24)１０６を500μLの10 mM Tris, 150 mM NaCl緩衝液（pH7.4，以下「Tris-HCl buffer」と省略する。）中で添加し、その周波数変化量から親和性を求めることが可能となる。 A more specific description will be given with reference to FIG. FIG. 5A is a conceptual diagram for measuring the affinity between lipid 105 and ACTH (1-24) 106 using the QCM sensor 101.
The gold electrode 103 disposed on the AT-cut quartz plate 102 is previously cleaned with oxygen plasma and a mixed solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide (3: 1 (w / w)), and then the sensor 101 has a surface of 1 mM on the surface. The n-Octadecanethiol solution is cast and allowed to stand at room temperature for 1 hour. As a result, the n-octadecanethiol self-assembled film 104 is formed on the surface of the gold electrode 103, and the surface of the sensor 101 (the surface of the self-assembled film 104) becomes hydrophobic.
Next, lipid 105 in a state called Small unilamellar vesicle (hereinafter abbreviated as “SUV”) is abbreviated as 500 μL of phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.4 solution (hereinafter abbreviated as “PBS solution”) at a concentration of 1 mM. )) And bringing it into contact with the self-assembled film 104 on the sensor 101, the lipid 105 can be immobilized on the self-assembled film 104 in a monolayer state. The SUV may be prepared by using a conventional technique, and can be prepared by suspending a lipid film in a buffer solution and then sonicating it into vesicles.
500 μL of 10 mM Tris, 150 mM NaCl buffer solution (pH 7.4, hereinafter abbreviated as “Tris-HCl buffer”) ACTH (1-24) 106 as a ligand substance on a QCM sensor with lipid 105 immobilized thereon. It is possible to obtain the affinity from the frequency change amount by adding in the medium.

図１（ｂ）は、DMPC膜を固定化した際の得られるQCMの周波数変化の模式図である。↓１１１の時点で1 μM のACTH(1-24)を添加すると、周波数が減少し、一定時間後に周波数減少が飽和する。繰り返しACTH(1-24)を添加し、各濃度での周波数変化量からその親和性を示す結合(解離)定数が求めることができる。   FIG. 1B is a schematic diagram of the frequency change of the QCM obtained when the DMPC film is immobilized. When 1 μM ACTH (1-24) is added at the time of ↓ 111, the frequency decreases and the frequency decrease becomes saturated after a certain time. By repeatedly adding ACTH (1-24), the binding (dissociation) constant indicating the affinity can be determined from the amount of frequency change at each concentration.

以下、結合(解離)定数を求める方法について記述する。
センサ１０１上に固定化されている認識物質(A)とそれと相互作用する標的物質(B)は結合し、複合体(C)を形成する。この過程はA+B⇔Cで従う平衡であり、その親和性は数１で定義される結合(解離)定数: K_a (K_d)で定量化することができる（ここで、[A]、[B]、[C]はそれぞれのモル濃度を示す）。
センサ１０１上に固定化されている認識物質(A)の標的物質(B)との結合複合体形成率をθ（＝[C]/[A]₀）とすると、数２が誘導される（[A]₀は認識物質(A)の初期濃度を表す）。
数２はLangmuirの式と呼ばれ固相表面−液相間相互作用の平衡モデル式である。QCMセンサでは結合による質量変化が周波数ΔFとして計測できるため、全ての認識物質が標的物質と結合した際の周波数変化量ΔF_maxを用いてθはΔF/ΔF_MAXのように置き換えることができる。この関係から数２を変形すると、以下の数３及び数４が導き出される。
上記数１〜４において、認識物質を脂質であるDMPC、標的物質をリガンド物質のACTH(1-24)と置き換え、数４に従いプロットした模式図が図２（ａ）である。回帰直線の傾き及び切片からDMPCとACTH(1-24)の結合定数K_aが算出される。 Hereinafter, a method for obtaining the binding (dissociation) constant will be described.
The recognition substance (A) immobilized on the sensor 101 and the target substance (B) interacting with the recognition substance bind to each other to form a complex (C). This process is an equilibrium in accordance with A + B⇔C, the affinity binding is defined by the number 1 (dissociation) constant: it (here be quantified with _{K a (K d), [} A] , [B], and [C] indicate respective molar concentrations).
Assuming that the complex formation rate of the recognition substance (A) immobilized on the sensor 101 and the target substance (B) is θ (= [C] / [A] ₀ ), Equation 2 is derived ( [A] ₀ represents the initial concentration of the recognition substance (A)).
Equation 2 is called the Langmuir equation and is an equilibrium model equation for the interaction between the solid surface and the liquid phase. Since the mass change due to the binding can be measured as the frequency ΔF in the QCM sensor, θ can be replaced by ΔF / ΔF _MAX using the frequency change amount ΔF _max when all the recognition substances are bound to the target substance. By transforming Equation 2 from this relationship, Equations 3 and 4 below are derived.
FIG. 2A is a schematic diagram in which the recognition substance is replaced with DMPC which is a lipid and the target substance is replaced with the ligand substance ACTH (1-24) in the above formulas 1 to 4, and plotted according to the formula 4. Binding constant K _a of DMPC and ACTH from the slope and intercept of the regression line (1-24) is calculated.

この結合定数K_aは、大きい程リガンド物質と脂質の親和性が高いことがいえるが、本発明においては、リガンド物質が脂質と複合体を形成するものであればよいため、結合定数K_aは１×１０^３を超えるものであればよいが、前記複合体が安定状態となるためには、結合定数K_aは１×１０^５以上とすることが好ましい。 The association constant K _a is higher can be said to have a high affinity ligand substances and lipid large, in the present invention, since the ligand substance as long as it forms a complex with lipids, association constant K _a is as long as more than 1 × 10 ^3, but the for the complex is a stable state, the binding constant K _a is preferably set to 1 × 10 ⁵ or more.

また、脂質が複数のものから構成されている場合には、図２（ｂ）に例示するように、DMPCとDMPGの混合膜において酸性脂質であるDMPGの組成比に対する結合定数K_aの指数値をプロットすることにより、どの組成比において結合定数K_aが最大となるかを判断することができる。図示したものでは、７５％DMPC、２５％DMPGの脂質組成の混合膜に対してACTH(1-24)の結合定数K_aが極大点を持つことがわかかる。 Also, if the lipid is composed of a plurality of ones, as illustrated in FIG. 2 (b), DMPC and exponent value of the coupling constant K _a for the composition ratio of DMPG is acidic lipid in the mixed film of DMPG the by plotting the binding constant K _a in which composition ratio can be determined whether the maximum. An illustration, such I have a binding constant K _a is the maximum point of ACTH (1-24) with respect to 75% DMPC, mixed film of lipid composition of 25% DMPG.

上記説明では結合定数K_aに着目しているが、脂質を固定化したQCMセンサに異なる濃度のリガンド物質を添加し、得られた周波数の経時変化から動力学解析を行うことで、結合速度定数及び解離速度定数を求めることでも同様な結果を得ることができる（非特許文献４：Anal. Chem. 70, 1288-1296(1998)）。 In the above description has focused on association constant K _a, but the addition of the ligand material different concentrations of QCM sensor with immobilized lipid, by performing dynamic analysis of temporal changes in the obtained frequency, association rate constant Similar results can also be obtained by determining the dissociation rate constant (Non-patent Document 4: Anal. Chem. 70, 1288-1296 (1998)).

また、本発明の複合体の結合素子は、リガンド物質が安定した構造をとることが好ましい。この安定した構造とは、前記結合定数を目安にすることができるが、リガンド物質がペプチドもしくはたんぱく質である場合、脂質膜と結合することによって二次構造が変化していることが考えられる。この構造については、固体高分解能核磁気共鳴法（以下、「固体NMR」と省略する。）を用いて脂質と結合したACTH(1-24)の構造に関する解析を例示して説明する。
試料はACTH(1-24)を合成する際、分子中央に位置するVal-13残基のカルボニル炭素を部位特異的に¹³C安定同位体標識しNMR観測核とする。このACTH(1-24)を５種類の異なる混合脂質比で調製したDMPG/DMPCマルチラメラリポソームに組み込み、脂質表面に結合したACTH(1-24)の局所構造解析を固体NMRにて行う。固体NMRの測定方法は¹³C核の磁化を90度パルスで直接励起して観測するDD-MAS及びDD-static法を採用する。DD-MAS法では、ペプチド主鎖カルボニル炭素の等方化学シフト値が得られる。等方化学シフト値は二次構造との相関関係が知られており、直接α−へリックス、β−シート、ランダムコイルを識別することが可能である。DD-staticスペクトルからは、化学シフト異方性に関する情報が得られ、分子運動によってスケールされた化学シフト異方性は、ペプチドが等方運動している場合、等方化学シフト値と同じシャープな線形を示し、脂質からのペプチドの遊離の有無に関する知見を得ることができる。 Further, the binding element of the complex of the present invention preferably has a structure in which the ligand substance is stable. The stable structure can be based on the above-mentioned binding constant. However, when the ligand substance is a peptide or protein, it is considered that the secondary structure is changed by binding to the lipid membrane. This structure will be described by exemplifying an analysis related to the structure of ACTH (1-24) bound to a lipid using a solid high-resolution nuclear magnetic resonance method (hereinafter abbreviated as “solid-state NMR”).
When synthesizing ACTH (1-24), the sample uses ^13C stable isotope labeling of the carbonyl carbon of the Val-13 residue located in the center of the molecule as the NMR observation nucleus. This ACTH (1-24) is incorporated into DMPG / DMPC multilamellar liposomes prepared with five different mixed lipid ratios, and the local structure analysis of ACTH (1-24) bound to the lipid surface is performed by solid-state NMR. The solid-state NMR measurement methods employ DD-MAS and DD-static methods, in which the magnetization of ¹³ C nuclei is directly excited with a 90-degree pulse and observed. In the DD-MAS method, an isotropic chemical shift value of the peptide main chain carbonyl carbon is obtained. The isotropic chemical shift value is known to correlate with the secondary structure, and can directly identify α-helix, β-sheet, and random coil. The DD-static spectrum provides information on chemical shift anisotropy, and the chemical shift anisotropy scaled by molecular motion is as sharp as the isotropic chemical shift value when the peptide is isotropic. It shows linearity, and knowledge about the presence or absence of peptide release from lipids can be obtained.

上記解析を行うことにより、ACTH(1-24)は脂質組成が７５％DMPC、２５％DMPGにおいてα−へリックスを形成する安定的な二次構造をとり、且つ、混合脂質表面に結合して安定な結合体を形成していることがわかかる。即ち、ACTH(1-24)の脂質への結合及び脂質上でのフォールディングには脂質における酸性脂質の割合が結合とフォールディングに関して極めて重要な働きを示すことがわかかる。このことから、ペプチドの脂質への結合には疎水性相互作用と静電相互作用のバランスが重要であることを示している。
このように、QCMにより親和性解析と固体NMRでの局所構造を解析により、安定した脂質とACTH(1-24)の複合体をACTH(1-24)が活性化された状態の試料条件を決定することができる。 By performing the above analysis, ACTH (1-24) has a stable secondary structure that forms an α-helix in the lipid composition of 75% DMPC and 25% DMPG, and binds to the mixed lipid surface. It can be seen that a stable conjugate is formed. That is, it can be seen that the ratio of acidic lipids in lipids plays an extremely important role in binding and folding of ACTH (1-24) to lipids and folding on lipids. This indicates that the balance between hydrophobic interaction and electrostatic interaction is important for the binding of peptides to lipids.
In this way, QCM can be used to analyze the complex structure of stable lipids and ACTH (1-24) by using affinity analysis and solid-state NMR to analyze the sample conditions in which ACTH (1-24) is activated. Can be determined.

また、本発明において、リガンド物質が結合される脂質は粒子状のリポソームとすることが好ましい。これは、本発明において前記複合体を形成する意義は、脂質膜とリガンド物質とが相互作用したものを複合体に用いることによって、リガンド物質と脂質膜たんぱく質レセプターとの相互作用を計測できるところにあり、その脂質の状態はレセプターの存在する脂質と同じ脂質二重膜の状態であることが望まれるからである。   In the present invention, the lipid to which the ligand substance is bound is preferably a particulate liposome. This is because in the present invention, the significance of forming the complex is that the interaction between the ligand substance and the lipid membrane protein receptor can be measured by using, in the complex, an interaction between the lipid membrane and the ligand substance. This is because the state of the lipid is desired to be the same as that of the lipid in which the receptor exists.

また、本発明のバイオセンサは、前記結合素子の前記脂質側を、固相表面の物理的特性の変化を測定可能なセンサの前記固相表面に固定化することにより得ることができる。
尚、本明細書において、固相表面（固相表面に設けられた電極も含む。）の物理的特性の変化を測定可能なセンサとは、固相表面を反応検出場としたセンサーであればよく、その物理的特性とは、周波数、誘電率等の所得性をいい、例えば、水晶振動子、表面プラズモン、エリプソメトリー、二面編波式干渉法および表面弾性波を利用したセンサ等を挙げることができる。
水晶振動子を使用する場合には、水晶板の両面に設けられた電極のうちの一方の電極に、結合素子を固定化しておき、水晶板の片側をレセプターが含まれる試料溶液に浸し、前記両電極に電圧を所定周波数で印加するようにし、相互作用による水晶板の周波数変動を両電極を介して測定すればよい。
また、表面プラズモンセンサーを使用する場合には、プリズム底面に金属層を設け、そこに結合素子を積層し、プリズム底面を試料溶液を浸漬させ誘電率の変化を測定すればよく、より具体的には、表面プラズモン共鳴現象の減衰ピークの生じる角度変化を測定すればよい。 The biosensor of the present invention can be obtained by immobilizing the lipid side of the binding element on the solid phase surface of a sensor capable of measuring changes in physical properties of the solid phase surface.
In this specification, a sensor capable of measuring a change in physical properties of a solid phase surface (including electrodes provided on the solid phase surface) is a sensor having a solid phase surface as a reaction detection field. The physical characteristics often refer to income characteristics such as frequency and dielectric constant, such as quartz resonators, surface plasmons, ellipsometry, two-plane knitting wave interferometry, and sensors using surface acoustic waves. be able to.
When using a crystal resonator, the coupling element is fixed to one of the electrodes provided on both sides of the crystal plate, and one side of the crystal plate is immersed in a sample solution containing a receptor, A voltage may be applied to both electrodes at a predetermined frequency, and the frequency fluctuation of the quartz plate due to the interaction may be measured via both electrodes.
In addition, when using a surface plasmon sensor, a metal layer is provided on the prism bottom surface, a coupling element is laminated thereon, a sample solution is immersed in the prism bottom surface, and a change in dielectric constant is measured. The angle change in which the attenuation peak of the surface plasmon resonance phenomenon occurs may be measured.

また、本発明における計測方法として、前記固相表面における物理的特性の変化を用いて計測する方法のほかに、蛍光標識した試料を用いて、蛍光分光法による解析を行うことも可能である。これは、蛍光分光法における生体物質の解析方法は歴史が長く、様々な手段を応用することが可能であるからである。   Moreover, as a measuring method in the present invention, in addition to the method of measuring using a change in physical properties on the solid phase surface, it is also possible to perform analysis by fluorescence spectroscopy using a fluorescently labeled sample. This is because the biological material analysis method in fluorescence spectroscopy has a long history, and various means can be applied.

次に、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
QCMセンサを用いて、DMPC及びDMPGの混合膜とACTH(1-24)との相互作用を解析した結果を元に、ACTH(1-24)とそのレセプターであるMC3レセプターとの相互作用を行った例を示す。MC3レセプターはヒト胎児腎細胞由来の細胞株であるHEK293をホスト細胞として発現させ、膜分画として調整されている物をPerkinElmer社（カタログ番号：RBXMC３M）から入手することができる。 Next, examples of the present invention will be described.
Example 1
Based on the results of analyzing the interaction between DMPC and DMPG mixed film and ACTH (1-24) using a QCM sensor, the interaction between ACTH (1-24) and its receptor, MC3 receptor, was performed. An example is shown. MC3 receptor can be obtained from PerkinElmer (catalog number: RBXMC3M) by expressing HEK293, a cell line derived from human fetal kidney cells, as a host cell and adjusting the membrane fraction.

図３（ａ）は本測定例の概念図である。
QCMセンサ４０１の金電極上４０２に７５％DMPC、２５％DMPGの混合脂質を固定化後、Tris-HCl buffer中で0.5μMのリガンド物質であるACTH(1-24)４０５を添加し脂質に結合させて、本実施例の結合素子とした。
この後、緩衝液を交換し、500μLの0.05% Tween-20を含むTris-HCl buffer中で25℃にて測定を開始する。細胞分角膜４０８であるMC3レセプター４０７を添加することで、ACTH(1-24)４０５とMC3レセプター４０７が相互作用しQCMの周波数が減少する。 FIG. 3A is a conceptual diagram of this measurement example.
After immobilizing a mixed lipid of 75% DMPC and 25% DMPG on the gold electrode 402 of the QCM sensor 401, 0.5 μM ligand substance ACTH (1-24) 405 is added in the Tris-HCl buffer to bind to the lipid. Thus, the coupling element of this example was obtained.
Thereafter, the buffer solution is exchanged, and measurement is started at 25 ° C. in Tris-HCl buffer containing 500 μL of 0.05% Tween-20. By adding MC3 receptor 407, which is a cell cornea 408, ACTH (1-24) 405 and MC3 receptor 407 interact with each other, and the frequency of QCM decreases.

図３（ｂ）は、測定結果の模式図である。MC3レセプターが発現している膜分画試料では、周波数が減少している（４１１）。これに対し、コントロールとしてMC3レセプターを持たない膜分画試料では周波数が変化せず（４１２）、ACTH(1-24)とMC3レセプターが相互作用した結果、周波数変化していることがわかった。
このように、脂質にACTH(1-24)が結合した素子を用いることで、MC3レセプターとの相互作用が確認できる。このことから、インヒビター等を組み合わせることで蛍光やIRでの標識をせずに容易にバインディングアッセイが可能となる。 FIG. 3B is a schematic diagram of the measurement result. In the membrane fraction sample in which the MC3 receptor is expressed, the frequency is decreased (411). In contrast, as a control, the membrane fraction sample without MC3 receptor did not change the frequency (412), and it was found that ACTH (1-24) interacted with the MC3 receptor, resulting in a frequency change.
Thus, the interaction with MC3 receptor can be confirmed by using an element in which ACTH (1-24) is bound to lipid. Therefore, a binding assay can be easily performed by combining an inhibitor or the like without labeling with fluorescence or IR.

（実施例２）
フロー型のSPRセンサを用いて実施例１と同様の膜タンパク質MC3レセプターとリガンド物質であるACTH(1-24)の動力学解析を行った例を示す。
図４は、本測定例の概念図である。リガンド物質であるACTH(1-24)５１０は、７５％DMPC、２５％DMPGの脂質組成を持つリポソーム５１１との複合体を形成しており、結合素子５０９として用いる。結合素子５０９は、脂質のリポソーム５１１のサイズをあらかじめフィルターを通してサイズを20 nmに調整し、ACTH(1-24)５１０と十分な時間反応させた後、超遠心にて回収することができる。
SPRセンサ５０１はガラス基板５０２と金薄膜５０３から構成されている。MC3レセプター５０７を含む膜分画５０６は、センサ５０１上に日本油脂株式会社から販売されている細胞膜修飾試薬（以下「BAM」と省略する。）５０５を介して固定化する。BAM５０５は、オレイル基とNHS基がPEGの両末端に導入されている試薬で、オレイル基が細胞膜に挿入される。また、BAM５０５の末端にあるNHS基がアミノ基等に容易に反応するため、あらかじめセンサ５０１表面にBSA５０４を固定化しておき、これにBAM５０５を反応させることで、BAM５０５導入表面のセンサが作製できる。
BSA５０４のセンサ５０１表面への固定化方法は、化学的若しくは生物学的に特異的な結合によって固定化する方法と非特異吸着を用いる方法が挙げられる。本例では、非特異吸着を利用した固定化方法を採用する。センサの金薄膜５０３は酸素プラズマ及び硫酸と過酸化水素水の混合液（３：１(w/w)）にて洗浄後、1 mg/mL BSA５０４のPBS溶液をアプライし１時間反応させることでBSA５０４を固定化することができる。BSA５０４を固定化後、1 mMのBAM５０５のPBS溶液で反応させることでBAM５０５がセンサ５０１表面に修飾される。これらの工程はすべて室温で行う。BAM５０５が導入されたセンサにCM3レセプター５０７の膜分画５０６試料をアプライすることでMC3レセプター５０６を固定化することができる。
CM3レセプター５０７を含む膜分画５０６を固定化したSPRセンサ５０１に0.05% Tween-20を含むTris-HCl buffer緩衝液中に4, 6, 8, 10, 12 μM結合素子５０８を導入してSPRシグナルの変化を得る。 (Example 2)
An example in which a kinetic analysis of the same membrane protein MC3 receptor and ligand substance ACTH (1-24) as in Example 1 was performed using a flow type SPR sensor is shown.
FIG. 4 is a conceptual diagram of this measurement example. The ligand substance ACTH (1-24) 510 forms a complex with the liposome 511 having a lipid composition of 75% DMPC and 25% DMPG, and is used as the binding element 509. The binding element 509 can be collected by ultracentrifugation after adjusting the size of the lipid liposome 511 through a filter in advance to a size of 20 nm and reacting with ACTH (1-24) 510 for a sufficient time.
The SPR sensor 501 is composed of a glass substrate 502 and a gold thin film 503. The membrane fraction 506 containing the MC3 receptor 507 is immobilized on the sensor 501 via a cell membrane modifying reagent (hereinafter abbreviated as “BAM”) 505 sold by Nippon Oil & Fats Co., Ltd. BAM505 is a reagent in which an oleyl group and an NHS group are introduced at both ends of PEG, and the oleyl group is inserted into the cell membrane. In addition, since the NHS group at the end of BAM 505 easily reacts with an amino group or the like, BSA 504 is immobilized on the surface of sensor 501 in advance, and BAM 505 is reacted therewith, whereby a sensor on the BAM 505 introduction surface can be produced.
Examples of the method of immobilizing BSA 504 on the surface of sensor 501 include a method of immobilizing by chemical or biological specific binding and a method using non-specific adsorption. In this example, an immobilization method using non-specific adsorption is employed. The gold thin film 503 of the sensor is washed with oxygen plasma and a mixed solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide (3: 1 (w / w)), and then a 1 mg / mL BSA504 PBS solution is applied and reacted for 1 hour. BSA 504 can be immobilized. After the BSA 504 is immobilized, the BAM 505 is modified on the surface of the sensor 501 by reacting with 1 mM BAM 505 in PBS. All these steps are performed at room temperature. The MC3 receptor 506 can be immobilized by applying the CM3 receptor 507 membrane fraction 506 sample to the sensor into which the BAM 505 has been introduced.
The SPR sensor 501 with the membrane fraction 506 containing the CM3 receptor 507 immobilized thereon was introduced with a 4, 6, 8, 10, 12 μM binding element 508 in a Tris-HCl buffer buffer containing 0.05% Tween-20. Get a change in signal.

図５（ａ）は得られるSPRシグナルの模式図で、↓６０１で示した時点で結合素子５０８を導入している。結合素子５０８の導入濃度を変化させることによって、シグナル変化量及びその経時変化が異なることがわかかる（６０２〜６０６）。このように得られた結果から、動力学的解析を行うことができる。
結合素子を調整するための条件決定方法において記載したように、固相センサ表面に固定化されている認識物質(A)と標的物質(B)が相互作用し、複合体(C)が形成する過程の結合(解離)定数: K_a (K_d)は数１で定義される。この結合(解離)定数は、結合速度定数k₊と解離速度定数k_-を用いると数５で与えられる。
認識物質(A)と標的物質(B)の結合複合体(C)の生成濃度は、数６で表される。
数６において、[C]_t→∞は標的物質濃度が[B]の時に平衡に達した複合体Cの濃度である。複合体は時間に対し緩和時定数1/τを持つ一次の指数関数に従って形成されることがわかかる。この1/τは標的物質濃度[B]に依存する。ここで、[C]/[C]_t→∞はセンサの変化量比と置き換えることができる。
図５（ａ）の測定結果であるシグナル変化を数６でフィットし、各ACTH(1-24)濃度におけるシグナル変化の緩和時定数1/τを求めることができる。1/τは式６で示す通り、標的物質（ここではACTH(1-24)）濃度に依存した値を示すので、1/τをACTH(1-24)濃度に対してプロットすると図５（ｂ）のグラフを得ることができる。この1/τのプロットの回帰直線からMC3とACTH(1-24)との結合速度定数、解離速度定数及び結合(解離)定数を算出することができる。
このように、質量や表面の誘電率を検出するセンサを用いて、膜分画試料のようなレセプター分子の発現量が制限されたサンプルでは、センサの感度が足りず、動力学解析を行う事は困難な場合が多い。しかし、本例のように、リポソームとリガンド物質との複合体を結合素子として用いることで、感度の増幅を図れるだけではなく、実際のリガンドとレセプターの相互作用を検出することが可能で、より正確な動力学的な解析が可能となる。 FIG. 5A is a schematic diagram of the obtained SPR signal, and the coupling element 508 is introduced at the time indicated by ↓ 601. It can be seen that the amount of signal change and its change with time are different by changing the concentration of the coupling element 508 introduced (602 to 606). From the result thus obtained, a kinetic analysis can be performed.
As described in the method for determining the conditions for adjusting the binding element, the recognition substance (A) immobilized on the surface of the solid-phase sensor and the target substance (B) interact to form a complex (C). The association (dissociation) constant of the process: K _a (K _d ) is defined by Equation 1. This association (dissociation) constant is given by Equation 5 using the association rate constant k ₊ and the dissociation rate constant k ₋ .
The production concentration of the binding complex (C) of the recognition substance (A) and the target substance (B) is expressed by Equation 6.
In Equation 6, [C] _{t → ∞} is the concentration of complex C that has reached equilibrium when the target substance concentration is [B]. It can be seen that the complex is formed according to a first-order exponential function with a relaxation time constant 1 / τ over time. This 1 / τ depends on the target substance concentration [B]. Here, [C] / [C] _{t → ∞} can be replaced with the change ratio of the sensor.
The signal change, which is the measurement result of FIG. 5A, is fitted by Equation 6, and the relaxation time constant 1 / τ of the signal change at each ACTH (1-24) concentration can be obtained. 1 / τ shows a value depending on the concentration of the target substance (in this case, ACTH (1-24)) as shown in Equation 6. Therefore, when 1 / τ is plotted against the ACTH (1-24) concentration, FIG. The graph of b) can be obtained. The association rate constant, dissociation rate constant, and association (dissociation) constant between MC3 and ACTH (1-24) can be calculated from the regression line of the 1 / τ plot.
Thus, using a sensor that detects the mass and the dielectric constant of the surface, the sensitivity of the sensor molecule is insufficient, such as a membrane fraction sample, and the kinetic analysis is performed. Is often difficult. However, as in this example, by using a complex of liposome and ligand substance as a binding element, not only can sensitivity be increased, but it is possible to detect the actual interaction between the ligand and the receptor. Accurate kinetic analysis is possible.

（実施例３）
蛍光相間分光法（以下「FCS」と省略する。）を用いてACTH(1-24)とMC3レセプターとの相互作用を解析する例を示す。FCS法とは、共焦点レーザーを用いてごく微小領域の蛍光を検出し、分子の大きさの情報を蛍光強度の揺らぎの速さから求める方法である。
図６（ａ）は、測定をする際の概念図である。実施例２と同様、膜分画７０１として調整されているMC3レセプター７０２と、７５％DMPC、２５％DMPGの脂質組成を持つリポソーム７０７とACTH(1-24)７０６の複合体を結合素子７０５として用いる。MC3レセプター７０２は、FITC７０３で標識し、488 nmのレーザーを用いてFITCの蛍光のFCS解析を行う。FITCはフナコシ株式会社から販売されているEZ-Label Protein Labeling Kit（商品コード：#53004）として販売されている物を用いればよい。
測定は、0.05% Tween-20を含むTris-HCl buffer緩衝液中で行った。FITC標識MC3レセプター７０２を含む膜分画７０１は、2 nMで固定し、ACTH(1-24)７０６を0 μMから100 μMまで変化させるようにして結合素子７０５を混合して測定を行った。ACTH(1-24)７０６濃度に対してMC3膜分画７０１と結合素子７０５との複合体の存在比を図６（ｂ）に模式図として示す。プロット７１１から、結合定数を求めることが可能である。
このように、本発明では特定の脂質と結合したリガンド物質を用いることで、膜タンパク質レセプターとの相互作用解析を様々な系で行うことが可能となるだけではなく、より正確な相互作用解析ができる。 (Example 3)
An example of analyzing the interaction between ACTH (1-24) and MC3 receptor using fluorescence interphase spectroscopy (hereinafter abbreviated as “FCS”) is shown. The FCS method is a method that detects fluorescence in a very small region using a confocal laser and obtains information on the size of the molecule from the speed of fluctuation of the fluorescence intensity.
FIG. 6A is a conceptual diagram when performing measurement. As in Example 2, a complex of MC3 receptor 702 prepared as membrane fraction 701, liposome 707 having a lipid composition of 75% DMPC and 25% DMPG and ACTH (1-24) 706 is used as binding element 705. Use. The MC3 receptor 702 is labeled with FITC 703 and subjected to FCS analysis of FITC fluorescence using a 488 nm laser. FITC may be a product sold as EZ-Label Protein Labeling Kit (product code: # 53004) sold by Funakoshi Corporation.
The measurement was performed in a Tris-HCl buffer buffer containing 0.05% Tween-20. The membrane fraction 701 containing FITC-labeled MC3 receptor 702 was immobilized at 2 nM, and the measurement was performed by mixing the binding element 705 such that ACTH (1-24) 706 was changed from 0 μM to 100 μM. The abundance ratio of the composite of the MC3 membrane fraction 701 and the coupling element 705 with respect to the ACTH (1-24) 706 concentration is shown as a schematic diagram in FIG. From the plot 711, the coupling constant can be determined.
Thus, in the present invention, by using a ligand substance bound to a specific lipid, it becomes possible not only to perform interaction analysis with membrane protein receptors in various systems, but also to perform more accurate interaction analysis. it can.

（ａ）本発明の一実施の形態の結合素子の脂質とリガンド物質との親和性の計測を説明するための概念図、（ｂ）同計測による周波数変化の模式図(A) The conceptual diagram for demonstrating the measurement of the affinity of the lipid of the coupling element of one embodiment of this invention, and a ligand substance, (b) The schematic diagram of the frequency change by the measurement （ａ）本発明の一実施の形態における結合定数を説明するための模式図、（ｂ）同実施の形態の脂質の組成比を変更した場合の結合定数を説明するための模式図(A) Schematic diagram for explaining the binding constant in one embodiment of the present invention, (b) Schematic diagram for explaining the binding constant when the composition ratio of the lipid of the embodiment is changed. （ａ）実施例１の測定状態を説明するための概念図、（ｂ）同測定結果の模式図(A) The conceptual diagram for demonstrating the measurement state of Example 1, (b) The schematic diagram of the measurement result 実施例２の測定状態を説明するための概念図Conceptual diagram for explaining the measurement state of Example 2 （ａ）実施例２のSPRシグナルの模式図、（ｂ）同SPRシグナル変化を説明するためのグラフ(A) Schematic diagram of SPR signal of Example 2, (b) Graph for explaining the SPR signal change （ａ）実施例３の測定状態を説明するための概念図、（ｂ）同実施例の結合素子とMC3膜分画との複合体の存在比を示す模式図(A) Conceptual diagram for explaining the measurement state of Example 3, (b) Schematic diagram showing the abundance ratio of the composite of the coupling element and MC3 membrane fraction of the Example

符号の説明Explanation of symbols

１０１ QCMセンサ
１０２ AT-cut水晶板
１０３ 金電極
１０４ 自己組織化膜
１０５ 脂質
１０６ リガンド物質（ACTH(1-24)）
４０１ QCMセンサ
４０２ 金電極
４０５ リガンド物質（ACTH(1-24)）
４０７ MC3レセプター
５０１ SPRセンサ
５０２ ガラス基板
５０３ 金薄膜
５０４ BSA
５０５ 細胞膜修飾試薬
５０６ MC3レセプター
５０７ MC3レセプター
５０８ 結合素子
５０９ 結合素子
５１０ リガンド物質（ACTH(1-24)）
５１１ リポソーム
７０１ 膜分画
７０２ MC3レセプター
７０３ FITC
７０５ 結合素子
７０６ ACTH(1-24) 101 QCM sensor 102 AT-cut quartz plate 103 Gold electrode 104 Self-assembled membrane 105 Lipid 106 Ligand substance (ACTH (1-24))
401 QCM sensor 402 Gold electrode 405 Ligand substance (ACTH (1-24))
407 MC3 receptor 501 SPR sensor 502 Glass substrate 503 Gold thin film 504 BSA
505 Cell membrane modifying reagent 506 MC3 receptor 507 MC3 receptor 508 Binding element 509 Binding element 510 Ligand substance (ACTH (1-24))
511 Liposome 701 Membrane fraction 702 MC3 receptor 703 FITC
705 Coupling element 706 ACTH (1-24)

Claims (7)

脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定するために使用される結合素子であって、前記リガンド物質は脂質に結合され、結合定数が１×１０ ^３ 以上である安定状態の複合体であることを特徴とする結合素子。 A binding element used for measuring the interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance, wherein the ligand substance is bound to a lipid and has a stable state with a binding constant of 1 × 10 ³ or more. A coupling element characterized by being a composite . 前記脂質は粒子状のリポソームであることを特徴とする請求項１に記載の結合素子。   The coupling element according to claim 1, wherein the lipid is a particulate liposome. 請求項１に記載の結合素子の前記脂質側を、固相表面の物理的特性の変化を測定可能なセンサの前記固相表面に固定化したことを特徴とするバイオセンサ。   A biosensor, wherein the lipid side of the binding element according to claim 1 is immobilized on the solid phase surface of a sensor capable of measuring changes in physical properties of the solid phase surface. 脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記レセプターを固相表面に固定化して、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上である安定状態の複合体である結合素子とし、前記レセプターと前記リガンド物質との反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする生体物質間相互作用の測定方法。 A method for measuring the interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance, wherein the receptor is immobilized on a solid surface, and the ligand substance is bound to a lipid so that the binding constant is 1 × 10 ³ or more. And measuring a reaction between the receptor and the ligand substance on the basis of a change in physical properties of the solid phase surface. Method. 脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子の前記脂質側を固相表面に固定化し、前記レセプターと前記リガンド物質との反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする生体物質間相互作用の測定方法。 A method for measuring the interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance, wherein the ligand substance is bound to a lipid, and the binding element is a complex in a stable state having a binding constant of 1 × 10 ³ or more . A method for measuring an interaction between biological materials, wherein the lipid side is immobilized on a solid phase surface, and the reaction between the receptor and the ligand substance is measured based on a change in physical properties of the solid phase surface. 脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記レセプターを固相表面に設け、前記リガンド物質を脂質に結合させることにより得られる結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子と、前記レセプターとの反応を前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて測定することを特徴とする生体物質間相互作用の測定方法。 A method for measuring an interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance, wherein a binding constant obtained by providing the receptor on a solid phase surface and binding the ligand substance to a lipid is 1 × 10 ³ A method for measuring an interaction between biological substances, characterized in that a reaction between the binding element, which is a complex in a stable state as described above, and the receptor is measured based on a change in physical properties of the solid phase surface. 脂質膜たんぱく質であるレセプターと該リガンド物質との相互作用を測定する方法であって、前記リガンド物質を脂質に結合させて結合定数が１×１０ ^３ 以上の安定状態の複合体である結合素子とし、前記レセプターに蛍光物質を標識して、蛍光相間分光法により前記結合素子と前記レセプターとの結合を測定することを特徴とする生体物質間相互作用の測定方法。 A method for measuring an interaction between a receptor, which is a lipid membrane protein, and the ligand substance, wherein the ligand substance is bound to a lipid to form a binding element which is a stable complex having a binding constant of 1 × 10 ³ or more. A method for measuring an interaction between biological substances, wherein the receptor is labeled with a fluorescent substance, and the binding between the binding element and the receptor is measured by fluorescence phase spectroscopy.