JP4581571B2 - 粒子のマレイミジル基量を測定する定量方法 - Google Patents
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Description
従来用いられているポリマー粒子の官能基量の定量法としては、例えば、JIS規格K0070に記載されているような高分子の酸価や水酸基価の測定方法、K7245に記載されているプラスチックのアミノ基量の測定方法があげられる。これらの方法は高分子材料一般に用いることを想定していることから、測定に試料が多量に必要であったり、測定に時間と手間がかかるという問題があった。また、有機合成化学協会誌Vol.60 No.5 454〜463頁には、粒子の官能基量測定法として、粒子表面を赤外分光法分析による吸収ピークからの分析や、粒子と試薬との反応量をブランク試験との差分から求めるような紫外可視光分析が記載されている。これらの分析方法は、官能基量を直接定量したものではないことから、同じ官能基量であっても実際の特性が異なったり、試料の表面状態によって得られる値が異なることがあるという問題があった。
マレイミジル基量の測定法としては、(株)同仁化学研究所第23版総合カタログ 80〜81頁に記載されている。この方法は一般的化合物の測定を想定していることから、上記の官能基測定法と同様に、測定に試料が多量に必要であったり、測定に時間と手間がかかるという問題があった。
フローサイトメーターは、粒子の蛍光強度、散乱強度、および個数を測定できる機器でありこれを用いた測定としては、ラテックス粒子の凝集状態の測定(例えば、特許文献1参照。)や、藻類のシストの定量法(例えば、特許文献2参照。)、汚泥中のリン蓄積微生物の定量法(例えば、特許文献3参照。)等が開示されている。これらの方法は、粒子の蛍光の強度を定性的に比較するものであり、測定としては粒子の個数のカウントに重点を置いていることから、粒子の官能基量の定量に応用できるものではなかった。
このように粒子の官能基量を測定するには、従来の測定法では課題があった。
すなわち、本発明は、少なくともマレイミジル基を含むポリマー粒子について、マレイミジル基と蛍光物質とを、前記蛍光物質と前記ポリマー粒子の総マレイミジル基とのモル比が1:1〜1:100となるように反応させ、粒子の蛍光量を測定することによって、粒子のマレイミジル基量を測定する定量方法を提供することにある。
また、さらに、粒子の蛍光量の測定にフローサイトメーターを用いることを特徴とする粒子のマレイミジル基の定量方法である。
本発明に用いる蛍光物質は、粒子に存在するマレイミジル基との反応が可能である。すなわち、蛍光物質の構造中にSH基を有している化合物であって、詳しくは蛍光色素とSH基を有する化合物(チオール化合物)と結合させた蛍光物質を用いることができる。例えば、蛍光色素が、イソチオシアン酸基、ジクロロトリアジン基、スクシンイミド基、カルボキシル基等を有し、これらの官能基がチオール化合物の水酸基、アミノ基等と反応して蛍光物質を作製する方法があげられるが、二つの化合物の結合が可能であればこれらに限定されるものではない。
具体的には蛍光色素としてはチオイソシアン酸フルオレセイン、ジクロロトリアジルアミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエーテル、カルボキシフルオレセイン等モレキュラープローブ社から販売されている5−DTAF、FITC、FAM、SFX等が、また、上記に記載したような官能基を有していないが、9−アントロイルニトリル、ダンシルアミノフェニルホウ酸等の化合物は反応条件によっては粒子の官能基との反応が可能であるため用いることが出来るが、これらに限定されるものではない。蛍光色素として好ましくは、メルカプトエチルフルオレセイン、メルカプトプロピルフルオレセン等のメルカプトアルキルフルオレセイン系色素であり、より好ましくは、メルカプトエチルフルオレセインである。
チオール化合物としてはシステイン、システアミン、アミノエタンチオール、メルカプトアミン、グルタチオン、メルカプトエタノール、DTT、DTEその他構成アミノ酸にシステインを含むペプチド化合物等があげられるがこれらに限定されるものではない。また、これらの化合物の二量体であっても、蛍光色素と反応した後、還元剤によってSH基を作製することによって使用することが可能である。チオール化合物として好ましくは、システイン、アミノエタンチオール、メルカプトアミン、グルタチオン、メルカプトエタノール、DTT、DTEであり、より好ましくは、システイン、アミノエタンチオール、メルカプトアミン、グルタチオンである。
本発明のマレイミジル基を含むポリマー粒子は、マレイミジル基が粒子表面もしくは粒子内部に存在しているものであって、その製造法としては例えば、マレイミジル基を有する単量体をあらかじめ媒体中で懸濁重合し粒子化する方法、ポリマー粒子を構成する母材粒子にマレイミジル基を導入することによって得ることが可能であるが、これらに限定されるものではない。
ポリマー粒子を構成する母材粒子としては、たとえば(メタ)アクリレート重合体を有するポリマー粒子であって、具体的にはt−ブチル(メタ)アクリレート、2−メチル−2−ブチル(メタ)アクリレート、ベンジル(メタ)アクリレート、メトキシベンジル(メタ)アクリレート、エトキシベンジル(メタ)アクリレート、ジメトキシベンジル(メタ)アクリレート、メチルベンジル(メタ)アクリレート、ジメチルベンジル(メタ)アクリレート、エチルベンジル(メタ)アクリレート、4−フルオロベンジル(メタ)アクリレートなどの重合体で形成されるポリマー粒子等が挙げられる。この中でも特にt−ブチル(メタ)アクリレート、ベンジル(メタ)アクリレートの重合体が単量体の入手性、価格、反応性の点で好ましい。
例えば、(1)水酸基を含有したポリマー粒子とヒドロキシメチルマレイミドとをエーテル化触媒の存在下で縮重合させる方法や、(2)アミノ基を含有したポリマー粒子に対してN−(6−マレイミドカプロイロキシ)サクシンイミドのような二官能基試薬を作用させマレイミジル基を導入する方法、(3)t−ブチル(メタ)アクリレート重合体のごときエステル交換可能な官能基を有するポリマー粒子を作製し、テトラ−n−プロポキシチタンのようなエステル交換触媒を利用して、ヒドロキシメチルマレイミド等の水酸基を有するマレイミド化合物とエステル交換反応を行う方法、(4)カルボン酸基を有するポリマー粒子を作製し、ヒドロキシメチルマレイミド等の水酸基を有するマレイミド化合物と脱水反応を行う方法、等が挙げられる。
まず、ポリマー粒子のマレイミジル基と蛍光物質とを反応させて、ポリマー粒子のマレイミジル基に蛍光物質を結合させる。
粒子のマレイミジル基と蛍光物質の反応時の仕込みモル比は、1:1から100:1の範囲であり、より好ましくは2:1から20:1の範囲である。一般的に機器分析では官能基と反応する色素量は、官能基に対して1から数倍となるように仕込む。本発明の場合、仕込み時の蛍光物質量が粒子のマレイミジル基量に対してモル比で1倍より大きくなると、反応溶液中で色素が過剰になり析出したり、必要以上の蛍光色素が粒子中に取り込まれてしまうので好ましくない。また、マレイミジル基量に対して蛍光物質量がモル比で1/100より小さくなると、蛍光色素の量が不十分である粒子の定量に十分な蛍光が得られなくなるため好ましくない。
フローサイトメーターでの測定に必要な試料量は、1〜10mg程度であり、従来の定量方法に比べて、極めて少量となっている。また、蛍光物質が結合したマレイミジル基含有の粒子を直接定量できるため、従来の二次的な定量方法に比べて、操作の煩雑さも解消される。
t−ブチルメタクリレート(和光純薬(株)製)100部、ジビニルベンゼン(純度55%)5部を用いて懸濁重合を行い、分級操作を施し平均粒径15μmの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋重合体微粒子を得た。得られた架橋ポリマー粒子10部をポリエチレングリコール200(和光純薬(株)製)50部に分散させ、メシチレン(和光純薬(株)製)15部を加え、窒素雰囲気下テトラ−n−プロポキシチタンを0.2部滴下し、3、5、7、10、14時間、還流下反応させた。得られた粒子をそれぞれ、メタノールに分散/洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して水酸基含有架橋ポリマー粒子−1〜5を得た。
24部のマレイミド(アルドリッチ(株)製)、21部の35質量%ホルムアルデヒド水溶液(和光純薬(株)製)、5質量%水酸化ナトリウム水溶液を0.7部入れ、40℃で2時間反応させたところ、ヒドロキシメチルマレイミドの白色結晶が析出した。減圧濾過後、常温で真空乾燥した。このようにして得たヒドロキシメチルマレイミドの粗結晶を酢酸エチルで再結晶し、22部のヒドロキシメチルマレイミドを得た。
調製したマレイミジル基含有架橋ポリマー粒子−1〜5を各10部に対して、上記合成したヒドロキシメチルマレイミド17部、トルエン500部を入れ60〜70℃に加熱撹拌し、触媒のp−トルエンスルホン酸一水和物0.4部を入れ、温度を上げて10時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散/洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄し、さらに2NA((株)同仁化学研究所製)と塩化ナトリウム(和光純薬(株)製)を含むpH7のりん酸バッファーで分散/洗浄しさらにイオン交換水洗浄した後、単離乾燥してマレイミジル基含有架橋ポリマー粒子を得た。
グルタチオン還元型(和光純薬(株)製)0.09部に対して、FITC−I((株)同仁化学研究所製)0.25部をりん酸緩衝生理食塩水(PBS)(和光純薬(株)製)1000部に溶解させ、常温で1時間攪拌し、ランニングバッファーにPBSを用いてクロマトグラフィーで分離精製後、蛍光物質を含む反応液Aを10部を得た。得られた反応液に対して、DTNB((株)同仁化学研究所製)を用いてSH基量を測定したところ、2.5×10-5mol/Lであった。
・マレイミジル基含有架橋ポリマー粒子 0.002部
・反応液 A 1部
キャップ付き試験管に上記の組成になるように調製し、室温で振とう機で2時間攪拌した。試料をキャップ付き試験管のまま3000rpmで5分間遠心分離して粒子と上澄みに分け、さらに、PBS(和光純薬(株)製)で超音波分散と遠心分離繰り返し洗浄した。
得られたそれぞれの粒子を、フローサイトメーター用シース液(FACS FLOW ベクトンディケンソン社製)に分散し、フローサイトメーター(Facs Calibur ベクトンディケンソン社製)を用いて、測定条件一定で、検出波長530nmでの蛍光強度を測定した。
・2−メルカプトエチルアミン塩酸塩 0.05部
・PBS (和光純薬(株)製) 98.45部
・EDTA2Na・2水和物(2NA)(株)同仁化学研究所製) 1.5部
上記の組成の溶液を調製し反応液Bとした。
・反応液 B 10部
上記の組成になるようにキャップ付き試験管に取り、攪拌して粒子を5分間遠心分離した後、反応液Cを得た。
・0.1mol/L りん酸水素二ナトリウム12水和物(和光純薬(株)製)水溶液 1部
・5mmol/L DTNB((株)同仁化学研究所製)エタノール溶液 0.5部
・超純水 23.3部
A=(C−B)/w×1000
ここで、wは粒子の重量(g)である。
・反応液 A 1部
マレイミジル基含有架橋ポリマー粒子の量を変更した以外は、実施例1と同様の方法で粒子を作製して、測定を行った。
実施例1、実施例2の測定結果のデータを表1に示し、そのデータから作成したグラフを図1に示した。また、マレイミジル基量A(mmol/g)から、仕込み時の蛍光物質と粒子の水酸基量のモル比を計算し、その結果も併せて掲載した。図1では横軸に比較例のマレイミジル基量を示し、縦軸にフローサイトメーターで得られた蛍光強度の相対値としてプロットした。
実施例1において、t−ブチルメタクリレート(和光純薬(株)製)100部を用いたところを、t−ブチルメタクリレート(和光純薬(株)製)57.7部、スチレン(和光純薬(株)製)42.3部に変更した以外は同様にして、水酸基含有架橋ポリマー粒子−10〜15を得た。
実施例1と同様の方法で、傾向強度の測定を行った。その結果、水酸基含有架橋ポリマー粒子−10〜15から調製したマレイミジル基含有架橋ポリマー粒子についても、マレイミジル基量と蛍光強度との関係が直線的であった。これより、架橋ポリマー粒子の素材が異なる場合であっても、本発明の方法で定量評価が可能であることが明らかである。
Claims (2)
- 少なくともマレイミジル基を含むポリマー粒子について、SH基を有する蛍光物質と前記マレイミジル基とを、前記蛍光物質と前記ポリマー粒子の総マレイミジル基とのモル比が1:1〜1:100となるように反応させ、該蛍光物質の蛍光量を測定することによって、前記ポリマー粒子のマレイミジル基の量を測定する定量方法。
- 前記蛍光量が、フローサイトメーターで測定されることを特徴とする請求項1に記載の定量方法。
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