JP4578235B2 - 自己免疫状態およびｎａｄｐｈオキシダーゼ欠損 - Google Patents

Description

本願は、2002年5月13日に出願された米国仮特許出願第60/380,904号および2002年11月27日に出願された米国仮特許出願第60/429,609号の利益を主張する。

本発明は、自己免疫状態を診断および治療するのに関与する方法および材料に関する。とりわけ、本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う関節炎状態を診断および治療するのに関与する方法および材料、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う関節炎状態の発症を治療、予防または遅延するのに関与する方法および材料、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のアゴニストおよびアンタゴニストの同定に関与する方法および材料に関する。

自己免疫状態とは、哺乳動物の免疫系が自己の組織に対して反応を開始する状態である。そのような状態としては、これに限られるものではないが、関節炎（たとえば、慢性関節リウマチ（ＲＡ））、多発性硬化症、エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、気管支喘息、ブドウ球菌または連鎖球菌によって誘発された化膿性関節炎、および脈管炎を伴う心血管疾患が挙げられる。

ＲＡは、人口の約１〜２％に認められる慢性の炎症性疾患である。ＲＡでは主として末梢の関節に障害を受け、炎症性の滑膜炎が軟骨の破壊、骨の侵食、および最終的に関節の変形および関節機能の喪失に導く。ＲＡは、環境因子並びに複数の染色体領域の両者がＲＡに対する感受性に関わっているという点で複合的な疾患である。動物モデルにおける関節炎のインデューサーとしては、アジュバント、コラーゲン（たとえば、II型コラーゲン）（コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ））、ヘキサデカン（ヘキサデカン誘発関節炎（ＨＩＡ））、油脂（たとえば、フロイントの不完全アジュバント）、スクアレン（スクアレン誘発関節炎（ＳＩＡ））、およびプリスタン（プリスタン誘発関節炎（ＰＩＡ））が挙げられる。ＲＡの発症と関連することが知られている染色体領域としては、主要組織適合遺伝子複合体領域が挙げられる。さらに、異なるゲノム領域が、該疾患の異なる時期（たとえば、発症、急性発症時の際の重篤度、および慢性再発時の際の破壊の重篤度など）を制御することが知られている。

本発明は、関節炎（たとえば、ＲＡ）、多発性硬化症、エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、気管支喘息、ブドウ球菌または連鎖球菌によって誘発された化膿性関節炎、および脈管炎を伴う心血管疾患などの自己免疫状態の診断および治療に関連する方法および材料を提供する。たとえば、本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を診断および治療するのに関与する方法および材料、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態の発症を治療、予防または遅延するのに関与する方法および材料、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のアゴニストおよびアンタゴニストの同定に関与する方法および材料を提供する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態としては、これに限られるものではないが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の欠損を併発するかまたは該欠損によって引き起こされる、関節炎（たとえば、ＲＡ）、多発性硬化症、エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、気管支喘息、ブドウ球菌または連鎖球菌によって誘発された化膿性関節炎、および脈管炎状態を伴う心血管疾患が挙げられる。本発明の目的のためには、「arthritis accompanied by NADPH oxidase deficiency」（「ＡＡＮＯＤ」と略する）なる語は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の欠損を併発するかまたは該欠損によって引き起こされる関節炎状態をいう。そのような欠損は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の完全な欠如であってもよいし、またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の部分的な低減であってもよい。たとえば、哺乳動物が関節炎並びに同種の健康な哺乳動物によって通常示されるよりも低い程度のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を示す細胞を有する場合に、該哺乳動物はＡＡＮＯＤを有するといえる。同様に、哺乳動物が多発性硬化症並びに同種の健康な哺乳動物によって通常示されるよりも低い程度のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を示す細胞を有する場合に、該哺乳動物はＮＡＤＰＨオキシダーゼの欠損を伴う多発性硬化症を有するといえる。

本明細書に記載するＡＡＮＯＤを診断または治療するための方法および材料は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う他の自己免疫状態を診断および治療するのに用いることができることに注意すべきである。たとえば、本明細書に記載する方法および材料は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症状態を診断および治療するのに用いることができる。この観点から、実験的アレルギー性（自己免疫）脳脊髄炎（ＥＡＥ）は多発性硬化症の有用なモデルである。

ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤ）を有する患者を診断することは、臨床医がそれら患者に対して適切な治療を決定する手だてとなりうる。たとえば、ある患者をＡＡＮＯＤを有すると診断した臨床医は、該患者に患者の関節炎とＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損との両者を改善する投薬により処置することができる。幾つかの場合には、患者の関節炎の徴候が低減または緩和されるように、単一の投薬を患者のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を改善すべく用いることができる。それゆえ、ＡＡＮＯＤを有する患者をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性をモデュレートすることにより治療することは、たとえば、関節炎に付随する徴候または徴候の重篤度を低減することによって、または関節炎の発症を遅延させることによって、該患者の健康および生活の質を改善させることができる。

さらに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定することは、臨床医および患者の両者の助けとなりうる。たとえば、本明細書に記載する方法および材料は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤ）を有する患者を首尾良く治療できるように、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる因子を同定するのに用いることができる。

本発明は、関節炎がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の低減したレベルと関連するかまたは低減したレベルによって引き起こされうるという発見に基づく。たとえば、関節炎動物モデルにおける重篤な関節炎の徴候の発症は、少なくとも部分的に、低いＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の存在に依存している。本発明はまた、関節炎の感受性の原因である低減したレベルのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が哺乳動物のＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素のポリペプチド成員（たとえば、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド）における配列の変異（たとえば、変異したリン酸化部位）によって引き起こされうるという発見に基づいている。さらに、本発明は、関節炎を発症する傾向のある哺乳動物は該哺乳動物に正常レベルのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を与えることによって防御しうるという発見に基づく。たとえば、重篤な関節炎の徴候を発症しやすい傾向のある動物モデルは、該動物に完全に機能するＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を与えることによって救済することができる。

一般に、本発明は、自己免疫状態（たとえば、関節炎または多発性硬化症）の発症に対する哺乳動物の感受性を評価する方法であって、（ａ）哺乳動物から細胞を含有する血液または滑液試料を用意し、（ｂ）該細胞をＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターと接触させた後に該細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは自己免疫状態を有しない哺乳動物（たとえば、非関節炎哺乳動物）の集団からの対照細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均量であり、また、自己免疫状態を有しない哺乳動物は該哺乳動物と同じ種からのものであり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物を自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定する、ことを含む方法を特徴とする。ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターは、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘキサデセン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、スーパーオキサイドまたは反応性酸素分子種を測定することにより決定することができる。集団は少なくとも１０匹の哺乳動物を含んでいてよい。工程（ｃ）は該レベルが対照レベルよりも５〜７５％低いか否かを決定することを含んでいてよく、その際、工程（ｄ）は該レベルが対照レベルよりも５〜７５％低い場合に哺乳動物を自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定することを含む。工程（ｃ）は該レベルが対照レベルよりも２５〜５５％低いか否かを決定することを含んでいてよく、その際、工程（ｄ）は該レベルが対照レベルよりも２５〜５５％低い場合に哺乳動物を自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定することを含む。

他の態様において、本発明は、自己免疫状態（たとえば、関節炎または多発性硬化症）の発症に対する哺乳動物の感受性を評価する方法であって、（ａ）哺乳動物から血液または滑液試料を用意し、（ｂ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映する血液または滑液の成分のレベルを決定し、（ｃ）該レベルが対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは自己免疫状態を有しない哺乳動物（たとえば、非関節炎哺乳動物）の集団からの対照試料中の該成分の平均量であり、また、自己免疫状態を有しない哺乳動物は該哺乳動物と同じ種からのものであり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物を自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定する、ことを含む方法を特徴とする。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映する成分はマロン酸ジアルデヒドであってよい。

本発明の他の態様は、自己免疫状態（たとえば、関節炎または多発性硬化症）の発症に対する哺乳動物の感受性を評価する方法であって、哺乳動物が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路において機能するポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝的変異体を含むか否かを決定することを含み、その際、該遺伝的変異体の存在が該哺乳動物が自己免疫状態の発症に対して感受性であることを示すものであることを特徴とする方法を特徴とする。遺伝的変異体は突然変異体ポリペプチドをコードするものであってよい。突然変異体ポリペプチドは、ＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ２２ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４０ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド、またはＰ６７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドはＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。哺乳動物はヒトであってよく、突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは配列番号６に示す配列を含み、少なくとも２つのアミノ酸置換を有していてよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは、配列番号４の１０６位とアラインメントする位置にバリン以外のアミノ酸残基または配列番号４の１５３位とアラインメントする位置にトレオニン以外のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。遺伝的変異体は、遺伝子の調節配列中に突然変異を含んでいてよい。

本発明の他の態様は、自己免疫状態を有する哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を診断する方法であって、（ａ）哺乳動物から細胞を含有する試料を用意し、（ｂ）該細胞をＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターと接触させた後に該細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは自己免疫状態を有しない哺乳動物（たとえば、非関節炎哺乳動物）の集団からの対照細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均量であり、また、自己免疫状態を有しない哺乳動物は該哺乳動物と同じ種からのものであり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物をＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を有すると同定する、ことを含む方法を特徴とする。ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターは、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘキサデセン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、スーパーオキサイドまたは反応性酸素分子種を測定することにより決定することができる。集団は少なくとも１０匹の自己免疫状態を有しない哺乳動物を含んでいてよい。工程（ｃ）は該レベルが対照レベルよりも５〜７５％低いか否かを決定することを含んでいてよく、その際、工程（ｄ）は該レベルが対照レベルよりも５〜７５％低い場合に哺乳動物をＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定することを含む。工程（ｃ）は該レベルが対照レベルよりも２５〜５５％低いか否かを決定することを含んでいてよく、その際、工程（ｄ）は該レベルが対照レベルよりも２５〜５５％低い場合に哺乳動物をＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態の発症に対する感受性があると同定することを含む。

本発明の他の態様は、自己免疫状態を有する哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を診断する方法であって、（ａ）哺乳動物から血液または滑液試料を用意し、（ｂ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映する血液または滑液の成分のレベルを決定し、（ｃ）該レベルが対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは自己免疫状態を有しない哺乳動物（たとえば、非関節炎哺乳動物）の集団からの対照試料中の成分の平均量であり、また、自己免疫状態を有しない哺乳動物は該哺乳動物と同じ種からのものであり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物をＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を有すると同定する、ことを含む方法を特徴とする。

本発明の他の態様は、自己免疫状態を有する哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を診断する方法であって、（ａ）哺乳動物から血液または滑液試料を用意し、（ｂ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映する血液または滑液の成分のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは自己免疫状態を有しない哺乳動物の集団からの対照細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均量であり、また、自己免疫状態を有しない哺乳動物は該哺乳動物と同じ種からのものであり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物をＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を有すると同定する、ことを含む方法を特徴とする。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映する成分はマロン酸ジアルデヒドであってよい。

本発明の他の態様は、自己免疫状態を有する哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を診断する方法であって、哺乳動物が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路において機能するポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝的変異体を含むか否かを決定することを含み、その際、該遺伝的変異体の存在が該哺乳動物がＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を有することを示すものであることを特徴とする方法を特徴とする。遺伝的変異体は突然変異体ポリペプチドをコードするものであってよい。突然変異体ポリペプチドは、ＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ２２ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４０ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド、またはＰ６７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドはＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。哺乳動物はヒトであってよく、突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは配列番号６に示す配列を含み、少なくとも２つのアミノ酸置換を有していてよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは、配列番号４の１０６位とアラインメントする位置にバリン以外のアミノ酸残基または配列番号４の１５３位とアラインメントする位置にトレオニン以外のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。遺伝的変異体は、遺伝子の調節配列中に突然変異を含んでいてよい。

他の側面において、本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を有する哺乳動物を治療する方法であって、該動物にＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進する薬剤を投与することを含む方法を特徴とする。該薬剤は、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。あるいは、該薬剤は、上記化合物よりも極性の大きな誘導体であってよい。たとえば、該薬剤は、上記化合物のアルケン誘導体（たとえば、ウンデセン、ヘキサデセン）、または上記化合物の酸誘導体であってよい。１つの態様ではヘキサデセンを用いる。他の態様ではウンデカンを用いる。該薬剤は皮内、腹腔内、または鼻内に投与してよい。

他の態様において、本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態（たとえば、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症）を治療する医薬を製造するうえでの薬剤の使用であって、該薬剤が哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進するものである使用を特徴とする。該薬剤は、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。あるいは、該薬剤は、上記化合物よりも極性の大きな誘導体であってよい。たとえば、該薬剤は、上記化合物のアルケン誘導体（たとえば、ウンデセン、ヘキサデセン）、または上記化合物の酸誘導体であってよい。１つの態様ではヘキサデセンを用いる。他の態様ではウンデカンを用いる。

本発明の他の態様は、自己免疫状態の治療用医薬を調合する方法であって、（ａ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞または細胞画分を含有する試料を被験薬剤と接触させ、（ｂ）該試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも高いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤を欠如した対照試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、（ｄ）該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルが対照レベルよりも高い場合に該被験薬剤を自己免疫状態の治療に有用な薬剤であると同定し、ついで（ｅ）自己免疫状態の治療のために該薬剤から医薬を調合する、ことを含む方法を特徴とする。自己免疫状態は関節炎または多発性硬化症であってよい。

本発明の他の側面は、細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を活性化する薬剤を同定する方法であって、該細胞は関節炎誘発に対して感受性の非ヒト動物からのものであり、該細胞を被験薬剤で処理した後に該細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルが増大するか否かを決定することを含み、その際、該レベルの増大が該被験薬剤がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を活性化することを示すものであることを特徴とする方法を特徴とする。細胞はＤＡラットからのものであってよい。細胞はリンパ球であってよい。非ヒト動物は、プリスタン誘発関節炎、またはコラーゲン誘発関節炎、またはアジュバント誘発関節炎、または油脂誘発関節炎、またはヘキサデカン誘発関節炎、またはスクアレン誘発関節炎、またはアブリジン誘発関節炎に対して感受性であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、たとえばシトクロムＣアッセイまたはＷＳＴ−１アッセイまたはフローサイトメーター（たとえば、ＦＡＳＣ）ベースのアッセイにて、たとえばジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ−１２３）を用い、スーパーオキサイドまたは反応性酸素分子種を測定することにより決定することができる。

他の態様において、本発明は、自己免疫状態の治療に有用な薬剤を同定する方法であって、（ａ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞または細胞画分を含有する試料を被験薬剤と接触させ、（ｂ）該試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも高いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤を欠如した対照試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、ついで（ｄ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の該レベルが対照レベルよりも高い場合に該被験薬剤を自己免疫状態の治療に有用な薬剤であると同定する、ことを含む方法を特徴とする。自己免疫状態は関節炎または多発性硬化症であってよい。

他の態様において、本発明は、自己免疫状態の治療に有用な薬剤を同定する方法であって、（ａ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞または細胞画分を含有する試料を被験薬剤と接触させ、（ｂ）該試料をＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターと接触させ、（ｃ）該試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｄ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも高いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤の不在下で該アクチベーターで処理した対照試料中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、ついで（ｅ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の該レベルが対照レベルよりも高い場合に該被験薬剤を自己免疫状態の治療に有用な薬剤であると同定する、ことを含む方法を特徴とする。自己免疫状態は関節炎または多発性硬化症であってよい。

他の態様において、本発明は、細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進する薬剤を同定する方法であって、該細胞は関節炎誘発に対して感受性の非ヒト動物からのものであり、（ａ）該細胞をＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターおよび被験薬剤と接触させて被験細胞を生成させ、（ｂ）該被験細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも高いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤の不在下で該アクチベーターで処理した対照細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも高い場合に該被験薬剤をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進するものであると同定する、ことを含む方法を特徴とする。細胞はＤＡラットからのものであってよい。細胞はリンパ球であってよい。非ヒト動物は、プリスタン誘発関節炎、またはコラーゲン誘発関節炎、またはアジュバント誘発関節炎、または油脂誘発関節炎、またはヘキサデカン誘発関節炎、またはスクアレン誘発関節炎、またはアブリジン誘発関節炎に対して感受性であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターは、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘキサデセン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、たとえばシトクロムＣまたはＷＳＴ−１アッセイまたはフローサイトメーター（たとえば、ＦＡＳＣ）ベースのアッセイにて、たとえばジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ−１２３）を用い、スーパーオキサイドまたは反応性酸素分子種を測定することにより決定することができる。

他の態様において、本発明は、細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を抑制する薬剤を同定する方法であって、該細胞は関節炎誘発に対して感受性の非ヒト動物からのものであり、（ａ）該細胞をＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターおよび被験薬剤と接触させて被験細胞を生成させ、（ｂ）該被験細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤の不在下で該アクチベーターで処理した対照細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該被験薬剤をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を抑制するものであると同定する、ことを含む方法を特徴とする。細胞はＤＡラットからのものであってよい。細胞はリンパ球であってよい。非ヒト動物は、プリスタン誘発関節炎、またはコラーゲン誘発関節炎、またはアジュバント誘発関節炎、または油脂誘発関節炎、またはヘキサデカン誘発関節炎、またはスクアレン誘発関節炎、またはアブリジン誘発関節炎に対して感受性であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターは、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、プリスタン、フィトール、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘキサデセン、ヘプタデカン、オクタデカン、ガレクチン１、またはガレクチン３であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、スーパーオキサイドまたは反応性酸素分子種を測定することにより決定することができる。

他の態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化をモデュレートする（たとえば、Ｔ細胞活性化を低減または促進する）薬剤を同定する方法であって、（ａ）被験薬剤がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させるか否かを決定し、ついで（ｂ）該被験薬剤がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる場合にＴ細胞活性化を低減させる薬剤であると同定する、ことを含む方法を特徴とする。

本発明の他の側面は、第二のラットに対してコンジェニックなラットであって、該ラットと該第二のラットとの間で少なくとも１の遺伝子座が遺伝的に異なっており、該第二のラットが関節炎誘発に対して感受性であり、該ラットは該第二のラットからのＴ細胞を含んでおり、該ラットは関節炎を有することを特徴とするものを特徴とする。ラットはＤＡ.Ｅ３ｃ１２−／−ラットであってよい。第二のラットはＤＡラットであってよい。該少なくとも１の遺伝子座は、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドをコードする核酸を含んでいてよい。幾つかの態様において、１を超えない遺伝子座がラットと第二のラットとの間で異なっていてよい。そのような場合において、該遺伝子座は、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドをコードする核酸を含んでいてよい。

本発明の他の側面は、欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物であって、自己免疫疾患の徴候を示すものを特徴とする。自己免疫疾患は、関節炎、多発性硬化症、エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、気管支喘息、ブドウ球菌または連鎖球菌によって誘発された化膿性関節炎、または脈管炎を伴う心血管疾患であってよい。たとえば、非ヒト動物は関節炎の徴候を示してよい。関節炎は、アジュバント誘発関節炎、コラーゲン誘発関節炎、プリスタン誘発関節炎、ヘキサデカン誘発関節炎、アブリジン誘発関節炎、またはスクアレン誘発関節炎、または油脂誘発関節炎であってよい。欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路は、低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性によって示されてよい。低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能する突然変異体ポリペプチドの結果であってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドは、ＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ２２ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４０ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド、またはＰ６７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドはＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは配列番号６に示す配列を含み、少なくとも２つのアミノ酸置換を有していてよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは、配列番号４の１０６位とアラインメントする位置にバリン以外のアミノ酸残基または配列番号４の１５３位とアラインメントする位置にトレオニン以外のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。他の態様において、低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、Ｎｃｆ１をコードする遺伝子または遺伝子座（ｐ４７ｐｈｏｘ）の欠失の結果であってよい。欠失は、非ヒト哺乳動物でへテロ接合性またはホモ接合性であってよい。非ヒト哺乳動物はマウスであってよい。

他の態様において、本発明は、ある薬剤が関節炎の発症を遅延させるか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングする方法を特徴とする。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、（ｃ）該非ヒト哺乳動物で関節炎を誘発させ、ついで（ｄ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で関節炎の発症を遅延させるか否かを決定する、ことを含む。欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路は上記と同様であってよい。薬剤が関節炎の発症を遅延させるか否かを決定する方法としては、たとえば、（ａ）関節炎の発症価（onset of arthritis value）の日を非ヒト哺乳動物について決定し、ついで（ｂ）該非ヒト哺乳動物についての関節炎の発症価の日を関節炎の発症価の対照日と比較する、などの工程が挙げられる。関節炎の発症価の対照日は、該薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物についての関節炎の発症価の日を決定することにより決定することができる。非ヒト哺乳動物における関節炎の発症価の日は、それが発症価の対照日よりも遅い場合に遅延しているとされる。誘発関節炎は、アジュバント誘発関節炎、コラーゲン誘発関節炎、プリスタン誘発関節炎、ヘキサデカン誘発関節炎、アブリジン誘発関節炎、スクアレン誘発関節炎、および／または油脂誘発関節炎であってよい。

本発明の他の方法は、ある薬剤が関節炎を治療するか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングすることを含む。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、その際、該非ヒト哺乳動物は関節炎（たとえば、アジュバント誘発関節炎、コラーゲン誘発関節炎、プリスタン誘発関節炎、ヘキサデカン誘発関節炎、アブリジン誘発関節炎、スクアレン誘発関節炎、または油脂誘発関節炎）の徴候を示し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、ついで（ｃ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で関節炎を治療するか否かを決定する、ことを含む。そのような決定する工程としては、（ａ）関節炎スコアを非ヒト哺乳動物で計算し、ついで（ｂ）該関節炎価スコアを対照関節炎スコアと比較する、ことを含んでいてよい。対照関節炎スコアは、該薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物についての関節炎スコアを計算することにより決定することができる。該薬剤は、非ヒト哺乳動物における関節炎スコアが対照関節炎スコアよりも低い場合に関節炎を治療すると決定される。

他の態様において、ある薬剤が関節炎を予防するか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、（ｃ）該非ヒト哺乳動物に関節炎を誘発することが知られている化合物を投与し、ついで（ｄ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で該化合物によって誘発された関節炎を予防するか否かを決定する、ことを含む。該薬剤が関節炎を予防するか否かを決定する方法としては、関節炎の徴候について該非ヒト哺乳動物を評価することが挙げられる。そのような評価は、一定の期間、たとえば、２０日まで、３０日まで、５０日まで、または７０日まで行ってよい。該薬剤が関節炎を予防するか否かを決定する方法は、関節炎の徴候および発症の日を、該薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物の徴候および発症の日と比較することを含む。関節炎を誘発することが知られている化合物は、アジュバント、コラーゲン、プリスタン、ヘキサデカン、アブリジン、スクアレン、および／または油脂であってよい。コラーゲンはII型コラーゲンであってよく、油脂はフロイントの不完全アジュバントであってよく、アジュバントはマイコバクテリア由来であってよい。

他の態様において、リンパ球中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を抑制する薬剤を同定する方法であって、該リンパ球がＤＡラットからのものである方法が提供される。この方法は、（ａ）該リンパ球をＰＭＡおよび被験薬剤と接触させて被験細胞を生成させ、（ｂ）スーパーオキサイドを測定することにより該被験細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定し、（ｃ）該レベルがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルよりも低いか否かを決定し、その際、該対照レベルは該被験薬剤の不在下で該ＰＭＡで処理した対照細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の量であり、ついで（ｄ）該レベルが対照レベルよりも低い場合に該被験薬剤をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を抑制するものであると同定する、ことを含む。

他の態様において、関節炎誘発に対して感受性の非ヒト動物からのへテロ接合性Ｔ細胞を含む非ＤＡラットであって、関節炎を有するものが提供される。該ラットはＥ３ラットであってよい。非ヒト動物はＤＡラットであってよい。

特に断らない限り、本明細書で使用する技術的および科学的術語は本発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または同等の方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許その他の参照文献はその全体が参照のため引用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先するであろう。さらに、これら材料、方法、および実施例は例示的なものであって、本発明を限定することを意図するものではない。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであろう。

本発明は、自己免疫状態（たとえば、関節炎）の診断および治療に関連した方法および材料を提供する。とりわけ、本発明は、関節炎に対して感受性の哺乳動物およびＡＡＮＯＤを有する哺乳動物を診断するのに関与する方法および材料を提供する。さらに本発明は、関節炎に対して感受性の哺乳動物およびＡＡＮＯＤを有する哺乳動物を治療するのに関与する方法および材料を提供する。さらに、本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するのに関与する方法および材料を提供する。

１．関節炎に対して感受性の哺乳動物の診断
本発明は、関節炎の発症に対する哺乳動物の感受性を評価する方法を提供する。哺乳動物は、ヒト、サル、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、またはラットであってよい。簡単に説明すると、関節炎の発症に対する哺乳動物の感受性は、哺乳動物の細胞中に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを調べることによって決定することができる。ついで、以下にさらに詳細に記載するように、このＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを対照レベルと比較し、哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼのレベルが対照レベルよりも低い場合に該哺乳動物を関節炎の発症に対して感受性があると分類することができる。

哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、知られたいずれの方法によっても決定することができる。たとえば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、生成した反応性酸素分子種の量を測定することによって評価することができる。本明細書において「反応性酸素分子種」は、これに限られるものではないが、スーパーオキサイドイオン（Ｏ_２ ^−＊）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ^＊）およびヒドロキシドイオンなどの酸素の部分的に還元された分子種を含む。生成した反応性酸素分子種の量は、シトクロムＣ還元、ルシゲニン（lucigenin）ルミネセンス、ルミノールルミネセンス、およびＤＣＦＤＡ蛍光の測定を含むものなどの標準法を用いて測定することができる。別法として、哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を反映することが知られている成分のレベルを測定することによって決定することができる。そのような成分としては、これに限られるものではないが、循環しているマロン酸ジアルデヒドが挙げられる。

哺乳動物の細胞中に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定した後、このＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルをその特定の種についてのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルと比較することができる。特定の種についてのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルは、その特定の種からの健康な成員の集団からの細胞で測定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均レベルである。ヒトの場合、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の対照レベルは、５人、１０人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の健康なヒトからの細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均レベルであってよい。哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルが対照レベルよりも低い場合は、該哺乳動物は関節炎に対して感受性であると分類することができる。たとえば、対照レベルの約８５％未満（たとえば、７５％、６５％、５５％、４５％、３５％、２５％、１５％、５％未満またはそれ以下）のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する哺乳動物は関節炎に対して感受性であると分類することができる。

あるいは、欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する哺乳動物（たとえば、ヒト）を関節炎に対して感受性であると分類することができる。たとえば、欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有し、そのヒトからの約１×１０^６顆粒球の試料が０.０１μＭ ｆＭＬＰで約７分間処理した後に０.３〜０.４吸光度単位（５５０ｎｍ）未満のシトクロムＣ還元を示すヒトは関節炎に対して感受性であると分類することができる。一つの態様において、この活性レベルの約８５％未満（たとえば、７５％、６５％、５５％、４５％、３５％、２５％、１５％、５％未満またはそれ以下）の細胞を有するヒトは関節炎に対して感受性であると分類する。細胞は、ｆＭＬＰ以外のアクチベーター、たとえば、リン酸化をモデュレートすることによって細胞のシグナル伝達に影響を及ぼす薬剤（たとえば、ＰＭＡ）、細胞膜を不安定にする薬剤（たとえば、プリスタン、スクアレン、フィトール、およびヘキサデカン）、および細胞表面レセプターに結合する薬剤（たとえば、ガレクチン１およびガレクチン３）などで処理することができる。

哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定するためにいかなる種類の試料をも用いることができる。たとえば、試料は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞（たとえば、ＰＢＭＣ）を含む血液、滑液、またはリンパ液であってよい。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞としては、これに限られるものではないが、マクロファージ、好中球、顆粒球、多形核白血球、および単核細胞が挙げられる。そのような試料を哺乳動物から得るために標準法を用いることができる。たとえば、血液試料は静脈穿刺により得ることができる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を評価する前に試料を必要な標準調製手順に供することができる。たとえば、細胞を含む血液試料を遠心分離および／または洗浄工程に供して細胞を単離し、この細胞からＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を測定することができる。

他の態様において、関節炎の発症に対する哺乳動物の感受性は、哺乳動物のＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路内のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を調べることにより決定することができる。そのようなポリペプチドとしては、これに限られるものではないが、ＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ２２ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４０ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド、およびＰ６７ＰＨＯＸポリペプチドが挙げられる。たとえば、哺乳動物のＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するにはいかなる方法も用いることができる。たとえば、標準アミノ酸配列決定法を用いて精製したＰ４７ＰＨＯＸポリペプチド調製物のアミノ酸配列を決定することができる。別法として、ポリペプチドをコードする核酸を標準核酸配列決定法を用いてシークエンシングすることができる。核酸配列が決定されたら、それによってコードされるアミノ酸配列は誘導することができる。

哺乳動物のＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路内のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部（たとえば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）が決定されたら、最大ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の少なくとも約７０％（たとえば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）が保存されているように、そのアミノ酸配列をＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能する比較しうる参照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較することができる。たとえば、哺乳動物のＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列を、細胞がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の少なくとも約７０％を示すことを可能にするＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列と比較することができる。同様に、哺乳動物のＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列を、細胞がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の少なくとも約７０％を示すことを可能にするＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列と比較することができる。

本明細書で使用する「最大ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性」なる語は、特定の種の健康な成員からの細胞で測定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の平均最大レベルをいう。たとえば、ラットでは、最大ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、約５×１０^６の末梢好中球からのスーパーオキサイド放出をシトクロムＣ還元を用いて測定したときに、ＰＭＡで刺激して約１０００秒後に０.１５〜０.２５吸光度（５５０ｎｍ）単位であってよい。細胞は、ＰＭＡ以外のアクチベーター、たとえば、細胞膜を不安定にする薬剤（たとえば、プリスタン、スクアレン、フィトール、およびヘキサデカン）、および細胞表面レセプターに結合する薬剤（たとえば、ガレクチン１およびガレクチン３）などで処理することができる。Ｅ３ラットからの細胞はこの活性の少なくとも約７０％を示すので、Ｅ３ラットのＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能するポリペプチドのアミノ酸配列を参照ポリペプチドとして用いることができる。たとえば、ラットのＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列をＥ３ラットのＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４に示す）と比較することができる。ヒトでは、最大ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、約１×１０^６の顆粒球からのスーパーオキサイド放出をシトクロムＣ還元を用いて測定したときに、０.０１μＭのｆＭＬＰで刺激して約７分後に０.３〜０.４吸光度（５５０ｎｍ）単位であってよい。それゆえ、この活性の少なくとも７０％を示すヒト細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能するポリペプチドを参照ポリペプチドとして用いることができる。ヒトのＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを評価する場合は、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを参照ポリペプチドとして用いることができる。

試験すべき哺乳動物が比較しうる参照ポリペプチドと比較して突然変異体ポリペプチドを含む場合には、その哺乳動物は関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。突然変異体ポリペプチドは、比較しうる参照ポリペプチドの配列と比較したときにアミノ酸の付加、欠失、置換、またはその組み合わせを含むポリペプチドであってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドは、比較しうる参照ポリペプチドの配列と比較したときにいかなる数のアミノ酸の相違（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、またはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）を有するポリペプチドであってもよい。それゆえ、一つの態様において、ヒトが配列番号６に示すアミノ酸配列と比較して１またはそれ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上）のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有するＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを含む場合に、そのヒトは関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。あるいは、ヒトが配列番号４の１０６位とアラインメントする位置がバリン以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを含む場合に、そのヒトは関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。

さらに、突然変異体ポリペプチドは１またはそれ以上のリン酸化部位を欠失したポリペプチドであってよい。典型的には、リン酸化部位はセリン、トレオニン、またはチロシン残基である。それゆえ、比較しうる参照ポリペプチドと比較したときに１またはそれ以上のセリン、トレオニン、またはチロシン残基が欠失したポリペプチドは突然変異体ポリペプチドであるということができる。一つの態様において、ヒトが配列番号６に示すアミノ酸配列と比較して１またはそれ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のセリン、トレオニン、またはチロシン残基が欠失したアミノ酸配列を有するＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを含む場合に、そのヒトは関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。あるいは、ヒトが配列番号４の１５３位とアラインメントする位置がトレオニン以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドを含む場合に、そのヒトは関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。

特定の哺乳動物が関節炎に対して感受性であるか否かを決定するために突然変異体ポリペプチドの存在を使用することに加えて、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能するポリペプチドの発現を制御する調節配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサー）を調べることができる。たとえば、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド発現を制御するプロモーター配列を健康なヒトで正常なＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドの発現を駆動するプロモーター配列と比較することができる。この場合、突然変異した調節プロモーター配列を有するヒトは関節炎の発症に対して感受性であると分類することができる。

２．ＡＡＮＯＤを有する哺乳動物の診断
本発明は、哺乳動物が特定の種類の関節炎を罹患しているか否かを決定する方法を提供する。具体的には、哺乳動物が（１）関節炎の徴候および（２）対照価よりも低いかまたは欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを有する細胞を有する場合に、その哺乳動物はＡＡＮＯＤを有すると診断することができる。さらに、哺乳動物が（１）関節炎の徴候および（２）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能し、本明細書に記載の比較しうる参照ポリペプチドと比較したときに突然変異を含むポリペプチドを有する場合に、その哺乳動物はＡＡＮＯＤを有すると診断することができる。

関節炎の臨床徴候としては、これに限られるものではないが、腱、靱帯、関節、または骨の炎症が挙げられる。関節炎の徴候はまた、手足の痛み、腫脹、および硬直をも含み、これらは哺乳動物において虚弱、可動性の喪失、および変形に導きうる。関節炎の例としては、これらに限られるものではないが、細菌性関節炎、変形性関節症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘキサデカン誘発関節炎（ＨＩＡ）、プリスタン誘発関節炎（ＰＩＡ）、アブリジン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、スクアレン誘発関節炎（ＳＩＡ）、および油脂誘発関節炎（ＯＩＡ）が挙げられる。

哺乳動物の細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルは本明細書に記載するようにして評価することができる。同様に、本明細書に記載する方法および材料は、哺乳動物がＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能する突然変異体ポリペプチドを含むか否かを決定するのに用いることができる。

３．関節炎の治療
本発明は、哺乳動物において関節炎（たとえば、ＡＡＮＯＤ）を治療する方法および材料を提供する。ＡＡＮＯＤなどの関節炎を治療する方法は、哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを増大させる薬剤を投与することを含む。たとえば、細胞の反応性酸素分子種の産生を増大させる薬剤を関節炎を患う哺乳動物に投与することができる。そのような薬剤としては、これに限られるものではないが、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン；細胞膜を不安定にする薬剤（たとえば、プリスタン、スクアレン、フィトール、およびヘキサデカン）、および細胞表面レセプターに結合する薬剤（たとえば、ガレクチン１およびガレクチン３）が挙げられる。あるいは、該薬剤は上記化合物よりも極性の大きな誘導体であってよい。たとえば、該薬剤は、上記化合物のアルケン誘導体（たとえば、ウンデセン、ヘキサデセン）、または上記化合物の酸誘導体であってよい。１つの態様ではヘキサデセンを用いる。他の態様ではウンデカンを用いる。

ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤は、標準法を用い、いかなる標準剤形でも投与することができる。たとえば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤は、経口で摂取する錠剤またはカプセル（たとえば、徐放カプセル）の剤形であってよい。あるいは、該薬剤は液体の剤形であってよく、経口または注射により摂取することができる。該薬剤はまた坐剤の剤形であってよい。さらに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤は、皮膚に塗布できるクリーム、ゲル、およびフォームの剤形であってよい。さらに、該薬剤は、鼻内に投与する吸入薬の剤形であってよい。該薬剤は、皮内、腹腔内、または鼻内で投与することができる。

ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が低い細胞で該活性を増大させるのに充分な投与量で投与することができる。そのような投与量は、関節炎の進行を予防および／または遅延させ、または関節炎の進行を逆行させるため、数年の期間にわたって摂取することができる。投与量は、標準薬理法を用い、特定の薬剤の有効性および毒性に基づいて選択することができる。

４．ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を修飾する薬剤の同定
本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性をモデュレートする薬剤を同定する方法および材料を提供する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性をモデュレートする薬剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大または低減することができる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤の例としては、これに限られるものではないが、ノルフロキサシン、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、アラキドン酸、ミリスチン酸酢酸ホルボール、リゾホスファチジルコリン、ｆＭＬＰ、オクタン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン；細胞膜を不安定にする薬剤（たとえば、プリスタン、スクアレン、フィトール、およびヘキサデカン）、および細胞表面レセプターに結合する薬剤（たとえば、ガレクチン１およびガレクチン３）が挙げられる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を低減させる薬剤の例としては、これに限られるものではないが、ジフェニルヨードニウム、フェノール、アポシニン、キノン、ヘムリガンド、ピロキシカム、Ｂ２２０（２,３−ジメチル−６（２−ジメチルアミノエチル）−６Ｈ−インドロ−（２,３−ｂ）キノキサリン）、リドカイン、グリトキシン、ヒドロコルチゾン、ＯＰＣ−６５３５（６−［２−（３,４−ジエトキシフェニル）チアゾール−４−イル］−ピリジン−２−カルボン酸）、およびクロモリンが挙げられる。

ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大または低減させる薬剤を同定するため、被験薬剤をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞または細胞画分を含有する試料と混合することができる。そのような細胞は、ヒト（たとえば、健康なヒトまたは関節炎患者）または非ヒト動物（たとえば、健康な非ヒト動物または関節炎誘発に対して感受性の非ヒト動物などの関節炎に対して感受性の非ヒト動物）からのものであってよい。動物は、誘発剤（たとえば、コラーゲンまたはプリスタン）による処理に応答して関節炎状態を発症するときに関節炎誘発に対して感受性であるとされる。そのような動物としては、ＣＩＡ、ＰＩＡ、ＨＩＡ、ＳＩＡ、およびＯＩＡに対して感受性のものが挙げられる。非ヒト動物は、これに限られるものではないが、サル（たとえば、チンパンジー）、ウマ、ヤギ、ウシ、ブタ、および齧歯類（たとえば、マウスおよびラット）を含むいかなる種類の動物であってもよい。

関節炎に対して感受性の非ヒト動物の例は、ＤＡラットなどのＰＩＡに対して感受性のラットである。ラットは、標準法を用いてＤＡ系（または目的とするいずれかの系）の成員として同定することができる。たとえば、標準核酸配列決定法を用い、（１）マイクロサテライト配列、（２）主要組織適合遺伝子複合体をコードする核酸配列、または（３）１８ＳリボソームＲＮＡをコードする核酸配列を含む（これに限られるものではないが）、ゲノムまたはミトコンドリア核酸配列を比較することができる。２つの動物からの核酸配列の比較は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）に基づく方法およびランダム複製多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）に基づく方法などの遺伝子分析手段を用いて行うことができる。２つの動物は、両動物の核酸配列がＲＦＬＰまたはＲＡＰＤにより分析したときに類似の特性を有している場合に同じ系であると結論付けることができる。

被験薬剤で処理した後、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルを決定することができる。試料は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有する細胞または細胞画分を含有するいかなる種類の試料であってもよい。試料は、血液、リンパ液、または滑液であってよい。細胞は、リンパ球、顆粒球（たとえば、好中球）またはマクロファージであってよい。

被験薬剤の存在下で決定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を被験薬剤の不在下で決定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性と比較することができる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤とは、被験薬剤の不在下で観察されるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルと比較したときにいずれかの量にて（たとえば、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、またはそれ以上の％の増大）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の増大に導くものである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を低減させる薬剤とは、被験薬剤の不在下で観察されるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルと比較したときにいずれかの量にて（たとえば、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、またはそれ以上の％の低減）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の低減に導くものである。

他の態様において、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大または低減させる薬剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、アクチベーター、および被験薬剤を含むアッセイ混合物で同定することができる。これらの態様において、アクチベーターおよび被験薬剤の存在下で決定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性をアクチベーターの存在下で被験薬剤の不在下で決定したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性と比較することができる。本明細書において、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大させる薬剤とは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼアッセイ混合物中に存在するときに、被験薬剤の不在下で観察されるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルと比較した場合にいずれかの量にて（たとえば、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、またはそれ以上の％の増大）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の増大に導くものであり、一方、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を低減させる薬剤とは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼアッセイ混合物中に存在するときに、被験薬剤の不在下で観察されるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性のレベルと比較した場合にいずれかの量にて（たとえば、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、またはそれ以上の％の低減）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の低減に導くものである。

５．へテロ接合性Ｔ細胞を含む非ＤＡラット
本発明は、新規の形態の誘発性関節炎（すなわち、Ｔ細胞誘発関節炎：ＴＩＡ）と組み合わせてへテロ接合性Ｔ細胞を有する動物（たとえば、ラットまたはマウスなどの齧歯類）を生成する方法および材料を提供する。ＴＩＡは、レシピエントの動物に関節炎を患うドナー動物からのＴ細胞を導入することによって動物において発症させることができる。ドナー動物およびレシピエント動物は、異なる系統からのものであってもよいし、または（１）Ｐｉａ４ ＱＴＬなどの関節炎に対する感受性に寄与するＱＴＬまたは（２）ｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の配列に関してのみ相違する同じ飼育群の動物の成員であってもよい。Ｔ細胞は、脾臓のホモジナイズを含むいずれの標準法を用いても動物から単離することができる。Ｔ細胞の移送は、いずれの常法を用いても行うことができる。ＴＩＡを患う動物は、本明細書に記載するようにＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を修飾する薬剤を同定するのに用いることができる。

６．欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物
本発明の他の側面は、欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物であって自己免疫疾患の徴候を示すものを提供する方法および材料を特徴とする。哺乳動物は、サル、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、またはラットであってよい。自己免疫疾患は、関節炎、多発性硬化症、エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、Ｉ型糖尿病、気管支喘息、ブドウ球菌または連鎖球菌によって誘発された化膿性関節炎、および脈管炎を伴う心血管疾患であってよい。たとえば、非ヒト哺乳動物は関節炎の徴候を示してよい。関節炎は当該技術分野で知られた標準法によって誘発することができ、たとえば、アジュバント誘発関節炎、ＣＩＡ、ＰＩＡ、ＨＩＡ、アブリジン誘発関節炎、ＳＩＡ、またはＯＩＡであってよい。

非ヒト哺乳動物において欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路は、低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性によって示すことができる。低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路で機能する突然変異体ポリペプチドの結果であってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドは、ＧＰ９１ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ２２ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４０ＰＨＯＸポリペプチド、Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチド、またはＰ６７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。たとえば、突然変異体ポリペプチドはＰ４７ＰＨＯＸポリペプチドであってよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは配列番号６に示す配列を含み、少なくとも２つのアミノ酸置換を有していてよい。突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドは、配列番号４の１０６位とアラインメントする位置にバリン以外のアミノ酸残基または配列番号４の１５３位とアラインメントする位置にトレオニン以外のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。他の態様において、低減したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性はＮｃｆ１（ｐ４７ｐｈｏｘ）をコードする遺伝子または遺伝子座の欠失の結果であってよい。欠失は、非ヒト哺乳動物でへテロ接合性またはホモ接合性であってよい。一つの態様において、非ヒト哺乳動物はマウスであってよい。たとえば、マウスは当該技術分野における標準法を用いてＮｃｆ１（ｐ４７ｐｈｏｘ）をノックアウトされていてよく、またはマウスはすでに記載したようにして突然変異体Ｐ４７ＰＨＯＸポリペプチドの一つを発現してよい（たとえば、トランスジェニックマウスとして）。

７．関節炎を遅延、治療または予防する薬剤のスクリーニング
他の態様において、本発明は、ある薬剤が関節炎の発症を遅延させるか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングする方法を提供とする。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、（ｃ）該非ヒト哺乳動物で関節炎を誘発させ、ついで（ｄ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で関節炎の発症を遅延させるか否かを決定する、ことを含む。

欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する哺乳動物はすでに記載したようにして得ることができる。薬剤が関節炎の発症を遅延させるか否かを決定する方法としては、たとえば、（ａ）関節炎の発症価の日を非ヒト哺乳動物について決定し、ついで（ｂ）該非ヒト哺乳動物についての関節炎の発症価の日を関節炎の発症価の対照日と比較する、などの工程が挙げられる。関節炎の発症は肉眼視スコアリングシステムを用いてモニターすることができ、その際、１ポイントは膨潤または赤くなった各足に、１ポイントは膨潤した各中足（midfood）、足指、または膝関節突起に、および５ポイントは膨潤した足首に与え、四肢当たり１５の最大スコアで合計６０スコアとする。哺乳動物を関節炎の誘発後、１〜２ヶ月の間、１週間に１〜４回モニターする。関節炎の発症価の対照日は、薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物についての関節炎の発症価の日を決定することにより決定することができる。非ヒト哺乳動物の関節炎の発症の日は、それが発症価の対照日よりも遅い場合に遅延しているとされる。関節炎は通常の手段により誘発することができ、アジュバント誘発関節炎、ＣＩＡ、ＰＩＡ、ＨＩＡ、ＳＩＡ、アブリジン誘発関節炎、またはＯＩＡであってよい。

本発明はまた、ある薬剤が関節炎を治療するか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングする方法をも提供する。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、その際、該非ヒト哺乳動物は関節炎（たとえば、アジュバント誘発関節炎、ＣＩＡ、ＰＩＡ、ＨＩＡ、ＳＩＡ、アブリジン誘発関節炎、またはＯＩＡ）の徴候を示し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、ついで（ｃ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で関節炎を治療するか否かを決定する、ことを含む。そのような決定する工程としては、（ａ）関節炎スコアを非ヒト哺乳動物で計算し、ついで（ｂ）該関節炎スコアを対照関節炎スコアと比較する、ことを含んでいてよい。欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有し関節炎の徴候を示す哺乳動物はすでに記載したようにして得ることができる。対照関節炎スコアは、該薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物についての関節炎スコアを計算することにより決定することができる。関節炎スコアはすでに記載したようにして肉眼視スコアリングシステムを用いて決定することができ、平均スコア、相加スコア、または最大スコアであってよい。該薬剤は、非ヒト哺乳動物における関節炎スコアが対照関節炎スコアよりも低い場合に関節炎を治療すると決定される。

他の態様において、ある薬剤が関節炎を予防するか否かを決定すべく該薬剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、（ａ）欠陥のあるＮＡＤＰＨオキシダーゼ経路を有する非ヒト哺乳動物を用意し、（ｂ）該非ヒト哺乳動物に薬剤を投与し、（ｃ）該非ヒト哺乳動物に関節炎を誘発することが知られている化合物を投与し、ついで（ｄ）該薬剤が該非ヒト哺乳動物で該化合物によって誘発された関節炎を予防するか否かを決定する、ことを含む。該薬剤が関節炎を予防するか否かを決定する方法としては、関節炎の徴候について該非ヒト哺乳動物を評価することが挙げられる。そのような評価は、一定の期間、たとえば、２０日まで、３０日まで、５０日まで、または７０日まで行ってよい。該薬剤が関節炎を予防するか否かを決定する方法は、関節炎の徴候および発症の日を、該薬剤を投与していない対照非ヒト哺乳動物の徴候および発症の日と比較することを含む。この評価および比較にはすでに上記で記載した肉眼視スコアリングシステムを用いることができる。関節炎を誘発することが知られている化合物は、アジュバント、コラーゲン、プリスタン、ヘキサデカン、アブリジン、スクアレン、または油脂であってよい。コラーゲンはII型コラーゲンであってよく、油脂はフロイントの不完全アジュバントであってよく、アジュバントはマイコバクテリア由来であってよい。

本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これら実施例は特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１−動物
以下の実験に用いたラット（ラツス・ノルベジクス（Rattus norvegicus））系には、ＰＩＡに対して極めて感受性のＤＡ系、およびＰＩＡ耐性のＥ３系が含まれていた。ＤＡラットおよびＥ３ラットはツェントラールインスティトゥート・フューア・フェアズーフスティーアズフト（Zentralinstitut fur Versuchstierzucht）、ハノーバー、ドイツから得、１２時間の明／暗サイクルで環境状態を制御した環境にある動物施設で保持した。ラットは木の削りくずを入れたポリスチレン製ケージに収容し、標準齧歯類用食餌および水を随意に与えた。ラットは、センダイウイルス、ハンタンウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、サイトメガロウイルス、およびマイコプラズマ・パルモニスを含む通常の病原体から遮断されていた。動物の食餌および実験は、同じ動物施設で行った。

実施例２−関節炎の誘発および評価
ラットでの関節炎の誘発は、尾の基部に１５０μＬのプリスタン（２,６,１０,１４−テトラメチルペンタデカン；Aldrich、ミルウォーキー、ウイスコンシン）を皮内注射することにより８〜１２週齢の年齢で行った。関節炎の発症は肉眼視スコアリングシステムを用いてすべての四肢でモニターした。簡単に説明すると、１ポイントは膨潤または赤くなった各足に、１ポイントは膨潤した各中足（midfoot）、足指、または膝関節突起に、および５ポイントは膨潤した足首に与えた。四肢当たりの最大スコアは１５であり、マウス当たりの最大スコアは６０スコアであった。ラットをプリスタン注射後１ヶ月の間、１週間に１〜４回調べた。

組織病理学的分析のため、プリスタン注射後３１日でラットを屠殺し、後肢および足首関節を以下のようにして調製し、分析した。後肢を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、ＥＤＴＡ中で脱石灰し、パラフィン中に埋設し、ついで切片にし、ヘマトキシリンおよびエリスロシンで染色した（Jonssonら、(1986) J. Immunol. Methods 88: 109-14に記載）。

実施例３−コンジェニック系での関節炎重篤度への連鎖の確認
Ｐｉａ４と称する量的形質座（quantitative trait locus；ＱＴＬ）がＰＩＡおよびＣＩＡと関係していることがわかった。Ｐｉａ４ ＱＴＬ中の関節炎と関係した遺伝子を同定および単離するため、ＰＩＡ耐性のＥ３ラットからの第１２染色体の１０ｃＭ断片をＰＩＡ感受性のＤＡラットに遺伝子導入してＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットを得た。１０ｃＭ断片上のＲＡと関係しない他のＥ３遺伝子は、ＤＡラットと１０を超える連続した戻し交配で除去した。ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット間でのＦ２交雑から得たＤＡ同腹ラットを対照として用いた。Ｐｉａ４ ＱＴＬはＤＡに付加して遺伝され、ＤＡラットはＥ３ラットとＤＡラット間での最初のＦ２交雑に関節炎重篤度促進遺伝子座を有していた。子孫のラットを対照のラットと比較したときに観察された有意の表現型の差異は、Ｐｉａ４領域での遺伝的差異によると結論付けることができた。

プリスタンを注射することにより関節炎を２０匹のＤＡラット、４０匹のＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット、および１４匹のＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットで誘発させ、臨床関節炎の発症をすでに記載したようにして評価した。図１は、ＤＡラット、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットにプリスタン注射後の１０日目、１４日目、１９日目、２４日目、および２８日目に決定した臨床関節炎スコアの比較である。ＤＡ同腹対照とＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットとの間で関節炎の重篤度に劇的な差異が認められた（ｐ＜０.０００１）。ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−コンジェニックラットは依然として関節炎に対して感受性であったが、炎症は非常に軽かった。プリスタン注射後の３１日目に観察された関節炎の罹患率は、ＤＡラットで１００％、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラットで５８％、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットで３６％であった。プリスタン注射後の３１日目に得たラット後肢の足首関節の切片をヘマトキシリンおよびエリスロシンで染色し、ついで１００×の倍率にて顕微鏡で調べたところ、関節への細胞の浸潤が観察された。Ｐｉａ４ ＱＴＬにより与えられたＰＩＡ耐性Ｅ３表現型は殆ど優性に近く防御的であることがわかったが、第１２染色体の２つのＥ３遺伝子座を有するＤＡ子孫ラットは第１２染色体の１つのＥ３遺伝子座を有するＤＡ子孫ラットよりも低い重篤度の関節炎を示した（ｐ＜０.０５）。

Ｐｉａ４ ＱＴＬを含むＥ３由来断片はまた、ＣＩＡ、ＨＩＡ、およびＯＩＡを抑制することがわかった（表１を参照）。ＤＡ由来Ｐｉａ４についてコンジェニックなＥ３ラット（たとえば、Ｅ３.ＤＡｃｈｒ１２−／−ラット）は依然として関節炎に対して耐性であったので、他の遺伝子が関与していると思われる。

表１．ＣＩＡ、ＯＩＡ、およびＨＩＡに対するＰｉａ４コンジェニックラット系の感受性：ｐ値はＰｉａ４コンジェニックラットとＤＡラットとの間で観察された差異の有意さを示す。ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−とＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−との間で有意の差異は検出されなかった。

実施例４−シークエンシングおよび物理的マッピング
Woonら、(1998) Genomics 50: 306-16に記載されたＢＮラットのＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリー（ＲＰＣＩ−３１）を、Resource Center of the German Human Genome Project (ＲＺＰＤ)（rzpd.deでのworld wide webを参照）からＤＮＡプールおよびアレイしたフィルターとして得た（ライブラリー７１２）。正のＰＡＣクローン、並びにＰｉａ４連関マイクロサテライトの近傍のＤＮＡに対応するＤＮＡ挿入物を有するクローンもまた、ＲＺＰＤから得た（Goseleら、(2000) Genomics 69: 287-94、mdc-berlin.de/ratgenomでのworld wide web、およびmolgen.mpg.de/~ratgenomeでのworld wide webを参照）。ＰＡＣクローンをQiagen Large Construction Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製し、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて末端シークエンシングした（Woonら、(1998) Genomics 50: 306-16に記載）。

ラットのｐ４７ｐｈｏｘ、ＧＴＦ２ｉ、およびＧＴＦ２ｉｒｄ ｃＤＮＡ配列を以下のようにして決定した。ラットのｐ４７ｐｈｏｘ（ジーンバンクアクセッション番号ＡＹ０２９１６７）、マウスのＧＴＦ２ｉ（ジーンバンクアクセッション番号ＡＦ０１７０８５）およびマウスのＧＴＦ２ｉｒｄ（ジーンバンクアクセッション番号ＮＭ ０２０３３１）配列に対応する公的に利用可能な配列をプライマーデザインのために用いた。Ｅ３、ＤＡ、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２のＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。第一鎖ｃＤＮＡをFirst-strand cDNA Synthesis Kit（Amersham Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン）を用いて全ＲＮＡから合成した。二本鎖ｃＤＮＡ断片を通常のＰＣＲにより生成し、ついでｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにライゲートした。その結果得られたプラスミド構築物をコンピテントな大腸菌（Invitrogen、ペスリー、英国）に形質転換し、ついで通常のアルカリ溶解精製に従って大腸菌形質転換体から精製した。シークエンシングはMegaBACE 1000（Amersham Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン）シークエンサーを用いて行い、得られたデータをSequence Analysis 2.1およびSeqMan4.05を用いて分析した。

実施例５−遺伝子型決定および統計的分析
ＤＮＡを足の生検から調製し、MegaBACE 1000（Amersham Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン）上で分析する複製連鎖反応（ＰＣＲ）によりマイクロサテライトマーカーでアッセイした。定量データを平均±ＳＥＭで表し、有意分析をノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いて行った。頻度データの有意さをカイ二乗分析により決定した。

実施例６−物理的マッピングおよびポジショナルクローニングの結果
Ｅ３ラットにおいてＰＩＡ耐性表現型に寄与するＰｉａ４ ＱＴＬ内の遺伝子型を同定するため、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットをＤＡラットと戻し交配し、異なるサイズの重複したＰｉａ４断片を有する多数のコンジェニック子孫ラットを以下の実験に用いた。物理的マッピングは１ｃＭのコンジェニック断片から開始した。図２は、ＰＡＣクローンおよびＥＳＴクローンを用いて構築したＰｉａ４領域の物理的地図である。Ｐｉａ４領域中の知られたマイクロサテライト（ｄ１２ｒａｔ７２、ｄ１２ｇｏｔ４５、ｄ１２ｇｏｔ４６およびｄ１２ｒａｔ２６）を、この領域に対応する挿入物を有するＰＡＣを同定するのに用いた。アイオワ大学でのRat ESTプロジェクトの結果を用いて、Ｐｉａ４領域中に配列を含むことが知られているＥＳＴクローンを同定した。ＰＡＣクローンの末端配列およびＥＳＴクローンからのプライマー配列を、Ｐｉａ４領域の物理的地図を作製するのに用いた。ラットのＰｉａ４領域（ＰＡＣクローンＲＰ３１−７８ｃ１３、ＲＰ３１−４８５ｆ９、ＲＰ３１−１９８ｌ１３、ＲＰ３１−７５ｇ２２、ＲＰ３１−１１ｍ２２、ＲＰ３１−３９１ｄ２３、ＲＰ３１−５７ｊ２３）からの、Ｐｉａ４領域に対応する挿入物を有する部分的にシークエンシングしたＢＡＣクローン（hgsc.bcm.tmc.edu/projects/rat/でのworld wide webを参照）からの、およびマウス（ジーンバンクアクセッション番号ＮＴ ０２９８２９、ＡＦ２８９６６５、ＡＦ１３９９８７およびＡＦ２６７７４７；Kwitekら、(2001) Genome Res. 11: 1935-43；Hoogenraadら、(1998) Genomics 53: 348-58；Valeroら、(2000) Genomics 69:1-13を参照）およびヒト（ジーンバンクアクセッション番号ＮＴ ００７８６７；Peoplesら、(2000) Am. J. Hum. Genet. 66: 47-68；Osborneら、(2001) Nat. Genet. 29: 321-5を参照）の相同領域からの配列情報を組み立ててＰｉａ４の物理的地図を作製した。

Ｐｉａ４領域の物理的地図を単離したコンジェニック系の関節炎感受性と組み合わせることにより、ＰＩＡ耐性表現型に必要な３００キロ塩基の最小領域が同定された。この３００キロ塩基領域には、２つの遺伝子、すなわちｐ４７ｐｈｏｘおよびＧＴＦ２ｉが含まれていた。ｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子は、感染の結果として酸素ラジカルを生成するＮＡＤＰＨ複合体のサブユニットである好中球細胞質因子１（Neutrophil Cytosolic Factor 1（ＮＣＦ１））をコードする（Volppら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 7195-9を参照）。ＧＴＦ２ｉ遺伝子は、Ｂ細胞レセプターシグナル伝達経路に関与するブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の基質であるブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）結合タンパク質（ＢＡＰ−１３５）をコードする（Yang & Desiderio (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 604-9を参照）。

実施例７−ｐ４７ｐｈｏｘ Ｅ３対立遺伝子は関節炎において優性の防御的役割を有する
Ｐｉａ４領域中のＤＡ対立遺伝子とＥ３対立遺伝子とを区別する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、Pyrosequencing（Pyrosequencing、ウプサラ、スウェーデン）を用い、製造業者によって提供されたプロトコールに従ってｃＤＮＡをシークエンシングすることにより同定した。ＳＮＰはｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子、ＧＴＦ２ｉ遺伝子、ＧＴＦ２ｉｒｄ１遺伝子およびＣｙｌｎ２（ＡＪ０００４８５）遺伝子で認められた。

ＤＡのｐ４７ｐｈｏｘ ｃＤＮＡとＥ３のｐ４７ｐｈｏｘ ｃＤＮＡとの比較により３つのＳＮＰが明らかとなった（図３参照）。３つの多型はすべて塩基置換であり、そのうち２つは非同義で１０６位および１５３位アミノ酸の置換という結果となった。これら配列多型には、（１）１０６位でのメチオニン残基のバリン残基による置換（Ｍｅｔ１０６Ｖａｌ）という結果となる、ＤＡラットと比較したときにＥ３ラットでの３３０位でのアデニンヌクレオチドのグアニンヌクレオチドによる置換（ＤＡ／Ｅ３；Ａ３３０Ｇ）；（２）１５３位でのメチオニン残基のトレオニン残基による置換（Ｍｅｔ１５３Ｔｈｒ）という結果となる、Ｅ３ラットでの４７２位でのチミンヌクレオチドのシトシンヌクレオチドによる置換（ＤＡ／Ｅ３；Ｔ４７２Ｃ）；および（３）アミノ酸変化に導かない同義置換である、ヌクレオチド１１６１でのアデニンのシトシンによる置換が含まれていた。ＤＡラットからのｐ４７ｐｈｏｘ ｃＤＮＡの配列は、Sprague-Dawleyラットからのｐ４７ｐｈｏｘ（ＡＹ０２９１６７）の刊行された配列と同一であった。

ＤＡのＧＴＦ２ｉ ｃＤＮＡ配列とＥ３のＧＴＦ２ｉ配列との比較により、Ｅ３が２９９２位にヌクレオチド置換を有することが明らかとなった。ＤＡ配列中の２９９２位のチミンヌクレオチドはＥ３配列中のシトシンヌクレオチドで置換されていた（ＤＡ／Ｅ３；Ｔ２９９２Ｃ）。この置換は非翻訳領域で生じており、それゆえＧＴＦ２ｉタンパク質配列には影響を及ぼさなかった。

ＤＡラットおよびＥ３ラットのＣｙｌｎ２遺伝子とＧＴＦ２ｉｒｄ１遺伝子との同様の比較により、Ｃｙｌｎ２遺伝子中のヌクレオチド４２０６でのＳＮＰ（ＤＡ／Ｅ３；Ｇ４２０６Ａ）およびＧＴＦ２ｉｒｄ１遺伝子中のヌクレオチド２８２３でのＳＮＰ（ＤＡ／Ｅ３；Ｇ２８２３Ｃ）が明らかとなった。

実施例８−近交ラットおよび野生型ラットでのｐ４７ｐｈｏｘ多型の普及率（Prevalence）
他の近交ラット系および野生型ラットでのｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の配列を、ｐ４７ｐｈｏｘ Ｅ３対立遺伝子中の上記３つの多型の存在について分析した（表２）。近交ラットおよび野生型ラットで高頻度の多型が検出された。このことは、これら多型が家畜化（domestification）または近交実験室ラットで生成した突然変異のいずれの結果でもないことを示唆している。実際、ＤＡ対立遺伝子およびＥ３対立遺伝子は等しい頻度で生じており、これら対立遺伝子が自然選択により保持されていることを示している。

表２．ＤＡ／Ｅ３近交ラットおよび野生型ラットの集団で同定されたｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の多型

ＢＮラットに存在する通常のハプロタイプは、ヌクレオチド３３０におけるＤＡ多型およびヌクレオチド４７２におけるＥ３多型を含んでいた。多発性硬化症（Dahlmanら、(1999) J. Immunol. 162: 2581-8参照）または関節炎（Griffithsら、(2000) Arthritis Rheum. 43: 1278-89参照）と類似の疾患状態を示すＤＡラットとＢＮラットとの間での以前に刊行された交雑種は、Ｐｉａ４と同じ位置での遺伝子座を明らかにしており、疾患防御がアミノ酸１５３でのトレオニンと関係していることが示唆されている。トレオニンが潜在的なリン酸化部位であること、およびヒトＮＡＤＰＨ複合体の機能がｐ４７ｐｈｏｘのリン酸化によって高度に制御されていることから、Ｐ４７ＰＨＯＸの活性、それゆえＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性は、この残基のリン酸化状態によって影響を受けやすいと思われる（Faustら、(1995) J. Clin. Invest. 96: 1499-505；El Bennaら、(1996) J. Biol. Chem. 271: 6374-8；Lalら、(1999) Biochem. J. 338: 359-66参照）。

実施例９−ＤＡラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−コンジェニックラットは同様のｐ４７ｐｈｏｘ発現レベルを示した
ＤＡラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２ラットの脾臓およびリンパ節でのｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の発現をノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。３匹のＤＡラットおよび３匹のＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットをプリスタン注射に供した。プリスタン注射の８日後、１０μｇの全ＲＮＡを脾臓および鼠蹊リンパ節から単離した。ＲＮＡをアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、紫外線照射により固定した。得られたノーザンブロットを２つのプローブとのハイブリダイゼーションに供した：（１）ラットＰ４７ＰＨＯＸをコードするα^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＤＮＡおよび（２）３６Ｂ４−リボソームタンパク質をコードするα^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＤＮＡ。ハイブリダイゼーションはAmbion ULTRAハイブリダイゼーション緩衝液（Ambion、オースチン、テキサス）中、４２℃で一夜行った。ハイブリダイゼーション後、ノーザンブロットを製造業者の指示に従って洗浄し、ついでKodakスクリーンおよびImager FXシステム（Bio-Rad、ハーキュールズ、カリフォルニア、米国）を用いてリン酸造影（phosphor imaging）に供した。酸性リボソームタンパク質に対して向けられたプローブ（Ｚ２９５３０）を、分析したＲＮＡの全量に対して対照として用いた。

ＤＡラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−コンジェニックラットを比較したときにｐ４７ｐｈｏｘ ｍＲＮＡの発現レベルに差異は検出されなかった。それゆえ、ｐ４７ｐｈｏｘの発現レベルよりもむしろｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子における多型が関節炎の重篤度の差異の原因であった。

ｐ４７ｐｈｏｘのポリペプチド発現をウエスタンブロットにより分析した。脾臓細胞を、溶解緩衝液（３×１０^７細胞／１００μＬ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、０.５％トリトンＸ−１００（Sigma）、０.２５Ｍショ糖、プロテアーゼインヒビター錠（Roche Diagnostics）、および１０μｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Sigma）中、４℃で２時間溶解し、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。タンパク質アッセイキット（BioRad）によって決定した上澄み液中の全タンパク質の等価量を１０％分離ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ポリペプチドを電気泳動的にニトロセルロースメンブレン（Biorad）に移した。メンブレンをＮｃｆ１ペプチドＲＲＳ ＴＩＲ ＮＡＱ ＳＩＨ ＱＲＣに対するポリクローナルウサギ抗体、ビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Jacksson Immunoresearch Laboratories）、およびExtrAvidinペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma）とともにインキュベートした。免疫反応性のバンドを、ＥＣＬ（enhanced chemoluminescence）試薬およびHyperfilm（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて可視化した。

ＤＡラットとＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−コンジェニックラットとでポリペプチド発現に差異は観察されなかった。

実施例１０−ＣＯＭＰおよびα _１ −ＡＧＰの血漿レベルはＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットの方が対照ラットよりも低かった
軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）およびα_１酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）は、ＲＡおよびＰＩＡと密接に関連する２つの血漿マーカーである。ＡＧＰ（肝細胞によって産生される）は一般的な炎症応答のマーカーであり、一方、循環するＣＯＭＰは軟骨破壊および／または軟骨代謝回転の産物である。プリスタン注射３１日後、ＤＡラット、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットの血清中のＡＧＰおよびＣＯＭＰレベルを以下のようにして決定した。

ＡＧＰの血清レベルは、ラットα_１酸性糖タンパク質（Zivic-Miller Laboratories、ゼリエノプル、ペンシルベニア）およびラットα_１酸性糖タンパク質に特異的なポリクローナル抗ウサギ抗体（Agrisera、バナス、スウェーデン）を用いた競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ；Akerstrom (1985) J. Biol. Chem. 260: 4839-44を参照）で測定した。

ＣＯＭＰの血漿濃度は、Saxne & Heinegard (1992) Br. J. Rheumatol. 31: 583-91に記載されているように、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。ラットＣＯＭＰを用いてマイクロタイタープレートをコーティングし、標準曲線を作成した。血漿ＣＯＭＰの検出は、ラットＣＯＭＰに対して生成したポリクローナル抗血清を捕捉抗体として用いて行った。ポリクローナル抗血清はDick Heinegard教授から得た。

図４Ａおよび図４Ｂは、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットでのＣＯＭＰおよびＡＧＰの血漿レベルがＤＡ対照でのＣＯＭＰおよびＡＧＰの血漿レベルよりも有意に低い（ｐ＜０.００５）ことを示す棒グラフである。

実施例１１−ＤＡラット中のｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の関節炎重篤度促進突然変異体が低減した酸化的バーストと連関していることを示す酸化的バーストアッセイ
Ｐ４７ＰＨＯＸの機能を、腹膜好中球による反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を評価することにより調べた。ラットの腹腔内に５ｍＬの２.４％チオグリコール酸を注射して好中球の漸増を誘起させた。チオグリコール酸注射の１６時間後にラットを屠殺し、好中球を腹膜腔から以下のようにして単離した。腹膜腔をハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳ）で濯ぎ、得られた細胞をＨＢＳで２回洗浄し、ついで１０^７細胞／ｍＬの濃度で再浮遊させた。

ＲＯＳの産生により示されるＮＡＤＰＨ複合体の活性を、シトクロムＣ還元の分光測光検出により決定した（Lomaxら、(1989) Science 245: 409-12；Huangら、(2000) J. Leukoc. Biol. 67: 210-5；およびZuら、(1996) Blood 87: 5287-96を参照）。簡単に説明すると、５×１０^６細胞を１００μｇのシトクロムＣ（Sigma C3131）を入れた９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配して全容量を１００μＬとした。ＮＡＤＰＨ複合体の活性化およびスーパーオキサイドラジカルの分泌は、ＰＭＡ（Sigma P8139）を０.１μｇ／ｍＬの濃度で加えると開始された。反応は３７℃で起こり、５５０ｎｍでの吸光度を１分間隔で測定した。

図５Ａ〜５Ｄは、ＤＡラット、Ｅ３ラット、およびＰｉａ４コンジェニックラット（ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラット）によるＲＯＳの産生を示す吸光度曲線のセットである。酸素ラジカルの産生は、曲線下面積を決定することにより決定した。これら結果は、ＲＯＳの産生がＤＡ同腹ラットよりもＥ３ラットおよびＰｉａ４コンジェニックラットの方が高いことを示している。各遺伝子型の群で約３〜６匹のラットを調べた。

常染色体慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を患うヒト患者（Casimirら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 2753-7を参照）または機能性のｐ４７ｐｈｏｘが欠損しているマウス（Jacksonら、(1995) J. Exp. Med. 182: 751-8；およびHuangら、(2000) J. Leukoc. Biol. 67: 210-5を参照）とは異なり、ＤＡラットは機能性のＮＡＤＰＨ複合体またはＲＯＳ産生は完全には欠如していなかった。Ｅ３ラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットはＰＭＡ刺激の１０００秒後に最大シトクロムＣ還元（ＯＤ_５５０＝０.２）を示したが、ＤＡラットのＲＯＳ産生のレベルはゆっくりであり、３０００秒後でさえも最大シトクロムＣ還元に達しなかった。それゆえ、ＤＡラットにおけるｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子の関節炎重篤度促進変異体は低減した酸化的バーストと連関している。

実施例１２−ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２ラットにおけるＮＡＰＤＨ阻害
Ｐｉａ４ ＱＴＬの防御的効果が、ＮＡＤＰＨ複合体からのフリーラジカル産生の低減へと導くｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子における多型の存在によって説明されるか否かを決定するため、以下の実験を行った。

ＤＡラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２ラットに、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＮＡＤＰＨオキシダーゼなどのフラボ酵素の強力なインヒビターである塩化ジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ、Ｃ_１２Ｈ_８ＩＣｌ、ＭＷ＝３１４.６）を投与した。ＤＰＩは、ペルオキソクロム酸カリウム誘発関節炎を抑制するためにマウスでインビボで用いられている（Mieselら、(1996) Free Radic. Biol. Med. 20: 75-81を参照）。２.８μモル／ｋｇ（マウスの体重）（すなわち、８８０μｇ／ｋｇ）を毎日腹腔内投与すると関節炎が５０％抑制されることがわかった。

この実験では、１.２５μモルＤＰＩ／ｋｇ（マウスの体重）（すなわち、０.４ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重））の投与量にてＤＰＩを投与した。各ラットの平均体重が２２５ｇであると想定して、０.５ｍＬのＤＭＳＯ／ＰＢＳ中の約０.０８ｍｇのＤＰＩを各ラットに与えた。投与のため、５０ｍｇのＤＰＩを２５０ｍＬのＤＭＳＯ／ＰＢＳに溶解した。約０.５ｍＬをラットに０日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目、および２１日目に腹腔内注射した。

１５０μＬのプリスタンを尾の基部に皮内注射することにより、８〜１２週齢のすべてのラットに関節炎を誘発させた。関節炎の発症はすべての四肢でモニターした。図６および図７に示す結果は、ＤＰＩによるＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害が関節炎の重篤度の増大に導くことを明らかにしている。それゆえ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性はＰＩＡの発症において防御的な役割を有している。

実施例１３−ＤＡラットからのＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞の移送はＥ３ラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットで関節炎を誘発した
Ｐｉａ４ ＱＴＬが関節炎原性（arthritogenic）Ｔ細胞の初回抗原刺激を制御しているか否かまたは関節炎の発症後に生じる事象に関与しているか否かを決定するため、ＤＡ同腹対照、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラットおよびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットをＴ細胞マイトジェンＣｏｎＡで活性化した脾臓細胞のドナーまたはレシピエントとして用いる相互脾臓Ｔ細胞移送実験を行った。各群から３匹のラットをドナーとして用い、各群から３匹のラットをレシピエントとして用いた。

ドナーラットに５００μＬのプリスタンを注射した。注射１２日後にラットを屠殺し、その脾臓を取り出し、脾臓Ｔ細胞単離のためにホモジナイズした。レシピエントラットに移送する前に脾臓細胞をＣｏｎＡで活性化した。簡単に説明すると、脾臓Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Paisley Scotland）（ストレプトマイシン、Ｄ−ペニシリン、ＨＥＰＥＳ、β−メルカプトエタノール、５％ウシ胎仔血清、および３μｇ／ｍＬのＣｏｎＡを添加）中、３７℃で４８時間、４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で培養することにより活性化した。ついで、脾臓細胞を回収し、ＰＢＳに再浮遊し、ついでレシピエントラットに３５×１０^６細胞／動物の濃度で腹腔内注射した。

関節炎の発症はＴ細胞移送後５日目に検出され、最高の関節炎スコアリングは１５日目に得られた。図８は、ＤＡラットからのＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞の移送がＥ３ラット、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットで重篤な関節炎を引き起こすことを示す棒グラフである。さらに、ＤＡラットからのＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞のみでも関節炎原性であった。それゆえ、ｐ４７ｐｈｏｘ多型は関節炎原性Ｔ細胞の生成に関与しているが、関節では有意に作用していないと思われる、なぜならＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットはＤＡ Ｔ細胞移送に供したときに関節炎に対して感受性であったからである。Ｐ４７ＰＨＯＸはＴ細胞移送前に脾臓において機能していることから、Ｐ４７ＰＨＯＸはＲＯＳ産生におけるその役割によりリンパ器官でのＴ細胞／抗原提示細胞相互作用に影響を及ぼすと思われる。

実施例１４−ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーターとしてのアルカンの酸化的バーストアッセイにおける評価
飽和アルカン分子Ｃ８−Ｃ１９（ｎ−オクタン、ノナン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、およびノナデカン）を、以下に記載するようにしてＮＡＤＰＨ複合体を活性化する能力について試験した。不飽和脂肪酸Ｃ１４：１−Ｃ２４：１（ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、１１ｃ−エイコサエン酸、アラキドン酸、エルカ酸、およびニューロン酸（neuronic acid））およびスクアレン（Sigma）もまた試験した。油脂はシクロデキストリン（ＰＢＳ中に１００ｍＭ）中に希釈することにより可溶化した。

腹膜好中球およびマクロファージの単離：
屠殺する１６時間前に５ｍＬのチオグリコール酸（２.４％）をＥ３ラットに腹腔内注射して好中球の漸増を誘起した。４０ｍＬのＰＢＳ＋ｈｅｐｅｓ（１％）を腹膜中に注射し、細胞浮遊液を抽出した。赤血球を０.８４％ＮＨ_４Ｃｌで溶解し、ＷＢＣをＰＢＳで洗浄し、約１０^７細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再浮遊した。

腹膜好中球およびマクロファージの培養：
ヒトミエローマ細胞株ＨＬ６０をダルベッコ完全培地中、Ｈｅｐｅｓ、１０％ウシ胎仔血清、およびペニシリン−ストレプトマイシンとともに培養した。ＨＬ６０細胞は１.２５％ＤＭＳＯの添加６日後に好中球−マクロファージに分化した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、ついでＰＢＳで２回洗浄した。ついで細胞を約１０^７細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再浮遊した。

ＷＳＴ−１アッセイによる酸素バースト分析：
１０μＬの試験すべき各油脂を９μＬのＷＳＴ１とともに９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに加えた。１０^６細胞／ｍＬ（１００μＬの１０^７細胞／ｍＬ）を各ウエルに加え、色変化を分光測光計にて４５０ｎｍ、３７℃で６０分間測定した（１回の測定／分）。

シトクロムＣアッセイ：
１０μＬの試験すべき各油脂を９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに加えた。５０μＬのシトクロムＣ（４ｍｇ／ｍＬ）および５×１０^６細胞／ウエル（５０μＬの１０^７細胞／ｍＬ）を各ウエルに加え、吸光度を分光測光計にて５５０ｎｍ、３７℃で６０分間測定した（１回の測定／分）。

ＦＡＣＳベースのバーストアッセイ：
細胞（２〜５×１０^６ウエル）を１μＭジヒドロローダミン（ＤＨＲ）１２３とともに９６ウエルプレートに全量２００μＬ、３７℃で１０分間プレインキュベートする。各１０μＬの試験すべき化合物（たとえば、油脂）をウエルに加え、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。反応性オキシダントの産生をジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）からの蛍光染料ローダミン１２３（ＲＨ）の生成としてフローサイトメトリーを用いてアッセイする。

結果
飽和アルカン分子を酸化的バーストアッセイで試験してＮＡＤＰＨ複合体のアクチベーターを決定した。アッセイは好中球のチオグリコール酸漸増後のＥ３ラットからの腹膜細胞（図９Ａ）およびＨＬ６０細胞（図９Ｂ）の両者で試験した。ＷＳＴ−１試験は、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の細胞外濃度の変化を示している。両細胞型ともに同様の一般的傾向を示す。たとえば、すべてのアッセイにおいてウンデカンは強力なアクチベーターであった。

油脂の関節炎誘発作用を、油脂をＤＡラットに皮内注射することにより調べた。スコアリングは、約１４炭素原子よりも長い油脂は関節炎を誘発するが、より短い炭素鎖は関節炎を誘発しないことを示している（図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃ）。ｐ＜０.０５はＣ１５より短いアルカンをＣ１９と比べたものである。統計はすべてスチューデントのｔ検定で評価した。すべての群でＮ＝４である。

実施例１５−ＮＡＤＰＨ活性化油脂を用いた関節炎の予防および改善治療
１．ウンデカンを用いたプリスタン誘発関節炎のインビボでの治療および／または予防
ＤＡラット群に以下に示す油脂２００ｍＬを尾の基部にて皮内注射した：
ウンデカン −１０日目、プリスタン ０日目；
オリーブ油 −１０日目、プリスタン ０日目；
ウンデカン −５日目、プリスタン ０日目；
ウンデカノール −５日目、プリスタン ０日目；
オリーブ油 −５日目、プリスタン ０日目；
ウンデカン ５日目、プリスタン ０日目；および
オリーブ油 ５日目、プリスタン ０日目。

ラットを拡張スコアリングシステムに従って１１日目から開始して隔日にスコアリングし、その際、赤くなったまたは膨潤した各足または中足は１ポイントと計上し、および赤くなったまたは膨潤した足首を５ポイントと計上して、合計１５ポイント／四肢および６０ポイント／ラットとした。オリーブ油およびウンデカノールは対照として用いた。

２．ヘキサデセンを用いたヘキサデカン誘発関節炎のインビボ治療
ＤＡラット群に以下に示すものを尾の基部にて皮内注射した：
ヘキサデカン２００μＬ ０日目；
ヘキサデセン２００μＬ ０日目；
ヘキサデセン２００μＬ −５日目、ヘキサデカン２００μＬ ０日目；
オリーブ油２００μＬ −５日目、ヘキサデカン２００μＬ ０日目；
ヘキサデセン２００μＬ ＋５日目、ヘキサデカン２００μＬ ０日目；および
オリーブ油２００μＬ ＋５日目、ヘキサデカン２００μＬ ０日目。

ラットを上記のようにしてスコアリングした。オリーブ油は対照として用いた。

結果
ウンデカンをＰＩＡの発症または重篤度に対するその潜在的な防御的作用について調べた。ラットをウンデカンで−１０日目、−５日目、または＋５日目に処理し、ウンデカノールで−５日目に処理した（対照として）。すべてのラットにプリスタンを０日目に注射した（図１１Ａ）。ウンデカンで−５日目に処理したラットとオリーブ油で−５日目に処理したラットとの間で相加スコア（図１１Ｂ）および最大スコア（図１１Ｃ）の両者で有意の差異があった。また、ウンデカンで−５日目に処理したラットとウンデカノールで−５日目に処理したラットとの間でも相加スコア（図１１Ｂ）および最大スコア（図１１Ｃ）の両者で有意の差異があった。ウンデカンで＋５日目に処理したラットは、プリスタン注射する前に−１０日目または−５日目にウンデカンで処理したラットよりもわずかに高いスコアを有していたことに注意すべきである。

統計はすべてスチューデントのｔ検定で評価した。ｐ＜０.０５は−５日目のウンデカンと−５日目のオリーブ油との相加スコアおよび最大スコアの両者の相違についてのものである。ｐ＝０.０５は−５日目のウンデカンと−５日目のウンデカノールとの相加スコアの差異についてのものであり、ｐ＜０.０５は−５日目のウンデカンと−５日目のウンデカノールとの最大スコアの相違についてのものである。第４群でＮ＝１２であった他はすべての群でＮ＝６である。

ヘキサデカンによる関節炎誘発に対するヘキサデセンの防御的作用を評価するため、同様の実験を行った。ラットを−５日目、＋５日目のいずれかでヘキサデセンで処理するか、または処理しなかった。第３群の他はすべてのラットにヘキサデカンを０日目に注射した。オリーブ油は対照として用いた。関節炎スコアは、これら２つの物質の関節炎誘発能の有意の差異を示している（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ）。ヘキサデカンは関節炎を誘発するが、ヘキサデセンは誘発しない。ヘキサデセンで−５日目に処理したラットおよび＋５日目に処理したラットと対照のラットとのスコアの差異もまた有意である。ヘキサデセンで処理したラットはいずれも関節炎を発症しなかった。

第３群および第４群はヘキサデカンまたはヘキサデセンのいずれかのみを注射した。統計はすべてスチューデントのｔ検定で評価した。ｐ＜０.０５は非処理（第４群）に対する−５日目の処理および＋５日目の処理の相加スコアおよび最大スコアの両者の相違についてのものである。ｐ＜０.０５はヘキサデカンとヘキサデセンとの相加スコアおよび最大スコアの相違についてのものである。ヘキサデセンを＋５日目に注射した群とオリーブ油を＋５日目に注射した群との間にも有意の差異があった（相加スコアではｐ＜０.０１であり、最大スコアではｐ＜０.０５）。第３群および第４群でＮ＝４であった他はすべての群でＮ＝６である。

検討
関節炎誘発能を決定すべく油脂をＤＡラットの尾の基部に注射したときに、約１４炭素原子よりも長いアルカンは関節炎を誘発したが、短いアルカンは誘発しなかった。酸素バースト試験および関節炎誘発試験での油脂の活性の比較が、関節炎の誘発および／または治療への油脂の関与についての３つの可能なメカニズムを呈示していることを考察することは興味深い。たとえば、酸素バースト試験ではウンデカンはＮＡＤＰＨ複合体を活性化したが尾−注射関節炎試験では関節炎を誘発しなかったのに対し、ヘキサデカンは該複合体を活性化したのみならず関節炎をも誘発した。これら２つの実験の比較は、ヘキサデカン、ヘプタデカン、およびオクタデカンがＷＳＴ−１アッセイによればＮＡＤＰＨ複合体を活性化し、関節炎をも誘発することを示している。一方、ペンタデカン（Ｃ１５）はＮＡＤＰＨ複合体を活性化しなかったが関節炎は誘発しており、疾患の誘発への関与の第三のメカニズムが示唆される。

同様の関係はヘキサデカンとヘキサデセン、およびプリスタンとフィトールとの間でも認められ、ここでヘキサデカンおよびプリスタンは関節炎を誘発するのに対し、ヘキサデセンおよびフィトールは誘発しない（Lorenzen (1999) Scand. J. Immunol. 49: 45-50）。これら４つの物質はすべてＮＡＤＰＨ複合体を活性化する。ヘキサデカンとヘキサデセンとの差異はヘキサデセンに存在する単一の炭素−炭素二重結合であり、一方、プリスタンとフィトールとは酸性基により相違している。いかなる理論にも拘束されるものではないが、極性の増大がヘキサデセンおよびフィトールの代謝を容易にし、それゆえ関節炎の誘発を防ぐと考えることができる。極性の低い分子は極性の高い分子ほど容易には代謝することはできず、より長期にわたって組織に残留し、免疫応答を誘起する。

本発明者らはヘキサデセンおよびウンデカンの両者の防御能を調べた。ヘキサデセンで処理したラットは、ヘキサデセンを−５日目または＋５日目のいずれで注射しても関節炎の徴候を示さなかった。さらに、これら実験は、ヘキサデカンが関節炎を誘発するのに対し、ヘキサデセンは誘発しないことを確認している。ウンデカンによる前処理は、プリスタンによる関節炎の誘発の長期前に処理すればより高い防御が得られる。たとえば、＋５日目のウンデカン処理は−１０日目または−５日目のウンデカン処理ほど有意の防御作用を示さなかった。

実施例１６−アルカン油脂のインビボ分布
［１−１４Ｃ］−ヘキサデカンおよび［１−１４Ｃ］−オレイン酸をAmershamから購入した。これら油脂を１８匹のＤＡラットの尾の基部に皮内注射した（２００μＬ）。１０日目に各群からの３匹のラットの臓器（リンパ節、脾臓、肝臓および腎臓）を回収した。これら臓器の重さを量り、全量２ｍＬのＰＢＳ中にホモジナイズし、凍結した。同じ手順を２０日目および３０日目に行った。ついで、ホモジナイズした試料１ｍＬを１０ｍＬのReady Safe（Beckman）に加え、ベータカウンターでカウントした。放射性標識したヘキサデカンのリンパ節への分布もまた、初期の時点（３日目、６日目、１０日目、および１３日目）で検視できた。

結果：
放射性標識したヘキサデカンをＤＡラットの尾の基部に皮内注射することにより、ヘキサデカンのインビボでの分布を調べた。放射性標識したオレイン酸も同様にして投与した。ラットのスコアリングは、ヘキサデカンを注射したラットのみが関節炎を有することを示した（図１３）。この関節炎は急性であり、後肢および前肢の両者で対称的に認められた。回収した種々の臓器（ＬＮ、脾臓、腎臓および肝臓）のβ−カウンターでの分析は、測定したいずれの時点でも油脂が専らリンパ節に蓄積することを示した（図１４）。ヘキサデカンはオレイン酸よりも高い程度でリンパ節に分布したように思われる。リンパ節への油脂の分布は時間の経過とともに低減するように思われ、分析した他の臓器での増大もなかった。

より早い時点でのヘキサデカンのリンパ節への分布もまた記載したようにして測定した。１０日目までのヘキサデカンのリンパ節への蓄積の増大が観察された。

放射性標識したヘキサデカンの分布は以前にも調べられており、１４Ｃ−標識ヘキサデカンが主としてリンパ節に分布することが示されている（Kleinauら、(1995) Int. J. Immunopharmac., 17(5): 393-401）。

これら実験は、ヘキサデカン油脂がリンパ節内で前関節炎原性（pro-arthritogenic）作用を奏することを示している。放射性標識したヘキサデカンおよび放射性標識したオレイン酸の両者の注射は、オレイン酸がヘキサデカンほどには高い程度でリンパ節に分布しないために関節炎を誘発しないことを示唆している。さらに、ヘキサデカンはリンパ節にゆっくりと蓄積して１０日目に最大となり、該疾患の通常の発症と相関関係を有している。１０日目以後はヘキサデカン油脂の濃度はゆっくりと低下した（図１５）。

実施例１７−実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のインビボでの治療
ＤＡラット群に２００μＬのフィトールを尾の基部にて−１０日目、−５日目、および＋５日目に注射した。オリーブ油は対照として用いた。０日目にすべてのラットを２００μＬのＳＣＨ（ＤＡの脊髄ホモジネート、ＥＡＥを誘発する）で尾の基部にて皮内処理した（免疫した）。ついで、ラットを以下の評定に従って４０日間スコアリングした：
０＝正常
１＝尾の衰弱
２＝尾の麻痺
３＝尾の麻痺および軽いよたよた歩き
４＝尾の麻痺および重度のよたよた歩き
５＝尾の麻痺および一方の足の麻痺
６＝尾の麻痺および一対の足の麻痺
７＝四本の足の麻痺
８＝発病前または死

ＥＡＥは９日目頃に発症が開始した。結果は、フィトールで処理したラットと対照のラットとで−１０日目および＋５日目での相加スコア（図１６Ａ）および最大スコア（図１６Ｂ）の両者での有意の差異を示している（ｐ＜０.０５）。

統計はすべてスチューデントのＴ検定で評価した。ｐ＜０.０５はフィトール処理とオリーブ油処理との間での−１０日目および＋５日目での最大スコアの相違についてのものである。すべての群でＮ＝６であることに注意。

ＥＡＥおよびＰＩＡの両者において、ＥＡＥを誘発するＳＣＨおよびＰＩＡを誘発するプリスタンは尾の基部にて皮内注射した。疾患の発症は一般に数週間以内に生じた。ＮＡＤＰＨの潜在的なアクチベーターは、自己反応性（auto reactive）のＴ細胞の増殖を変えることができ、疾患の発病率、発症速度（rate of onset）、および重篤度を低減することができる。

実施例１８−ＰＩＡの治療に及ぼすフィトールの投与経路の効果
ＤＡラット群を以下の処理レジメン（regimens）に従ってフィトールで−５日目および＋５日目に処理した。０日目にすべてのラットにプリスタン（２００μＬ）を尾の基部にて注射した。フィトールをラット群に以下のとおり投与した：
２５μＬのフィトールを鼻内（ｉ.ｎ.）；
２００μＬのフィトールを腹腔内（ｉ.ｐ.）；
２００μＬのフィトールを尾の基部にて皮内（ｉ.ｄ.）；および
１ｍＬのフィトールを経口（ｐ.ｏ.）。

ラットを拡張スコアリングシステム（以前に検討したように）を用いて９日目からスコアリングした。

実験は、皮内（ｉ.ｄ.）投与の改善および予防効果を示した。腹腔内（ｉ.ｐ.）投与経路および鼻内（ｉ.ｎ.）投与経路もまた改善および予防効果を示した（図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃ参照）。鼻内投与群は重篤な関節炎を示した１匹のラットによる歪みがあったが、同群の他の３匹のラットは防御されたことに注意。

実施例１９−Ｎｃｆ１欠損マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎
動物
エクソン８のスプライス部位での点変異のためにＮｃｆ１が欠損したマウス（Ｂ６.Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）、以前はＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ^ｄｂとして知られていた）（Huangら、(2000) J. Leukoc. Biol. 67: 210-215）をJackson Laboratory（メーン、米国）から購入した。マウスをＢ１０.Ｑ（もともとJan Klein教授、チュービンゲン、ドイツから）と２世代にわたって戻し交配してＭＨＣにＱハプロタイプを生成させ、レプチンレセプター（ｌｅｐｒ）欠損を消失させた。同腹対照動物を得るため、Ｂ１０.ＱＮｃｆ１＋／−をコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）実験のために交雑した。関節炎実験はすべて、地元の（Malmo/Lund、スウェーデン）倫理委員会ライセンスＭ７−０１により認可されていた。

関節炎の誘発および評価
０日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Difco、デトロイト、ミシガン）中に乳濁した１５０μｇのラットＣII（コラーゲンII）をマウスの尾の基部に皮内注射することにより、９〜１５週齢のすべてのマウスで関節炎を誘発した。３５日目にフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中の５０μｇのラットＣIIをマウスの同じ部位にブースター注射した。関節炎の発症を肉眼視スコアリングシステムを用いてすべての四肢でモニターした。簡単に説明すると、１ポイントは膨潤または赤くなった各足に、１ポイントは膨潤した各中足、足指、または膝関節突起に、および５ポイントは膨潤した足首に与え、四肢当たりの最大スコアは１５で合計６０スコアであった。マウスを免疫後２ヶ月の間、１週間に１〜４回調べた。４０日目に尾の採血により血清を得、アッセイのときまで−２０℃で保持した。

ＣＯＭＰの血清レベルの決定
軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の血清濃度を酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。ラットＣＯＭＰを用いてマイクロタイタープレートをコーティングし、各プレートについて標準曲線を作成した。血漿ＣＯＭＰの検出は、ラットＣＯＭＰ（Dick Heinegard教授により気前よく提供された）に対して生成したポリクローナル抗血清を捕捉抗体として用いて行った。

抗体応答
血漿中のラット軟骨に対する抗体をＥＬＩＳＡにより５０μＬ／ウエルのＰＢＳ（１０μｇ／ｍＬのラットコラーゲンIIを含む）とともに４℃で一夜コーティングした９６ウエルプレート（Costar、ケンブリッジ、マサチューセッツ）で分析した。洗浄はすべて、０.１％Tween20を含むトリス緩衝食塩水（ＮａＣｌ １.３Ｍ、トリス０.１Ｍ、ｐＨ７.４）（トリス／Tween）を用いて行った。血漿をＰＢＳ／０.１％Tweenで希釈し、２つずつ分析した。結合したＩｇＧ抗体の量は、ペルオキシダーゼに結合したロバ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、ウエストグローブ、ペンシルベニア）および基質としてのＡＢＴＳとともにインキュベート後、ついでSpectraMax（Molecular Devices）で検出することにより評価した。血漿中の抗体の相対量は、抗コラーゲンII標準の正の対照と比較することにより決定した。

結果
関節炎に対する機能的Ｎｃｆ１および／またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の欠陥または欠損の役割を決定するため、Ｎｃｆ１欠陥Ｂ１０.ＱマウスでのＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）を調べた。野生型のＢ１０.Ｑマウスは、通常、軽度／中程度〜重篤な関節炎を発症し、発症はブースター免疫後に生じる（Svenssonら、(1998) Clin. Exp. Immunol. 111: 521-526）。結果は、Ｂ１０.Ｑマウスに比べてＮｃｆ１欠陥マウスでより早い発症（図１９）および関節炎の重篤度の増大（Ｐ＜０.００１）（図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ）の両者を示している。欠陥Ｎｃｆ１についてへテロ接合性のマウスはホモ接合性の欠陥マウスに比べてより遅く発症するより軽い関節炎を示した（Ｐ＜０.００５）。

ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）の血清レベルの定量は、末梢関節の軟骨侵食の測定とみなされる。血清ＣＯＭＰは、Ｎｃｆ１＋／−および野生型対照に比べてＮｃｆ１−／−マウスで非常に上昇した（Ｐ＜０.０００１）（図２０）。さらに、Ｎｃｆ１欠陥マウスでは最初の免疫後４０日目にコラーゲンIIに対する強い抗体応答があった（図２１）。

実施例２０−ヘキサデセンを−５日目に注射した後の１４Ｃ−ヘキサデカンのリンパ節での分布
油脂がリンパ節中の利用できる空間について競合するのかどうか、およびそのような競合がヘキサデセンおよびウンデカンによる前処理の予防効果の理由であるのかどうかを決定するために実験を行った。−５日目に以下のいずれかの量のヘキサデセンをＤＡラットに注射した：０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、または２００μＬ。０日目にすべてのラットに１４Ｃ−ヘキサデカンを尾の基部にて皮内注射した。１０日目にラットを屠殺し、リンパ節を回収してＰＢＳ中に入れ、ホモジナイズし、凍結した。１ｍＬのホモジネートをReady Safe（Beckman）に移し、β−カウンター（Beckman）で分析した。

水切りしたリンパ節中の関節炎誘発性ヘキサデカンの量は、より多くの量の防御ヘキサデセンによって影響されなかった。これらの結果は、油脂の防御作用にとって重要な水切りしたリンパ節中の空間について競合が存在しないことを示している。

実施例２１−フィトールで処理したラットにおけるＣＩＡ
ＤＡラットを以下のいずれかに従って処理した：
−１０日目に２００μＬのフィトールを尾の基部にて皮内投与
−５日目に２００μＬのフィトールを尾の基部にて皮内投与
−５日目および＋５日目に２００μＬのフィトールを腹腔内投与
非処理の対照

０日目に７５μＬの０.１Ｍ酢酸に溶解し７５μＬのＩＦＡに乳濁させた１５０μＬのコラーゲンIIを注射することにより、ＣＩＡをすべての動物で誘発させた。１０日目からラットを拡張スコアリングシステム（上記を参照）を用いてスコアリングした。

フィトールの腹腔内処理および皮内処理は、いずれもＣＩＡラットモデルでの関節炎の発症を防いだ（図２２）。

実施例２２−フィトールまたはウンデカンによる活性なＰＩＡの治療
ＤＡラット群にプリスタンを０日目に注射した。プリスタン（１５０μＬ）は尾の基部にて皮内注射した。９日目からラットを拡張スコアリングシステム（上記を参照）を用いてスコアリングした。ついでラットを２１日目および２６日目に以下のいずれかで処理した：
２００μＬのフィトールを腹腔内投与
２００μＬのフィトールを尾の基部にて皮内投与
２００μＬのウンデカンを腹腔内投与
２００μＬのウンデカンを尾の基部にて皮内投与
非処理の対照

すべてのフィトール処理およびウンデカン処理がＰＩＡラットモデルでの活性な関節炎に対して有効であった（図２３Ａ、図２３Ｂ）。

他の態様
本発明を発明の詳細な説明に関連して記載したが、上記の記載は本発明を説明することを意図するものであって本発明を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められる。他の側面、利点、および改変は以下の特許請求の範囲の範囲内である。

ＤＡラット、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラットのプリスタン注射後の１０日目、１４日目、１９日目、２４日目、および２８日目に決定した平均臨床関節炎スコアを比較したグラフである。

ＰＡＣクローンおよびＥＳＴクローンを用いて構築したＰｉａ４領域の物理的地図である。

Ｅ３ラットおよびＤＡラットのＲＮＡから増幅したＥ３およびＤＡ ｐ４７ｐｈｏｘ ｃＤＮＡ配列のアラインメントである。

軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ；図４Ａ）およびα１酸性糖タンパク質（ＡＧＰ；図４Ｂ）の血漿レベルが、ＤＡ同腹対照ラットよりもＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２コンジェニックラットの方が有意に低い（ｐ＜０.００５）ことを示す棒グラフのセットである。

ＤＡラット（図５Ａ）、Ｅ３ラット（図５Ｂ）、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット（図５Ｃ）、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラット（図５Ｄ）における反応性酸素分子種の産生を示す吸収曲線のセットである。

ＮＡＤＰＨインヒビターである塩化ジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）で処理したラットにおいて重篤度の増大した関節炎を示すグラフである。

ＤＰＩで処理したラットが対照ラットよりも高い累積関節炎スコアを有することを示す棒グラフである。

ＤＡラットからのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）活性化Ｔ細胞の移送が、ＤＡ同腹対照ラット（ＤＡ）、ＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２＋／−ラット（ＨＥＴ）、およびＤＡ.Ｅ３ｃｈｒ１２−／−ラット（Ｅ３）において重篤な関節炎を引き起こすことを示す棒グラフである。

アルカンでインビトロ処理した後のラットＥ３腹膜細胞（図９Ａ）およびＨＬ６０細胞（図９Ｂ）からの酸化的バーストの活性化を示すグラフのセットである。酸化的バーストはＷＳＴ−１アッセイで測定する。

投与１２〜３１日後のアルカンの関節炎誘発作用を示すグラフのセットである。平均スコアを示す。

投与１２〜３１日後のアルカンの関節炎誘発作用を示すグラフのセットである。相加スコアを示す。

投与１２〜３１日後のアルカンの関節炎誘発作用を示すグラフのセットである。尾の基部でのアルカンの皮内注射後の本明細書に記載の拡張スコアリングシステムによる最大スコアを示す。

種々の時点でウンデカンまたはウンデカノールで処理したＤＡラットにおけるＰＩＡの重篤度を示すグラフのセットである。平均スコアを示す。

種々の時点でウンデカンまたはウンデカノールで処理したＤＡラットにおけるＰＩＡの重篤度を示すグラフのセットである。相加スコアを示す。

種々の時点でウンデカンまたはウンデカノールで処理したＤＡラットにおけるＰＩＡの重篤度を示すグラフのセットである。最大スコアを示す。

ヘキサデセンで−５日目または＋５日目に処理した後にヘキサデカン誘発関節炎の重篤度を示すグラフのセットである。平均スコアを示す。

ヘキサデセンで−５日目または＋５日目に処理した後にヘキサデカン誘発関節炎の重篤度を示すグラフのセットである。相加スコアを示す。

ヘキサデセンで−５日目または＋５日目に処理した後にヘキサデカン誘発関節炎の重篤度を示すグラフのセットである。最大スコアを示す。

放射性標識油脂で処理したラットにおける関節炎の重篤度を示す棒グラフである。

注射後１０日、２０日、および３０日での１４Ｃ標識油脂の組織分布を示す棒グラフである。活性の測定はβ−カウンターで１分間行った。ＬＮ＝リンパ節。

β−カウンター（Beckman）で１分間測定した［１−１４Ｃ］−ヘキサデカンのリンパ節への分布を示す棒グラフである。

フィトールで−１０日目、−５日目または＋５日目に処理したＤＡラットにおけるＥＡＥの発症に対するフィトールの効果を示す棒グラフのセットである。相加スコアを示す。オリーブ油は対照として用いた。

フィトールで−１０日目、−５日目または＋５日目に処理したＤＡラットにおけるＥＡＥの発症に対するフィトールの効果を示す棒グラフのセットである。最大スコアを示す。オリーブ油は対照として用いた。

種々の経路でフィトールを投与した場合のＰＩＡの発症に対するフィトール処理の効果を示すグラフのセットである。平均スコアを示す。

種々の経路でフィトールを投与した場合のＰＩＡの発症に対するフィトール処理の効果を示すグラフのセットである。相加スコアを示す。

種々の経路でフィトールを投与した場合のＰＩＡの発症に対するフィトール処理の効果を示すグラフのセットである。最大スコアを示す。

Ｂ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１（ｐ４７ｐｈｏｘ）欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）におけるＣＩＡの発症を示すグラフのセットである。平均スコアを示す。

Ｂ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１（ｐ４７ｐｈｏｘ）欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）におけるＣＩＡの発症を示すグラフのセットである。最大スコアを示す。

Ｂ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１（ｐ４７ｐｈｏｘ）欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）におけるＣＩＡの発症を示すグラフのセットである。相加スコアを示す。

Ｂ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）におけるＣＩＡの発症の平均日を示す棒グラフである。

ラットＣIIの注射によるＣＩＡの誘発後にＢ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）における血清ＣＯＭＰレベルを示す棒グラフである。

ラットＣIIの注射によるＣＩＡの誘発後にＢ１０.Ｑマウスと比較したＮｃｆ１欠損マウス（ホモ接合性およびへテロ接合性の両者）における抗コラーゲン抗体のレベルを示す棒グラフである。

種々の投与経路を用いたフィトール処理の効果を示すグラフである。

種々の活性剤および投与経路を用いた活性ＰＩＡの処理の効果を示すグラフのセットである。２００μＬのフィトール（図２３Ａ）かまたはウンデカン（図２３Ｂ）を２１日目および２６日目に投与した。

Claims (1)

1. ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態を治療する医薬の製造における、哺乳動物においてＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を促進する薬剤の使用であって、該ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う自己免疫状態が、ＡＡＮＯＤまたはＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損を伴う多発性硬化症から選ばれ、該薬剤が、フィトール、ウンデカンまたはヘキサデセンから選ばれる、使用。

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