JP4576168B2 - Method for examining vesicoureteral reflux or interstitial cystitis - Google Patents

Description

本発明は、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査方法、ならびにそのための検査薬および検査キットに関する。   The present invention relates to a test method for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis, and a test drug and test kit therefor.

膀胱尿管逆流症（ＶＵＲ）は非常に人種差が大きい先天性疾患で、最も発生頻度が高い欧米の白人では全胎児の１０％以上に認められると報告されている。ＶＵＲの程度、先天性腎低形成の合併、反復した***による腎瘢痕化の有無など様々な因子により予後は異なるが、早期に十分な治療が行われなかった場合は成人になって腎機能障害、さらには腎不全へと進展することが多い。実際に、進行した腎不全患者の約２０％にＶＵＲが認められると報告されている。ＶＵＲの診断には尿道からのカテーテル挿入を行う排尿時膀胱造影を必須とし、このような重要な疾患でありながら、スクリーニングに利用できる簡便な検査方法は確立されていない。そのためＶＵＲの疑いがある患者のほとんど全てが侵襲的なレントゲン検査を受けざるを得ないのが現状である。   Cystoureteral reflux disease (VUR) is a congenital disease with a very large racial difference, and it is reported that it is observed in more than 10% of all fetuses in the most common European and American whites. The prognosis varies depending on various factors such as the degree of VUR, congenital hypoplasia of the kidney, and the presence or absence of renal scarring due to repeated urinary tract infections. It often progresses to dysfunction and even renal failure. In fact, it has been reported that approximately 20% of patients with advanced renal failure have VUR. Urinary cystography with catheter insertion from the urethra is essential for the diagnosis of VUR, and a simple test method that can be used for screening has not been established despite such an important disease. For this reason, almost all patients suspected of having VUR have to undergo invasive X-ray examinations.

ＶＵＲを早期診断することができれば、適切な治療管理を実施することにより、最終的には腎不全になって血液透析を年余に渡って受ける患者を多数救えることになり、また地球規模でも医療資源を節約できる。従って、全出産例においてＶＵＲの有無を容易に検査できるような簡便かつ侵襲のない検査方法の確立が望まれている。   If VUR can be diagnosed at an early stage, appropriate treatment management will eventually help save many patients who suffer from renal failure and receive hemodialysis over the years. You can save resources. Therefore, it is desired to establish a simple and noninvasive test method that can easily test for the presence or absence of VUR in all births.

間質性膀胱炎（ＩＣ）は、米国では約７０万人の罹患者数（９０％以上が女性）が見込まれる比較的一般的な疾患である。主に強い尿意切迫感と頻尿、膀胱充満時の疼痛を主訴とし、程度に差はあるものの患者の「生活の質」を著しく損ねる疾患である。それにもかかわらず、有効な治療方法は確立されていないのが現状である。そもそもＩＣの診断は容易ではなく、詳細な問診と排尿動態検査のほかに、膀胱鏡検査での粘膜からの点状出血の確認や、麻酔下での膀胱粘膜生検など、侵襲的な検査を診断の補助としているのは憂慮すべき事態である。現時点では、ＩＣの原因として、機械的刺激、アレルギー、免疫応答、神経血管性、***など、多くの要因が関与していると考えられているが、いずれの説にも決定的根拠はなく、ＩＣの簡便かつ侵襲のない検査方法が望まれている。   Interstitial cystitis (IC) is a relatively common disease in which approximately 700,000 affected people (90% or more women) are expected in the United States. It is a disease that mainly impairs urinary urgency, frequent urination, and pain when the bladder is full. Nevertheless, no effective treatment method has been established. In the first place, the diagnosis of IC is not easy. In addition to detailed inquiry and urination dynamics examination, invasive examinations such as cystoscopy confirming punctate bleeding from the mucous membrane and urinary bladder mucosa biopsy under anesthesia Assisting the diagnosis is a worrisome situation. At present, it is thought that many factors such as mechanical stimulation, allergy, immune response, neurovascularity, urinary tract infection, etc. are involved as the cause of IC. There is also a need for a simple and non-invasive testing method for ICs.

一方、ウロプラキン（ＵＰ）は尿路上皮（尿道、膀胱、尿管、腎盂の粘膜）細胞に特異的に発現する膜タンパク質で、分子量２７ｋＤａのＩａ（ＵＰＩａ）、２８ｋＤａのＩｂ（ＵＰＩｂ）、１５ｋＤａのＩＩ（ＵＰＩＩ）、そして４７ｋＤａのＩＩＩ（ＵＰＩＩＩ）と４種類の構成タンパク質が分離同定されており、これら４種類のファミリーが尿路上皮最上層でプラークを形成している。これらウロプラキンファミリーは尿路上皮表面の安定化や透過物質からのバリアーとして機能していることなどが考えられているが、詳しい生理機能は解明されていない。非特許文献１には、ヒトＵＰＩＩＩ遺伝子のクローニングについて報告されており、非特許文献２には、ＵＰＩａに対する特異的ポリクローナル抗体について報告されおり、尿路移行上皮癌（膀胱癌、尿管癌、腎盂癌）の組織診断マーカーとしての有用性が示唆されている。   On the other hand, uroplakin (UP) is a membrane protein specifically expressed in urothelial (urethra, bladder, ureter, and renal pelvic mucosa) cells and has a molecular weight of 27 kDa Ia (UPIa), 28 kDa Ib (UPIb), and 15 kDa. II (UPII), and 47 kDa III (UPIII) and four types of constituent proteins have been separated and identified, and these four families form plaques in the uppermost layer of the urothelium. These uroplakin families are thought to function as a barrier to urothelial surface stabilization and permeation substances, but detailed physiological functions have not been elucidated. Non-Patent Document 1 reports on cloning of human UPIII gene, Non-Patent Document 2 reports on a specific polyclonal antibody against UPIA, and urothelial carcinoma (bladder cancer, ureter cancer, renal pelvis) The usefulness as a tissue diagnosis marker of (cancer) is suggested.

最近、生まれつき標的タンパク質が機能発現しないように遺伝子操作したウロプラキンＩＩＩ（ＵＰＩＩＩ）遺伝子ノックアウトマウスで両側ＶＵＲが単独発生するとの注目すべき発表があったが（非特許文献３）、家族性ＶＵＲ患者を対象としたＵＰＩＩＩ遺伝子解析では「遺伝子変異は検出されなかった」とも報告されている（非特許文献４）。従って、ＶＵＲおよびＩＣの原因については未だ不明であり、その利用可能な検査方法も知られていない。   Recently, there has been a noticeable announcement that bilateral VUR occurs alone in a Uroplakin III (UPIII) gene knockout mouse that has been genetically engineered so that the target protein is not functionally expressed (Non-patent Document 3). It was also reported that “gene mutation was not detected” in the targeted UPIII gene analysis (Non-patent Document 4). Therefore, the cause of VUR and IC is still unknown, and the available inspection methods are not known.

Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９：８７９，１９９８Japan Journal of Cancer Research, 89: 879, 1998. Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９３：５２３，２００２Japane Journal of Cancer Research, 93: 523, 2002 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５１：９６１，２０００Journal of Cell Biology, 151: 961,2000 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，１７１：９３１−２，２００４Journal of Urology, 171: 931-2, 2004.

本発明の課題は、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎に対する新規なマーカーを見出し、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎を簡便かつ侵襲なく検出できる方法を提供することである。   An object of the present invention is to find a novel marker for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis, and to provide a method capable of detecting vesicoureteral reflux or interstitial cystitis simply and without invasiveness.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、尿路上皮細胞に特異的に発現する膜タンパク質であるウロプラキンが、膀胱尿管逆流症患者および間質性膀胱炎患者の上皮組織において発現亢進することを見いだし、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that uroplakin, which is a membrane protein specifically expressed in urothelial cells, is an epithelial tissue of patients with vesicoureteral reflux and interstitial cystitis. The inventors have found that expression is enhanced in, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）被検体由来の試料中のウロプラキンの発現を検出することを含む、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査方法。
（２）ウロプラキンがウロプラキンＩＩＩである（１）記載の方法。
（３）被検体由来の試料中のウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを検出することによりウロプラキンの発現を検出する（１）または（２）記載の方法。
（４）ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマーまたはウロプラキンをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてウロプラキンの発現を検出する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）被検体由来の試料が尿である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ウロプラキンまたはその断片と特異的に結合する抗体を含む、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査薬。
（７）ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー、またはウロプラキンをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを含む、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査薬。
（８）（６）または（７）記載の検査薬を含む、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査キット。
（９）以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号９で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列の全部または一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、各塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが膀胱尿管逆流症患者または間質性膀胱炎患者において発現亢進するＤＮＡ。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for examining vesicoureteral reflux or interstitial cystitis, comprising detecting the expression of uroplakin in a sample derived from a subject.
(2) The method according to (1), wherein the uroplakin is uroplakin III.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the expression of uroplakin is detected by detecting a polynucleotide encoding uroplakin in a sample derived from a subject.
(4) A continuous oligonucleotide primer having a length of at least 15 bases for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin or a continuous poly at least 15 bases that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding uroplakin The method according to any one of (1) to (3), wherein the expression of uroplakin is detected using a nucleotide probe.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the sample derived from the subject is urine.
(6) A test agent for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis comprising an antibody that specifically binds to uroplakin or a fragment thereof.
(7) A continuous oligonucleotide primer of at least 15 bases in length for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin, or a continuous of at least 15 bases in length that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding uroplakin A diagnostic agent for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis comprising a polynucleotide probe.
(8) A test kit for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis comprising the test agent according to (6) or (7).
(9) DNA of the following (a) or (b):
(A) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9
(B) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary base sequence to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, comprising each base sequence DNA whose polypeptide-encoded polypeptide is upregulated in patients with vesicoureteral reflux or interstitial cystitis.

本発明により、膀胱尿管逆流症および間質性膀胱炎に対する新規かつ有効なマーカーが提供される。   The present invention provides a novel and effective marker for vesicoureteral reflux and interstitial cystitis.

本発明者らは、ＶＵＲ患者およびＩＣ患者と対照者の尿路上皮組織を試料に用いて、ウロプラキン遺伝子発現量解析のために、それらの各メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を比較した。その結果、ウロプラキンｍＲＮＡがＶＵＲおよびＩＣ上皮組織において発現亢進していることが判明した。さらにこのうちウロプラキンＩＩＩでの実験過程で、１０５９残基からなる完全長ウロプラキンＩＩＩｍＲＮＡ（ＵＰＩＩＩ−Ｆ）のうち、翻訳領域内にある８３残基を欠損したウロプラキンＩＩＩ新規選択的スプライシングバリアント（ＵＰＩＩＩ−Ａ）を発見し、このＵＰＩＩＩ−ＡについてもＶＵＲ組織での過剰発現が見られることを確認した。   The present inventors compared the expression levels of each messenger RNA (mRNA) for the analysis of the expression level of uroplakin gene using the urinary epithelial tissues of VUR patients, IC patients and controls as samples. As a result, it was found that uroplakin mRNA is up-regulated in VUR and IC epithelial tissues. Furthermore, among the above, in the course of the experiment with uroplakin III, among the full-length uroplakin III mRNA (UPIII-F) consisting of 1059 residues, a novel alternative splicing variant (UPIII-A) lacking 83 residues in the translation region. ) Was found, and it was confirmed that this UPIII-A was also overexpressed in the VUR tissue.

ウロプラキン
本発明においてウロプラキン（ＵＰ）とは、尿路上皮（尿道、膀胱、尿管、腎盂の粘膜など）細胞に特異的に発現する膜タンパク質であり、Ｉａ（ＵＰＩａ）、Ｉｂ（ＵＰＩｂ）、ＩＩ（ＵＰＩＩ）、およびＩＩＩ（ＵＰＩＩＩ）を含む。ウロプラキンＩａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩをコードするポリヌクレオチドの塩基配列については、例えば、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００７０００（配列番号１）、ＡＢ００２１５５（配列番号３）、ＮＭ＿００６７６０（配列番号５）、およびＮＭ＿００６９５３（配列番号７）として登録されている。ウロプラキンＩａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩのアミノ酸配列については、例えば、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００８９３１（配列番号２）、ＢＡＡ８８８７８（配列番号４）、ＮＰ＿００６７５１（配列番号６）およびＮＰ＿００８８８４（配列番号８）として登録されている。なおウロプラキンＩＩＩをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である配列番号７において、第２４１〜５２０番の領域が第３のエクソン（以下、「エクソン３」と称することがある）に、第５２１〜６０３番の領域が第４のエクソン（以下、「エクソン４」と称することがある）に、第６０４〜７３６番の領域が第５のエクソン（以下、「エクソン５」と称することがある）に、それぞれ対応する。また、上記エクソン４が欠落したウロプラキンＩＩＩ新規選択的スプライシングバリアント（ＵＰＩＩＩ−Ａ）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号９に示す。 Uroplakin In the present invention, uroplakin (UP) is a membrane protein that is specifically expressed in urothelial cells (such as urethra, bladder, ureter, and renal mucosa), and is expressed as Ia (UPIa), Ib (UPIb), II. (UPII) and III (UPIII). Regarding the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding uroplakin Ia, Ib, II and III, for example, Genbank accession No. NM_007000 (SEQ ID NO: 1), AB002155 (SEQ ID NO: 3), NM_006760 (SEQ ID NO: 5), and NM_006953 (SEQ ID NO: 7) are registered. Regarding the amino acid sequences of uroplakin Ia, Ib, II and III, see, for example, Genbank accession No. NP_008931 (SEQ ID NO: 2), BAA88878 (SEQ ID NO: 4), NP_006751 (SEQ ID NO: 6), and NP_008884 (SEQ ID NO: 8) are registered. In SEQ ID NO: 7, which is the base sequence of a polynucleotide encoding uroplakin III, the region of Nos. 241 to 520 is the third exon (hereinafter sometimes referred to as “exon 3”), and Nos. 521 to 603. Are the fourth exon (hereinafter sometimes referred to as “exon 4”), and the regions 604 to 736 are the fifth exon (hereinafter sometimes referred to as “exon 5”). Correspond. In addition, the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a novel uroplakin III alternative splicing variant (UPIII-A) lacking exon 4 is shown in SEQ ID NO: 9.

本発明においてウロプラキンをコードするポリヌクレオチドには、上記塩基配列（配列番号１、３、５、７および９）で表されるポリヌクレオチドと機能的に同等なポリヌクレオチドが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、各塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。   In the present invention, the polynucleotide encoding uroplakin includes polynucleotides functionally equivalent to the polynucleotides represented by the above base sequences (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9). Here, “functionally equivalent” means that the polypeptide encoded by the target polynucleotide has the same biological function and biochemical function as the polypeptide encoded by the polynucleotide consisting of each base sequence. It means having.

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。   Other methods well known to those skilled in the art for preparing polynucleotides encoding polypeptides that are functionally equivalent to a polypeptide include hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9). 47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

本発明においてウロプラキンをコードするポリヌクレオチドには、各塩基配列を含むＤＮＡ、ならびに各塩基配列の全部または一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、各塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがＶＵＲ患者またはＩＣ患者において発現亢進するものが包含される。ここで、「一部の配列」とは、各ポリヌクレオチドの塩基配列の一部分を含むポリヌクレオチドの塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。   In the present invention, the polynucleotide encoding uroplakin hybridizes under stringent conditions with DNA comprising each base sequence and DNA comprising a base sequence complementary to all or part of each base sequence. And a DNA whose expression is increased in a VUR patient or an IC patient. Here, the “partial sequence” is a base sequence of a polynucleotide containing a part of the base sequence of each polynucleotide, and the length of the base sequence sufficient to hybridize under stringent conditions. For example, a sequence of at least 50 bases, preferably at least 100 bases, more preferably at least 200 bases.

本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各ポリヌクレオチドに対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。   In the present specification, stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed, that is, high homology to each polynucleotide (homology is 80% or more, 90% or higher, more preferably 95% or higher). Examples of hybridization conditions include low stringency conditions. The low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C., 5 × SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 5 × SSC, 0.1% SDS in washing after hybridization. is there. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. .

また、塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、各ポリヌクレオチドと機能的に同等なポリヌクレオチドを単離することも可能である。   It is also possible to isolate a polynucleotide functionally equivalent to each polynucleotide using a gene amplification method using a primer synthesized based on nucleotide sequence information, for example, a polymerase chain reaction (PCR) method. is there.

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される、機能的に同等なポリヌクレオチドは、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。   Functionally equivalent polynucleotides isolated by these hybridization techniques and gene amplification techniques usually have high homology at the amino acid sequence level. High homology generally refers to at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. .

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。   The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Specific techniques for these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

試料中におけるウロプラキンの発現検出
本発明の検査方法は、上記ウロプラキンＩａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩから選択されるウロプラキンの少なくとも１種の発現を検出することを含む。好ましくは少なくともウロプラキンＩＩＩの発現を検出する。 Detection of uroplakin expression in a sample The test method of the present invention comprises detecting the expression of at least one uroplakin selected from the above-described uoplakin Ia, Ib, II and III. Preferably, at least the expression of uroplakin III is detected.

本発明の検査方法において、被検体由来の試料中のウロプラキンの発現を検出する方法としては、被検体由来の試料中のウロプラキンポリペプチドを検出する方法、被検体由来の試料中のウロプラキンをコードするＲＮＡを検出する方法が挙げられる。ここで、ウロプラキンをコードするＲＮＡの検出には、該ＲＮＡから変換されたｃＤＮＡやｃＲＮＡの検出も包含される。   In the test method of the present invention, as a method for detecting the expression of uroplakin in a sample derived from a subject, a method for detecting a uroplakin polypeptide in a sample derived from a subject, code for uroplakin in a sample derived from a subject And a method of detecting RNA to be detected. Here, detection of RNA encoding uroplakin includes detection of cDNA and cRNA converted from the RNA.

１．ウロプラキンポリペプチドの検出
試料中のウロプラキンポリペプチドを検出する方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．８（２００２））、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、上記検査方法は、これらに限定されない。 1. Detection of uroplakin polypeptide Methods for detecting uroplakin polypeptide in a sample include methods well known to those skilled in the art, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), double monoclonal antibody sandwich immunoassay (US Pat. No. 4). , 376, 110), monoclonal polyclonal antibody sandwich assay (Wide et al., Kirkham and Hunter, “Radioimmunoassay”, E. and S. Livingstone, Edinburgh, (1970)), immunofluorescence, Western Blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, protein chip analysis method (protein nucleic acid enzyme Vol. 47 No. 5 (2002), protein nucleic acid enzyme Vol. 47 No. 8 ( 2002)) Two-dimensional electrophoresis method and SDS polyacrylamide electrophoresis method are mentioned, but the inspection method is not limited to these.

以下に、ウロプラキンまたはその断片と特異的に結合する抗体を用いて、ウロプラキンの発現を検出する方法について詳述する。ウロプラキンまたはその断片と特異的に反応する抗体は、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎において発現されたウロプラキンと結合することができるため、該抗体を用いて試料中のウロプラキンとの反応を検出することによって、該試料が患者またはハイリスク者に由来するか否かを検査することができる。   Hereinafter, a method for detecting the expression of uroplakin using an antibody that specifically binds to uroplakin or a fragment thereof will be described in detail. An antibody that specifically reacts with uroplakin or a fragment thereof can bind to uroplakin expressed in vesicoureteral reflux or interstitial cystitis, so that the antibody can be used to react with uroplakin in a sample. By detecting, it is possible to test whether the sample is derived from a patient or a high-risk person.

ウロプラキンまたはその断片と特異的に反応する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれウロプラキンのエピトープに結合することができる。本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧおよびＩｇＭが好ましい。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等の抗体断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号）。 The antibody that specifically reacts with uroplakin or a fragment thereof is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can bind to an epitope of uroplakin, respectively. The globulin type of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics, and may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD, with IgG and IgM being preferred. In particular, the monoclonal antibodies in the present invention include a part of the heavy chain and / or light chain derived from a specific species, or a specific antibody class or subclass, and the remaining part of the chain from another species, or another antibody. Included are “chimeric” antibodies (immunoglobulins) that are derived from a class or subclass, and antibody fragments such as Fab, F (ab ′) ₂ , Fv fragments, etc., as long as they have the desired biological activity (US Pat. No. 4 , 816, 567).

本発明の抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるためのポリペプチドを調製する。免疫原ポリペプチドとしては、ウロプラキンまたはその断片を用いる。本発明において免疫原として使用可能なウロプラキンのアミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、上記のとおり公開されている。従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのウロプラキンまたはその断片を合成することができる。断片としてはウロプラキンのうち少なくとも６個以上のアミノ酸、好ましくは６〜５００、より好ましくは８〜５０アミノ酸からなる部分ペプチドが挙げられる。免疫原としてウロプラキン断片を使用する場合は、ＫＬＨ、ＢＳＡなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。   In producing the antibody of the present invention, a polypeptide to be used as an immunogen (antigen) is prepared. Uroplakin or a fragment thereof is used as the immunogenic polypeptide. The amino acid sequence of uroplakin that can be used as an immunogen in the present invention and the cDNA sequence encoding the polypeptide have been published as described above. Therefore, uroplakin or a fragment thereof for use as an immunogen can be synthesized by publicly known techniques such as solid phase peptide synthesis using the publicly available amino acid sequence information. Examples of the fragment include a partial peptide consisting of at least 6 or more amino acids, preferably 6 to 500, more preferably 8 to 50 amino acids of uroplakin. When an uroplakin fragment is used as an immunogen, it is preferably used by linking to a carrier protein such as KLH or BSA.

また、公知の遺伝子組換え手法を利用して、ウロプラキンをコードするｃＤＮＡの情報を用いてウロプラキンを生産することも可能である。以下、組換え手法を用いたウロプラキンの生産に関して説明する。   It is also possible to produce uroplakin using information on cDNA encoding uroplakin using known gene recombination techniques. Hereinafter, the production of uroplakin using the recombinant technique will be described.

ウロプラキン生産用組換えベクターは、上記公開されているｃＤＮＡ配列を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、ウロプラキン生産用組換えベクターを、ウロプラキンが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。   The recombinant vector for production of uroplakin can be obtained by ligating the above disclosed cDNA sequence to an appropriate vector, and the transformant can be used to transform the recombinant vector for production of uroplakin so that uroplakin can be expressed. It can be obtained by introducing in.

ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。   As the vector, a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used. Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pET21a, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.) ) And the like, and examples of the phage DNA include λ phage (λgt11, λZAP, etc.). Furthermore, animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.

ベクターにウロプラキンｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。   In order to insert uroplakin cDNA into a vector, first, a method in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site of a suitable vector DNA or a multicloning site, and ligated to the vector is employed. The

その他、哺乳動物細胞において用いられるウロプラキン生産用組換えベクターには、プロモーター、ウロプラキンｃＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。   In addition, recombinant vectors for uroplakin production used in mammalian cells include promoters, uroplakin cDNA, cis elements such as enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selectable markers, and ribosome binding sequences (SD sequences). Etc. may be connected.

ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、ウロプラキン生産用組換えベクターを作製する。   A known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. Then, the DNA fragment and the vector fragment are annealed and then ligated to produce a recombinant vector for uroplakin production.

形質転換に使用する宿主としては、ウロプラキンを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。   The host used for transformation is not particularly limited as long as it can express uroplakin. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.) and insect cells.

一例として、細菌を宿主とする場合は、ウロプラキン生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ウロプラキンＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。   As an example, when a bacterium is used as a host, it is preferable that the recombinant vector for producing uroplakin is autonomously replicable in the bacterium, and at the same time comprises a promoter, a ribosome binding sequence, uroplakin DNA, and a transcription termination sequence. . Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of E. coli include Escherichia coli BRL. Examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method.

酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、ウロプラキンを生産することができる。   Similarly, when yeast, animal cells, insect cells, etc. are used as hosts, uroplakin can be produced according to techniques known in the art.

本発明において免疫原として使用するウロプラキンは、上記作製した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。   Uroplakin used as an immunogen in the present invention can be obtained by culturing the transformant prepared above and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. The method of culturing the transformant in a medium is performed according to a usual method used for host culture.

大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。   As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.

培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。   The culture is usually performed at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. During the culture period, the pH is kept near neutral. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.

培養後、ウロプラキンが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ウロプラキンが菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からウロプラキンを単離精製することができる。   After culturing, when uroplakin is produced in cells or cells, proteins are extracted by disrupting the cells or cells. When uroplakin is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, Can be isolated and purified.

ウロプラキンが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。   Whether or not uroplakin is obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.

なお、以上の方法によって得られる組換えウロプラキンには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドもウロプラキンとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。   In addition, the recombinant uroplakin obtained by the above method includes fusion proteins with other arbitrary proteins. Examples thereof include a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) and green fluorescent protein (GFP). Furthermore, the peptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Therefore, modified peptides can also be used as uroplakin. Examples of such post-translational modifications include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation and the like.

次に、得られたタンパク質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。   Next, the obtained protein is dissolved in a buffer solution to prepare an immunogen. If necessary, an adjuvant may be added for effective immunization. Examples of the adjuvant include commercially available complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant, and any of these may be mixed.

モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（ＫＯＨＬＥＲ ＡＮＤ ＭＩ ＬＳＴＥＩＮ，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５６：４９５)、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。例えば、以下のようにして作製することができる。   Monoclonal antibodies may be produced, for example, by the hybridoma method (KOHLER AND MI LSTEIN, NATURE (1975) 256: 495) or the recombinant method (US Pat. No. 4,816,567). It may also be isolated from a phage antibody library. For example, it can be produced as follows.

ｉ）免疫および抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。 i) Immunization and collection of antibody-producing cells The immunogen obtained as described above is administered to mammals such as rats, mice (for example, BALB / c of inbred mice), rabbits, and the like. The single dose of the immunogen is appropriately determined according to the type of immunized animal, the route of administration, etc., and is about 50 to 200 μg per animal. Immunization is performed mainly by injecting an immunogen intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and after the first immunization, booster immunization is performed 2 to 6 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks. After the initial immunization, the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method, etc. When the antibody titer reaches a plateau, the immunogen is intravenously or intraperitoneally Inject and give final immunization. Then, antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.

ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。 ii) Cell fusion In order to obtain a hybridoma, cell fusion between an antibody-producing cell obtained from an immunized animal and a myeloma cell is performed as described above.

抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８株、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株またはＳｐ２／０−Ａｇ１４株などが挙げられる。   As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, thymine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred. The cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal. Specific examples of myeloma cells include P3X63-Ag., Which is a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficient cell line derived from BALB / c mice. 8 strains, P3X63-Ag. 8). U1 strain, P3 / NSI / 1-Ag4-1 strain, P3x63Ag8.653 strain, Sp2 / 0-Ag14 strain and the like can be mentioned.

次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００〜４，０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。   Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. For cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at a ratio of about 1: 1 to 20: 1 in an animal cell culture medium such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium, etc. The fusion reaction is performed in the presence of. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 to 4,000 daltons or the like can be used at a concentration of about 10 to 80%. In some cases, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used in combination in order to increase the fusion efficiency. Furthermore, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).

ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別およびクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×１０^５個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。 iii) Selection and cloning of hybridoma The target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment. As the method, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then plated on a microtiter plate at about 2 × 10 ⁵ cells / well, and a selective medium is added to each well. Cultivation is performed by appropriately changing the selection medium. The culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. When the myeloma cells are of HGPRT-deficient strain or thymidine kinase (TK) -deficient strain, cells having the ability to produce antibodies and myeloma can be obtained by using a selective medium (HAT medium) containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine. Only cell hybridomas can be selectively cultured and propagated. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.

次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ ＡｓｓａｙおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。   Next, it is screened whether the target antibody exists in the culture supernatant of the hybridoma which has proliferated. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be carried out according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and used by enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay) or the like. it can.

融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、尿路上皮癌に由来するウロプラキンと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。   Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established. As described later, the hybridoma of the present invention produces and secretes a monoclonal antibody that is stable in culture in a basic medium such as RPMI 1640 and DMEM, and specifically reacts with uroplakin derived from urothelial cancer. is there.

ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。 iv) Collection of monoclonal antibody As a method for collecting a monoclonal antibody from an established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.

細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ_２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。 In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% fetal bovine serum under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO ₂ concentration). Cultivate for 2 to 10 days and obtain antibody from the culture supernatant.

腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０^７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採取する。 In the case of the ascites formation method, about 1 × 10 ⁷ hybridomas are administered into the abdominal cavity of a mammal derived from a myeloma cell and the same strain, and the hybridomas are proliferated in large quantities. And ascites or serum is collected after 1-2 weeks.

上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。   In the above antibody collection method, when antibody purification is required, a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography or the like is appropriately selected or these are used. By combining, a purified monoclonal antibody of the present invention can be obtained.

ｖ）ポリクローナル抗体の採取
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。 v) Collection of polyclonal antibody In order to prepare a polyclonal antibody, an animal is immunized in the same manner as described above, and 6 to 60 days after the final immunization, enzyme immunoassay (EIA and ELISA), radioimmunoassay (RIA) ) And the like, and blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by an ELISA method or the like.

ウロプラキンに対する抗体を用いて被検体由来の試料中のウロプラキンの発現を検出し、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎を検出する場合には、被検体の試料中に、ウロプラキンに対する抗体またはその標識化抗体と結合する抗原ポリペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ポリペプチドが存在する被検体を膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の細胞で発現しているウロプラキンと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ポリペプチドを含む試料を、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５〜３９種類の抗体について試料中のウロプラキンとの結合を判定する。   When detecting the expression of uroplakin in a sample derived from a subject using an antibody against uroplakin and detecting vesicoureteral reflux or interstitial cystitis, the antibody against uroplakin or its Test for the presence of an antigen polypeptide that binds to the labeled antibody, and identify the subject in which the antigen polypeptide is present in a patient with vesicoureteral reflux or interstitial cystitis or a high-risk person. judge. That is, the antibody or labeled antibody used here is an antibody that specifically binds to uroplakin expressed in cells of vesicoureteral reflux or interstitial cystitis. A sample containing the peptide can be determined as a sample of a patient with cystoureteral reflux or interstitial cystitis or a high risk patient thereof. In this case, preferably, two or more types, preferably 5 types or more, more preferably 10 types or more, and most preferably 15 to 39 types of antibodies are determined to bind to uroplakin in the sample.

また別の態様は、抗体とウロプラキンとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体と試料とを接触させて標識化抗体とウロプラキンを結合させ、この結合体を上記と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。   In another embodiment, the antibody and uroplakin are bound in a liquid phase system. For example, the labeled antibody is contacted with the sample to bind the labeled antibody and uroplakin, the conjugate is separated by the same method as described above, and the labeled signal is detected by the same method.

液相系での検出の別の方法は、ウロプラキンに対する抗体（一次抗体）と試料とを接触させて一次抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ポリペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。   Another method for detection in a liquid phase system is to contact an antibody against uroplakin (primary antibody) with a sample to bind the primary antibody and antigen polypeptide, and bind the labeled antibody (secondary antibody) to this conjugate. The label signal in the tripartite conjugate is detected. Alternatively, in order to further enhance the signal, an unlabeled secondary antibody may first be bound to an antibody + antigen polypeptide conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody. Such binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance. Alternatively, an antibody (tertiary antibody) that recognizes a partial region (for example, Fc region) of the secondary antibody may be labeled and this tertiary antibody may be bound to the secondary antibody. The primary antibody and the secondary antibody may both be monoclonal antibodies, or one of the primary antibody and the secondary antibody may be a polyclonal antibody. Separation of the conjugate from the liquid phase and detection of the signal can be the same as described above.

また別の態様は、抗体とウロプラキンとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のウロプラキンの検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、ウロプラキンに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体にウロプラキンを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋ウロプラキン結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、ＥＬＩＳＡとして広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。   Another embodiment is a method for testing the binding between an antibody and uroplakin in a solid phase system. This method in the solid phase system is a preferable method for detecting a very small amount of uroplakin and simplifying the operation. That is, in this solid phase system method, an antibody (primary antibody) against uroplakin is immobilized on a solid phase (resin plate, membrane, beads, etc.), uroplakin is bound to this immobilized antibody, and unbound peptides are washed away. In this method, a labeled antibody (secondary antibody) is bound to the antibody + uroplakin conjugate remaining on the plate, and the signal of this secondary antibody is detected. This method is a so-called “sandwich method”, and is a method widely used as an ELISA when an enzyme is used as a marker. Both the primary antibody and the secondary antibody can be monoclonal antibodies, or one of the primary antibody and the secondary antibody can be a polyclonal antibody. Signal detection can be as described above.

２．ウロプラキンＲＮＡの検出
被検体由来の試料中のウロプラキンをコードするＲＮＡを検出する方法としては、ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマーまたはウロプラキンをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いて被検体由来の試料中のウロプラキンの発現を検出する方法が挙げられる。 2. Detection of uroplakin RNA As a method for detecting RNA encoding uroplakin in a sample derived from a subject, a continuous oligonucleotide primer having at least 15 bases in length or uroplakin for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin And a method of detecting the expression of uroplakin in a sample derived from a subject using a continuous polynucleotide probe having a length of at least 15 bases that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding the.

本発明において、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した分子をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。   In the present invention, polynucleotides and oligonucleotides are linked to nucleoside phosphate esters (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to the sugar. Molecules, including DNA and RNA.

該プライマーまたはプローブは、被検体由来の試料中に発現しているウロプラキンのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡと特異的に結合して、試料中のウロプラキンをコードするポリヌクレオチドの発現、すなわちウロプラキンの発現を検出することが可能である。   The primer or probe specifically binds to the mRNA of uroplakin expressed in the sample derived from the subject or cDNA or cRNA synthesized from the mRNA, and expresses the polynucleotide encoding uroplakin in the sample, ie, uroplakin Can be detected.

本発明のプライマーは、ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１部を増幅するものであればよく、例えば、１０５９残基からなる完全長ウロプラキンＩＩＩｍＲＮＡ（ＵＰＩＩＩ−Ｆ）のうち、翻訳領域内にある８３残基を欠損したウロプラキンＩＩＩ新規選択的スプライシングバリアント（ＵＰＩＩＩ−Ａ）を検出することもまた、ウロプラキンの発現の検出に包含される。   The primer of the present invention only needs to amplify at least a part of a polynucleotide encoding uroplakin. For example, among the full-length uroplakin III mRNA (UPIII-F) consisting of 1059 residues, Detection of uroplakin III novel alternative splicing variant (UPIII-A) lacking residues is also encompassed in the detection of uroplakin expression.

プライマーおよびプローブは、当業者に公知の手法に従って、設計することができる。プライマーおよびプローブ設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。   Primers and probes can be designed according to techniques known to those skilled in the art. As points to keep in mind when designing the primer and probe, the following can be pointed out, for example.

プライマーとして実質的な機能を有する長さは、通常１５塩基以上、好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。またプローブとして実質的な機能を有する長さとしては、１５塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。   The length having a substantial function as a primer is usually 15 bases or more, preferably 16 to 50 bases, more preferably 20 to 30 bases. Moreover, as a length which has a substantial function as a probe, 15 bases or more are preferable, More preferably, it is 16-50 bases, More preferably, it is 20-30 bases.

また設計の際には、プライマーまたはプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意のポリヌクレオチド鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡとプライマーまたはプローブとが二本鎖を形成してアニーリングまたはハイブリダイズするためには、アニーリングまたはハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーまたはプローブのＴｍは、増幅反応またはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマーまたはプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏＴＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜５５℃であることが好ましい。   In designing, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer or probe. Tm means the temperature at which 50% of any polynucleotide strand will hybridize with its complementary strand, so that template DNA or RNA and primer or probe form a double strand to anneal or hybridize. It is necessary to optimize the temperature of annealing or hybridization. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. Therefore, the Tm of the primer or probe to be designed is an important factor for performing an amplification reaction or hybridization. For confirmation of Tm, known primer or probe design software can be used. Examples of software that can be used in the present invention include Oligo ™ (National Bioscience Inc. (USA)), GENETYX [Software Development (Made by Japan)] etc. are mentioned. Also, Tm can be confirmed by calculating by itself without using software. In that case, a calculation formula based on the nearest neighbor method, the Wallance method, the GC% method, or the like can be used. In the present invention, the average Tm is preferably about 45 to 55 ° C.

プライマーまたはプローブとして特異的なアニーリングまたはハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。   Other conditions that allow specific annealing or hybridization as a primer or probe include GC content, and such conditions are well known to those skilled in the art.

上述のように設計したプライマーおよびプローブは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマーまたはプローブには、アニーリングまたはハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマーまたはプローブにそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。   Primers and probes designed as described above can be prepared according to methods known to those skilled in the art. Further, as is well known to those skilled in the art, the primer or probe may contain additional sequences other than the portion to be annealed or hybridized, such as a tag sequence, and so on. Those to which additional sequences are added are also included within the scope of the present invention.

ウロプラキンＩをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１〜２１番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも８１１〜８３１番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも３３７〜３５６番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。   As an oligonucleotide primer for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin I, the nucleotide sequence comprising at least the 1st to 21st bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having 15 or more consecutive bases or An oligonucleotide consisting of the complementary sequence, an oligonucleotide consisting of at least 15 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of a continuous base sequence of 15 or more bases or a complementary sequence thereof, shown in SEQ ID NO: 1 Examples include oligonucleotides comprising at least bases 337 to 356 in the base sequence and comprising a continuous base sequence of 15 bases or more or a complementary sequence thereof.

ウロプラキンＩｂをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号３に示す塩基配列のうち少なくとも７〜２８番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列のうち少なくとも８８０〜９０１番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列のうち少なくとも３５５〜３７７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列のうち少なくとも７８９〜８１２番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。   As an oligonucleotide primer for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin Ib, a nucleotide sequence comprising at least 7 to 28 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having 15 or more consecutive bases or An oligonucleotide consisting of the complementary sequence, an oligonucleotide consisting of at least 15 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and consisting of 15 or more consecutive base sequences or a complementary sequence thereof, shown in SEQ ID NO: 3 An oligonucleotide consisting of at least bases 355 to 377 in the base sequence and consisting of a continuous base sequence of 15 bases or more or a complementary sequence thereof, including at least bases 789 to 812 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 And a continuous base sequence of 15 bases or more or its phase It includes oligonucleotides consisting of sequences.

ウロプラキンＩＩをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも４〜２２番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも６０７〜６２８番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。   As an oligonucleotide primer for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin II, a nucleotide sequence comprising at least 4 to 22 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and having 15 or more consecutive bases or Examples thereof include an oligonucleotide composed of the complementary sequence, and an oligonucleotide composed of at least 15 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and comprising 15 or more consecutive base sequences or a complementary sequence thereof.

ウロプラキンＩＩＩをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも４〜２４番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも２５１〜２７２番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも５８２〜６０１番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。   As an oligonucleotide primer for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin III, a base sequence comprising at least 4 to 24 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and having 15 or more consecutive bases or An oligonucleotide consisting of the complementary sequence, an oligonucleotide consisting of at least 15 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and consisting of 15 or more consecutive base sequences or a complementary sequence thereof, shown in SEQ ID NO: 7 Examples include oligonucleotides comprising at least 582 to 601 bases in the base sequence and consisting of 15 or more consecutive base sequences or their complementary sequences.

ウロプラキンＩＩＩのスプライシングバリアントをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも４〜２４番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも９２０〜９４０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも５０１〜５２０番の塩基および６０４〜６０７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。   As an oligonucleotide primer for specifically amplifying a polynucleotide encoding a splicing variant of uroplakin III, it contains at least 4 to 24 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and has 15 or more consecutive bases An oligonucleotide comprising a base sequence or a complementary sequence thereof, an oligonucleotide comprising at least the bases 920 to 940 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and comprising a continuous base sequence of 15 bases or more or a complementary sequence thereof, SEQ ID NO: 7 includes at least bases 501 to 520 and bases 604 to 607, and an oligonucleotide consisting of a continuous base sequence of 15 bases or more or a complementary sequence thereof.

被検体由来の試料におけるウロプラキンの発現を検出するためには、上記プライマーおよび／またはプローブをそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出する。   In order to detect the expression of uroplakin in a sample derived from a subject, the primers and / or probes are used in an amplification reaction or a hybridization reaction, respectively, and the amplification product or hybrid product is detected.

試料としては、膀胱尿管逆流症を検査する場合は、試料として尿、膀胱上皮組織を対象とすることができ、間質性膀胱炎を検査する場合もまた、試料として尿、膀胱上皮組織を対象とすることができる。本発明の検査方法は、尿等の試料を対象とできることから、簡便かつ非侵襲の検査が可能になる。   As a sample, when examining vesicoureteral reflux disease, urine and bladder epithelial tissue can be targeted, and when examining interstitial cystitis, urine and bladder epithelial tissue are also used as samples. Can be targeted. Since the inspection method of the present invention can target a sample such as urine, a simple and non-invasive inspection is possible.

増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被検体由来の試料から被検ポリヌクレオチドを調製する。被検ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドであればＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、またはチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料または被検ポリヌクレオチドを用いて、以下に示す増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を行う。   When performing an amplification reaction or a hybridization reaction, a test polynucleotide is usually prepared from a sample derived from a test sample. The test polynucleotide may be DNA or RNA as long as it is a polynucleotide. DNA or RNA can be extracted appropriately using a method well known in the art. For example, when extracting DNA, a method of phenol extraction and ethanol precipitation, a method using glass beads, etc., and when extracting RNA, guanidine-cesium chloride ultracentrifugation, hot phenol method, or thiocyanic acid A guanidinium-phenol-chloroform (AGPC) method or the like can be used. The following amplification reaction and / or hybridization reaction is performed using the sample or the test polynucleotide prepared as described above.

抽出されたＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブ を加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブ からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。   The extracted RNA is preferably further purified and used as mRNA. Although the purification method is not particularly limited, since many mRNAs present in the cytoplasm of eukaryotic cells have a poly (A) sequence at the 3 ′ end thereof, this feature is used, for example, as follows. be able to. First, a biotinylated oligo (dT) probe is added to the extracted total RNA to adsorb poly (A) + RNA. Next, a paramagnetic particle carrier on which streptavidin is immobilized is added, and poly (A) + RNA is captured using the binding between biotin / streptavidin. After the washing operation, finally, poly (A) + RNA is eluted from the oligo (dT) probe. Alternatively, a method of adsorbing poly (A) + RNA using an oligo (dT) cellulose column and eluting it to purify it may be employed. The eluted poly (A) + RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.

プライマーを用いて被検ポリヌクレオチドを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、試料中のウロプラキンの発現を検出することができる。   Expression of uroplakin in the sample can be detected by performing an amplification reaction using the test polynucleotide as a template using a primer and detecting the specific amplification reaction.

増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。   The amplification method is not particularly limited, and a known method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method can be mentioned. For example, the PCR method, the LAMP (Loop-Mediated Isometric Amplification) method, the ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Citric Acid of Citric Acids, the RCA (Rolling Acid Amplification) method, the RCA (Rolling Amplification method). (Amplification) method, RT-PCR method, real-time PCR method and the like. Amplification is performed until the amplification product is at a detectable level.

例えば、ＰＣＲ法は、被検ポリヌクレオチドであるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリングおよび合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。   For example, in the PCR method, a base sequence between a pair of primers is synthesized by DNA polymerase using DNA as a test polynucleotide as a template. According to the PCR method, the amplified fragment can be amplified exponentially by repeating a cycle consisting of denaturation, annealing and synthesis. Those skilled in the art can easily determine the optimum conditions for PCR.

またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検ポリヌクレオチドであるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。   In the RT-PCR method, first, cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using RNA as a test polynucleotide as a template, and then PCR is performed using a pair of primers using the prepared cDNA as a template. is there.

なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法では、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブ を目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブ が５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を定量する。   In addition, quantitative detection is possible by adopting a quantitative PCR method such as a competitive PCR method or a real-time PCR method as an amplification method. In the real-time PCR (TaqMan PCR) method, an oligonucleotide probe that hybridizes to a specific region of a target gene, which is labeled with a fluorescent dye (reporter) at the 5 ′ end and a fluorescent dye (quencher) at the 3 ′ end, is used. . In the normal state of the probe, the fluorescence of the reporter is suppressed by the quencher. In a state where this fluorescent probe is completely hybridized to the target gene, PCR is performed from the outside using Taq DNA polymerase. When the extension reaction by Taq DNA polymerase proceeds, the exonuclease activity hydrolyzes the fluorescent probe from the 5 'end, releases the reporter dye, and emits fluorescence. In the real-time PCR method, the initial amount of template DNA is quantified by monitoring the fluorescence intensity in real time.

上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。   In order to detect whether or not a specific amplification reaction has occurred after the amplification reaction, a known means capable of specifically recognizing an amplification product obtained by the amplification reaction can be used. For example, a specific amplification reaction can be detected by confirming whether an amplified fragment of a specific size is amplified using agarose gel electrophoresis or the like.

あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。 Alternatively, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance is allowed to act on dNTP taken in during the amplification reaction, and this label can be detected. As a radioactive isotope, ³² P, ¹²⁵ I, ³⁵ S, or the like can be used. As the fluorescent material, for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used.

これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。   There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.

標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。   As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method known in the art for detecting the above-described labeled body may be used. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured by, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.

以上のようにして特異的な増幅反応が検出された場合には、試料中にウロプラキンをコードするポリヌクレオチドが発現している、すなわちウロプラキンが発現していることとなる。従って、試料中にウロプラキンが発現している被検体を膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎患者またはハイリスク者と判定する。   When a specific amplification reaction is detected as described above, a polynucleotide encoding uroplakin is expressed in the sample, that is, uroplakin is expressed. Therefore, a subject in which uroplakin is expressed in the sample is determined as a patient with vesicoureteral reflux or interstitial cystitis or a high-risk person.

また、プローブを用いて試料または被検ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、ウロプラキンの発現を検出することもできる。   Moreover, the expression of uroplakin can also be detected by performing a hybridization reaction on a sample or a test polynucleotide using a probe and detecting its specific binding (hybrid).

ハイブリダイゼーション反応は、プローブがウロプラキンに由来するポリヌクレオチドのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件が挙げられる。   The hybridization reaction needs to be performed under conditions such that the probe specifically binds only to the polynucleotide derived from uroplakin, ie, stringent conditions. Such stringent conditions are well known in the art and are not particularly limited. As stringent conditions, for example, the sodium concentration is 10 to 300 mM, preferably 20 to 100 mM, and the temperature is 25 to 70 ° C, preferably 42 to 55 ° C.

ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（^３２Ｐなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、以下に述べる本発明の検査用キットには、上記のような標識を付加したプローブも含まれる。 When performing hybridization, fluorescent label probe (fluorescein, rhodamine, and the like), (such as ^{32 P)} radiolabeled, enzyme-labeled (alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.), adds the appropriate labels such biotin-labeled be able to. Therefore, the test kit of the present invention described below includes a probe to which the above label is added.

標識化プローブを用いた検出は、試料またはそれから調製した被検ポリヌクレオチドとプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、試料または被検ポリヌクレオチドをスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブと試料または被検ポリヌクレオチドとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、試料または被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、試料中にウロプラキンが発現していることとなる。従って、試料中にウロプラキンが発現している被検体を膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎患者またはハイリスク者と判定する。   The detection using the labeled probe includes contacting the sample or a test polynucleotide prepared therefrom with the probe so that they can be hybridized. “To be able to hybridize” means in an environment (temperature, salt concentration) in which specific binding occurs under the above-described stringent conditions. Specifically, the sample or test polynucleotide is immobilized on an appropriate solid phase such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and a probe to which a label is added is added to the probe and the sample or test polynucleotide. Is contacted to perform a hybridization reaction to remove unhybridized probe, and then the label of the probe hybridized with the sample or the test polynucleotide is detected. When the label is detected, uroplakin is expressed in the sample. Therefore, a subject in which uroplakin is expressed in the sample is determined as a patient with vesicoureteral reflux or interstitial cystitis or a high-risk person.

また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法等を挙げることができる。 In addition, quantitative detection is possible by using the concentration of the label as an index. Examples of the detection method using a labeled probe include Southern hybridization method, Northern hybridization method, FISH (fluorescence in situ hybridization) method and the like.

上記で述べたような本発明の検出方法における判定基準としては、典型的には、ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を作成してカットオフ値（病態識別値）を設定し、所定のカットオフ値以上であれば患者またはハイリスク者であると判定する方法が挙げられる。例えば膀胱尿管逆流症については、検体が尿であるとき、ＲＯＣ曲線から得られる至適カットオフ値は、単位ＧＡＰＤＨあたりウロプラキンｍＲＮＡ９５コピー以上、９０％の特異性になるように重点を置けば１３８コピー以上の場合に患者またはハイリスク者であると判定することができる。間質性膀胱炎についても同様の手法による判定が可能である。   As a determination criterion in the detection method of the present invention as described above, typically, an ROC curve (receiver operating characteristic curve) is created, a cutoff value (pathological condition identification value) is set, and a predetermined cut The method of determining that it is a patient or a high-risk person if it is more than an off value is mentioned. For example, for vesicoureteral reflux disease, when the specimen is urine, the optimal cut-off value obtained from the ROC curve is 138 if the emphasis is on the specificity of 90% or more of uroplakin mRNA per unit GAPDH. It can be determined that the patient or a high-risk person is more than a copy. Interstitial cystitis can also be determined by the same method.

その他の検査方法として、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０９３７、Ｗａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ．，Ｓａｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｃｅｌｌ（１９７９）１６，４４３−４５２）、また、適当なプローブ を用いたクロスハイブリダイゼーション法（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等が挙げられる。   Other inspection methods include, for example, the subtraction method (Sive, HL and John, T. St. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10937, Wang, Z., and Brown, DD (1991) Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.88, 11505-11509), differential display method (Liang, P., and Pardee, AB (1992) Science 257, 967-971, Liang, P , Averboukh, L., Keimarsi, K., Sager, R., and Pardee, AB (1992) Cancer Research 52, 6966-6968), differential hybridisation. (John, T. St., and Davis, RW Cell (1979) 16, 443-452), and a cross-hybridization method using an appropriate probe ("Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Maniatis) , T., Fritsch, EF, Sambrook, J. (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press).

検査薬および検査キット
本発明はまた、膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎を検査するための検査薬に関する。該検査薬は、ウロプラキンの発現を検出する手段として、ウロプラキンまたはその断片と特異的に結合する抗体、ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー、およびウロプラキンをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブから選択される少なくとも１種を含む。 Test Agent and Test Kit The present invention also relates to a test agent for testing vesicoureteral reflux or interstitial cystitis. The test drug comprises, as a means for detecting the expression of uroplakin, an antibody that specifically binds to uroplakin or a fragment thereof, and a continuous oligonucleotide having a length of at least 15 bases for specifically amplifying the polynucleotide encoding uroplakin A primer and at least one selected from a continuous polynucleotide probe of at least 15 bases in length that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding uroplakin.

該検査薬は、有効成分であるオリゴヌクレオチドプライマー、ポリヌクレオチドプローブまたは抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。   In addition to the oligonucleotide primer, polynucleotide probe or antibody that is an active ingredient, the test agent is, for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, protein stabilizer (BSA) And gelatin), preservatives and the like may be mixed as necessary.

本発明はまた、上記検査薬を含む膀胱尿管逆流症または間質性膀胱炎の検査キットに関する。このようなキットとしては、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、本発明の検査用キットも、ウロプラキンの発現を検出するための上記検査薬を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。ウロプラキンの発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリヌクレオチドプローブまたは抗体に加え、例えば、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質等を含みうる。   The present invention also relates to a test kit for vesicoureteral reflux or interstitial cystitis comprising the above test agent. As such a kit, various types are commercially available depending on the type of the test component, and the test kit of the present invention is also known except for using the above test agent for detecting the expression of uroplakin. It can be constituted by each element used in a public kit. In addition to the oligonucleotide primer, polynucleotide probe or antibody for detecting the expression of uroplakin, for example, a labeled secondary antibody, a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, a standard substance and the like can be included.

以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.

（実施例１）膀胱尿管逆流症（ＶＵＲ）におけるウロプラキンｍＲＮＡ発現量
対象
ＶＵＲ組織におけるウロプラキンｍＲＮＡ発現量を検討するため、滋賀医科大学附属病院泌尿器科での手術で得られたＶＵＲ患者の膀胱上皮組織２０例、および対照となる患者（前立腺肥大症、前立腺癌などの尿路移行上皮に明らかな異常を有しない泌尿器科患者）の尿路上皮組織１１例を用いた。標本は採取後、速やかに−８０℃で保存した。また、尿中剥離細胞でのウロプラキンｍＲＮＡ発現量の検証には、同病院泌尿器科で得られたＶＵＲ患者尿１８検体、および対照患者の尿２０検体（外来検査で尿路に明らかな異常がない泌尿器科患者１２検体と健常人８検体）を用いた。尿の採取は原則的に自然排尿とし、必要に応じてカテーテル導尿にて行った。採取した尿は、遠心分離にて剥離上皮を回収したのちバッファーで洗浄し、速やかに−８０℃で保存した。検体の採取にあたっては、当該研究への臨床材料の使用につき文書で十分な説明を行い、患者本人または代理者からの同意を得た。 (Example 1) Uroplakin mRNA expression level in vesicoureteral reflux (VUR)
To examine the expression level of uroplakin mRNA in the target VUR tissue, 20 cases of bladder epithelial tissue of VUR patients obtained by surgery at the Department of Urology, Shiga Medical University Hospital, and control patients (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.) Eleven cases of urothelial tissue from urological patients who have no obvious abnormality in the urothelial epithelium were used. The specimen was stored at -80 ° C immediately after collection. In addition, for the verification of uroplakin mRNA expression level in urinary exfoliated cells, 18 VUR patient urine samples obtained from the urology department of the hospital and 20 urine samples from control patients (there are no obvious abnormalities in the urinary tract in outpatient examinations) 12 urological patients and 8 healthy subjects) were used. Urine was collected by spontaneous urination in principle, and catheter urine was used as needed. The collected urine was washed with a buffer after collecting the separated epithelium by centrifugation, and immediately stored at −80 ° C. When collecting specimens, we provided sufficient explanation in writing about the use of clinical materials for the study and obtained consent from the patient himself or his representative.

方法
（１）ｍＲＮＡの採取とｃＤＮＡの合成
ｉ）組織検体
保存した組織検体から、ＴｒｉＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、プロトコールに従い全ＲＮＡを抽出し、分光光度計で濃度測定を行った。抽出した各５μｇずつの全ＲＮＡから、ランダムプライマー（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による逆転写反応からｃＤＮＡを合成し、以下の実験の試料とした。ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に対する特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法でｃＤＮＡ合成の良否を確認した後、各試料を使用するまで−２０℃で保存した。 Method (1) Collection of mRNA and synthesis of cDNA i) Tissue specimen Using TriZOL Reagent (Life Technologies, Inc.), total RNA was extracted from the preserved tissue specimen according to the protocol, and the concentration was measured with a spectrophotometer. It was. From 5 μg of each extracted RNA, cDNA was synthesized from the reverse transcription reaction by Superscript II (Invitrogen) using a random primer (Takara Biochemical), and used as a sample for the following experiment. After confirming the quality of cDNA synthesis by RT-PCR using a specific primer for GAPDH (Glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase), each sample was stored at −20 ° C. until use.

ｉｉ）尿検体
採取した尿を遠心分離（１，５００ｒｐｍ×１０分間）して剥離上皮を回収し、ＰＢＳバッファーで計２回洗浄した後、速やかに−８０℃で保存した。ＴｒｉＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、常法に従い全ＲＮＡを抽出し、これを全量用いて組織検体の時と同様にｃＤＮＡを合成し、以下の実験の試料として使用するまで−２０℃で保存した。 ii) Urine sample The collected urine was centrifuged (1,500 rpm × 10 minutes) to recover the detached epithelium, washed twice with PBS buffer, and immediately stored at −80 ° C. Using TriZOL Reagent (Life Technologies, Inc.), total RNA was extracted according to a conventional method, and this was used to synthesize cDNA in the same manner as the tissue sample until it was used as a sample for the following experiment. Stored at ° C.

（２）全長ＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩ、ＵＰＩＩＩに対するＲＴ−ＰＣＲとダイレクトシークエンシング
合成したｃＤＮＡからＬＡ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。反応液２０μｌ中にそれぞれ２μｌのｃＤＮＡを使用し、独自に設計したセンスおよびアンチセンスプライマーとしてウロプラキンＩａ（ＵＰＩａ）、ウロプラキンＩｂ（ＵＰＩｂ）、ウロプラキンＩＩ（ＵＰＩＩ）、ウロプラキンＩＩＩ（ＵＰＩＩＩ）それぞれについてＵＰＫ１Ａ−Ｓ１（配列番号１０）とＵＰＫ１Ａ−ＡＩ（配列番号１１）、ＵＰＫ１Ｂ−ＳＩ（配列番号１３）とＵＰＫ１Ｂ−ＡＩ（配列番号１４）、ＵＰＫ２−ＳＩ（配列番号１７）とＵＰＫ２−ＡＩ（配列番号１８）、ＵＰＫ３−Ｓ１（配列番号１９）とＵＰＫ３−Ａ２（配列番号２０）を用いて（最終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌ）、変性反応９４℃×３０ｓｅｃ、アニーリング反応６２℃×３０ｓｅｃ、伸長反応７２℃×１ｍｉｎ、３０サイクルの増幅で行った。ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド加２％アガロースゲルで電気泳動し、可視化したバンドを切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ ＤＮＡ シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でダイレクトシークエンシングを行い、Ｇｅｎｂａｎｋに登録された塩基配列と比較した。同様にＧＡＰＤＨに対してはアニーリング反応を５５℃で２３サイクルとした。 (2) RT-PCR and direct sequencing for full-length UPIa, UPIb, UPII, UPIII RT-PCR was performed from the synthesized cDNA using LA taq (Takara Biochemical). Using 2 μl each of cDNA in 20 μl of the reaction solution, UPK1A− for each of uroplakin Ia (UPIa), uroplakin Ib (UPIb), uroplakin II (UPII), and uroplakin III (UPIII) were used as uniquely designed sense and antisense primers. S1 (SEQ ID NO: 10) and UPK1A-AI (SEQ ID NO: 11), UPK1B-SI (SEQ ID NO: 13) and UPK1B-AI (SEQ ID NO: 14), UPK2-SI (SEQ ID NO: 17) and UPK2-AI (SEQ ID NO: 18) ), UPK3-S1 (SEQ ID NO: 19) and UPK3-A2 (SEQ ID NO: 20) (final concentration 0.2 pmol / μl), denaturation reaction 94 ° C. × 30 sec, annealing reaction 62 ° C. × 30 sec, extension reaction 72 ° C. X 1 min, 30 cycles of amplification. The PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel with ethidium bromide, and the visualized band was excised and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), direct sequencing was performed with the ABI PRISM 310 DNA sequencer (Applied Biosystems) and compared with the base sequence registered with Genbank. Similarly, for GAPDH, the annealing reaction was 23 cycles at 55 ° C.

（３）ＵＰＩＩＩ−Ｆ（完全型）およびＵＰＩＩＩ−Ａ（不完全型）特異的ＲＴ−ＰＣＲ
ＵＰＩＩＩ−Ｆを特異的に検出するため、エクソン４の配列内にアンチセンスプライマー、ＵＰＫ３−Ａ４（配列番号２２）を設計した。ＵＰＩＩＩ−Ａのみを増幅させるセンスプライマーとしてＵＰＫ３−ＡＬ１（配列番号２３）を、５’側をエクソン３内に置き、３’側はエクソン４をまたいでエクソン５先頭の４残基を付加するように設計した。ＵＰＩＩＩ−Ｆ特異的ＰＣＲはセンスプライマーＵＰＫ３−ＳＦ（配列番号２１）とアンチセンスプライマーＵＰＫ３−Ａ４（配列番号２２）を用いて（最終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌ）アニーリング反応を６２℃で行い、ＵＰＩＩＩ−Ａ特異的ＰＣＲではセンスプライマーＵＰＫ３−ＡＬ１（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＵＰＫ３−Ａ２（配列番号２０）を用いて（最終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌ）アニーリング反応を６７℃とした。ＲＴ−ＰＣＲで使用した全てのプライマーを表１に要約した。なお前述の通りＵＰＩＩＩ−Ｆ（完全型）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である配列番号７において、第２４１〜５２０番の領域がエクソン３に、第５２１〜６０３番の領域がエクソン４に、第６０４〜７３６番の領域がエクソン５にそれぞれ対応する。 (3) UPIII-F (complete type) and UPIII-A (incomplete type) specific RT-PCR
In order to specifically detect UPIII-F, an antisense primer, UPK3-A4 (SEQ ID NO: 22), was designed within the sequence of exon 4. UPK3-AL1 (SEQ ID NO: 23) as a sense primer for amplifying only UPIII-A is placed in the exon 3 on the 5 ′ side and the 4 residues at the beginning of exon 5 are added across the exon 4 on the 3 ′ side. Designed. UPIII-F specific PCR was performed at 62 ° C. using the sense primer UPK3-SF (SEQ ID NO: 21) and the antisense primer UPK3-A4 (SEQ ID NO: 22) (final concentration: 0.2 pmol / μl). In the -A-specific PCR, the annealing reaction was 67 ° C. using the sense primer UPK3-AL1 (SEQ ID NO: 23) and the antisense primer UPK3-A2 (SEQ ID NO: 20) (final concentration 0.2 pmol / μl). All primers used in RT-PCR are summarized in Table 1. As described above, in SEQ ID NO: 7, which is the base sequence of a polynucleotide encoding UPIII-F (complete type), the region from 241 to 520 is in exon 3, the region from 521 to 603 is in exon 4, Regions Nos. 604 to 736 correspond to exon 5, respectively.

（４）ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａのサブクローニング
ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−ＡのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミドベクターでサブクローニングし、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてそれぞれのプラスミドを精製した。 (4) Subcloning of UPIII-F and UPIII-A The PCR products of UPIII-F and UPIII-A amplified by RT-PCR were subcloned with pCR4-TOPO plasmid vector using TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen). Then, each plasmid was purified using Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit (BIO-RAD).

（５）定量的ＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるリアルタイムＰＣＲを行った。推奨されているプロトコールに従い２０μｌの反応液中に２μｌずつのｃＤＮＡ試料を使用し、ＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩのリアルタイムＰＣＲではセンスおよびアンチセンスプライマーとしてそれぞれＵＰＫ１Ａ−Ｓ２（配列番号１２）とＵＰＫ１Ａ−ＡＩ（配列番号１１）、ＵＰＫ１ｂ−Ｓ２（配列番号１５）とＵＰＫ１ｂ−Ａ１（配列番号１６）、ＵＰＫ２−ＳＩ（配列番号１７）とＵＰＫ２−ＡＩ（配列番号１８）を用いて（最終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌ）アニーリング反応を６２℃で行った。ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−ＡのリアルタイムＰＣＲは特異的ＲＴ−ＰＣＲと同じ条件で行った。４５回転の増幅反応の後、アニーリング反応より７℃高い条件で融解曲線を検証した。定量化コントロール用ＤＮＡは、ダイレクトシークエンシングのためのＲＴ−ＰＣＲで得られたそれぞれのウロプラキンＤＮＡを精製したのち分光光度計で濃度を測定し、これを段階的に希釈して調整した。ＧＡＰＤＨについても同様の手順で定量的ＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマーも上記表１に記した。 (5) Quantitative PCR
Real-time PCR was performed with LightCycler FastStart DNA Master SYBER GREEN I (Roche Diagnostics). According to the recommended protocol, 2 μl of each cDNA sample was used in a 20 μl reaction solution, and UPK1A-S2 (SEQ ID NO: 12) and UPK1A-AI (SEQ ID NO: 12) were used as sense and antisense primers in UPIa, UPIb, UPII real-time PCR, respectively. SEQ ID NO: 11), UPK1b-S2 (SEQ ID NO: 15) and UPK1b-A1 (SEQ ID NO: 16), UPK2-SI (SEQ ID NO: 17) and UPK2-AI (SEQ ID NO: 18) (final concentration 0.2 pmol / μl) The annealing reaction was carried out at 62 ° C. UPIII-F and UPIII-A real-time PCR was performed under the same conditions as specific RT-PCR. After an amplification reaction of 45 rotations, the melting curve was verified under conditions higher by 7 ° C. than the annealing reaction. The DNA for quantification control was prepared by purifying each uroplakin DNA obtained by RT-PCR for direct sequencing, measuring the concentration with a spectrophotometer, and diluting it stepwise. For GAPDH, quantitative PCR was performed in the same procedure. The primers used in real-time PCR are also shown in Table 1 above.

（６）データの解析
定量的ＰＣＲで得られた結果を元に、ＶＵＲ試料と対照患者試料間で全てのウロプラキンｍＲＮＡ発現量の比較を行い、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定で統計学的解析を行った（ｐ＜０．０５：有意差あり）。尿におけるＵＰＩＩＩｍＲＮＡ定量の検査能を検討するため、ＲＯＣ曲線を描いて至適カットオフ値を設定し、感度、特異度を求めた。 (6) Data analysis Based on the results obtained by quantitative PCR, all Uroplakin mRNA expression levels were compared between VUR samples and control patient samples, and statistical analysis was performed by Mann-Whitney U test. (P <0.05: significant difference). In order to examine the test ability of UPIII mRNA quantification in urine, an ROC curve was drawn, optimal cut-off values were set, and sensitivity and specificity were determined.

結果
（１）ＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩ、ＵＰＩＩＩダイレクトシークエンシングによるプライマー特異性の検証とＵＰＩＩＩ−Ａの検出
ＶＵＲ組織から得られたｃＤＮＡを対象とし、上記のように、全長ＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩ、ＵＰＩＩＩに対するＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動後、バンドを切り出してダイレクトシークエンシングを行った。シークエンス結果とデータベースに登録された塩基配列との比較から、全てのプライマーが鋳型特異的であることを確認した。ＵＰＩＩＩのＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動では、予測されたバンドよりもやや下方（低分子量域）にもバンドを認めた。ダイレクトシークエンシングの結果、このＰＣＲ産物はＵＰＩＩＩの全６つのエクソンのうち４番目のエクソン（配列番号７の第５２１〜６０３番の領域、８３塩基）を完全に欠損したＵＰＩＩＩのスプライシングバリアント（ＵＰＩＩＩ−Ａ）であることが確認された（配列番号９）。なお、配列番号９の塩基配列においてタンパク質コード領域は第３３〜６７１番であると推定され、コードされるタンパク質は配列番号２６のアミノ酸配列を有するものと推定される。 Results (1) Verification of primer specificity by UPIa, UPIb, UPII, UPIII direct sequencing and detection of UPIII-A For cDNA obtained from VUR tissue, as described above, full-length UPIa, UPIb, UPII, UPIII RT-PCR was performed on the DNA, and after electrophoresis, the band was cut out and subjected to direct sequencing. Comparison of the sequence results with the nucleotide sequences registered in the database confirmed that all primers were template-specific. In agarose gel electrophoresis of the UPIII PCR product, a band was also observed slightly below the expected band (low molecular weight region). As a result of direct sequencing, this PCR product was found to be a UPIII splicing variant (UPIII-) in which the fourth exon (regions 521 to 603 of SEQ ID NO: 7, region 83) of all six exons of UPIII was completely deleted. A) was confirmed (SEQ ID NO: 9). In the base sequence of SEQ ID NO: 9, the protein coding region is presumed to be No. 33 to 671, and the encoded protein is presumed to have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

（２）ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａ特異的プライマーの設計と特異性の検証
ＵＰＩＩＩ−ＦまたはＵＰＩＩＩ−ＡのみをＲＴ−ＰＣＲにて検出するため、それぞれの特異的プライマーの設計と特異性の検証を行った。完全長のＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−ＡをコードするＤＮＡをプラスミドベクターでサブクローニングし、このプラスミドを鋳型としてそれぞれの特異的プライマーを用いたＰＣＲを行った。その結果、ＵＰＩＩＩ−Ａ特異的プライマーはＵＰＩＩＩ−Ａプラスミドには反応したが、ＵＰＩＩＩ−Ｆプラスミドを鋳型としたＰＣＲではバンドは検出されず、ＵＰＩＩＩ−Ｆ特異的プライマーはＵＰＩＩＩ−Ｆプラスミドにのみ反応した。以上から、ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａそれぞれに対するプライマーの特異性が証明された。 (2) Design of UPIII-F and UPIII-A specific primers and verification of specificity In order to detect only UPIII-F or UPIII-A by RT-PCR, design of each specific primer and verification of specificity Went. DNAs encoding full-length UPIII-F and UPIII-A were subcloned with a plasmid vector, and PCR was performed using this plasmid as a template and each specific primer. As a result, the UPIII-A specific primer reacted with the UPIII-A plasmid, but no band was detected by PCR using the UPIII-F plasmid as a template, and the UPIII-F specific primer reacted only with the UPIII-F plasmid. did. From the above, the specificity of the primers for UPIII-F and UPIII-A was proved.

（３）ＶＵＲおよび正常尿路上皮組織におけるウロプラキンｍＲＮＡ発現量の比較
ＶＵＲ患者膀胱上皮組織と正常尿路上皮組織でのＵＰＩＩＩｍＲＮＡ発現量を定量して比較検討するため、ＶＵＲ２０例、正常１１例を対象に定量的ＰＣＲを行った。ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａそれぞれの発現量をコピー数として算出し、同様に定量した各試料のＧＡＰＤＨ発現量で標準化した。その結果、ＶＵＲ組織でのＧＡＰＤＨ １ｎｇあたりのＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−ＡのｍＲＮＡ発現量の平均±ＳＤはそれぞれ５９６９．６０±１７６４２．５０、１２．５１±２６．３５であったのに対し、正常組織ではそれぞれ１３１．１９±１６５．４２、１．３７±２．０４であり、ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａ共にＶＵＲ組織において過剰発現が認められた。２０例のＶＵＲ組織のうち４例は、ＵＰＩＩＩ−Ｆが７０００コピー以上、ＵＰＩＩＩ−Ａが１３コピー以上と異常高値を示したが、これらの特別な４例を除外した比較でもＵＰＩＩＩ−Ｆ、ＵＰＩＩＩ−ＡいずれもＶＵＲ組織において有意に発現が亢進していた（それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＝０．０２３）（表２、図１）。他のウロプラキンについても同様の比較を行ったところ、全てのウロプラキンｍＲＮＡがＶＵＲ組織において過剰発現していることが明らかとなった（表３、図２）。 (3) Comparison of uroplakin mRNA expression levels in VUR and normal urothelial tissues VUR patients were compared with UPIII mRNA expression levels in bladder epithelial tissues and normal urothelial tissues. Quantitative PCR was performed. The expression levels of UPIII-F and UPIII-A were calculated as copy numbers, and normalized by the GAPDH expression level of each sample quantified in the same manner. As a result, mean ± SD of mRNA expression levels of UPIII-F and UPIII-A per ng of GAPDH in VUR tissue was 5969.60 ± 17642.50, 12.51 ± 26.35, respectively. In normal tissues, they were 131.19 ± 165.42 and 1.37 ± 2.04, respectively, and both UPIII-F and UPIII-A were overexpressed in VUR tissues. Of the 20 VUR tissues, 4 showed an abnormally high value of UPIII-F of 7000 copies or more and UPIII-A of 13 copies or more. However, even when these special cases were excluded, UPIII-F and UPIII -A was significantly upregulated in VUR tissues (p <0.0001, p = 0.023, respectively) (Table 2, FIG. 1). Similar comparisons were made with respect to other uroplakin, and it was revealed that all uroplakin mRNA was overexpressed in the VUR tissue (Table 3, FIG. 2).

年齢と尿路上皮採取部位によるウロプラキンｍＲＮＡ発現量の相違についても検証した。成人ＶＵＲ患者と小児ＶＵＲ患者間での発現量の差はなくほぼ同等に過剰発現しており、膀胱正常組織と上部尿路正常組織間での発現量も差を認めなかった。   We also examined the difference in the expression level of uroplakin mRNA depending on age and urinary epithelial collection site. There was no difference in expression level between adult VUR patients and pediatric VUR patients, and there was almost no overexpression, and there was no difference in expression levels between normal bladder tissue and normal upper urinary tract tissue.

（４）ＶＵＲ患者および健常者の尿剥離細胞中ＵＰＩＩＩｍＲＮＡ発現の比較
ＶＵＲ組織においてｍＲＮＡの過剰発現が確認されたＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａについて、尿を検体とした場合も同様に検出可能かどうかを検討した。ＶＵＲ患者尿１８検体および対照となる尿２０検体を対象として、ＵＰＩＩＩ−ＦおよびＵＰＩＩＩ−Ａに対してリアルタイムＰＣＲでの定量を行った。ＶＵＲ１８検体には、白血球５〜１０個／１視野の軽度膿尿を認めた３検体も含め、組織の場合と同様にＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現量で各試料の検出結果を標準化して、それぞれのコピー数を算出した。その結果、ＧＡＰＤＨ １ｎｇあたりのＵＰＩＩＩ−ＦｍＲＮＡ発現量の中央値はＶＵＲおよび対照尿でそれぞれ１９８．６、６３．９、平均±ＳＤはＶＵＲおよび対照尿でそれぞれ４３８．５４±７６３．２０、７０．８±５７．１（ｐ＝０．００４）と、ＶＵＲ尿で統計学的に有意に発現亢進していた。ＵＰＩＩＩ−ＡｍＲＮＡについては中央値がそれぞれ２．３７、２．４８、平均±ＳＤはそれぞれ１３．４５±２９．５６、２．４３±２．５４（ｐ＝０．２７６）であった（表４、図３、４および５）。ＵＰＩＩＩ−ＦｍＲＮＡ発現量の定量値を元にＶＵＲを検出するためのカットオフ値を設定した。ＲＯＣ曲線から得られる至適カットオフ値は９５で、この設定での感度は６６．７％、特異度は８０％であった（陽性検体数：ＶＵＲ １２／１８、対照 ４／２０）。また、ＶＵＲ検体のうち３例の膿尿検体の定量値は、全てカットオフ値以下であった。この結果には、尿路上皮ではない白血球由来のＧＡＰＤＨｍＲＮＡが混入したために偽陰性となっている可能性があるので、これら３例を除けば感度が８０％（陽性検体数：ＶＵＲ １２／１５）になった。 (4) Comparison of UPIII mRNA expression in urinary exfoliated cells of VUR patients and healthy subjects Whether UPIII-F and UPIII-A, in which overexpression of mRNA was confirmed in VUR tissue, could be detected in the same manner when urine was used as a specimen It was investigated. For 18 VUR patient urine samples and 20 control urine samples, UPIII-F and UPIII-A were quantified by real-time PCR. VUR18 specimens, including 3 specimens with 5 to 10 leukocytes / minor visual abscess, were standardized with the GAPDH mRNA expression level as in the case of tissues, and the number of copies was calculated. did. As a result, the median UPIII-F mRNA expression per ng of GAPDH was 198.6 and 63.9 for VUR and control urine, respectively, and the mean ± SD was 438.54 ± 763.20 and 70.70 for VUR and control urine, respectively. It was 8 ± 57.1 (p = 0.004), and the expression was statistically significantly increased in VUR urine. For UPIII-A mRNA, the median values were 2.37 and 2.48, respectively, and the mean ± SD were 13.45 ± 29.56 and 2.43 ± 2.54 (p = 0.276), respectively (Table 4). Figures 3, 4 and 5). A cut-off value for detecting VUR was set based on the quantitative value of UPIII-F mRNA expression level. The optimal cut-off value obtained from the ROC curve was 95. The sensitivity at this setting was 66.7% and the specificity was 80% (number of positive specimens: VUR 12/18, control 4/20). In addition, the quantitative values of the three pyeuria samples out of the VUR samples were all below the cut-off value. This result may be false negative because of the inclusion of GAPDH mRNA derived from leukocytes that are not urothelium, so the sensitivity is 80% except for these 3 cases (number of positive specimens: VUR 12/15) Became.

（実施例２）間質性膀胱炎（ＩＣ）におけるウロプラキンｍＲＮＡ発現量
対象
膀胱粘膜生検で得られたＩＣ患者の膀胱上皮組織４例、および対照となる患者（前立腺肥大症や前立腺癌など、尿路移行上皮に明らかな異常を有しない泌尿器科患者）の尿路上皮組織５例を用いた。標本は採取後、速やかに−８０℃で保存した。 (Example 2) Uroplakin mRNA expression level in interstitial cystitis (IC)
On the urinary tract of 4 bladder epithelial tissues of IC patients obtained by subject bladder mucosa biopsy, and control patients (urological patients with no obvious abnormalities in the urothelial epithelium such as prostatic hypertrophy and prostate cancer) Five skin tissues were used. The specimen was stored at -80 ° C immediately after collection.

方法
ＶＵＲ組織での実験と同じ方法で、ｍＲＮＡの採取とｃＤＮＡの合成およびＵＰＩＩＩ−Ａ特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド加２％アガロースゲルで電気泳動し、可視化したバンドをＬｕｍｉｎｏｕｓ Ｉｍａｇｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ １．２ ｆｏｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（ＡＩＳＩＮ Ｃｏｓｍｏｓ Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．）で取り込んだ後、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏ．）で各バンドを半定量化し、それぞれの試料のＧＡＰＤＨ発現量で標準化した。これらの結果を元にＩＣ組織試料と正常組織試料間でＵＰＩＩＩ−ＡｍＲＮＡ発現量の比較を行った。統計学的解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定で行った（ｐ＜０．０５：有意差あり）。 Method In the same manner as the experiment with VUR tissue, mRNA was collected, cDNA was synthesized, and UPIII-A specific RT-PCR was performed. The PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel supplemented with ethidium bromide, and the visualized band was captured with Luminous Imager version 1.2 for Macintosh (AISIN Cosmos R & D Co.), and then the scion image software (Scion Co.). Was quantified and standardized by the GAPDH expression level of each sample. Based on these results, the expression level of UPIII-A mRNA was compared between the IC tissue sample and the normal tissue sample. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney U test (p <0.05: significant difference).

結果
ＶＵＲ組織の場合と同様に、ＩＣ組織におけるＵＰＩＩＩ−ＡｍＲＮＡ発現量についても検討するため，ＩＣ患者膀胱上皮組織４例と正常尿路上皮組織５例を対象にＵＰＩＩＩ−Ａ特異的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｍＲＮＡ発現量を半定量して比較した。ＧＡＰＤＨで標準化したＵＰＩＩＩ−ＡｍＲＮＡ相対的発現量の平均±ＳＤは、ＩＣ組織と正常組織でそれぞれ９．１０±５．６９、１．４９±１．８８で、ＩＣ組織において有意に発現が亢進していた（ｐ＝０．０１６、図６）。 Results As in the case of VUR tissue, UPIII-A-specific RT-PCR was performed in 4 cases of IC patient bladder epithelial tissue and 5 normal urothelial tissue in order to examine the expression level of UPIII-A mRNA in IC tissue. The amount of mRNA expression was semi-quantified and compared. The mean ± SD of UPIII-A mRNA relative expression standardized by GAPDH is 9.10 ± 5.69 and 1.49 ± 1.88 in IC tissue and normal tissue, respectively, and the expression is significantly enhanced in IC tissue. (P = 0.016, FIG. 6).

以上の結果から、従来から知られていた４種類のウロプラキンファミリーと今回発見したＵＰＩＩＩ新規スプライシングバリアントの全てが、正常組織と比較してＶＵＲ組織で過剰発現していることが確認された。また定量的ＰＣＲ法によって、尿を対象としてもｍＲＮＡの定量が可能であり、組織での結果を反映してＶＵＲ患者の尿剥離細胞中でも統計学的に有意に過剰発現していた。これらのことから、尿剥離細胞中のウロプラキンｍＲＮＡ発現量の検出、特にＵＰＩＩＩ−Ｆ発現量の検出が、ＶＵＲ患者の尿を用いた簡便なスクリーニング法として有用であることが明らかとなった。   From the above results, it was confirmed that all of the four types of uroplakin families known so far and the UPIII novel splicing variant discovered this time were overexpressed in VUR tissues compared to normal tissues. Furthermore, mRNA can be quantified even in urine by a quantitative PCR method, and it was statistically significantly overexpressed in urine exfoliated cells of VUR patients reflecting the results in tissues. From these facts, it was revealed that the detection of uroplakin mRNA expression level in urinary exfoliated cells, particularly detection of UPIII-F expression level, is useful as a simple screening method using urine of VUR patients.

また、ＩＣ患者膀胱上皮組織でもＵＰＩＩＩｍＲＮＡの過剰発現が認められたことから、尿を用いた簡便なスクリーニング法として、ＩＣ患者でも尿剥離細胞中のウロプラキンｍＲＮＡ発現量の検出が有用であることが明らかとなった。   Moreover, since UPIII mRNA overexpression was also observed in IC patient's bladder epithelial tissue, it is clear that detection of uroplakin mRNA expression level in urinary exfoliated cells is also useful as a simple screening method using urine. It became.

組織でのウロプラキンＩＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The expression level of uroplakin III mRNA in the tissue is shown. 組織でのウロプラキンＩａ、ＩｂおよびＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The expression levels of uroplakin Ia, Ib and II mRNA in the tissue are shown. 尿剥離細胞中のウロプラキンＩＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The mRNA expression level of uroplakin III in urine exfoliated cells is shown. 尿剥離細胞中の完全型ウロプラキンＩＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The mRNA expression level of complete uroplakin III in urine exfoliated cells is shown. 尿剥離細胞中のバリアントウロプラキンＩＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The mRNA expression level of variant uroplakin III in urine exfoliated cells is shown. 間質性膀胱炎組織でのウロプラキンＩＩＩのｍＲＮＡ発現量を示す。The mRNA expression level of uroplakin III in interstitial cystitis tissue is shown.

Claims (9)

被検体由来の試料中のウロプラキンの発現を検出することを含み、ウロプラキンの発現量が亢進しているか検査することを特徴とする、膀胱尿管逆流症の検査方法。 A method for examining vesicoureteral reflux disease , comprising detecting the expression of uroplakin in a sample derived from a subject, and examining whether the expression level of uroplakin is increased . ウロプラキンがウロプラキンＩＩＩである請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the uroplakin is uroplakin III. 被検体由来の試料中のウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを検出することによりウロプラキンの発現量を検出する請求項１または２記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the expression level of uroplakin is detected by detecting a polynucleotide encoding uroplakin in a sample derived from a subject. ウロプラキンをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマーまたはウロプラキンをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてウロプラキンの発現量を検出する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 A continuous oligonucleotide primer having a length of at least 15 bases for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin or a continuous polynucleotide probe having a length of at least 15 bases that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding uroplakin The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the expression level of uroplakin is detected by using the method. 被検体由来の試料が尿である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the sample derived from the subject is urine. 被検体由来の試料中のウロプラキンＩＩＩの発現を検出し、ウロプラキンＩＩＩの発現量が亢進しているか検査することを特徴とする、間質性膀胱炎の検査方法。A test method for interstitial cystitis characterized by detecting the expression of uroplakin III in a sample derived from a subject and examining whether the expression level of uroplakin III is increased. 被検体由来の試料中のウロプラキンＩＩＩをコードするポリヌクレオチドを検出することによりウロプラキンＩＩＩの発現量を検出する請求項６記載の方法。The method according to claim 6, wherein the expression level of uroplakin III is detected by detecting a polynucleotide encoding uroplakin III in a sample derived from a subject. ウロプラキンＩＩＩをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマーまたはウロプラキンＩＩＩをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブを用いてウロプラキンＩＩＩの発現量を検出する請求項６または７記載の方法。A continuous oligonucleotide primer of at least 15 bases in length for specifically amplifying a polynucleotide encoding uroplakin III or a continuous polynucleotide of at least 15 bases in length that specifically hybridizes to a polynucleotide encoding uroplakin III The method according to claim 6 or 7, wherein the expression level of uroplakin III is detected using a probe. 被検体由来の試料が尿である請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。The method according to any one of claims 6 to 8, wherein the sample derived from the subject is urine.

Images