JP4571643B2 - 改良された重亜硫酸塩によるdnaの変換 - Google Patents
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Description
重亜硫酸塩による変換は0〜95℃の広い温度範囲で行うことができる(上記参照)。しかしながら、高い温度では、DNAの変換と分解の両方の程度が上昇するので、好ましい態様としては、反応温度を30〜70℃とする。特に好ましい範囲は45〜60℃であり、最も好ましくは50〜55℃である。重亜硫酸塩処理の最も好ましい反応時間は反応温度によって決まる。通常、反応温度は1〜18時間である(Grunau et al. 2001, loc. cit.参照)。反応時間は、一般には、50℃の反応温度に対し、4〜6時間である。
実施例1:
重亜硫酸塩反応の自動伝導
ゲノムDNAサンプルであるファクターVIII遺伝子に対して、シトシンのメチル化状態を検出する方法の適用を本実施例で述べる。該ゲノムDNAサンプルは、業者の説明書に従って制限エンドヌクレアーゼで処理している。該方法では、交換可能なピペットチップのための垂直に動く4つの独立したアダプターを備えた自動ピペットシステム(MWG RoboSeq 4204)を使用し、それにより、交差汚染を排除している。該ピペットシステムによって、±2μl 以下の誤差で100μl[アリコート]をピペットすることができる。自動ピペットシステムの作動プレートには、2つは冷却することができる、ピペットチップとピペットする8つの位置のためのラック、冷却することができる試薬ラック、10個のマイクロタイタープレートのためのスタッキングシステム、ピペットチップ洗浄ステーション、及びアダプターからピペットチップを分離するための装置が設けられている。
自動ピペットシステムは、シリアルインターフェイスによりコンピューターと接続しており、また、ソフトウエアプログラムでコントロールされており、これにより、本発明方法の適用に必要な全てのピペット工程を自由にプログラミングできる。
重亜硫酸塩処理の後、マイクロタイタープレートをサーモサイクラーから自動ピペットシステムに移動させる。次いで、同様のタイプの第2マイクロタイタープレートを配置する。最初に、基礎のTris−HClバッファー(pH9.5)及び、その次にアリコートの重亜硫酸塩処理DNAを、全てのチャンバーにある第2マイクロタイタープレートの、重亜硫酸塩処理DNAを含む第1マイクロタイタープレートの位置に対応する位置に移動させる。非メチル化シトシン残基の重亜硫酸塩反応生成物は、上記基礎溶液中でウラシル残基に変換する。
重亜硫酸塩処理DNAの1本鎖(本実施例ではセンス鎖)の標的増幅をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にて行う。タイプ1のプライマーのペア(AGG GAG TTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A ( SEQ. ID: 1) 及びTAA TCC CAA AAC CTC TCC ACT ACA ACA A ( SEQ. ID: 2) を使用する。これにより、重亜硫酸塩処理したDNA鎖の特異的増幅が可能になる。非メチル化シトシン残基がウラシル残基に変換しなかったか、又は不完全に変換したDNA鎖は特異的増幅はされない。PCR反応のため、同様のタイプの第3マイクロタイタープレートを自動ピペットシステムに配置する。第1マイクロタイタープレートの対応する位置に重亜硫酸塩処理DNAを含む全てのチャンバーに、PCRバッファー、DNAポリメラーゼ、及びタイプ1のプライマーを含むアリコートのストック溶液を最初に自動的にピペットする。その後、PCR反応を行うために第3のマイクロタイタープレートをサイクラーに移動させる前に、アリコートの希釈重亜硫酸塩処理DNAを第2マイクロタイタープレートから第3マイクロタイタープレートの対応する位置に移動させる。PCR産物はアガロースゲル電気泳動及びその後の臭化エチジウムによる染色で同定する(図1)。図1は、PCRで増幅した重亜硫酸塩処理DNA鎖のゲルイメージを示す(左:分子量マーカー、右:PCR産物)。
重亜硫酸塩を用いる最適化した方法によって、体液から得たDNAに対する高感度のメチル化解析ができることを示す。この目的のため、1mlのヒト血漿と特定量のヒトDNAを混合した。Magna Pure法(ロシュ)を業者の説明書に従って行うことにより、該DNAを血漿サンプルから分離した。精製によって得た100μlの溶離液を以下の重亜硫酸塩反応に使用した。標準的方法(Frommer et al., loc. cit.)に基づく変換をコントロールとして行った。本発明方法の手順は以下のとおりであった。該溶離液を354μlの重亜硫酸塩溶液(5.89mol/l)及びラジカルスカベンジャー(6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン2−カルボン酸、ジオキサン2.5ml中98.6mg)を含む146μlのジオキサンと混合した。該反応混合物を3分間、99℃で変性し、次いで、以下の温度プログラムに従って合計5時間インキュベートした。50℃で3時間、1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で1.5時間;1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で3時間。次いで、コントロール及び本発明方法に係る反応混合物を、Millipore Microcon(商標)カラムを用いた限外ろ過により精製した。該精製は本質的に業者の説明書に従って行った。この目的のため、上記反応混合物を300μlの水と混合し、限外ろ過膜に載せ、15分間遠心分離し、次いで、1×TEバッファーで洗浄した。この処理で、DNAは上記膜に残る。その後、脱スルホン化を行った。この目的のため、0.2mol/l のNaOHを添加し、10分間インキュベートした。その後、遠心分離(10分間)を行い、次いで1×TEバッファーで洗浄した。この後、DNAを溶離した。この目的のため、上記膜を10分間、50μlの暖かい1×TEバッファー(50℃)と混合した。上記膜は業者の説明書に従い回転させた。次いで、遠心分離を再度行って、該膜からDNAを除去した。そして、10μlの溶離液を、Lightcycler Real Time PCRに用いた。ヒトベータアクチン遺伝子の領域を解析した(Miyamoto: Nucleotide sequence of the human beta-actin promoter 5' flanking region; Nucleic Acids Res. 15 (21), 9095(1987) 参照)。以下のプライマー及びプローブを使用した。フォワードプライマー:TGG TGA TGG AGG AGG TTT AGT AAG T (SEQ ID 3) ; リバースプライマー:AAC CAA TAA AAC CTA CTC CTC CCT TAA (SEQ ID 4) ; ドナープローブ:TTG TGA ATT TGT GTT TGT TAT TGT GTG TTG −flou (SEQ ID 5) ;アクセプタープローブ:LC Red640−TGG TGG TTA TTT TTT TTA TTA GGT TGT GGT−Phos (SEQ ID 6)。増幅は重亜硫酸塩特異的アッセイにより行った。蛍光シグナルを検出し、Lightcycleソフトウエアで計算した。変換DNAと分離DNAの量は、キャリブレーション曲線を用いて比較することにより定量した。最適化した方法では、DNA濃度は133.21ng/100μlとなったのに対し、従来方法では濃度は41.03ng/100μlとなった。したがって、本発明方法により、従来方法よりも3倍高い収率を得ることが可能になった。
重亜硫酸塩を用いる最適化した方法によって、体液から得たDNAに対する高感度のメチル化解析ができることを示す。この目的のため、1mlのヒト血漿と特定量のヒトDNAを混合した。Magna Pure法(ロシュ)を業者の説明書に従って行うことにより、該DNAを血漿サンプルから分離した。該精製によって得た100μlの溶離液を以下の重亜硫酸塩反応に使用した。標準的方法(Frommer et al., loc. cit.)に基づく変換をコントロールとして行った。本発明方法の手順は以下のとおりであった。上記溶離液を354μlの重亜硫酸塩溶液(5.89mol/l)及びラジカルスカベンジャー(6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン2−カルボン酸、DME787μl中98.6mg)を含む46μlのDMEと混合した。該反応混合物を3分間、99℃で変性し、次いで、以下の温度プログラムに従って合計5時間インキュベートした。50℃で30分間、1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で1.5時間;1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で3時間。次いで、コントロール及び本発明方法に係る反応混合物を、Millipore Microcon(商標)カラムを用いた限外ろ過により精製した。該精製は本質的に業者の説明書に従って行った。この目的のため、上記反応混合物を300μlの水と混合し、限外ろ過膜に載せ、15分間遠心分離し、次いで、1×TEバッファーで洗浄した。この処理で、DNAは上記膜に残る。その後、脱スルホン化を行った。この目的のため、0.2mol/lのNaOHを添加し、10分間インキュベートした。その後、遠心分離(10分間)を行い、次いで1×TEバッファーで洗浄した。この後、DNAを溶離した。この目的のため、上記膜を10分間、50μlの暖かい1×TEバッファー(50℃)と混合した。該膜は業者の説明書に従い回転させた。次いで、遠心分離を再度行って、該膜からDNAを除去した。そして、10μlの溶離液をLightcycler Real Time PCRに用いた。ヒトベータアクチン遺伝子の領域を、実施例2に記載したプライマー及びプローブを使用して解析した。増幅は重亜硫酸塩特異的アッセイにより行った。Lightcyclerソフトウエアで計算した結果を図2に示す。左の曲線は最適化した方法であり、右の曲線は従来方法である。最適化した方法では、サイクルが少ない数であっても、重要な蛍光シグナルが発生することが示されている。DNA収率はこのように従来方法よりも高い。変換DNAの量はキャリブレーション曲線を用いて比較することにより定量することができる。最適化した方法では、DNA濃度は133.27ng/100μlとなったのに対し、従来方法では濃度は41.03ng/100μlとなった。したがって、本発明方法により、従来方法よりも3倍高い収率を得ることが可能になった。
サーモスパイクを導入した重亜硫酸塩による変換
2μlのddH2Oを、MssI(Promega;160ng)で消化した非常に純度の高いヒトDNA1μlと混合した。該サンプルを96℃で10分間変性した。その後、約10μlの重亜硫酸塩溶液(5.85mol/l)及び7μlのラジカルスカベンジャー/ジオキサン混合物(5μlのジオキサンプラス2μlのスカベンジャー)を添加した。この後、第1サンプル(0h値)を除去し、氷上に配置した。該反応混合物を96℃で30秒間インキュベートし、その後、50℃で59.5分間インキュベートした。第2サンプル(1h値)を除去し、氷上に配置した。第3サンプル(2h値)を再び96℃で30秒間、また、50℃で59.5分間インキュベートした。次いで、このサンプルも氷上に配置した。第4サンプル(3h値)を再び96℃で30秒間及び50℃で59.5分間インキュベートし、次いで、同様に冷却した。30μlのddH2Oを上記サンプルに添加した。上記反応混合物をG25 Sephadexカラムで精製した。該溶離液を50μlの100mmol/l Tris−HCl(pH9.5)と混合し、96℃で20分間、脱スルホン化した。この溶液2μlを各PCR反応に用いた。2つの重亜硫酸塩特異的断片、2つの非特異的断片及びゲノム断片を、それぞれPCRにて増幅した。重亜硫酸塩特異的断片は、重亜硫酸塩による変換が進行するほど、より多く増幅される。非特異的断片は重亜硫酸塩による変換とは独立して増幅し、DNA分解の兆候を示す。ゲノム断片は、重亜硫酸塩で変換していないゲノム断片が存在している場合だけに限り増幅する。このように、ゲノムDNAの増幅は、重亜硫酸塩による不完全な変換を測定することになる。アガロースゲルで分離した増幅物を図3に示す。本発明方法では、大部分のDNAが1時間後でさえ、変換していることが示されている。最も遅くとも3時間後には、ゲノムDNAを、もはや検出することができない。すなわち、重亜硫酸塩による変換は終了している。従来の重亜硫酸塩処理では、相当する値は早くとも5時間後に得られる(下記参照)。
サーモスパイクを有する重亜硫酸塩処理とサーモスパイクを有しない重亜硫酸塩処理の比較
実施例4で処理したサンプルを、2つのサーモスパイクで、3又は5時間の反応時間インキュベートした。コントロールはサーモスパイクなしで反応させた。精製及びPCRは下記のとおり行った。2つの重亜硫酸塩特異的断片を増幅した。そのうちの1つの断片はシトシンに富むものであった。したがって、完全に変換するには比較的長い反応時間が必要であった。対照的に、他方の断片はシトシンに乏しいものであり、そのため、比較的短い時間の後、完全に変換した。増幅の結果を図4に示す。従来の重亜硫酸塩変換は左側の図であり、サーモスパイクを有する最適化された変換は右側の図である。シトシンに富む断片は各時間左側にプロットし、シトシンに乏しい断片は右側にプロットしている。それには、本発明方法により、明らかに感度の高い検出ができることが示されている。したがって、シトシンに富む断片はサーモスパイク処理により、わずか3時間後には、はっきりと検出することができるのに対し、従来処理では、5時間の反応時間後であっても検出することができない。
本発明方法により、非常に効果的な重亜硫酸塩による変換及び精製が可能となることを示す。この目的のため、種々の量のM13−DNAとヒトDNAを100μlの水に溶解した。該DNA溶液を354μlの重亜硫酸塩溶液(5.89mol/l)及びラジカルスカベンジャー(6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン2−カルボン酸、2.5mlのジオキサン中に98.6mg)を含む146μlのジオキサンと混合した。該反応混合物を99℃で3時間変性し、次いで、以下の温度プログラムにて合計5時間インキュベートした。50℃で30分間;1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で1.5時間;1つのサーモスパイク(99.9℃)で3分間;50℃で3時間。次いで、該反応混合物をMillipore Microcon(商標)カラムによる限外ろ過によって精製した。該精製は本質的に業者の説明書に従って行った。この目的のため、該反応混合物を300μlの水と混合し、限外ろ過膜に載せ、15分間遠心分離し、次いで、1×TEバッファーで洗浄した。この処理で上記膜にDNAが残る。その後、脱スルホン化を行う。この目的のため、0.2mol/lのNaOHを添加し、10分間インキュベートした。そして、遠心分離(10分)を行った後、1×TEバッファーによる洗浄工程を行った。その後、該DNAを溶離した。この目的のため、上記膜を50μlの暖かい1×TEバッファー(50℃)と10分間混合した。業者の説明書に従って上記膜を回転させた。次いで、再度遠心分離を行い、それにより、上記膜からDNAを除去した。そして、該DNAの濃度を蛍光的に決定した(オリーブグリーン)。データを表1に示す。DNAの回収率は少なくとも75%である。公知の重亜硫酸塩によるDNA変換及び精製方法では、対照的に、回収率は25%以下である。
Claims (14)
- a)DNAが組織サンプル又は採取した体液から抽出される工程、
b)該DNAが重亜硫酸塩により変換される工程、
c)該変換DNAが限外ろ過で精製される工程、
が行われることを特徴とする、患者又は個人に対する、癌、望まない薬物相互作用、心臓の疾患、又は炎症の診断および/または予測のための重亜硫酸塩によるDNAの変換方法。 - 上記化合物に、n−アルキレングリコール化合物が含まれることを特徴とする請求項2に記載のDNAの変換方法。
- 上記化合物に、ジアルキルエーテルが含まれることを特徴とする請求項3に記載のDNAの変換方法。
- 上記化合物に、ジエチレングリコールジメチルエーテル(DME)が含まれることを特徴とする請求項4に記載のDNAの変換方法。
- 上記化合物が、1〜35体積%の濃度で存在していることを特徴とする請求項2〜5のいずれか1項に記載のDNAの変換方法。
- 上記化合物が、5〜25体積%の濃度で存在していることを特徴とする請求項2〜5のいずれか1項に記載のDNAの変換方法。
- 単離したゲノムDNAを重亜硫酸塩試薬と反応させる、重亜硫酸塩によるDNAの変換の反応を0〜80℃の温度範囲で行い、該反応温度を、変換の間に短い時間85〜100℃の範囲に上昇させる(サーモスパイク)ことを特徴とする請求項1に記載のDNAの変換方法。
- 短い時間の温度上昇(サーモスパイク)の数が2〜5であることを特徴とする請求項8に記載のDNAの変換方法。
- 短い時間の温度上昇(サーモスパイク)の間、反応温度が85〜100℃に上昇することを特徴とする請求項8に記載のDNAの変換方法。
- 短い時間の温度上昇(サーモスパイク)の間、反応温度が90〜98℃に上昇することを特徴とする請求項10に記載のDNAの変換方法。
- 変換DNAを磁気粒子で精製することを特徴とする請求項8に記載のDNAの変換方法。
- 変換DNAをMSP、Heavy Methyl、MsSNuPE、Methyl Lightのうちのいずれかの方法で解析することを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載のDNAの変換方法。
- 重亜硫酸塩によるDNAの変換の反応が、ジオキサン、その誘導体、及び類似の脂肪族環式エーテルからなる群から選択された化合物の存在下で行われることを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載のDNAの変換方法。
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