JP4570949B2 - Method for producing yeast-derived glucan - Google Patents
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Description
本発明は、酵母由来グルカンの製造方法に係り、特に、水を電気分解して得られるアルカリ性電解水を処理媒体として用いて、酵母細胞壁から多糖類であるβ−グルカンを製造する、改良された方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing yeast-derived glucan, and in particular, improved β-glucan, which is a polysaccharide, from yeast cell walls using alkaline electrolyzed water obtained by electrolyzing water as a treatment medium. It is about the method.
β−グルカンは、糖の成分が高分子結合した物質であり、免疫力向上作用や、抗腫瘍作用、コレステロール低減作用、抗ウイルス作用、白血球増加作用等、数多くの有用な生理的作用を有していることが報告されており、近年においては、健康食品や医薬品等として、注目を浴びている。 β-glucan is a substance in which sugar components are polymer-bonded, and has many useful physiological effects such as immunity enhancing action, antitumor action, cholesterol reducing action, antiviral action, leukocyte increasing action, etc. In recent years, it has been attracting attention as a health food, medicine, and the like.
ところで、上記したβ−グルカンは、酵母菌の細胞壁等に含まれており、そのような酵母の細胞壁から、β−グルカン等の多糖類を得る各種の手法が、これまでに、数多く提案されてきている。例えば、特開２００３−１９７号公報（特許文献１）には、酵母に対して、蛋白質分解酵素、特にグルカナーゼ活性総量が少ない酵素剤を作用させて、酵母を溶菌させることにより、生理活性の高いインタクトな状態のβ−グルカンを多く含む多糖類含有組成物を得る技術が、明らかにされている。更に、特開２００２−２０９５９８号公報（特許文献２）には、高圧ホモジナイザーを用いて酵母を物理的に破壊した後、自己消化処理を施し、次いで、洗浄した酵母細胞壁画分に、細胞壁溶解酵素を作用させて、可溶性の多糖を得る手法が提案されており、これによって、β−グルカンを多く含む可溶性多糖が、高収率で製造され得ることが明らかにされている。 By the way, the above-mentioned β-glucan is contained in the cell wall of yeast, etc., and various methods for obtaining polysaccharides such as β-glucan from such a cell wall of yeast have been proposed so far. ing. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-197 (Patent Document 1) discloses that a yeast has a high physiological activity by lysing yeast by acting a proteolytic enzyme, particularly an enzyme agent having a small total amount of glucanase activity. A technique for obtaining a polysaccharide-containing composition containing a large amount of intact β-glucan has been clarified. Further, JP 2002-209598 A (Patent Document 2) discloses that yeast is physically disrupted using a high-pressure homogenizer, self-digested, and then washed into a cell wall lysate. A method for obtaining a soluble polysaccharide by acting is proposed, and it has been clarified that a soluble polysaccharide containing a large amount of β-glucan can be produced in a high yield.
また、特表平１１−５０８７７２号公報（特許文献３）には、ｐＨ５〜６及び３５〜６０℃の温度で、６〜４８時間、微生物細胞を自己消化して得られる生成物から、固体材料を分離することによって、β−グルカン−マンナン調製物を得る手法が、明らかにされている。加えて、特表平１１−５００１５９号公報（特許文献４）には、キチンを含有する微生物を、アルカリ溶液で処理した後、得られた生成物を希鉱酸で処理し、更に、アルカリ度の高いアルカリ溶液で処理することによって、部分的な脱アセチル化を施して、キトサン−グルカン複合体を調製する方法が、明らかにされている。 Further, in Japanese Patent Publication No. 11-508772 (Patent Document 3), a solid material is obtained from a product obtained by self-digesting microbial cells at pH 5-6 and 35-60 ° C. for 6-48 hours. A technique for obtaining a β-glucan-mannan preparation by separating In addition, in Japanese Patent Publication No. 11-500159 (Patent Document 4), after treating a microorganism containing chitin with an alkaline solution, the resulting product is treated with a dilute mineral acid. A method for preparing a chitosan-glucan complex by partial deacetylation by treatment with a high alkaline solution is disclosed.
さらに、特表平９−５１２７０８号公報（特許文献５）には、グルカンを含有する酵母細胞を、適切な抽出用水性アルカリ溶液や、加水分解用酸、エタノール等を、それぞれ用いて、不溶性β−（１，３）−グルカン粒子を調製することが、明らかにされている。加えて、特開平９−３２２７９５号公報（特許文献６）には、酵母等の水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体の含有溶液を、特定の濃度の酸化物とかかる溶液のｐＨを１０〜１２．５にする水酸化物とで同時に処理することにより、生産菌の細胞破壊、脱色及び粘度低下が同時に実現されて、水不溶性グルカンが効率的に精製され得ることが、明らかにされている。 Further, JP-A-9-512708 (Patent Document 5) discloses that glucan-containing yeast cells are dissolved in an insoluble β-form using an appropriate aqueous alkaline solution for extraction, hydrolyzing acid, ethanol, or the like. It has been shown to prepare-(1,3) -glucan particles. In addition, Japanese Patent Laid-Open No. 9-322795 (Patent Document 6) discloses a solution containing microbial cells containing a water-insoluble glucan such as yeast as a constituent, an oxide having a specific concentration, and a pH of such a solution of 10. It has been clarified that by simultaneously treating with a hydroxide of ˜12.5, cell destruction, decolorization and viscosity reduction of the producing bacteria can be realized at the same time, and water-insoluble glucan can be purified efficiently. Yes.
しかしながら、上述せるように、アルカリや酸、有機溶媒を用いてグルカンを得る手法においては、中和処理や脱塩処理等を行なう必要があり、製造工程が煩雑となる他、食品としての安全性の面からも不安が残るものであり、更には、収率の面でもあまり良好であるとは言い難いものであった。また、酵素剤を用いる手法では、酵素剤に含まれるアミラーゼ等によって、グルカンが分解されてしまう恐れがあり、効能の高い長鎖のグルカンを得ることが難しいといった問題があった。更にまた、かかる手法で得られるグルカンにあっては、酵母細胞内の脂質分を充分に除去することが出来ず、そのような脂質の酸化によって、得られる製品が着色したり、酸化異臭が惹起される恐れも内在するものであった。 However, as described above, in the method of obtaining glucan using an alkali, an acid, or an organic solvent, it is necessary to perform a neutralization treatment, a desalting treatment, and the like. However, it was difficult to say that the yield was very good. In addition, the method using an enzyme agent has a problem that glucan may be decomposed by amylase contained in the enzyme agent, and it is difficult to obtain a long-chain glucan having high efficacy. Furthermore, in the glucan obtained by such a method, the lipid content in the yeast cells cannot be sufficiently removed, and oxidation of such lipids causes the resulting product to be colored or cause an odor. The fear of being done was also inherent.
このため、本発明者等は、従来の如く、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属の水酸化物を用いることなく、安全性が高く且つ酸化異臭を発生することのないグルカンを簡便に製造することの出来る手法を確立すべく、鋭意検討を重ねた結果、酵母細胞からグルカンを取り出す方法において、物理的に破砕した酵母を、その細胞内酵素で自己消化する際や、酵素を添加して蛋白質を分解せしめる際に、媒体として、水道水等の水を電気分解することによって得られる電解水（電解生成水）、中でも、陰極側に生成されるアルカリ性の水（以下、アルカリ性電解水と呼称する）を用いることにより、酸化による着色や酸化異臭のないグルカンを、有利に製造できることを見出し、先に、国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１５９２として、酵母由来グルカンの製造方法を提案した。 Therefore, the inventors of the present invention can easily produce a glucan that is highly safe and does not generate a bad odor without using an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide as in the prior art. As a result of intensive investigations to establish a method that can be performed, in the method of removing glucan from yeast cells, when physically crushed yeast is self-digested with its intracellular enzymes, or when enzymes are added to degrade proteins When the solution is used, electrolyzed water (electrolytically generated water) obtained by electrolyzing water such as tap water as a medium, especially alkaline water (hereinafter referred to as alkaline electrolyzed water) generated on the cathode side. As a result, it has been found that glucan free from coloring due to oxidation or oxidative off-flavor can be produced advantageously. First, as international application number: PCT / JP2004 / 001592 We proposed a method for producing a yeast-derived glucan.
そして、そのような本発明者等の提案になる酵母由来グルカンの製造方法にあっては、アルカリ性電解水中において、破砕された酵母の細胞内酵素による自己消化処理や、アルカリ性プロテアーゼによる酵素処理（蛋白質分解処理）が行なわれることとなるところから、酵母細胞を構成する蛋白質成分が、効果的に分解せしめられ得ると共に、アルカリ性電解水による洗浄効果乃至は界面活性効果が有利に発現され、以て、酵母細胞内の脂質や他の不要な成分がアルカリ性電解水中に効果的に溶解されたり、エマルジョン化されて、目的とするグルカンとの分離が良好に行なわれることとなる。そして、このように、アルカリ性電解水中にグルカン以外の他の成分が溶出せしめられることにより、固形分として残るグルカンから、蛋白質や脂質等の他の成分が効果的に取り除かれて、得られるグルカンの純度が向上せしめられ得るのである。しかも、アルカリ性電解水は、アルカリ性を呈すると共に、酸化還元電位が低く、還元力を有しているところから、処理操作中において、脂質の酸化等が惹起されることもなく、従って、脂質の酸化によって招来される着色や酸化異臭の発生も有利に抑制乃至は防止され得る、等の格別の作用乃至は効果が奏され得ることが明らかとなったのである。 In the yeast-derived glucan production method proposed by the present inventors, self-digestion treatment with intracellular enzymes of yeast disrupted in alkaline electrolyzed water, enzyme treatment with alkaline protease (protein The protein component constituting the yeast cell can be effectively decomposed, and the washing effect or the surface-active effect by the alkaline electrolyzed water is advantageously expressed. Lipids and other unnecessary components in the yeast cells are effectively dissolved or emulsified in alkaline electrolyzed water, so that separation from the target glucan can be carried out satisfactorily. Thus, by eluting other components other than glucan in alkaline electrolyzed water, other components such as proteins and lipids are effectively removed from the remaining glucan as a solid content, and the glucan obtained is obtained. The purity can be improved. Moreover, alkaline electrolyzed water exhibits alkalinity, has a low redox potential, and has a reducing power, so that lipid oxidation or the like is not induced during the treatment operation. It has been clarified that special effects or effects such as the occurrence of coloring and off-flavor odors caused by the above can be advantageously suppressed or prevented.
しかしながら、本発明者等が、この先に提案に係る酵母由来グルカンの製造方法について更に検討を進めた結果、そのような方法によって得られる最終的なグルカン製品は、今一つその純度が充分でなく、蛋白質含有量において、５％程度とすることは出来るものの、それよりも低含有量、例えば蛋白質の含有量が２％以下、更には１％以下にまで低減されたグルカン製品を得ることは、極めて困難であるものであった。しかして、β−グルカンの機能乃至は特性をより一層有効に発揮せしめ、また、様々な用途において有利に使用され得るようにするために、前述の如き製造方法に従って得られる酵母由来グルカン製品の純度を更に高めることは、極めて有用なことである。 However, as a result of further investigations on the production method of the yeast-derived glucan proposed by the present inventors, the final glucan product obtained by such a method is not sufficient in purity. Although the content can be about 5%, it is extremely difficult to obtain a glucan product having a lower content, for example, a protein content of 2% or less, further reduced to 1% or less. It was what was. Accordingly, the purity of the yeast-derived glucan product obtained according to the production method as described above in order to make the function or characteristic of β-glucan more effective and be used advantageously in various applications. It is extremely useful to further increase.
ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであって、その解決課題とするところは、極めて純度の高い酵母由来グルカンを有利に製造することの出来る方法を提供することにある。 Here, the present invention has been made in the background of such circumstances, and the problem to be solved is to provide a method capable of advantageously producing extremely pure yeast-derived glucan. is there.
そして、本発明者等は、そのような課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、酵母の物理的な磨砕工程と、その磨砕物を自己消化・酵素処理して得られるものの洗浄工程とに、それぞれ工夫を加えると共に、その得られた洗浄処理物に対する希酸処理工程を、更に採用することによって、得られる酵母由来グルカン（β−グルカン）の純度を極めて高め得ることを見出したのである。 And, as a result of intensive studies to solve such problems, the present inventors, as a result, a physical grinding process of yeast, and a washing process of what is obtained by self-digestion and enzymatic treatment of the ground product In addition, they have found that the purity of the yeast-derived glucan (β-glucan) obtained can be greatly enhanced by further employing a dilute acid treatment step for the obtained washed product, respectively. .
従って、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、（ａ）水を電気分解して得られるアルカリ性電解水を磨砕媒体として用い、これに酵母を加えて冷却しつつ、かかる酵母を物理的に磨砕する工程と、（ｂ）該磨砕工程で得られる磨砕物を、上記と同様なアルカリ性電解水の存在下、前記酵母の細胞内酵素による自己消化処理に加えて、アルカリ性プロテアーゼを用いて酵素処理する工程と、（ｃ）かかる磨砕物の酵素処理されたものを、ｐＨが１１以上、酸化還元電位が−８００ｍＶよりも低い強アルカリ性電解水にて洗浄する工程と、（ｄ）該洗浄工程で得られる洗浄処理物を、希酸水溶液にて接触、処理して、高純度グルカンを得る工程とを、含むことを特徴とする酵母由来グルカンの製造方法にある。 Accordingly, the present invention has been completed based on such knowledge, and the gist thereof is that (a) alkaline electrolyzed water obtained by electrolyzing water is used as a grinding medium, and yeast is used for this. And (b) a ground product obtained by the grinding step in the presence of alkaline electrolyzed water as described above in the presence of alkaline electrolyzed water. In addition to the self-digestion treatment by the above, an enzyme treatment step using an alkaline protease, and (c) a strong alkaline electrolysis of such a ground product that has been subjected to enzyme treatment, having a pH of 11 or higher and a redox potential lower than −800 mV A yeast-derived product comprising: a step of washing with water; and (d) a step of obtaining a high-purity glucan by contacting and treating the washed product obtained in the washing step with a dilute aqueous acid solution. Glucan production There is the law.
なお、このような本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法の望ましい態様の一つによれば、前記磨砕工程は、不活性雰囲気下において実施され、これによって、アルカリ性電解水に配合された酵母が、大気中の酸素に触れることが阻止されて、その酸化が効果的に抑制乃至は防止され得ることとなる。 In addition, according to one of the desirable embodiments of the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, the grinding step is performed in an inert atmosphere, whereby the yeast mixed in the alkaline electrolyzed water is obtained. Then, contact with oxygen in the atmosphere is prevented, and the oxidation can be effectively suppressed or prevented.
また、かかる本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法の望ましい態様の他の一つによれば、前記磨砕される酵母が、不活性ガスの液化物に接触せしめられて、凍結されている状態において、前記磨砕操作が、進行せしめられることとなる。このように、酵母が凍結されて、磨砕せしめられることにより、その磨砕操作をより一層容易に行なうことが出来るのである。更にまた、有利には、不活性ガスの極く低温の液化物を添加して、その存在下において、磨砕操作が行なわれることにより、前記した酵母とアルカリ性電解水との配合物の冷却が、効果的に為され得ると共に、酵母やその磨砕物の大気（空気）からの遮断を、そのような液化物から気化する不活性ガスにて、効果的に実現することが出来るのである。 According to another preferred embodiment of the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, the yeast to be ground is brought into contact with an inert gas liquefaction and frozen. The grinding operation is allowed to proceed. Thus, the yeast can be frozen and ground, so that the grinding operation can be performed more easily. Furthermore, advantageously, a very low temperature liquefied product of an inert gas is added, and a grinding operation is performed in the presence of the liquefied product so that the mixture of yeast and alkaline electrolyzed water can be cooled. In addition to being able to be done effectively, the shielding of the yeast and its ground product from the atmosphere (air) can be effectively realized with an inert gas that vaporizes from such a liquefied product.
そして、本発明にあっては、有利には、そのような不活性ガスの液化物としては、液体窒素が用いられるのであり、更に、かかる磨砕によって、粒径が１〜３０μｍの酵母磨砕物が有利に形成されることとなる。 In the present invention, liquid nitrogen is advantageously used as the liquefied product of such an inert gas. Further, by this grinding, the yeast ground product having a particle size of 1 to 30 μm is used. Is advantageously formed.
また、本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法の他の望ましい態様においては、前記強アルカリ性電解水による洗浄操作は、複数回、繰り返して実施され、それによって、より有効な洗浄効果が達成されるのである。 In another desirable embodiment of the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, the washing operation with the strongly alkaline electrolyzed water is repeatedly carried out a plurality of times, thereby achieving a more effective washing effect. is there.
さらに、本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法の別の望ましい態様によれば、前記希酸水溶液として、０．００１〜０．１Ｎ塩酸水溶液が有利に用いられ、これによって、希酸処理効果の有効な実現が図られ得ることとなる。 Furthermore, according to another desirable aspect of the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, 0.001 to 0.1N hydrochloric acid aqueous solution is advantageously used as the dilute acid aqueous solution, thereby effective dilute acid treatment effect. Realization can be achieved.
このように、本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法にあっては、酵母の物理的な磨砕工程において、アルカリ性電解水を磨砕媒体として用いて、その特性を有効に利用することにより、脂質の酸化によって招来される着色や、酸化異臭の発生も有利に抑制乃至は防止され得ることとなることに加えて、磨砕操作にて発生する熱が、冷却操作にて、磨砕系から取り除かれることによって、酵母、ひいては磨砕物の磨砕熱による変性乃至は変質が、効果的に抑制乃至は阻止され得るのである。 As described above, in the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, in the physical grinding process of yeast, alkaline electrolyzed water is used as a grinding medium, and its characteristics are effectively used to obtain a lipid. In addition to being able to advantageously suppress or prevent the occurrence of coloring and oxidation off-flavors caused by the oxidation of heat, the heat generated by the grinding operation is removed from the grinding system by the cooling operation. As a result, the denaturation or alteration of the yeast, and thus the ground product, by the heat of grinding can be effectively suppressed or prevented.
しかも、酵母磨砕物の酵素処理されたものに対する洗浄工程においては、所定の強アルカリ性電解水が用いられているところから、そのような強アルカリ性電解水による優れた洗浄作用、特に、蛋白質や脂質を溶解し、乳化して、効果的に洗い流すことが出来ることとなり、これによって、得られるグルカンの純度の向上に大きく寄与し得ることとなるのである。 In addition, in the washing step for the enzyme-treated yeast ground product, since a predetermined strong alkaline electrolyzed water is used, an excellent washing action by such strong alkaline electrolyzed water, in particular, proteins and lipids are added. It can be dissolved, emulsified and washed away effectively, which can greatly contribute to the improvement of the purity of the glucan obtained.
また、本発明にあっては、強アルカリ性電解水による洗浄工程の後、その洗浄処理物を希酸水溶液にて処理し、そして、その処理物から高純度グルカンを得るようにしていることによって、かかる高純度グルカンの特性が更に高められ、本発明に従って得られるグルカンの品質を高度に確保することが出来る特徴も有している。 In the present invention, after the washing step with strong alkaline electrolyzed water, the washed product is treated with a dilute acid aqueous solution, and high purity glucan is obtained from the treated product. The characteristics of the high-purity glucan are further enhanced, and the glucan obtained according to the present invention has a feature that can ensure a high quality.
特に、本発明において、酵母を不活性ガスの液化物にて凍結せしめる一方、その磨砕操作が不活性ガスの液化物を用いて極く低温で実施されるようにすることにより、磨砕による温度上昇（磨砕熱）により、酵母の菌体内酵素が熱分解乃至は破壊されるのを効果的に阻止することが出来、以て、後の自己消化を有利に進行せしめることが出来る。 In particular, in the present invention, the yeast is frozen with an inert gas liquefaction, while the grinding operation is carried out at a very low temperature using an inert gas liquefaction. By the temperature rise (grinding heat), it is possible to effectively prevent the yeast intracellular enzymes from being thermally decomposed or destroyed, and the subsequent self-digestion can proceed advantageously.
ところで、本発明において、目的とするβ−グルカンを得るために用いられる酵母としては、特に限定されるものではなく、例えば、酒類の醸造やアルコールの製造、製パン等に用いられる、サッカロミセス属（Saccharomyces ）の酵母である、ビール酵母や清酒酵母、ワイン酵母、パン酵母、醤油酵母、味噌酵母等を挙げることが出来、これらのうちの少なくとも１種以上の酵母が、適宜に選択されて用いられることとなる。なお、これらの酵母は、商業的に入手することが可能であって、例えば、パン酵母、ビール酵母等は、乾燥酵母として市販されている。尤も、乾燥酵母は、そのまま用いられる生酵母とは異なり、後述するアルカリ性電解水を用いて、室温下で膨潤させられたものが、本発明に従う磨砕工程に付されることとなる。 By the way, in this invention, it does not specifically limit as yeast used in order to obtain the target (beta) -glucan, For example, the genus Saccharomyces ( Saccharomyces) yeast, beer yeast, sake yeast, wine yeast, baker's yeast, soy sauce yeast, miso yeast, etc., and at least one of these yeasts is appropriately selected and used. It will be. In addition, these yeast can be obtained commercially, for example, baker's yeast, beer yeast, etc. are marketed as dry yeast. However, dry yeast, unlike live yeast that is used as it is, is swollen at room temperature using alkaline electrolyzed water described later, and is subjected to the grinding step according to the present invention.
そして、本発明方法に従って、そのような酵母に含まれる水不溶性のグルカンを取り出して、目的とするグルカンが製造（採取）されることとなるのであるが、本発明方法にあっては、かかる酵母の磨砕操作や自己消化処理・酵素処理に際して、媒体として、水を電気分解することによって得られるアルカリ性電解水が、用いられるのである。 Then, according to the method of the present invention, the water-insoluble glucan contained in such yeast is taken out, and the target glucan is produced (collected). In the grinding operation, self-digestion treatment, and enzyme treatment, alkaline electrolyzed water obtained by electrolyzing water is used as a medium.
具体的には、電解水は、通常の水道水等の水を、隔膜を有する電解槽中で電気分解することによって得られるものであり、かかる電気分解によって、水中に含まれているイオンは、それぞれの持っている電荷とは反対の電荷を有する電極に移動し、電気分解装置の陰極側では、カチオンが集まり、更に水素が生成されることにより、水道水（原水）に比して高ｐＨ、高濃度のカチオン及び還元性を有する水が生成される一方、陽極側では、アニオンが集まり、酸素が生成されることにより、水道水（原水）に比して低ｐＨ、高濃度のアニオン及び酸化性を有する水が生成される。そして、本発明においては、そのような二種類の電解水の中でも、陰極側に生成されるアルカリ性電解水が有利に用いられることとなる。 Specifically, the electrolyzed water is obtained by electrolyzing water such as ordinary tap water in an electrolytic cell having a diaphragm, and by such electrolysis, ions contained in the water are: It moves to an electrode having a charge opposite to the charge of each, and on the cathode side of the electrolysis apparatus, cations gather and hydrogen is generated, resulting in a higher pH than tap water (raw water). On the anode side, anions are collected and oxygen is generated, so that a low pH, a high concentration of anions and a high concentration of cations and raw water are generated. Oxidizing water is produced. And in this invention, the alkaline electrolyzed water produced | generated by the side of a cathode among such two types of electrolyzed water will be used advantageously.
なお、そのようなアルカリ性電解水としては、上述せるように、電気分解によって陰極側に生成される電解水であれば良く、特に制限されるものではないものの、そのｐＨが、好ましくは８．５〜１１．０程度、より好ましくは９．５〜１０．５であるものが、望ましい。何故なら、ｐＨが上記の範囲よりも低くなると、蛋白質の溶解作用が良好に発揮され得なくなる恐れがあるからであり、また、上記の範囲より高くなると、酵素の至適ｐＨから大きく外れて、酵素の活性が失われる恐れがあるからである。 Such alkaline electrolyzed water may be electrolyzed water generated on the cathode side by electrolysis as described above, and is not particularly limited, but the pH is preferably 8.5. It is desirable that it is about ˜11.0, more preferably 9.5 to 10.5. This is because if the pH is lower than the above range, the protein dissolving action may not be satisfactorily exerted, and if the pH is higher than the above range, it is greatly deviated from the optimum pH of the enzyme. This is because the enzyme activity may be lost.
また、アルカリ性電解水には、陰極で生成された水素ガスが溶存しており、この水素ガスによって、アルカリ性電解水の酸化還元電位は、水道水等の水（原水）に比して低い値となっている。そのようなアルカリ性電解水の酸化還元電位にあっても、特に限定されるものではないものの、好ましくは−１００〜−８００ｍＶ程度、より好ましくは−５００〜−８００ｍＶ程度であるアルカリ性電解水を用いることが望ましい。このように、酸化還元電位の低いアルカリ性電解水を用いれば、アルカリ性電解水の還元力が効果的に作用せしめられて、酵母細胞中の脂質等の成分の酸化が有利に防止され、酸化異臭の発生が極めて効果的に抑制され得ると共に、穏やかな還元漂白によって、酸化による着色のない、良質なグルカンが得ることが出来る。 Moreover, the hydrogen gas generated at the cathode is dissolved in the alkaline electrolyzed water, and this hydrogen gas causes the redox potential of the alkaline electrolyzed water to be lower than that of water (raw water) such as tap water. It has become. Even if it is at the oxidation-reduction potential of such alkaline electrolyzed water, it is not particularly limited, but preferably alkaline electrolyzed water that is about -100 to -800 mV, more preferably about -500 to -800 mV. Is desirable. Thus, when alkaline electrolyzed water having a low oxidation-reduction potential is used, the reducing power of alkaline electrolyzed water is effectively acted, and oxidation of components such as lipids in yeast cells is advantageously prevented, and oxidation of off-flavors Generation | occurrence | production can be suppressed very effectively, and the quality glucan which is not colored by oxidation by mild reductive bleaching can be obtained.
そして、本発明に従う酵母由来グルカンの製造方法においては、先ず、上記の如きアルカリ性電解水を磨砕媒体として用い、これに、前記した酵母を加えて冷却しつつ、かかる酵母を物理的に磨砕する工程が、実施されることとなる。この物理的な磨砕（乃至は機械的な破砕）の方法としては、特に限定されるものではなく、乳鉢、ホモジナイザー、コロイドミル等を用いた従来から公知の各種の磨砕手法が、適宜に選択されて用いられるのであり、また、磨砕処理温度や処理時間等の磨砕条件も、使用する酵母の量や種類、磨砕方法等に応じて、適宜に設定されることとなる。そして、この磨砕処理によって、一般に１〜３０μｍ程度、好ましくは１〜１０μｍ程度の大きさに磨砕されて、酵母の細胞壁が破砕されることにより、細胞内の蛋白質、糖質、アミノ酸、有機酸、脂質等の各種成分が、細胞外に取り出され得るようになる。また、かかる酵母の磨砕に際して、本発明に従って、アルカリ性電解水が磨砕媒体として用いられ、そのようなアルカリ性電解水中で酵母の磨砕処理が実施されることによって、その細胞内に存在する酵素が、アルカリ性電解水に溶出されると共に、親水性の他の成分も可溶化されることとなる。 In the method for producing a yeast-derived glucan according to the present invention, first, the alkaline electrolyzed water as described above is used as a grinding medium, and the yeast is physically ground while adding the above-described yeast and cooling. The process to perform will be implemented. The physical grinding (or mechanical crushing) method is not particularly limited, and various conventionally known grinding methods using a mortar, a homogenizer, a colloid mill, or the like can be appropriately used. In addition, the grinding conditions such as the grinding treatment temperature and the treatment time are appropriately set according to the amount and type of yeast to be used, the grinding method, and the like. And by this grinding treatment, it is ground to a size of generally about 1 to 30 μm, preferably about 1 to 10 μm, and the cell wall of the yeast is crushed, so that intracellular proteins, carbohydrates, amino acids, organic Various components such as acids and lipids can be taken out of the cells. In addition, when such yeast is ground, alkaline electrolyzed water is used as a grinding medium in accordance with the present invention, and yeast is ground in such alkaline electrolyzed water, whereby the enzyme present in the cells. However, while being eluted in alkaline electrolyzed water, other hydrophilic components are also solubilized.
なお、そのような磨砕工程においては、酵母の磨砕操作によって、被磨砕物（酵母＋アルカリ性電解水）が発熱するようになるところから、本発明にあっては、そのような被磨砕物の冷却が行なわれ、発熱による酵母、更には酵母磨砕物の変性乃至は変質が抑制又は阻止せしめられるようにされる。また、このような被磨砕物の冷却は、磨砕装置の冷却によって、被磨砕物を外部から冷却せしめる手法も採用可能ではあるが、特に本発明にあっては、液化された不活性ガス、例えば液体窒素、液体アルゴン、液体ヘリウム等の、被磨砕物に悪影響をもたらさない液化ガスを、被磨砕物中に添加せしめて、その冷却を行うようにする手法が、効果的に採用されることとなる。そして、このような被磨砕物の冷却操作によって、変性や変質のない磨砕物が有利に得られることとなるのである。 In such a grinding process, the material to be ground (yeast + alkaline electrolyzed water) generates heat due to the grinding operation of the yeast. In the present invention, such a material to be ground is used. In order to suppress or prevent the denaturation or alteration of the yeast and further the ground yeast product due to the exothermic heat. In addition, for the cooling of the material to be ground, a method of cooling the material to be ground from the outside by cooling the grinding device can be adopted, but particularly in the present invention, a liquefied inert gas, For example, liquid nitrogen, liquid argon, liquid helium, or other liquefied gas that does not adversely affect the material to be ground is added to the material to be ground, and the cooling method is effectively employed. It becomes. And by such a cooling operation of the material to be ground, a ground material without modification or alteration can be advantageously obtained.
また、本発明にあっては、そのような磨砕工程は、生成する微細な磨砕物の酸化の抑制乃至は阻止を図るべく、不活性雰囲気下において実施されることが望ましく、一般に、磨砕装置内の雰囲気を不活性ガスにして、磨砕操作が実施されることとなるが、特に、酵母とアルカリ性電解水の混合物である被磨砕物に対して、不活性ガスの液化物を添加しつつ、その磨砕操作を進行せしめることが推奨される。かかる不活性ガスの液化物の添加によって、被磨砕物の冷却が効果的に行なわれ得て、磨砕操作による発熱に基づくところの悪影響を有利に回避し得ると共に、被磨砕物の周りの雰囲気を、効果的に不活性雰囲気と為し得るからである。なお、そのような被磨砕物に添加される不活性ガスの液化物の量としては、目的とする被磨砕物の冷却の程度や磨砕装置内における不活性雰囲気の保持の程度等によって、適宜に決定されるものであり、また、その添加方法としても、液化物を連続的に滴下する方式や、液化物を所定時間毎に添加する間欠的方式等の公知の添加方式が、適宜に採用される。 In the present invention, such a grinding step is preferably carried out in an inert atmosphere in order to suppress or prevent oxidation of the fine ground material to be produced. The atmosphere in the apparatus is changed to an inert gas and the grinding operation is performed. In particular, an inert gas liquefaction is added to the material to be ground, which is a mixture of yeast and alkaline electrolyzed water. However, it is recommended that the grinding operation proceed. By adding such a liquefied product of an inert gas, the material to be ground can be effectively cooled, and adverse effects based on heat generated by the grinding operation can be advantageously avoided, and the atmosphere around the material to be ground can be avoided. This is because an inert atmosphere can be effectively formed. The amount of inert gas liquefied substance added to the material to be ground is appropriately determined depending on the intended degree of cooling of the material to be ground and the degree of maintenance of the inert atmosphere in the grinding apparatus. In addition, as addition methods, well-known addition methods such as a method of continuously dropping a liquefied product and an intermittent method of adding a liquefied product every predetermined time are appropriately adopted. Is done.
さらに、本発明にあっては、かかる磨砕工程において磨砕される酵母は、凍結せしめられていることが望ましく、それによって、酵母に対する磨砕操作が容易となり、また、より微細な磨砕物を有利に得ることが出来ると共に、磨砕によって生じる熱も効果的に抑制乃至は阻止することが出来るという特徴を発揮する。なお、そのような酵母の凍結は、有利には、不活性ガスの液化物を接触せしめることにより行なわれる。 Furthermore, in the present invention, it is desirable that the yeast to be ground in such a grinding step is frozen, thereby facilitating the grinding operation on the yeast, and further reducing the finely ground product. It is advantageous in that it can be advantageously obtained, and heat generated by grinding can be effectively suppressed or prevented. Such freezing of the yeast is advantageously carried out by contacting with a liquefied product of an inert gas.
ところで、このような本発明に従う磨砕工程において、酵母とアルカリ性電解水の混合物からなる被磨砕物の冷却に用いられたり、磨砕工程（磨砕系）における雰囲気を不活性雰囲気としたり、磨砕される酵母を凍結せしめたりする不活性ガスの液化物としては、先述せる如く、酵母やその磨砕物に対して悪影響をもたらすことのない不活性ガス、例えば窒素やアルゴン、ヘリウム等の気体の液化物が適宜に用いられ得るが、中でも、本発明においては、液体窒素が有利に用いられることとなる。 By the way, in such a grinding process according to the present invention, it is used for cooling an object to be ground consisting of a mixture of yeast and alkaline electrolyzed water, or the atmosphere in the grinding process (grinding system) is an inert atmosphere. As described above, the inert gas liquefaction that freezes the yeast to be crushed includes an inert gas that does not adversely affect the yeast and its ground product, such as nitrogen, argon, helium, and the like. Although a liquefied material can be used suitably, especially in this invention, liquid nitrogen will be used advantageously.
そして、かくの如き磨砕処理の後、得られた微細な酵母磨砕物は、上記と同様なアルカリ性電解水の存在下において、所定のアルカリ性プロテアーゼを用いて酵素処理され、これによって、アルカリ性電解水に可溶化していない蛋白質やグルカンに結合する蛋白質等の分解が効果的に促進されるようになるのである。 Then, after the grinding treatment as described above, the fine yeast ground product obtained is subjected to an enzyme treatment using a predetermined alkaline protease in the presence of alkaline electrolytic water similar to the above, whereby alkaline electrolytic water is obtained. Degradation of proteins that are not solubilized or proteins that bind to glucan is effectively promoted.
また、この酵素処理工程においては、アルカリ性電解水中に、酵母磨砕物から酵母の細胞内に存在する酵素が溶出されて、存在しているところから、そのような酵母の細胞内酵素による自己消化も、アルカリ性プロテアーゼによる酵素処理と同時に進行しているものと考えられている。特に、前記した酵母の磨砕によって得られた磨砕物を、その磨砕に用いられたアルカリ性電解水を分離することなく、そのまま存在させた状態において、本発明に従う酵素処理が実施されるようにすることにより、そのような磨砕物中に存在するアルカリ性電解水中には、酵母の細胞内酵素が溶存されているために、そのような溶存酵素を利用して、酵素磨砕物の自己消化処理を有利に進行せしめることが出来る。 In this enzyme treatment step, the enzyme present in the yeast cells is eluted from the ground yeast product in the alkaline electrolyzed water. It is thought that it is proceeding simultaneously with the enzyme treatment with alkaline protease. In particular, the enzymatic treatment according to the present invention is carried out in the state where the ground product obtained by grinding the yeast is left as it is without separating the alkaline electrolyzed water used for the grinding. Therefore, since the intracellular enzymes of yeast are dissolved in the alkaline electrolyzed water present in such a ground product, self-digestion treatment of the enzyme ground product is performed using such dissolved enzyme. It is possible to proceed advantageously.
なお、かかる酵素処理工程において用いられるアルカリ性電解水の量は、特に制限されるものでないものの、アルカリ性電解水の量が酵母磨砕物に対して少なくなり過ぎると、脂質等の不要な成分をアルカリ性電解水中に充分に可溶化せしめることが出来なくなる恐れがある一方、アルカリ性電解水の量が多くなり過ぎると、アルカリ性プロテアーゼによる酵素処理効果が低下したり、酵母の細胞内酵素による消化が、効率的に行なわれ得ず、酵母細胞を構成する各種成分、例えば、蛋白質、脂質、糖質（グルカンを除く）等を可溶化するまで充分に分解することが出来なくなる恐れがあるところから、アルカリ性電解水は、酵母（乾燥重量）の１重量部に対して、一般に１〜２０重量部程度、好ましくは２〜５重量部となる割合において、用いられることが望ましい。 Although the amount of alkaline electrolyzed water used in the enzyme treatment step is not particularly limited, if the amount of alkaline electrolyzed water is too small relative to the yeast ground product, unnecessary components such as lipids are subjected to alkaline electrolysis. While it may not be possible to sufficiently solubilize in water, if the amount of alkaline electrolyzed water increases too much, the enzyme treatment effect by alkaline protease decreases, and digestion by yeast intracellular enzymes is efficient. Alkaline electrolyzed water is used because it may not be able to be sufficiently degraded until it is solubilized until various components constituting yeast cells such as proteins, lipids, and sugars (excluding glucan) are solubilized. In a ratio of generally about 1 to 20 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight per 1 part by weight of yeast (dry weight), It needs it is desirable.
また、この酵素処理に使用されるアルカリ性プロテアーゼ（Alkaline protease ）としては、アルカリ性電解水で蛋白質を分解し得ると共に、人体に対する安全性が確保されているものであればよく、公知の各種プロテアーゼの中から、適宜に選択され得るものであり、また、そのようなアルカリ性プロテアーゼは、市販もされており、例えば、プロレザーＦＧ−Ｆ（天野エンザイム株式会社製品）等を挙げることが出来る。なお、このアルカリ性プロテアーゼの添加量としては、使用するプロテアーゼの種類等に応じて、適宜に設定され得るものであるが、その添加量が少な過ぎると、アルカリ性プロテアーゼによる蛋白質の分解が充分に実現されず、また、多過ぎると、アルカリ性プロテアーゼによるアレルギーの発症等が懸念されると共に、製造コストの高騰を招く恐れがある。このため、アルカリ性プロテアーゼは、好ましくは、使用する酵母の重量（乾燥重量）の１００重量部に対して、一般に０．０１〜２．０重量部、より好ましくは０．１〜１．０重量部となる割合において、添加されることが望ましい。 The alkaline protease used for the enzyme treatment is not limited as long as it is capable of degrading proteins with alkaline electrolyzed water and ensuring safety for the human body. Therefore, such alkaline protease is also commercially available, and examples thereof include Pro Leather FG-F (Amano Enzyme Co., Ltd. product). The addition amount of the alkaline protease can be appropriately set according to the type of protease to be used, but if the addition amount is too small, the protein degradation by the alkaline protease is sufficiently realized. In addition, if the amount is too large, there is a concern about the development of allergy due to alkaline protease, and the production cost may increase. For this reason, the alkaline protease is preferably generally 0.01 to 2.0 parts by weight, more preferably 0.1 to 1.0 parts by weight, with respect to 100 parts by weight of the yeast used (dry weight). It is desirable to be added in such a ratio.
そして、このようなアルカリ性プロテアーゼによる酵素処理工程において、その処理温度や処理時間としては、目的とする酵素処理と共に、自己消化処理をも同時に実施し得るように、アルカリ性プロテアーゼや酵母の細胞内酵素の特性を勘案して適宜に設定されることとなるが、一般に、処理温度としては４０〜７０℃程度、好ましくは５０〜６０℃程度の温度が好適に採用される一方、処理時間としては、通常、１〜４８時間程度、好ましくは１２〜２４時間程度の時間が採用されることとなる。 In such an enzyme treatment step with alkaline protease, the treatment temperature and treatment time of the alkaline protease and yeast intracellular enzymes are such that, in addition to the target enzyme treatment, self-digestion treatment can be performed simultaneously. In general, the processing temperature is about 40 to 70 ° C., preferably about 50 to 60 ° C., while the processing time is usually set appropriately. 1 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
このように、本発明に従って、酵母磨砕物のアルカリ性プロテアーゼによる酵素処理を実施することによって、また、酵母の細胞内酵素による自己消化処理も進行せしめられることとなるところから、酵母細胞を構成する各種成分、特に蛋白質が、効果的に分解されて、アルカリ性電解水中に可溶化されるのであり、また、アルカリ性電解水の採用によって、水不溶性の長鎖のグルカンが有利に製造され得るのである。しかも、アルカリ性電解水は、通常の水に比して、表面張力が弱く、浸透力やエマルジョン化能が高いといった特性を有しているところから、つまり、アルカリ性電解水には、洗浄作用乃至は界面活性作用があるところから、その作用が有利に発揮されて、酵母細胞の構成成分である脂質等が、アルカリ性電解水中に効果的にエマルジョン化され、以て、脂質等の成分と水不溶性のグルカンとの分離も、極めて良好に実施され得るのである。加えて、アルカリ性電解水は、酸化還元電位が低いところから、本発明に従う酵素処理工程においても、その媒体として用いられるアルカリ性電解水中で酵母細胞の構成成分が酸化するようなことも、極めて効果的に防止され得て、酸化異臭の発生や、酸化によるグルカンの着色も効果的に防止され得るようになっているのである。 Thus, according to the present invention, by carrying out the enzyme treatment of the yeast ground product with an alkaline protease, and also the self-digestion treatment with the yeast intracellular enzyme is allowed to proceed. Ingredients, particularly proteins, are effectively decomposed and solubilized in alkaline electrolyzed water, and by employing alkaline electrolyzed water, water-insoluble long-chain glucans can be advantageously produced. Moreover, alkaline electrolyzed water has characteristics such as weak surface tension, high penetrating power and high emulsifying ability compared to normal water. Since there is a surface active action, the action is advantageously exerted, and lipids and the like that are components of yeast cells are effectively emulsified in alkaline electrolyzed water, so that they are insoluble in water and components such as lipids. Separation from glucan can also be carried out very well. In addition, since alkaline electrolyzed water has a low redox potential, it is extremely effective that the components of yeast cells are oxidized in the alkaline electrolyzed water used as the medium in the enzyme treatment step according to the present invention. Thus, generation of an odor of oxidation and coloring of glucan due to oxidation can be effectively prevented.
そして、本発明にあっては、かくの如き酵素処理工程が終了した後、必要に応じて、所定の熱処理が実施される。この熱処理によって、各種酵素が失活され、酵素による各種成分の分解反応が終了せしめられる。なお、この熱処理の条件は、特に限定されるものではなく、一般的な熱処理条件が採用され得るのであり、通常、８０〜１００℃で、５〜６０分程度の加熱操作が施されることによって、アルカリ性電解水中の酵素が失活させられるのである。また、そのような失活操作を実施することなく、前記酵素磨砕物の酵素処理されたものに対して、以下の如き洗浄操作を行なうことにより、かかる酵素処理物中に存在する酵素を除去せしめることによっても、同様な効果を得ることが可能である。 In the present invention, after such an enzyme treatment step is completed, a predetermined heat treatment is performed as necessary. By this heat treatment, various enzymes are deactivated, and the decomposition reaction of various components by the enzymes is completed. In addition, the conditions of this heat treatment are not particularly limited, and general heat treatment conditions can be adopted. Usually, the heating operation is performed at 80 to 100 ° C. for about 5 to 60 minutes. The enzyme in alkaline electrolyzed water is deactivated. Further, the enzyme present in the enzyme-treated product is removed by performing the following washing operation on the enzyme-treated product of the enzyme ground product without performing such deactivation operation. It is possible to obtain the same effect.
上記の酵素処理工程において得られた酵素磨砕物の酵素処理されたものに対する洗浄操作は、先ず、そのような酵素処理物から各種不要な成分が溶出せしめられたアルカリ性電解水が、遠心分離や濾過等の固液分離操作によって分離、除去された後、得られた固形分に対して、本発明に従って、前記したアルカリ性電解水よりもｐＨが高く、且つ酸化還元電位が低い強アルカリ性電解水、具体的にはｐＨが１１以上、酸化還元電位が−８００ｍＶよりも低い強アルカリ性電解水を用いた洗浄操作が実施され、これによって、固形分中に残存する脂質等の性分がより一層効果的に除去されることとなり、以て、得られるグルカンの純度が、より一層有利に高められることとなるのである。特に、酵素処理までの工程において用いたアルカリ性電解水とは異なり、それよりも高ｐＨ、低酸化還元電位の強アルカリ性電解水を用いていることによって、より一層優れた洗浄効果と共に、有効な還元状態において洗浄処理を実施することが出来ることから、この洗浄処理においても、酸化による製品の劣化を有利に防ぐことが出来ることとなる。なお、この洗浄操作は、所定の強アルカリ性電解水にて固形分をすすぎ、その後、遠心分離を行なうことによって実施され、その回数は、適宜に設定されるものの、１〜８回程度、望ましくは複数回、繰り返して実施されることとなる。 The washing operation for the enzyme-treated product of the enzyme ground product obtained in the above-mentioned enzyme treatment step is first performed by subjecting alkaline electrolyzed water from which various unnecessary components are eluted from such enzyme-treated product to centrifugation or filtration. Strong alkaline electrolyzed water having a pH higher than that of the alkaline electrolyzed water and having a low redox potential according to the present invention with respect to the solid content obtained after separation and removal by solid-liquid separation operation such as Specifically, a washing operation using strongly alkaline electrolyzed water having a pH of 11 or higher and a redox potential lower than −800 mV is carried out, so that the sex components such as lipid remaining in the solid content can be more effectively obtained. As a result, the purity of the obtained glucan is further advantageously increased. In particular, unlike alkaline electrolyzed water used in the steps up to the enzyme treatment, the use of strong alkaline electrolyzed water having a higher pH and lower oxidation-reduction potential makes it possible to achieve effective reduction with an even better cleaning effect. Since the cleaning process can be performed in the state, the product can be advantageously prevented from being deteriorated due to oxidation even in this cleaning process. This washing operation is carried out by rinsing the solid content with a predetermined strong alkaline electrolyzed water, and then performing centrifugation, and the number of times is appropriately set, but about 1 to 8 times, preferably It will be repeated several times.
なお、この本発明に従う洗浄工程において用いられる強アルカリ性電解水は、先に説明した磨砕工程や酵素処理工程で用いられる通常のアルカリ性電解水と同様にして、原水を電気分解して得られるものであるが、かかる通常のアルカリ性電解水の製造に用いられる原水が、水道水等の通常の水を用いていることとは異なり、所定の濃度で塩化ナトリウムを含む水溶液を原水として、これを有隔膜電解槽において電解することにより、その陰極側から得られるｐＨが１１以上、好ましくは１１．３以上、より好ましくは１１．５以上、酸化還元電位が−８００ｍＶよりも低い、好ましくは−８５０ｍＶ以下の電解水として生じたものが、本発明において、強アルカリ性電解水として用いられることとなる。このような強アルカリ性電解水は、成分に微量の水酸化ナトリウムを含んでいるところから、蛋白質の溶解や油脂を乳化させる力が強く、これによって、固形分に対する洗浄処理が有効に行なわれ得て、より純度の高いグルカンからなる固形分を得ることが出来るのである。 The strongly alkaline electrolyzed water used in the washing step according to the present invention is obtained by electrolyzing raw water in the same manner as the normal alkaline electrolyzed water used in the grinding step and the enzyme treatment step described above. However, unlike raw water used for producing such normal alkaline electrolyzed water, such as tap water, an aqueous solution containing sodium chloride at a predetermined concentration is used as raw water. By electrolysis in a diaphragm electrolytic cell, the pH obtained from the cathode side is 11 or more, preferably 11.3 or more, more preferably 11.5 or more, and the oxidation-reduction potential is lower than −800 mV, preferably −850 mV or less. What was produced as the electrolyzed water is used as strong alkaline electrolyzed water in the present invention. Since such strong alkaline electrolyzed water contains a small amount of sodium hydroxide as a component, it has a strong ability to dissolve proteins and emulsify fats and oils, and thereby the washing treatment for solids can be effectively performed. Thus, it is possible to obtain a solid content of glucan having a higher purity.
さらに、本発明にあっては、上述の如き洗浄処理の施されたグルカンからなる固形分（洗浄処理物）が、希酸水溶液を用いて、接触処理されることとなる。このような希酸水溶液による処理は、前記した強アルカリ性電解水による固形分（グルカン）の洗浄処理によって取り込まれたナトリウムイオン（Ｎａ+ ）を除去しようとするものであって、このような希酸水溶液による処理によって、得られるグルカンの特性乃至は活性が、効果的に高められ得ることとなる。なお、ここで用いられる希酸水溶液は、前記洗浄処理された固形分中のナトリウムイオンを水素イオン（Ｈ+ ）に置換し得る公知の各種酸の希薄水溶液が用いられ得るものであるが、特に本発明にあっては、０．００１〜０．１Ｎ塩酸水溶液が好適に用いられることとなる。酸の濃度が極端に低くなると、ナトリウムイオンの置換効果が乏しく、また、高濃度の場合には、固形分中に酸が残存したり、固形分の変質を惹起する恐れがある等の問題を内在する。 Furthermore, in the present invention, the solid content (cleaned product) made of glucan that has been subjected to the cleaning process as described above is subjected to a contact process using a dilute acid aqueous solution. The treatment with the dilute acid aqueous solution is intended to remove sodium ions (Na + ) taken in by the washing treatment of the solid content (glucan) with the strong alkaline electrolyzed water. By treatment with an aqueous solution, the properties or activity of the glucan obtained can be effectively enhanced. The dilute acid aqueous solution used here may be a dilute aqueous solution of various known acids that can replace sodium ions in the washed solid content with hydrogen ions (H + ). In this invention, 0.001-0.1N hydrochloric acid aqueous solution will be used suitably. If the acid concentration is extremely low, the replacement effect of sodium ions is poor, and if the concentration is high, the acid may remain in the solid content or the solid content may be altered. Inherent.
そして、このようにして、希酸水溶液による処理が施された固形分に対しては、その後、遠心分離により、希酸水溶液の除去が行われた後、蒸留水にて複数回の洗浄操作が施され、更に、その後、真空凍結乾燥等の適当な乾燥操作によって、目的とするβ−グルカンからなる高純度な製品が、固形分として採取されるのである。 In this way, for the solids that have been treated with the dilute acid aqueous solution, the dilute acid aqueous solution is then removed by centrifugation, followed by multiple washing operations with distilled water. After that, a high-purity product comprising the target β-glucan is collected as a solid content by an appropriate drying operation such as vacuum freeze-drying.
従って、このようにして製造された酵母由来のグルカンにあっては、従来のβ−グルカンが、高々９０数％程度の純度のものであるのに対して、β−グルカンの純度が９９％或いはそれ以上の極めて高い純度のものとして得られるのであり、しかも、酸化異臭の発生や酸化による着色も、有利に抑制乃至は防止されたものとなっているのである。従って、本発明に係る製造方法に基づいて製造される酵母由来グルカン（β−グルカン）は、従来のβ−グルカン製品と同様な健康食品や医薬品等の用途において、より一層有利に使用されることとなるのである。 Therefore, in the glucan derived from yeast thus produced, the conventional β-glucan has a purity of about 90% at most, whereas the purity of β-glucan is 99% or Further, it is obtained in a very high purity, and the generation of oxidized odor and coloring due to oxidation are advantageously suppressed or prevented. Therefore, the yeast-derived glucan (β-glucan) produced based on the production method according to the present invention is more advantageously used in the same applications as health foods and pharmaceuticals similar to conventional β-glucan products. It becomes.
以下に、本発明の代表的な実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべきである。 Hereinafter, representative examples of the present invention will be shown to clarify the present invention more specifically, but the present invention is not limited by the description of such examples. It goes without saying. In addition to the following examples, the present invention includes various changes and modifications based on the knowledge of those skilled in the art without departing from the spirit of the present invention, in addition to the above specific description. It should be understood that improvements can be made.
先ず、酵母と二種の電解水（通常のアルカリ性電解水及び強アルカリ性電解水）とを、以下の如く、準備した。 First, yeast and two types of electrolyzed water (ordinary alkaline electrolyzed water and strong alkaline electrolyzed water) were prepared as follows.
−酵母−
酵母菌としては、家庭用の乾燥パン酵母として市販されているドライイースト（日清スーパーカメリヤドライイースト）を準備した。
-Yeast-
As yeast, dry yeast (Nisshin Super Camellia Dry Yeast) marketed as household dry bread yeast was prepared.
−電解水Ａ（通常のアルカリ性電解水）−
松江市の上水道水から、ホシザキ電機（株）製電解水生成装置（ＨＯＸ−４０Ａ）を用いて、電解水を製造した。電解条件は、電解強度が３〜４Ａ、流量が３〜４Ｌ／ｍｉｎであった。また、得られた電解水の酸化還元電位は、酸性電解水が約＋５８０ｍＶ、アルカリ性電解水が約−７００ｍＶであった。
-Electrolyzed water A (normal alkaline electrolyzed water)-
Electrolyzed water was produced from tap water in Matsue City using an electrolyzed water generator (HOX-40A) manufactured by Hoshizaki Electric Co., Ltd. The electrolysis conditions were an electrolysis strength of 3-4 A and a flow rate of 3-4 L / min. The redox potential of the obtained electrolyzed water was about +580 mV for acidic electrolyzed water and about −700 mV for alkaline electrolyzed water.
−電解水Ｂ（強アルカリ性電解水）−
ホシザキ電機（株）製電解水生成装置（ＲＯＸ−１０ＷＡ）を用いて、塩化ナトリウム濃度が０．２％以下とされた食塩水の電解を行ない、陰極側より、ｐＨが約１１．５、酸化還元電位が約−９００ｍＶの強アルカリ性電解水を得た。
-Electrolyzed water B (strong alkaline electrolyzed water)-
Using an electrolyzed water generator (ROX-10WA) manufactured by Hoshizaki Electric Co., Ltd., electrolysis of saline solution with a sodium chloride concentration of 0.2% or less was performed. From the cathode side, the pH was about 11.5, oxidation Strong alkaline electrolyzed water having a reduction potential of about −900 mV was obtained.
先ず、上記で準備した乾燥パン酵母の１０ｇと上記で準備した電解水Ａ（ｐＨ１０の通常のアルカリ性電解水）の３０ｍＬとを混合し、室温下において、３０分間放置することにより、かかるパン酵母の膨潤を行なった。そして、その膨潤物に対して、３０００ｒｐｍ×３０分間の遠心分離操作を施し、除水を行なった。 First, 10 g of the dried baker's yeast prepared above and 30 mL of the electrolyzed water A (ordinary alkaline electrolyzed water of pH 10) prepared above are mixed and left at room temperature for 30 minutes. Swelling was performed. Then, the swollen product was subjected to a centrifugal separation operation at 3000 rpm × 30 minutes to remove water.
次いで、かかる膨潤せしめられたパン酵母に対して、液体窒素を振りかけ、凍結せしめた。そして、この凍らせた酵母細胞に対して、等量の電解水Ａ（通常のアルカリ電解水）を加えて、自動乳鉢粉砕装置：モルターグラインダー（独国レッチェ社製）によって磨砕を行ない、１〜１０μｍの大きさの磨砕物を得た。なお、この磨砕操作において、被磨砕物である凍結酵母とアルカリ性電解水の混合物に対して、その磨砕操作を行ないつつ、時々、液体窒素を滴下して、冷却し、−７０℃で磨砕が行なわれるようにした。また、かかる磨砕される混合物の周りの雰囲気は、液体窒素の気化によって生じた窒素雰囲気（不活性雰囲気）となるものである。 Next, the swollen baker's yeast was sprinkled with liquid nitrogen and frozen. Then, an equal amount of electrolyzed water A (ordinary alkaline electrolyzed water) is added to the frozen yeast cells, and grinding is performed by an automatic mortar grinder: a mortar grinder (manufactured by Lecce, Germany). A ground product having a size of 10 μm was obtained. In this grinding operation, while performing the grinding operation on the mixture of frozen yeast and alkaline electrolyzed water that is to be ground, liquid nitrogen is sometimes added dropwise, cooled, and polished at -70 ° C. The crushing was done. Further, the atmosphere around the mixture to be ground is a nitrogen atmosphere (inert atmosphere) generated by vaporization of liquid nitrogen.
そして、上記の磨砕操作によって得られた磨砕物を磨砕装置（モルターグラインダー）から取り出し、それに、前記電解水Ａ（通常のアルカリ電解水）の約１０ｍＬを加え、更に、アルカリ性プロテアーゼとして、プロレザーＦＧ−Ｆ（天野エンザイム（株）製）の０．１ｇを加えた後、５５℃の温度で２４時間の間、保持することにより、酵素処理と自己消化処理を実施した。 Then, the ground product obtained by the above grinding operation is taken out from the grinding device (mortar grinder), and about 10 mL of the electrolyzed water A (ordinary alkaline electrolyzed water) is added thereto. After adding 0.1 g of leather FG-F (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), the mixture was held at a temperature of 55 ° C. for 24 hours to carry out an enzyme treatment and an autolysis treatment.
その後、かかる酵素処理及び自己消化処理された磨砕物に対して、３０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離操作を施し、その除水を行なって得られる固形分を用いて、それに、前記準備された電解水Ｂ（強アルカリ性電解水）の約１００ｍＬを混合して、その洗浄を行ない、更に、その洗浄後、３０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離操作を実施して、除水した。更に、この洗浄−遠心分離操作を６回繰り返すことにより、固形分中のグルカン以外の成分の除去を行なった。 Thereafter, the ground material subjected to the enzyme treatment and the self-digestion treatment is subjected to a centrifugal separation operation at 3000 rpm × 3 minutes, and the solid content obtained by removing the water is used for the prepared electrolyzed water. About 100 mL of B (strong alkaline electrolyzed water) was mixed and washed, and after the washing, a centrifugal operation at 3000 rpm × 3 minutes was performed to remove water. Furthermore, this washing-centrifugation operation was repeated 6 times to remove components other than glucan in the solid content.
次いで、かかる洗浄された固形分に対して、更に、Ｎ／１００ＨＣｌ水溶液の５０ｍＬを用いた洗浄を行ない、そして３０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離操作にて除水した後、蒸留水にて数回の洗浄を行ない、その後、真空凍結乾燥にて、目的とする高純度のグルカン（本発明製品）を得た。 Next, the washed solid content is further washed with 50 mL of an N / 100 HCl aqueous solution, and water is removed by centrifugation at 3000 rpm × 3 minutes, followed by several times with distilled water. Washing was performed, and then the desired high-purity glucan (product of the present invention) was obtained by vacuum freeze-drying.
かくして得られた本発明製品（精製β−グルカン）について、その評価を、下記の方法に従って行なった。 The product of the present invention (purified β-glucan) thus obtained was evaluated according to the following method.
−β−グルカンの純度の評価（蛋白質）−
精製したβ−グルカンに残存する蛋白質量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の蛋白質量測定試薬（Bradford法）により評価した。種々の濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を利用して、標準曲線を作成し、比色により、β−グルカン中の蛋白質量を評価した。
-Evaluation of β-glucan purity (protein)-
The amount of protein remaining in the purified β-glucan was evaluated using a protein mass measuring reagent (Bradford method) manufactured by Bio-Rad. Standard curves were prepared using bovine serum albumin (BSA) at various concentrations, and the amount of protein in β-glucan was evaluated by colorimetry.
−β−グルカンの免疫賦活作用の評価−
マウス・マクロファージ由来のＲａｗ２６４．７細胞（米国ＡＴＣＣより入手）を２４ｗｅｌｌプレートにより、１０％牛胎児血清入りDulbeco's MEM メディウム（Ｓｉｇｍａ社製）中で、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で４時間培養した（０．５×１０6ｃells/well）。培養開始時に種々の濃度のβ−グルカンを添加して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の誘導産生能を、後述の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、評価した。陽性対照群として、大腸菌由来の１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加した。なお、ＴＮＦα産生の評価は、独立した実験を実験を３度試行し、その平均値を求めることにより、行なった。
-Evaluation of immunostimulatory action of β-glucan-
Raw 264.7 cells derived from mouse macrophages (obtained from ATCC, USA) were cultured in a Duwellco's MEM medium (manufactured by Sigma) with 10% fetal calf serum for 4 hours at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. (0.5 × 10 6 cells / well). Various concentrations of β-glucan were added at the start of the culture, and the ability to induce and produce tumor necrosis factor (TNFα) was evaluated by enzyme immunoassay (ELISA) described later. As a positive control group, 100 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) derived from E. coli was added. The evaluation of TNFα production was carried out by trying an independent experiment three times and calculating the average value.
−酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＴＮＦαの測定−
抗マウスＴＮＦαモノクローナル抗体を利用したサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を原理とするＴＮＦα測定キット（Ｄｕｏ−Ｓｅｔ，Ｒ＆Ｄシステム社製）を利用して、Ｒａｗ２６４．７細胞が分泌した培養上清中のＴＮＦαを測定した。このシステムの感度は、１６ｐｇ／ｍｌで、マウスＴＮＦα以外の抗原（蛋白質）を認識しない、極めて特異性の高い測定法である。種々の濃度の組み換え型マウスＴＮＦαを基準として、標準曲線を得て、培養上清中に分泌したＴＮＦαを、ＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。
-Measurement of TNFα by enzyme immunoassay (ELISA)-
TNFα in the culture supernatant secreted by Raw264.7 cells was measured using a TNFα measurement kit (Duo-Set, manufactured by R & D System) based on the sandwich ELISA method using an anti-mouse TNFα monoclonal antibody. The sensitivity of this system is 16 pg / ml, and it is a highly specific measurement method that does not recognize antigens (proteins) other than mouse TNFα. A standard curve was obtained on the basis of various concentrations of recombinant mouse TNFα, and TNFα secreted into the culture supernatant was measured by an ELISA reader.
上記した測定方法に従って、本発明製品（精製β−グルカン）のＴＮＦα産生の誘導能について検討した結果、本発明製品が、濃度依存的に標的細胞であるＲａｗ２６４．７のＴＮＦα産生を誘導することを認めた。これにより、ＲＡＷ２６４．７によるＴＮＦα産生は、本発明製品により誘導されたと解釈することが出来る。また、種々の濃度の精製β−グルカンについて、検証した結果、１００μｇ／ｍｌにおいて、最も強くＴＮＦα産生を誘導した。なお、１００μｇ／ｍｌより高濃度では、精製β−グルカンの示す不溶性から、実験は困難であった。更に、１００μｇ／ｍｌの精製β−グルカンは、３７００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦα産生を促し、既知のＴＮＦα誘導体として知られている１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳの４２５０ｐｇ／ｍｌと比べて、８７％の誘導能を示した。なお、希酸水溶液による処理効果を確認するために、電解水Ｂによる洗浄処理の後、Ｎ／１００ＨＣｌ水溶液処理が施されていない固形分（β−グルカン）について、その１００μｇ／ｍｌ濃度でのＴＮＦα産生能を調べたところ、１３００ｐｇ／ｍｌと、極めて低い値を示した。 According to the measurement method described above, the ability of the product of the present invention (purified β-glucan) to induce TNFα production was examined. As a result, the product of the present invention induced TNFα production of RAW264.7, which is a target cell, in a concentration-dependent manner. Admitted. Thereby, it can be interpreted that TNFα production by RAW264.7 was induced by the product of the present invention. Moreover, as a result of verifying purified β-glucan at various concentrations, TNFα production was most strongly induced at 100 μg / ml. At concentrations higher than 100 μg / ml, the experiment was difficult due to the insolubility of purified β-glucan. Furthermore, 100 μg / ml purified β-glucan promoted 3700 pg / ml TNFα production and showed 87% inducibility compared to 4250 pg / ml of 100 ng / ml LPS known as a known TNFα derivative. In order to confirm the treatment effect with the dilute acid aqueous solution, the solid content (β-glucan) that has not been subjected to the N / 100 HCl aqueous solution treatment after the electrolyzed water B is treated with TNFα at a concentration of 100 μg / ml. When the production ability was examined, it was as extremely low as 1300 pg / ml.
また、本発明製品（精製β−グルカン）の純度について、前述せるBradford法による精製β−グルカン中の蛋白質量を測定した結果、その含有量が、０．５％以下であることを確認した。一方、市販のβ−グルカン製品の場合にあっては、それに混在している蛋白質量は、約５％であることを認めた。このことより、本発明製品（精製β−グルカン）は、市販製品に比べて、蛋白質含有量は１／１０であって、その純度が極めて高くなっていることを認めた。 Moreover, about the purity of this invention product (purification (beta) -glucan), as a result of measuring the protein amount in refinement | purification (beta) -glucan by Bradford method mentioned above, it confirmed that the content was 0.5% or less. On the other hand, in the case of a commercially available β-glucan product, it was confirmed that the amount of protein mixed therein was about 5%. From this, it was confirmed that the product of the present invention (purified β-glucan) had a protein content of 1/10 and a very high purity as compared with a commercially available product.
なお、かかる得られた本発明製品（精製β−グルカン）は、５分間の煮沸処理により、その活性が約５６％に低減したが、７０℃で１５分間の処理では、殆ど活性を損なうことがないことを認めた。
In addition, although the activity of the obtained product of the present invention (purified β-glucan) was reduced to about 56% by boiling treatment for 5 minutes, the treatment at 70 ° C. for 15 minutes could almost lose the activity. Admitted not.
Claims (8)
該磨砕工程で得られる磨砕物を、上記と同様なアルカリ性電解水の存在下、前記酵母の細胞内酵素による自己消化処理に加えて、アルカリ性プロテアーゼを用いて酵素処理する工程と、
かかる磨砕物の酵素処理されたものを、ｐＨが１１以上、酸化還元電位が−８００ｍＶよりも低い強アルカリ性電解水にて洗浄する工程と、
該洗浄工程で得られる洗浄処理物を、希酸水溶液にて接触、処理して、高純度グルカンを得る工程とを、
含むことを特徴とする酵母由来グルカンの製造方法。 Using alkaline electrolyzed water obtained by electrolyzing water as a grinding medium, adding yeast to this and cooling the yeast while physically grinding it,
A step of subjecting the ground product obtained in the grinding step to an enzymatic treatment using an alkaline protease in the presence of alkaline electrolyzed water as described above, in addition to the self-digestion treatment of the yeast with intracellular enzymes;
A step of washing such a ground product that has been enzyme-treated with strongly alkaline electrolyzed water having a pH of 11 or more and a redox potential lower than -800 mV;
Contacting the washed product obtained in the washing step with a dilute aqueous acid solution to obtain a high-purity glucan;
A method for producing a yeast-derived glucan, comprising:
The method for producing a yeast-derived glucan according to any one of claims 1 to 7, wherein the dilute acid aqueous solution is a 0.001 to 0.1N hydrochloric acid aqueous solution.
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