JP4563493B2 - ナフトキノン系抗がん活性成分の効率的製造 - Google Patents
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Description
(1)ノウゼンカズラ科植物の細胞塊を一以上の培地中にて懸濁培養または固体培養することにより抗がん活性成分を生産する成分生産工程(a)を含むことを特徴とする、抗がん活性成分の製造方法;
培養は、初代培養または二代以上の継代培養のいずれであってもよい。
抽出は、通常、培地または培地と細胞塊の混合物に適宜水を加えた後、ハロゲン化アルキル溶媒、例えばクロロホルムなどの有機溶媒で行う。
細胞増殖工程にて用いられる培地および培養方法などの条件は、成分生産工程と同一であるか、または異なっていてよい。
細胞増殖工程に要する培養期間は、0〜60日であり、好ましくは30〜45日である。
本発明を実施するにあたって、タベブイア・アベラネダエ(タベブイア・アベラネダエの種子はタヒボジャパン株式会社より入手可能;Tabebuia avellanedae seed (Lot: 000717))の栽培を行った。播種用培地として、1%の無栄養の寒天培地を使用した。該植物は一週間ほどで発芽し、次いで園芸用土(割合は赤玉土7:バーミキュライト3)に鉢上げして、温度25℃、明期16時間、暗期8時間の人工気象器内で生育させた。タベブイア・アベラネダエは南米アマゾン原産であるので、温度を28℃に上昇させ、霧吹きなどにより湿度を上昇させたところ、成長点からツル状に成長した。ある程度成長させた後、インキュベータの中に簡易ビニールハウスを作って該植物を栽培した。簡易ビニールハウス内で温度を地温30℃まで上昇させ、湿度も上昇させると、該植物は横に伸び、葉や茎が成長した。
参考例1にて栽培された植物体の殺菌方法を検討した。70%エタノールのみ(和光純薬工業株式会社より入手可能)、および70%エタノールと1%次亜塩素酸ナトリウム溶液(和光純薬工業株式会社より入手可能)の二種類の殺菌用溶媒を用いて、殺菌により適当なものを検討した。
上記の方法で殺菌した植物体を滅菌水で数回洗浄した後、該植物体からリーフディスク(葉:約1 cm2、茎:1 cm長の切片)を作成し、以下の実施例に用いた。
本実施例で培地に添加した成長調整物質は、ナフタレン酢酸(以下、NAA)、ベンジルアデニン(以下、BA)、一般にタベブイア・アベラネダエの植物片のカルス化を促すとされるカイネチン(以下、K)およびインドール酢酸(以下、IAA)、およびナフトキノン系成分の抽出を促すとされる2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(以下、2,4-D)を用い、これらのオーキシン類とサイトカイニン類との組み合わせでスクリーニングを行った。成長調整物質の濃度は、それぞれ0.5、1.0および2.0 ppmとした。
○:カルス化が起こったが、カルス塊(細胞塊)の成長が遅かった。
×:カルス化が起こったが、カルス塊(細胞塊)は成長せず黒色化した。
第2表に示されるように、培地にNAAおよびBAからなる成長調整物質を添加した場合には、カルス塊の成長が遅く、IAAおよびKからなる成長調整物質を添加した場合には、カルス塊の成長に関し他の培地よりも優れていた。
一方、培地に2,4-DおよびBAからなる成長調整物質を添加した場合には、カルス化は起こったが、カルス塊は黒色化した。
また、培地に2,4-DおよびKからなる成長調整物質を添加した場合には、他の培地を用いた場合よりもカルス化が早く、カルス塊の黒色化も早かった。
実施例2.1 成長調整物質の濃度の検討
カルスから生産されたナフトキノン系成分が培地に混入し始めると、培地が黄色く変色した。培地中のナフトキノン系成分含有濃度の度合いは、視認することが出来たので、これを結果とした。物質生産の観点から、成長調整物質の種類、濃度、培養期間、およびカルス化〜ナフトキノン系成分抽出における成長調整物質の組合せを検討した。
B:白色紙上に置いたときに、抽出前の培地の黄色が視認できた。
C:無色透明(抽出後の有機溶媒層も黄色を呈さなかった)。
成分生産工程において、成長調整物質を含まない培地ではナフトキノン系成分の生産は確認できなかった。
さらに、IAAおよびKを含む培地を用いた場合には、カルス化の点では優れていたが、NQ801は生産されなかった(第2表および第3表を参照のこと)。
B:白色紙上に置いたときに、抽出前の培地の黄色が視認できた。
C:無色透明(抽出後の有機溶媒層も黄色を呈さなかった)。
−:未検討。
2,4-DおよびBAならびに2,4-DおよびKからなる成長調整物質を添加した培地から非常に濃い黄色成分が抽出された。これらの培地では、置床後、5〜10日で培地にナフトキノン系成分が生産され始めた。
さらに、2,4-DおよびKからなる成長調整物質を添加した培地では、置床後20日でも濃い黄色成分であるナフトキノン系成分が生産された。
NAAおよびBAを1 ppm濃度にて含む培地条件下、植物体を培養した。培養開始から一ヶ月経過した後、同じ成分の培地に継代を行った(図2を参照のこと)。カルス化すると、培地の色が黄色に変色し、ナフトキノン系成分が生産されたと考えられる。これにより、上記培地を用いた場合には、カルス化から物質生産までを同一の培地で行うことができることに加えて(第2表および第3表を参照のこと)、カルスの継代培養ができることが判明した。
細胞増殖工程にて黄色成分が現れたタベブイア・アベラネダエ由来のカルスをMS液体培地にて培養した。カルスの懸濁培養によって、カルス本体からナフトキノン系成分が抽出されるかを検討した。成長調整物質はそれぞれ1.0 ppm濃度のNAAおよびBAを用いた。培養開始後一週間で培地が黄色に変色した(図3を参照のこと)。この培地をクロロホルムで抽出し、濃縮して定量したところ、液体培地150 ml中ナフトキノン系成分20 mgを得た。再度、同じ手順で行ったが、一ヶ月培養しても培地に色は付かなかった。
実施例4.1 定量分析
成分生産系で生産されたナフトキノン系成分と見られる物質が培地に混入し始めると、黄色く変色した(図4を参照のこと)。当該成分を同定するため、薄層液体クロマトグラフィー(TLC)分析を行った。
次に、TLC板(Merckシリカゲル60F254プレート)にNQ801と成分生産系から抽出された成分をスポットしたものを、展開溶媒としてノルマルヘキサン:酢酸エチル(7:3)を用いて分離した。
成分生産系における初代培養成分の濃縮画分をHPLCにより分析し、HPLCパターンをNQ801と比較した。
なお、本実施例では株式会社島津製作所製LC-10AのHPLCシステムを用いた。
図5に示されるように、成分生産系で生産された成分にNQ801が含まれていることが分かった。
HPLCのUV光(254 nm)で得られたピークの面積比から算出すると、成分生産系で得られた細胞塊またはカルスは、成分生産系の総質量に対して5〜15質量%以上のNQ801を含有することが分かった(図7および8を参照のこと)。
初代培養成分は一ヶ月の培養期間で行い、二代目および三代目はそれぞれさらに5日培養したものから抽出した。初代培養、第二代継代培養および第三代継代培養の濃縮後のナフトキノン系成分の質量はそれぞれ、14、15および15 mgであった。
初代培養〜第三代継代培養により得られたナフトキノン系成分の生産量の成分生産系全体に対するピーク面積比はほぼ変化しなかった。従って、本実施例により本発明の成分生産系においてカルスの継代培養は不要であることが判明した。
本発明の成分生産工程で用いた培地の抽出エキスの細胞毒性試験を行った。具体的には、以下の試験例1および2のように行った。
A-549細胞(肺がん細胞;株番号ECACC86012804;当時の大日本製薬株式会社ラボラトリープロダクツ部より入手)を、予めウシ胎児血清(FBS)20%を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を入れた35 mmシャーレに1x105/mlの濃度にて播種した。これを5%CO2中で36℃にて1日間インキュベートし、シャーレ底に細胞が密着していることを確認した。得られたA-549細胞を三群に分け、第一群には本発明の成分生産系で用いた培地の抽出エキスを、第二群には抗がん活性を有することが知られているNQ801(特許文献2を参照のこと)を、第三群には従来法によるタベブイア・アベラネダエ樹皮からのエーテル抽出画分をそれぞれ1、10、100および1000μg/mlの濃度にて添加した。これらを36℃にて3日間インキュベーションし、生存細胞を計数し、生存率を算出した。結果を第5表に示す。
MCF-7細胞(乳がん細胞;株番号ECACC86012803;当時の大日本製薬株式会社ラボラトリープロダクツ部より入手)について、試験例1と同様の手順により細胞毒性試験を行った。結果を第5表に示す。
第5表は、A-549細胞に関し、1、10および100μg/mlの濃度において、本発明の成分生産系で用いた培地の抽出エキスがNQ801とほぼ同程度の抗がん活性を示すことを明らかにする。
第5表は、MCF-7細胞に関し、1および10μg/mlの濃度において、本発明の成分生産系で用いた培地の抽出エキスがNQ801とほぼ同程度の抗がん活性を示し、100μg/mlの濃度ではNQ801と抗がん活性に全く差が見られないことを示す。
Claims (11)
- ノウゼンカズラ科植物の細胞塊を懸濁培養または固体培養することにより抗がん活性成分を生産する成分生産工程(a)および
工程(a)で用いられた培地から一種以上の抗がん活性成分を回収する成分回収工程(b)
を含む、抗がん活性成分の製造方法であって、
工程(a)において細胞塊の継代培養を必要とせず、
工程(a)で用いられた培地がナフタレン酢酸(NAA)、2-ナフトキシ酢酸、インドール酢酸(IAA)、4-クロロインドール酢酸、インドール酪酸(IBA)、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)、ベンジルアデニン(BA)、カイネチン(K)およびその混合物からなる群から選択される成長調整物質であって、少なくともナフタレン酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸またはカイネチンのいずれかを含む前記成長調整物質と有機補充物質とを含む、製造方法。 - 成長調整物質がナフタレン酢酸とベンジルアデニン、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸とベンジルアデニン、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸とカイネチン、またはインドール酢酸とカイネチンの組合せである、請求項1記載の方法。
- 成長調整物質が0.1〜2.5 ppm濃度である、請求項1または2のいずれか記載の方法。
- 有機補充物質が糖、寒天、ゲランガムおよびその混合物からなる群から選択される、請求項1または2のいずれか記載の方法。
- ノウゼンカズラ科植物がタベブイア・アベラネダエ(Tabebuia avellanedae)またはタベブイア・インペティギノーサ(Tabebuia impetiginosa)である、請求項1記載の方法。
- 抗がん活性成分が工程(a)で得られた細胞塊、工程(a)で用いられた培地またはその両者の総質量に対して少なくとも5質量%製造される、請求項1記載の方法。
- さらにノウゼンカズラ科植物の細胞を懸濁培養または固体培養により増殖させる細胞増殖工程を工程(a)の前段階に含む、請求項1記載の方法。
- 請求項1の工程(a)で得られた、細胞塊。
- 請求項1の工程(a)で得られた細胞塊、工程(a)で用いられた培地またはその両者を含有する、食品。
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