JP4560629B2

JP4560629B2 - Antineoplastic effect enhancer of tumor necrosis induction therapy

Info

Publication number: JP4560629B2
Application number: JP2005159492A
Authority: JP
Inventors: 茂樹串田
Original assignee: 国立大学法人筑波大学
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2025-05-31
Also published as: JP2006306824A

Description

本発明は、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤に関する。 The present invention relates to an antitumor effect potentiator for tumor necrosis induction therapy.

温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法や、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法など、腫瘍細胞に壊死を誘導する治療方法は、ある種の癌に対して効果があることは疑いのない事実である。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものではなく、臨床患者においては、腫瘍壊死誘導療法だけでは癌の原発巣ならびに転移を完全に抑制することは困難な場合が多い。そこで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強するために、ある種のサイトカインを腫瘍壊死誘導療法に併用する治療方法が提案されている。この治療方法は、サイトカインによって宿主の免疫系を活性化することで、腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強しようとするものである。例えば、非特許文献１には、ＴＮＦ−αとＩＬ−２を全身温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献２や非特許文献３や非特許文献４には、ＩＬ−２を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。また、非特許文献５には、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γと抗癌剤であるメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）を局所温熱療法と併用する治療方法が記載されている。
Fritz, K.L. et al. J. Surg. Res. 60, 55-60(1996) Geeham, D.M. et al. J. Surg. Oncol. 59, 35-39(1995) Nakayama, J. et al. Br. J. Dermatol. 130, 717-724(1994) Shen, R.-N. et al. Cancer Res. 50, 5027-5030(1990) Lienard, D. et al. J. Clin. Oncol. 10, 52-60(1992) Tumor cells, such as physical therapy such as hyperthermia, cryotherapy, radiation therapy, photocoagulation, photodynamic therapy, tumor vascular embolization, and drug therapy with anticancer agents, hormones, angiogenesis inhibitors, molecular targeted drugs, etc. There is no doubt that treatment methods that induce necrosis are effective against certain types of cancer. However, the effect is not always sufficient, and in clinical patients, it is often difficult to completely suppress the primary lesion and metastasis of cancer by tumor necrosis induction therapy alone. Therefore, in order to enhance the antitumor effect of tumor necrosis induction therapy, a treatment method using a combination of certain cytokines with tumor necrosis induction therapy has been proposed. This treatment method is intended to enhance the antitumor effect of tumor necrosis induction therapy by activating the host immune system with cytokines. For example, Non-Patent Document 1 describes a treatment method using TNF-α and IL-2 in combination with whole body thermotherapy. Non-patent document 2, Non-patent document 3 and Non-patent document 4 describe treatment methods using IL-2 in combination with local hyperthermia. Non-Patent Document 5 describes a treatment method using TNF-α, IFN-γ, and melphalan, which is an anticancer agent, in combination with local hyperthermia.
Fritz, KL et al. J. Surg. Res. 60, 55-60 (1996) Geeham, DM et al. J. Surg. Oncol. 59, 35-39 (1995) Nakayama, J. et al. Br. J. Dermatol. 130, 717-724 (1994) Shen, R.-N. et al. Cancer Res. 50, 5027-5030 (1990) Lienard, D. et al. J. Clin. Oncol. 10, 52-60 (1992)

しかしながら、これまでに提案されている上記の方法は、サイトカインによる宿主の免疫系活性化作用が必ずしも十分ではなく、また、サイトカインを多量に投与しなければならないために重篤な有害事象を招く恐れがあるので、一般的な癌の治療方法にはなり得なかった。 However, the above-mentioned methods proposed so far are not necessarily sufficient for the activation of the host immune system by cytokines, and may cause serious adverse events due to the high dose of cytokines. Therefore, it could not be a general cancer treatment method.

そこで本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide an antitumor effect potentiator for tumor necrosis induction therapy using cytokines that can effectively and avoid the occurrence of serious adverse events.

これまで、癌の免疫療法としては、癌ワクチン療法や、樹状細胞（ＤＣ）療法、サイトカイン遺伝子などを用いた遺伝子治療など、多くの臨床試験が試行されてきたが、癌患者のひどい免疫抑制状態による様々なバリアーを克服することは非常に困難である。腫瘍細胞は宿主の免疫防御に打ち勝って増殖しているので、免疫療法のみで癌を退縮させることは難しいかもしれない。免疫療法の抗腫瘍効果を改良するためには、腫瘍細胞に壊死を誘導できる温熱療法や放射線療法などの他の治療方法を併用することが重要かもしれない。免疫療法以外の方法により腫瘍細胞に壊死を誘導した後で、十分な樹状細胞の活性化および細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やナチュラルキラー細胞（ＮＫ）などのキラーリンパ球の効果的な誘導の可否が免疫療法の重要な鍵となる。一方で、感染と華氏１０２から１０５度（３８．８〜４０．６℃）の高熱の後に様々な種類の癌が自然退縮することが知られていて、コーリィ毒素（感染すると高熱を生じる２種類の細菌を熱で不活性化したもの）は、癌患者においてある程度の治療効果を得ている。これらの場合、癌患者にサイトカインストーム（多種多様のサイトカインが嵐のイメージのように同時に誘導されること）が誘導され、免疫抑制状況に打ち勝つ強力な抗腫瘍免疫が確立された可能性がある。そこで、本発明者は、腫瘍壊死誘導療法の１つである温熱療法に対し、多種多様のサイトカインを使用して人工的にサイトカインストームを誘導するサイトカインカクテル療法を試みたところ、その抗腫瘍効果が増強されることを見出した。 So far, many clinical trials such as cancer vaccine therapy, dendritic cell (DC) therapy, gene therapy using cytokine genes, etc. have been tried as immunotherapy of cancer, but severe immunosuppression of cancer patients It is very difficult to overcome various barriers depending on the situation. Since tumor cells have grown overcoming host immune defenses, it may be difficult to regress cancer with immunotherapy alone. In order to improve the antitumor effect of immunotherapy, it may be important to combine other therapies such as hyperthermia and radiation therapy that can induce necrosis in tumor cells. After inducing necrosis in tumor cells by methods other than immunotherapy, sufficient dendritic cell activation and effective induction of killer lymphocytes such as cytotoxic T cells (CTL) and natural killer cells (NK) Whether or not is an important key to immunotherapy. On the other hand, it is known that various types of cancer regress spontaneously after infection and high fever of 102 to 105 degrees Fahrenheit (38.8-40.6 ° C). The bacteria inactivated by heat) have a certain therapeutic effect in cancer patients. In these cases, it is possible that a cytokine storm (a variety of cytokines are induced simultaneously like a storm image) is induced in cancer patients, and strong anti-tumor immunity that overcomes the immunosuppressive situation has been established. Therefore, the present inventor attempted a cytokine cocktail therapy that artificially induces a cytokine storm using a variety of cytokines against hyperthermia, which is one of the tumor necrosis induction therapies. It was found to be enhanced.

上記の知見に基づいてなされた本発明の腫瘍壊死誘導療法としての温熱療法の抗腫瘍効果増強剤は、請求項１記載の通り、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルとして、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする。

The antitumor effect enhancer of hyperthermia as the tumor necrosis induction therapy of the present invention made based on the above findings, as described in claim 1, interferon, Th1 cytokine, Th2 cytokine, inflammation-inducing cytokine, Cytokine cocktails configured by combining dendritic cell-derived cytocanin include IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-4, IL- It consists of 1α, TNF-α, IL-3, and GM-CSF .

本発明によれば、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the anti-tumor effect potentiator of the tumor necrosis induction therapy using cytokine which can avoid the invitation of an effective and serious adverse event can be provided.

本発明の腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤は、インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルからなることを特徴とするものである。 The antitumor effect potentiator of the tumor necrosis induction therapy of the present invention comprises a cytokine cocktail comprising a combination of interferon, Th1 cytokine, Th2 cytokine, inflammation-inducing cytokine, and dendritic cell-inducing cytocanin. It is what.

本発明において、インターフェロンとは、脊椎動物の細胞に抗ウィルス活性を誘導したり、単球やマクロファージやナチュラルキラー細胞の活性を増強したりする作用などを有する低分子量の蛋白質を意味し、具体的には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどを挙げることができる。ここで、ＩＦＮ−αとは、主に白血球が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−βとは、主に繊維芽細胞が産生するインターフェロンを意味する。ＩＦＮ−γとは、ＩＬ−１２により主にＴ細胞やナチュラルキラー細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の機能と増殖を阻害する作用を有するインターフェロンを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。 In the present invention, interferon means a low molecular weight protein having an action of inducing antiviral activity in vertebrate cells or enhancing the activity of monocytes, macrophages and natural killer cells. Can include IFN-α, IFN-β, IFN-γ, and the like. Here, IFN-α means interferon produced mainly by leukocytes. IFN-β means interferon produced mainly by fibroblasts. IFN-γ means interferon produced mainly by T cells and natural killer cells by IL-12 and having an action of inhibiting the function and proliferation of Th2 cells. These may be natural products isolated and purified from mammals (preferably humans), or artificially produced by genetic engineering techniques (amino acid substitution or Deletion or addition may be performed).

本発明において、Ｔｈ１サイトカインとは、Ｔｈ１細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ１）が産生またはＴｈ１細胞を誘導・増殖し、その結果、細胞性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−２とは、Ｔｈ１細胞が産生し、リンパ球の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１２とは、樹状細胞や単球やマクロファージなどが産生し、ナイーブＴｈ細胞からのＴｈ１細胞への分化を促進したり、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１５とは、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、Ｔ細胞の増殖やナチュラルキラー細胞の活性化、細胞障害性Ｔ細胞とリンフォカイン活性化キラー細胞の誘導などの作用を有するサイトカインを意味する。ＩＬ−１８とは、単球やマクロファージなどが産生し、Ｔ細胞を増殖したり、ＩＬ−１２とは別の経路によりＴｈ１細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導したり、ナチュラルキラー細胞活性を増強したりする作用などを有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。 In the present invention, Th1 cytokine means a cytokine that Th1 cells (helper T cell type 1) produce or induce / proliferate Th1 cells, and as a result, induces a cellular immune response. -2, IL-12, IL-15, IL-18 and the like. Here, IL-2 means a cytokine produced by Th1 cells and having effects such as proliferation of lymphocytes, activation of natural killer cells, induction of cytotoxic T cells and lymphokine-activated killer cells. IL-12 is produced by dendritic cells, monocytes, macrophages, etc., and promotes differentiation of naive Th cells into Th1 cells, or induces IFN-γ production from T cells or natural killer cells. It means a cytokine having an action of enhancing natural killer cell activity. IL-15 is a cytokine produced by monocytes, macrophages, fibroblasts, etc., and has effects such as T cell proliferation, activation of natural killer cells, induction of cytotoxic T cells and lymphokine-activated killer cells Means. IL-18 is produced by monocytes, macrophages and the like, proliferates T cells, induces IFN-γ production from Th1 cells and natural killer cells by a different route from IL-12, natural killer, It means a cytokine having an effect of enhancing cell activity. These may be natural products isolated and purified from mammals (preferably humans), or artificially produced by genetic engineering techniques (amino acid substitution or Deletion or addition may be performed).

本発明において、Ｔｈ２サイトカインとは、Ｔｈ２細胞（ヘルパーＴ細胞タイプ２）が産生し、液性免疫応答を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−４などを挙げることができる。ここで、ＩＬ−４とは、Ｔｈ２細胞が産生し、Ｔｈ２細胞の誘導とＴｈ１細胞の誘導抑制作用や、Ｂ細胞の増殖や活性化などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。 In the present invention, the Th2 cytokine means a cytokine that is produced by a Th2 cell (helper T cell type 2) and induces a humoral immune response, and specific examples include IL-4. Here, IL-4 means a cytokine produced by Th2 cells and having actions such as Th2 cell induction and Th1 cell induction suppression action, and B cell proliferation and activation. These may be natural products isolated and purified from mammals (preferably humans), or artificially produced by genetic engineering techniques (amino acid substitution or Deletion or addition may be performed).

本発明において、炎症誘導サイトカインとは、感染症などに対する宿主反応として生じる発熱、発赤、腫脹、疼痛などを伴う炎症反応を誘導するサイトカインを意味し、具体的には、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−αなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−１αとは、単球やマクロファージ、Ｔｈ２細胞などが産生し、Ｔｈ２細胞やＢ細胞の増殖・分化促進、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの産生の誘導、発熱などの作用を有するサイトカインのうち、等電点が５．０のものを意味する。ＴＮＦ−αとは、Ｔｈ１細胞、単球やマクロファージ、繊維芽細胞などが産生し、単球やマクロファージや血管内皮細胞などからのＩＬ−１、ＩＬ−６などの産生誘導、好中球機能の増強、発熱活性などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。 In the present invention, the inflammation-inducing cytokine means a cytokine that induces an inflammatory response accompanied by fever, redness, swelling, pain, etc., which occurs as a host response to an infection or the like. Specifically, IL-1α, TNF-α And so on. Here, IL-1α is produced by monocytes, macrophages, Th2 cells and the like, and promotes proliferation and differentiation of Th2 cells and B cells, IL-1, IL-6, TNF-α, etc. from monocytes and macrophages. It means that the isoelectric point is 5.0 among cytokines having effects such as induction of production and fever. TNF-α is produced by Th1 cells, monocytes, macrophages, fibroblasts, etc., and induces production of IL-1, IL-6, etc. from monocytes, macrophages, vascular endothelial cells, etc., and functions of neutrophils It means a cytokine having effects such as enhancement and pyrogenic activity. These may be natural products isolated and purified from mammals (preferably humans), or artificially produced by genetic engineering techniques (amino acid substitution or Deletion or addition may be performed).

本発明において、樹状細胞誘導サイトカンインとは、樹状細胞を誘導する作用を有するサイトカンインを意味し、具体的には、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦなどを挙げることができる。ここで、ＩＬ−３とは、Ｔ細胞や胸腺上皮細胞が産生し、造血幹細胞や造血前駆細胞の分化、樹状細胞や好酸球の分化などの作用を有するサイトカインを意味する。ＧＭ−ＣＳＦとは、骨髄支持細胞やマクロファージやＴ細胞が産生し、骨髄前駆細胞からの樹状細胞やマクロファージ、好中球、好酸球の分化増殖などの作用を有するサイトカインを意味する。これらは、哺乳動物（ヒトが望ましい）から単離・精製された天然品でもよいし、以上の意味を有するものである限り、遺伝子工学的手法により人工的に製造されたもの（アミノ酸の置換や欠失や付加などが施されていてもよい）でもよい。 In the present invention, dendritic cell-derived cytocanin means cytocanin having an action of inducing dendritic cells, and specific examples include IL-3 and GM-CSF. Here, IL-3 means a cytokine produced by T cells and thymic epithelial cells and having actions such as differentiation of hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells, differentiation of dendritic cells and eosinophils. GM-CSF means a cytokine produced by bone marrow support cells, macrophages, and T cells, and having actions such as dendritic cells, macrophages, neutrophils, and eosinophil differentiation from bone marrow precursor cells. These may be natural products isolated and purified from mammals (preferably humans), or artificially produced by genetic engineering techniques (amino acid substitution or Deletion or addition may be performed).

インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、好適には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦの１２種類のサイトカインからなる。各々のサイトカインは、自体公知の方法で製剤化されたものであってよく、これらは、静脈内投与や筋肉内投与や皮下投与などの方法によって非経口的に投与される。各々のサイトカインは、ある閾値以下の投与量では、いくら複数のサイトカインを併用しても各々のサイトカインの効果が生じない可能性がある。抗腫瘍効果を得るためには、必要十分な免疫応答を誘導するための最低投与量以上を併用することが望ましいが、その具体的な投与量は、患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定すべきものである。一般的には１〜１００００万単位／日の範囲内である。腫瘍壊死誘導療法により壊死した腫瘍細胞が存在することが、その後の抗腫瘍免疫応答を誘導するサイトカインカクテル療法には重要である。サイトカインカクテルの投与時期は、例えば、１週間に１〜２度行う腫瘍壊死誘導療法の直前、同時、直後のいずれでもよい。しかしながら、いずれにしても、有効な腫瘍免疫応答を誘導するために、壊死した腫瘍細胞とサイトカインが生体内で少なくても数日程度は同時に存在していることが望ましいと考えられる。サイトカインは生体内での半減期が短いために、反復投与することが重要であるが、例えば、上記の１２種類のサイトカインを連日全て投与することは、患者への負荷が大きすぎることが推測されるので、数種類のサイトカインは数日おきに投与することを検討することが望ましい。 A cytokine cocktail comprising a combination of interferon, Th1 cytokine, Th2 cytokine, inflammation-inducing cytokine, and dendritic cell-inducing cytocanin is preferably IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL- 2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-4, IL-1α, TNF-α, IL-3, and GM-CSF. Each cytokine may be formulated by a method known per se, and these are administered parenterally by methods such as intravenous administration, intramuscular administration, and subcutaneous administration. For each cytokine, there is a possibility that the effect of each cytokine does not occur at a dose below a certain threshold, no matter how many cytokines are used in combination. In order to obtain an antitumor effect, it is desirable to use more than the minimum dose to induce a necessary and sufficient immune response, but the specific dose depends on the patient's age, weight, gender, symptoms, etc. It should be decided accordingly. Generally, it is in the range of 1 to 10 million units / day. The presence of tumor cells necrotized by tumor necrosis induction therapy is important for subsequent cytokine cocktail therapy that induces an anti-tumor immune response. The administration timing of the cytokine cocktail may be, for example, immediately before, simultaneously with, or immediately after the tumor necrosis induction therapy performed once or twice a week. However, in any case, in order to induce an effective tumor immune response, it may be desirable for necrotic tumor cells and cytokines to be present simultaneously in vivo for at least several days. Cytokines have a short half-life in vivo, so it is important to administer them repeatedly. For example, it is speculated that administration of all of the above-mentioned 12 types of cytokines every day would cause too much burden on the patient. Therefore, it is desirable to consider administering several types of cytokines every few days.

本発明の抗腫瘍効果増強剤が併用される腫瘍壊死誘導療法は、可能な限り広義に解釈されるべきものであり、腫瘍細胞に壊死を誘導することで癌の治療効果をあげることができる方法であればどのような治療方法であってもよい。具体的には、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法が好適に例示される。ここで、物理療法とは、物理的なエネルギーを人体に外部から適用したり、カテーテルなどを介して各種の塞栓物質を血管内に注入することで腫瘍血管を物理的に閉塞させたりするなど、薬剤の直接的な効果だけにはよらない物理的な手技を用いる癌の治療方法を意味する。温熱療法は、物理的なエネルギーとして熱を利用した方法である。具体的には、電磁波、放射線、超音波、温水、機能性磁性微粒子の交流磁場下での発熱などによる熱の力により、表在や深部にある腫瘍細胞を直接壊死させたり、担癌宿主の免疫システムを活性化させて抗腫瘍効果を発揮させたりする方法であって、腫瘍局所を加温する局所加温法と全身加温法に大別される。主にＴｈｅｍｏｔｒｏｎ−ＲＦなどのｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＲＦ）波を用いた誘電型加温装置やマイクロ波加温装置が使用されているが、放射型深部加温装置、ｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ方式による加温装置、血液の体外循環による加温装置、超音波を用いて深部腫瘍を焼くＨｉｇｈｉｎｔｅｎｓｉｔｙｆｏｃｕｓｅｄｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＨＩＦＵ）による装置などもある。凍結療法は、液体窒素などにより腫瘍組織を凍結融解して破壊する方法である。放射線療法は、物理的なエネルギーとして放射線を利用した方法である。放射線とは、物質を通過するときに衝突によって直接または間接に電離を起こしたり、核変換を起こすのに十分な運動エネルギーをもったりした粒子である。癌治療に用いられる放射線には、ライナックやベータートロンなどの照射装置から発生する高エネルギーＸ線や高エネルギー電子線、コバルト６０遠隔照射装置や高線量率腔内照射装置で使用する⁶⁰Ｃｏや¹⁹²Ｉｒなどから発生するγ線、Ｘ線やγ線に比較して線量分布が優れている陽子線、生物学的効果が優れている中性子線、線量分布と生物学的効果の両方が優れている重粒子線などがある。光凝固法と光線力学的治療法は、物理的なエネルギーとして光を利用した方法である。前者は、レーザー光線で腫瘍組織を焼いたり蒸散させたりする方法であり、後者は、腫瘍組織や腫瘍の新生血管に特異的に集積するＰｈｏｔｏｆｒｉｎ、ＢＰＤ−ＭＡ、ＮＰｅ６、ＡＴＸ−Ｓ１０、ＳｎＥＴ２、ＡＬＡ、Ｌｕｔｅｘなどの光センシタイザーを投与してからレーザーを照射し、光の励起により発生する一重項酸素によって腫瘍を破壊する方法である。腫瘍血管塞栓療法は、カテーテルなどを介して血管内にＬｉｐｉｏｄｏｌ、ゼラチンスポンジ、澱粉粒子で作成したＤＳＭ、エタノール、シアノアクリレート、金属コイルなどの塞栓物質を投与して腫瘍血管内を塞ぐことで、腫瘍細胞への栄養や酸素供給を途絶させて抗腫瘍効果を生じさせる方法である。なお、腫瘍壊死誘導療法は、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法であってもよい。抗癌剤とは、塩基と結合してＤＮＡ鎖内やＤＮＡ鎖間にｃｒｏｓｓｌｉｎｋを形成したり、ＤＮＡ鎖を切断したり、ＤＮＡやＲＮＡの合成阻害をしたり、ＲＮＡに機能障害を生じさせたり、ＤＮＡ複製に必要なトポイソメラーゼを阻害したり、細胞***装置である微小管の重合・脱重合を阻害したりすることなどによって抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、ｔｈｉｏｐｅｔａ，ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ，ｂｕｓｕｌｆａｎ，ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ（ＢＣＮＵ），ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ（ＣＣＮＵ），ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＭＣＮＵ），ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ（ＡＣＮＵ），ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ，ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ，ｎｅｄａｐｌａｔｉｎなどのアルキル化剤、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ，ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ，ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ），ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ），ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ，ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ，ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ，ａｍｒｕｂｉｃｉｎなどの抗癌性抗生物質、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ，ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ，ｎａｖｅｌｂｉｎｅ，ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ｎｏｇｉｔｅｃａｎ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｄｏｃｅｔａｘｅｌなどの植物アルカロイド、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｂｅｈｅｎｏｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｔｅｇａｆｕｒ，ＵＦＴ，ｃａｒｍｏｆｕｒ，ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ，Ｓ₁，ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ，ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ，ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ，ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅなどの代謝拮抗剤、その他、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓ，ａｌｌｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ，ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ，亜砒酸などがある。ホルモン剤とは、ホルモン依存性の癌に対してそのホルモンの効果を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、女性ホルモン（エストロゲン）依存性の乳癌に対しては、抗エストロゲン作用を有する、ｔａｍｏｘｉｆｅｎ，ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ，ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｆａｄｒｏｚｏｌｅ，ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ，ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅなどが、男性ホルモン（アンドロゲン）依存性の前立腺癌に対しては、抗アンドロゲン作用を有する、ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ，ｆｌｕｔａｍｉｄｅ，ｆｏｓｆｅｓｔｒｏｌ，ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ，ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ，ｇｏｓｅｒｅｌｉｎなどがある。血管新生阻害剤とは、腫瘍に栄養や酸素を供給する腫瘍血管の新生を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、血管新生に関与する遺伝子産物を標的としたＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）阻害薬や、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害薬、血管内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のチロシンキナーゼ阻害薬などがある。分子標的薬とは、癌細胞の分子生物学的特徴に注目し、正常細胞には影響の少ない新しい治療薬として開発され、腫瘍細胞の増殖、***、浸潤や転移に関与する遺伝子産物の機能を阻害することにより抗腫瘍効果を生じる化合物である。具体的には、慢性骨髄性白血病や胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に対するＫＩＴチロシンキナーゼ阻害薬のｉｍａｔｉｎｉｂ、非小細胞肺癌に対する上皮増殖因子受容体阻害薬のｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、乳癌に対するレセプター型チロシンキナーゼＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）に対するモノクローナル抗体のｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対するＣＤ２０を標的としたモノクローナル抗体のｒｉｔｕｘｉｍａｂや抗ＣＤ２０抗体に放射性同位元素を抱合させた⁹⁰Ｙｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔａｎ、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病に対するＣＤ３３抗体と抗癌性抗生物質のｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎとの結合体であるｇｅｍｔｕｚｕｍａｂｏｚｏｇａｍｉｃｉｎなどがある。 The tumor necrosis induction therapy combined with the antitumor effect enhancer of the present invention should be interpreted as broadly as possible, and a method that can increase the therapeutic effect of cancer by inducing necrosis in tumor cells. Any treatment method may be used. Specifically, physical therapy such as thermotherapy, cryotherapy, radiation therapy, photocoagulation method, photodynamic therapy method, tumor vascular embolization therapy, etc. are preferably exemplified. Here, physical therapy refers to physical application of physical energy to the human body from the outside, and physical occlusion of tumor blood vessels by injecting various embolic substances into blood vessels via catheters, etc. It refers to a method of cancer treatment that uses physical procedures that do not rely solely on the direct effects of the drug. Hyperthermia is a method that uses heat as physical energy. Specifically, by the force of heat from electromagnetic waves, radiation, ultrasonic waves, hot water, heat generation of functional magnetic fine particles under an alternating magnetic field, tumor cells in the superficial and deep areas can be directly necrotic, A method of activating the immune system to exert an anti-tumor effect, which is roughly divided into a local heating method for heating a tumor local area and a whole body heating method. Dielectric heating devices and microwave heating devices using radiofrequency (RF) waves such as Thermotron-RF are mainly used. Radiation type deep heating devices, ring application heating devices, blood There is also a warming device by extracorporeal circulation, a device by High intensity focused ultrasound (HIFU) that burns deep tumors using ultrasonic waves, and the like. Cryotherapy is a method in which tumor tissue is frozen and thawed with liquid nitrogen or the like. Radiation therapy is a method that uses radiation as physical energy. Radiation is a particle that is ionized directly or indirectly by collision when passing through a substance, or has enough kinetic energy to cause nuclear transmutation. The radiation used for cancer treatment includes high energy X-rays and high energy electron beams generated from irradiation devices such as linac and betatron, ⁶⁰ Co and ¹⁹² used in cobalt 60 remote irradiation devices and high dose rate intracavity irradiation devices. Γ rays generated from Ir, proton rays with superior dose distribution compared to X-rays and γ rays, neutron rays with superior biological effects, both dose distribution and biological effects are excellent There are heavy particle beams. Photocoagulation and photodynamic therapy are methods that utilize light as physical energy. The former is a method of burning or evaporating a tumor tissue with a laser beam, and the latter is a photofrin, BPD-MA, NPe6, ATX-S10, SnET2, ALA, which accumulates specifically in the tumor tissue or neovascularization of the tumor. This is a method of irradiating a laser after administering a photosensitizer such as Lutex and destroying the tumor by singlet oxygen generated by excitation of light. Tumor vascular embolization therapy is performed by administering an embolizing substance such as DSM, ethanol, cyanoacrylate, metal coil, etc. made of Lipiodol, gelatin sponge, starch particles into a blood vessel via a catheter, etc. It is a method of producing an antitumor effect by disrupting nutrients and oxygen supply to cells. The tumor necrosis induction therapy may be a drug therapy using an anticancer agent, a hormonal agent, an angiogenesis inhibitor, a molecular target drug, or the like. An anticancer agent is a substance that binds to a base to form a crosslink within or between DNA strands, cleaves a DNA strand, inhibits DNA or RNA synthesis, causes a functional disorder in RNA, It is a compound that produces an antitumor effect by inhibiting topoisomerase necessary for replication or inhibiting polymerization / depolymerization of microtubules, which are cell division devices. Specifically, thiopeta, melphalan, cyclophosphamide, ifosfamide, busulfan, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), ranimustine (MCNU), niscinepantine (ACNU), z mitomycin C, bleomycin, peplomycin, actinomycin D, daunorubicin (daunomycin), doxorubicin (adriamycin), epirubicin, pinexantrone, piranecine cin, antitumor antibiotics such as amrubicin, vincristine, vinblastine, vindesine, navelbine, etoposide, irinotecan, nogitecan, paclitaxel, plant alkaloids such as docetaxel, methotrexate, cytosine arabinoside, behenoyl cytosine arabinoside, gemcitabine, 5-fluorouracil, tegafur, Antimetabolites such as UFT, carbfur, doxifluridine, S ₁ , hydroxyurea, pentostatin, capecitabine, fludarabine, cladribine, and others, L-a There are sparginas, all trans retinoic acid, sobuzoxane, arsenous acid and the like. A hormonal agent is a compound that produces an anti-tumor effect by inhibiting the effect of the hormone on hormone-dependent cancer. Specifically, for female hormone (estrogen) -dependent breast cancer, tamoxifen, toremifene, medoxyprosthelone, fadrozole, anastrozole, exemastane, etc., which have antiestrogenic action, are male hormone (androgen) -dependent prostate cancers. On the other hand, there are estramustine, flutamide, fostrol, leuplorelin, bicalutamide, goserelin, etc. having antiandrogenic action. An angiogenesis inhibitor is a compound that produces an antitumor effect by inhibiting the neovascularization of tumor blood vessels that supply nutrients and oxygen to the tumor. Specifically, Matrix Metalloproteinase (MMP) inhibitors targeting gene products involved in angiogenesis, vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibitors, tyrosine kinase inhibitors of vascular endothelial cell receptor Tie2, and the like. Molecular targeting drugs focus on the molecular biological characteristics of cancer cells and were developed as new therapeutic agents that have little effect on normal cells, and have functions for gene products involved in tumor cell growth, division, invasion and metastasis. It is a compound that produces an antitumor effect by inhibition. Specifically, KIT tyrosine kinase inhibitor imatinib for chronic myelogenous leukemia and gastrointestinal stromal tumor (GIST), epidermal growth factor receptor inhibitor gefitinib for non-small cell lung cancer, receptor tyrosine kinase HER2 / for breast cancer ⁹⁰ Y ibritumab uxetane, CD33-positive acute myeloid conjugated with radioisotope to monoclonal antibody trastuzumab against neu (c-erbB2), monoclonal antibody rituximab targeting anti-CD20 against non-Hodgkin lymphoma (NHL) or anti-CD20 antibody There is gemtuzumab ozogamicin, which is a conjugate of CD33 antibody against leukemia and anticancer antibiotic calicheamicin.

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited and interpreted by the following description at all.

実施例１：ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。ＬＬＣ細胞は理研細胞開発銀行から取り寄せた。ＬＬＣ細胞の培養には日水２のＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＬＬＣ細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。 Example 1: Examination using mice inoculated with Lewis lung cancer cells (LLC cells) (experimental method)
Male C57BL / 6J mice 6-8 weeks old were purchased from Clea Japan. Five to six mice were placed in plastic cages and fed with water and standard laboratory food under SPF conditions (clean environment free from bacteria and virus infection). LLC cells were ordered from RIKEN Cell Development Bank. For the cultivation of LLC cells, a DMEM medium in Nissui 2 with 10% FBS (fetal bovine serum), l-glutamine, and bicarbonate added was used. One million live LLC cells were suspended in 0.05 ml of phosphate buffer saline (PBS) and subcutaneously administered to the back of the right foot of mice.

ＬＬＣ細胞を接種したマウスは次の７つのグループに分け、腫瘍接種後９日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．５℃±０．２℃×９０分を１０、１７、２４日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：ＩＦＮ投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）＋局所温熱療法群（同上）
ｅ）グループ５：Ｔｈ１サイトカイン投与群（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）＋局所温熱療法群（同上）
ｆ）グループ６：Ｔｈ１サイトカイン投与群（同上）＋ＩＦＮ投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上）
ｇ）グループ７：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上） Mice inoculated with LLC cells were divided into the following 7 groups, and treatment was started on day 9 after tumor inoculation.
a) Group 1: PBS-administered control group b) Group 2: Local hyperthermia treatment group (43.5 ° C. ± 0.2 ° C. × 90 minutes on days 10, 17, 24)
c) Group 3: 12 cytokine cocktail administration groups (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-4, IL-1α, TNF) -Α, IL-3, GM-CSF)
d) Group 4: IFN administration group (IFN-α, IFN-β, IFN-γ) + local thermotherapy group (same as above)
e) Group 5: Th1 cytokine administration group (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18) + local thermotherapy group (same as above)
f) Group 6: Th1 cytokine administration group (same as above) + IFN administration group (same as above) + local thermotherapy group (same as above)
g) Group 7: 12 types of cytokine cocktail administration group (same as above) + local hyperthermia group (same as above)

なお、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。ＩＬ−２は塩野義製薬社から購入した。ＩＬ−１８はＭＢＬ社から購入した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βはＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社から購入した。ＩＬ−２とＩＬ−１５はヒト由来のものを用いた（ヒト由来のものでもマウス由来のものでも同じ活性を示す）。他のサイトカインはマウス由来のものを用いた。各々のサイトカインは０．０５ｍｌのＰＢＳに懸濁してマウスの後肢か臀部に皮下投与した。各々のサイトカインの１回投与量は、ＩＬ−１α：５００００ＩＵ、ＩＬ−２：３５００ＩＵ、ＩＬ−３とＩＬ−４とＩＬ−１２：１０００ＩＵ、ＩＬ−１５：５００ＩＵ、ＩＬ−１８：２２７ＩＵ（０．２５μｇ）、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β：２５００ＩＵ、ＩＦＮ−γ：１００００ＩＵ、ＴＮＦ−α：２０００ＩＵ、ＧＭ−ＣＳＦ：２５００ＩＵとした。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは２〜３日毎に計１０回投与した（腫瘍接種後９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０日目）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは週１回計４回投与した（腫瘍接種後９、１６、２３、３０日目）。 IL-1α, IL-3, IL-4, IL-12, IL-15, IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF were purchased from PeproTech. IL-2 was purchased from Shionogi Pharmaceutical. IL-18 was purchased from MBL. IFN-α and IFN-β were purchased from R & D System. IL-2 and IL-15 were derived from humans (showing the same activity whether derived from humans or mice). Other cytokines were derived from mice. Each cytokine was suspended in 0.05 ml of PBS and administered subcutaneously to the hind limb or buttocks of the mouse. One dose of each cytokine was IL-1α: 50000 IU, IL-2: 3500 IU, IL-3 and IL-4 and IL-12: 1000 IU, IL-15: 500 IU, IL-18: 227 IU (0. 25 μg), IFN-α and IFN-β: 2500 IU, IFN-γ: 10000 IU, TNF-α: 2000 IU, and GM-CSF: 2500 IU. IL-1α, IL-3, IL-4, IL-12, IL-18, IFN-γ and TNF-α were administered 10 times every 2-3 days (9, 11, 14, 16, after tumor inoculation, 18, 21, 23, 25, 28, 30 days). IL-2, IL-15, IFN-α, IFN-β, and GM-CSF were administered once a week for a total of 4 times (9, 16, 23, and 30 days after tumor inoculation).

局所温熱療法はタイテック社製のＴｈｅｒｍｏｍｉｎｄｅｒＳＸ−１０Ｒで循環させた温水中にマウスの両後肢の膝下をつけることにより施行した。マウスの中心体温としてＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の温度測定器ＢＡＴ−１０Ｒに接続したＲＥＴ−３プローブにて直腸温を５〜１０分間隔でモニターした。０．２〜０．２５ｍｌのペントバルビタール（大日本製薬社製ネンブタール）の腹腔内投与による麻酔と７０％エタノールの背中への散布下（直腸温の上昇を防ぐために使用）で局所温熱療法中のマウスの中心体温は３４℃から３８℃の間に維持した。各グループ間でマウスの中心体温に有意差はなかった。腫瘍表面の温度は、局所温熱療法５分後には設定した水温と同じになることを確認した。２匹の別のマウスで腫瘍中心の温度も設定した水温と同じになっていることをＰｈｙｓｉｔｅｍｐ社製の２９ゲージのプローブにて確認した（腫瘍中心部の温度測定のためには細くても針をさすために腫瘍から出血を起こすので、当該実験のマウスでは行えない）。 Local hyperthermia was performed by placing knees on both hind limbs of the mouse in warm water circulated with a Thermominder SX-10R manufactured by Taitec. Rectal temperature was monitored at intervals of 5 to 10 minutes with a RET-3 probe connected to a temperature measuring device BAT-10R manufactured by Physitemp as the central body temperature of the mouse. 0.2-0.25 ml of pentobarbital (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Nembutal) under intraperitoneal anesthesia and 70% ethanol sprayed on the back (used to prevent rectal temperature rise) The central body temperature of the mice was maintained between 34 ° C and 38 ° C. There was no significant difference in the central body temperature of mice between each group. It was confirmed that the temperature of the tumor surface was the same as the set water temperature after 5 minutes of local thermotherapy. It was confirmed with a 29 gauge probe made by Physitemp that the temperature at the center of the tumor in two other mice was the same as the set water temperature. (This is not possible with the mouse in this experiment).

（実験結果）
図１に示す。図１において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図１から明らかなように、腫瘍接種後３５日目の時点で、グループ７（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌ）だけが全てのマウスが生存していた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にてグループ７の生存率が有意に最も高く、グループ１（ＰＢＳ）、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ＩＦＮ）に対してはｐ＜０．０１で、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してはｐ＜０．０５で、グループ５（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対してはｐ＝０．０５であった。なお、グループ６（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋Ｔｈ１ｃｙｔｏｋｉｎｅ／ＩＦＮ）は、５匹中２匹のマウスが２回目の温熱療法中に腫瘍からの出血のために死亡したので、解析から除いた。
原発腫瘍（各癌腫瘍接種部位に生じた腫瘍）に対し、ノギスを用いて２方向の直径を測定した。腫瘍体積をＶ＝０．５（ａｂ²）(ａ、ｂは腫瘍の直径で、ｂが短径)で計算したところ、足背に形成された原発腫瘍の増殖は、グループ５、グループ６、グループ７において抑制された。腫瘍接種後９日目に治療を開始したが、その時の各グループでの腫瘍の平均径には一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。腫瘍接種２１日目以後になると、原発腫瘍の増大やそこからの出血、肺転移により数匹のマウスが死亡したので、２１日目の原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果、温熱治療のみのグループ２（６９３ｍｍ³）では、コントロール群であるグループ１（２１６２ｍｍ³）に比較して統計学的に有意な腫瘍抑制効果が認められなかった。しかし、グループ５（５６０ｍｍ³）、グループ６（３６９ｍｍ³）、グループ７（２５５ｍｍ³）では、有意に抑制された（スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定でｐ＜０．０１）。原発腫瘍の増殖はグループ６とグループ７で最も抑制され、両方のグループとも５匹中２匹のマウスで腫瘍の一時的な縮小が認められた。実験を終了した腫瘍接種後３５日目までの時点で統計学的な解析が可能であったグループは２、５、７の３群であった。治療を開始した９日目から３５日目のグループ７の腫瘍増殖曲線は、グループ２と５のそれに比較して、統計学的に有意に抑制された（多重比較検定法でｐ＜０．０１）。腫瘍接種後２３日目以後に解剖したマウスにおいて肉眼的な肺転移の有無を解析した。その結果、グループ７では、肺転移は５匹中１匹だけに認められた。グループ１と５では５匹中４匹に、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６では５匹中５匹のマウスに肺転移が認められた。グループ７では、グループ２、グループ３、グループ４、グループ６と比較して有意に肺転移が抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。 (Experimental result)
As shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis indicates the survival rate, and the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed after tumor inoculation. The number in parentheses is the number of mice used in the experiment. As is apparent from FIG. 1, at the 35th day after tumor inoculation, only the group 7 (Hyperthermia + cytokine cocktail) had all mice alive. The survival rate of group 7 was significantly highest in the Kaplan-Meire method, p <0.01 for group 1 (PBS), group 2 (Hyperthermia), and group 4 (Hyperthermia + IFN), and group 3 (Cytokine cocktail). ) For p <0.05 and for group 5 (Hyperthermia + Th1 cytokine) p = 0.05. Group 6 (Hyperthermia + Th1 cytokine / IFN) was excluded from the analysis because 2 out of 5 mice died due to bleeding from the tumor during the second thermotherapy.
With respect to the primary tumor (tumor produced at each cancer tumor inoculation site), the diameters in two directions were measured using calipers. When the tumor volume was calculated by V = 0.5 (ab ² ) (a and b are the diameter of the tumor, and b is the short diameter), the growth of the primary tumor formed on the back of the foot was found to be group 5, group 6, Suppressed in group 7. Treatment was started on the 9th day after tumor inoculation, but no significant difference was observed in the one-way ANOVA in the average tumor diameter in each group at that time (p> 0.05). After the 21st day after tumor inoculation, several mice died due to an increase in the primary tumor, bleeding from the tumor, and lung metastasis. The average values of the primary tumor diameters on the 21st day were compared. As a result, the thermal treatment only group 2 (693mm ^3), compared to a statistically significant tumor suppression effect was not observed in the group 1 is a control group (2162mm ^3). However, Group 5 (560 mm ^3), Group 6 (369 mm ^3), the group 7 (255 mm ^3), was significantly inhibited (p <0.01 by t-test or Welch's t-test of Student). Primary tumor growth was most inhibited in Groups 6 and 7, with both tumors showing temporary tumor shrinkage in 2 out of 5 mice. Three groups (2, 5, and 7) were able to perform statistical analysis up to 35 days after tumor inoculation when the experiment was terminated. The tumor growth curve of group 7 on the 9th to 35th day after the start of treatment was statistically significantly suppressed compared to that of groups 2 and 5 (p <0.01 in the multiple comparison test). ). The presence or absence of gross lung metastasis was analyzed in mice dissected 23 days after tumor inoculation. As a result, in group 7, lung metastasis was observed in only 1 out of 5 animals. Lung metastasis was observed in 4 out of 5 mice in groups 1 and 5, and 5 out of 5 mice in group 2, group 3, group 4, and group 6. In group 7, pulmonary metastasis was significantly suppressed as compared to group 2, group 3, group 4, and group 6 (p <0.05 by Fisher's exact calculation method).

実施例２：Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞を接種したマウスを用いた検討
（実験方法）
６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレアから購入した。マウスは５〜６匹ずつプラスチックケージに入れて、ＳＰＦコンディション（細菌やウィルス感染などがないきれいな環境）下、水と標準的な実験飼育用の餌を与えた。Ｂ１６−ＢＬ６悪性黒色腫細胞はテキサス大学アンダーソン癌センターのＦｉｄｌｅｒ博士から分与していただいた。Ｂ１６−ＢＬ６細胞の培養にはＧｉｂｃｏ社製のＤＭＥＭ培地に７．５％ＦＢＳ・ｌ−グルタミン・重炭酸を加えたものを使用した。１００万個の生きたＢ１６−ＢＬ６細胞を０．０５ｍｌのリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に懸濁し、マウスの右足背に皮下投与した。 Example 2: Examination using mice inoculated with B16-BL6 malignant melanoma cells (experimental method)
Male C57BL / 6J mice 6-8 weeks old were purchased from Clea Japan. Five to six mice were placed in plastic cages and fed with water and standard laboratory food under SPF conditions (clean environment free from bacteria and virus infection). B16-BL6 malignant melanoma cells were provided by Dr. Fiddler at the University of Texas Anderson Cancer Center. B16-BL6 cells were cultured using Gibco DMEM medium supplemented with 7.5% FBS / l-glutamine / bicarbonate. One million live B16-BL6 cells were suspended in 0.05 ml phosphate buffer saline (PBS) and administered subcutaneously to the right foot of a mouse.

Ｂ１６−ＢＬ６細胞を接種したマウスは次の４つのグループに分け、腫瘍接種後１１日目より治療を開始した。
ａ）グループ１：ＰＢＳ投与のコントロール群
ｂ）グループ２：局所温熱療法群（４３．０℃±０．２℃×１２０分を１２、１９日目に施行）
ｃ）グループ３：１２種類のサイトカインカクテル投与群（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）
ｄ）グループ４：１２種類のサイトカインカクテル投与群（同上）＋局所温熱療法群（同上） Mice inoculated with B16-BL6 cells were divided into the following four groups, and treatment was started from day 11 after tumor inoculation.
a) Group 1: PBS-administered control group b) Group 2: Local hyperthermia group (43.0 ° C. ± 0.2 ° C. × 120 minutes on 12th and 19th days)
c) Group 3: 12 cytokine cocktail administration groups (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-4, IL-1α, TNF) -Α, IL-3, GM-CSF)
d) Group 4: 12 types of cytokine cocktail administration group (same as above) + local hyperthermia group (same as above)

なお、各々のサイトカインに関する詳細と投与量は実施例１と同じである。各々のサイトカインの投与方法はＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αは毎日計１０回投与した（腫瘍接種後１１日目から２０日目まで）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＧＭ−ＣＳＦは３日毎に計４回投与した（腫瘍接種後１１、１４、１７、２０日目）。 The details and doses for each cytokine are the same as in Example 1. As for the administration method of each cytokine, IL-1α, IL-3, IL-4, IL-12, IL-18, IFN-γ and TNF-α were administered 10 times in total (from the 11th day after tumor inoculation, 20 Until the day). IL-2, IL-15, IFN-α, IFN-β, and GM-CSF were administered four times every 3 days (11th, 14th, 17th, and 20th days after tumor inoculation).

局所温熱療法は実施例１と同様にして行った。 Local hyperthermia was performed in the same manner as in Example 1.

（実験結果）
図２に示す。図２において、縦軸は生存率を示し、横軸は腫瘍接種後の経過日数を示す。カッコ内は実験に使用したマウスの数である。図２から明らかなように、腫瘍接種後２４５日目の時点で、グループ４（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ＋ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌ）の生存率が最も高く、５匹中３匹のマウスが生存しており、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒｅ法にて、グループ１（ＰＢＳ）、グループ３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｏｃｋｔａｉｌ）に対してｐ＜０．０１であった。
原発腫瘍の増殖抑制効果を実施例１と同様にして測定した。その結果、グループ２（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、グループ３、グループ４において原発腫瘍の増殖は抑制された。腫瘍接種後１１日目に治療を開始した時点での各グループの腫瘍の平均径は、一方向ＡＮＯＶＡにて有意差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。治療が終了した腫瘍接種後２１日目の時点で原発腫瘍径の平均値を比較した。その結果は、グループ１で９８８ｍｍ³、グループ２で３９４ｍｍ³、グループ３で２３１ｍｍ³、グループ４で３１ｍｍ³であった。治療群では、コントロール群のグループ１に対して、スチューデントのｔ検定あるいはウェルチのｔ検定で有意に腫瘍の増大が抑制された（グループ３、グループ４対グループ１はｐ＜０．０１、グループ４対グループ３はｐ＜０．０１、グループ２対グループ１はｐ＜０．０５）。全てのグループで最後に統計学的な解析が可能であった腫瘍接種後２５日目の時点で、原発腫瘍径の平均値は、グループ１で１４５６ｍｍ³、グループ２で１０３１ｍｍ³、グループ３で４００ｍｍ³、グループ４で７ｍｍ³となり、グループ４ではグループ２に比較しても有意に腫瘍の増大が抑制された（ウェルチのｔ検定でｐ＜０．０５）。グループ４では５匹中３匹のマウスで原発腫瘍が完全に消失し、腫瘍接種後２４５日間の観察期間中に再発は認められなかった。残りの２匹のマウスにおいても、１匹では原発腫瘍は一時的に完全に消失し、他の１匹でも腫瘍からの出血死をするまでの間に原発腫瘍は徐々に縮小を続けた。肉眼的に認められた肺転移数の平均値は、グループ１で２３．６個、グループ２で７．５個、グループ３で３個であった。一方、グループ４では、全てのマウスで肺転移は認められなかった。グループ４ではグループ１、グループ２と比較して肺転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０５）。腫瘍形成をした左後肢の膝リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で１００％（４／４）、グループ３で６０％（３／５）、グループ４で２０％（１／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して膝リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。左鼠径（左後肢の付け根）リンパ節への転移の有無は、グループ１で９２％（１１／１２）、グループ２で５０％（２／４）、グループ３で４０％（２／５）、グループ４で０％（０／５）であった。グループ４ではグループ１と比較して左鼠径リンパ節への転移が有意に抑制された（フィッシャーの直接確率計算法でｐ＜０．０１）。また、治癒したマウス３匹の病理組織学的な解析で、リンパ節や胸腺・脾臓などのリンパ系組織の過形成が観察された。また、腫瘍細胞移植後２４５日も経過した時点で、肺においてのみリンパ球の集積が複数箇所において認められた。他の治療群では観察された肺転移像は全く認められなかった。これらの治癒マウスにおいては、一度生じた肺転移が、本治療方法によって誘導されたキラーリンパ球によって消滅した可能性も考えられる。 (Experimental result)
As shown in FIG. In FIG. 2, the vertical axis indicates the survival rate, and the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed after tumor inoculation. The number in parentheses is the number of mice used in the experiment. As is clear from FIG. 2, at 245 days after tumor inoculation, the survival rate of group 4 (Hyperthermia + cytokine cocktail) was the highest, and 3 out of 5 mice were alive, and the Kaplan-Meire method was used. P <0.01 for Group 1 (PBS) and Group 3 (Cytokine cocktail).
The growth inhibitory effect of the primary tumor was measured in the same manner as in Example 1. As a result, the growth of the primary tumor was suppressed in Group 2 (Hyperthermia), Group 3, and Group 4. There was no significant difference in the average diameter of tumors in each group at the time of starting treatment on the 11th day after tumor inoculation (p> 0.05) in one-way ANOVA. The mean values of the primary tumor diameters were compared at the 21st day after tumor inoculation when the treatment was completed. As a result, the group 1 in 988Mm ^3, Group 2 394Mm ^3, 231 mm ³ in Group 3 was 31 mm ³ in Group 4. In the treatment group, the tumor growth was significantly suppressed by the Student's t-test or Welch's t-test compared to the control group of Group 1 (p <0.01 for group 3, group 4 vs. group 1, group 4). Group 3 vs. p <0.01, Group 2 vs. Group 1 p <0.05). At the time of the last day tumor inoculation after 25 days was possible statistical analyzes in all groups, the average value of the primary tumor diameter, the group 1 in 1456Mm ^3, Group 2 1031Mm ^3, 400 mm in Group 3 ³ and group 4 were 7 mm ³ , and group 4 significantly suppressed tumor growth compared to group 2 (p <0.05 by Welch's t-test). In group 4, the primary tumor disappeared completely in 3 out of 5 mice, and no recurrence was observed during the 245 day observation period after tumor inoculation. In the remaining two mice, the primary tumor disappeared temporarily in one mouse, and the primary tumor gradually decreased until the other mouse died of bleeding from the tumor. The average number of macroscopically observed lung metastases was 23.6 in group 1, 7.5 in group 2, and 3 in group 3. On the other hand, in group 4, no lung metastasis was observed in all mice. In group 4, lung metastasis was significantly suppressed compared to group 1 and group 2 (p <0.05 by Fisher's exact calculation method). The presence or absence of metastasis to the knee lymph node of the left hind limb with tumor formation was 92% (11/12) in group 1, 100% (4/4) in group 2, 60% (3/5) in group 3, It was 20% (1/5) in group 4. In group 4, metastasis to knee lymph nodes was significantly suppressed compared to group 1 (p <0.01 by Fisher's exact calculation method). The presence or absence of metastasis to the left inguinal (root of the left hindlimb) lymph node was 92% (11/12) in group 1, 50% (2/4) in group 2, 40% (2/5) in group 3, It was 0% (0/5) in group 4. In group 4, metastasis to the left inguinal lymph node was significantly suppressed as compared to group 1 (p <0.01 by Fisher's exact calculation method). In addition, histopathological analysis of 3 cured mice revealed hyperplasia of lymphoid tissues such as lymph nodes, thymus and spleen. In addition, when 245 days passed after tumor cell transplantation, accumulation of lymphocytes was observed in multiple places only in the lung. In the other treatment groups, no lung metastasis was observed. In these cured mice, it is also possible that lung metastases that occurred once were extinguished by killer lymphocytes induced by this treatment method.

実施例１と実施例２のまとめ：
実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、Ｔｈ１サイトカイン類（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）は温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。Ｔｈ１サイトカイン類の温熱療法との併用により、原発腫瘍の増大がコントロール群に比較して有意に抑制された。この知見は、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５は細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することが報告されている。ＩＬ−１８は樹状細胞（ＤＣ）からのＩＦＮ−γの強力な誘導剤であり、ＩＬ−１２との併用により数種類のマウス腫瘍の増殖を抑制することが報告されている。また、ＩＦＮ類（ＩＦＮ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−γ）をＴｈ１サイトカイン類（同上）と組み合わせて併用すると、原発腫瘍径の平均値はＴｈ１サイトカイン類単独併用時よりも小さくなった。この知見も、これまでに報告されたことがない新規かつ有益性に富むものであり、本発明の一部を構成する。ＩＦＮ−γは細胞障害性Ｔ細胞を誘導したり、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）やマクロファージを活性化したり、樹状細胞などの抗原提示細胞や腫瘍細胞において腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓＩとｃｌａｓｓＩＩの発現を増強することが報告されている。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−γと同様にナチュラルキラー細胞やマクロファージを活性化したり、腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）のｃｌａｓｓＩとｃｌａｓｓＩＩの発現を増強したり、また抗ウィルス効果を誘導したりすることが報告されている。しかし、ＩＦＮ類だけの併用では温熱療法の抗腫瘍効果を増強できなかった。その増強には、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類の併用が重要である。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは細胞膜上の受容体以後の細胞内情報伝達経路は共通であると考えられているので、温熱療法などの腫瘍壊死誘導療法とサイトカイン類の併用時にはどちらか一方でもよいのかもしれない。 Summary of Example 1 and Example 2:
In an experiment using LLC cells of Example 1, Th1 cytokines (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18) enhanced the antitumor effect of hyperthermia. The combined use of Th1 cytokines with hyperthermia significantly suppressed the increase in primary tumors compared to the control group. This finding is novel and informative that has never been reported before and forms part of the present invention. IL-2, IL-12, and IL-15 have been reported to induce cytotoxic T cells (CTL). IL-18 is a potent inducer of IFN-γ from dendritic cells (DCs), and it has been reported to suppress the growth of several types of mouse tumors in combination with IL-12. Moreover, when IFNs (IFN-α, IL-β, IL-γ) were used in combination with Th1 cytokines (same as above), the average value of the primary tumor diameter was smaller than that when Th1 cytokines were used alone. This finding is also new and useful and has never been reported, and forms part of the present invention. IFN-γ induces cytotoxic T cells, activates natural killer cells (NK) and macrophages, and class I of tumor histocompatibility antigen (MHC) in antigen-presenting cells and tumor cells such as dendritic cells. It has been reported to enhance the expression of class II. Like IFN-γ, IFN-α and IFN-β activate natural killer cells and macrophages, enhance the expression of tumor histocompatibility antigen (MHC) class I and class II, and have antiviral effects. It has been reported to induce. However, the combined use of IFNs alone could not enhance the antitumor effect of hyperthermia. For the enhancement, the combined use of IFNs and Th1 cytokines is important. Since IFN-α and IFN-β are thought to share the intracellular signal transduction pathway after the receptor on the cell membrane, either of them may be used in combination with tumor necrosis-inducing therapy such as hyperthermia and cytokines Maybe.

実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、本発明の１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルは、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果を増強した。この１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の原発腫瘍の増大も抑制した。実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験では、ＩＦＮ類とＴｈ１サイトカイン類と温熱療法との併用よりも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法の方が、腫瘍接種後２１日目の原発腫瘍の平均径をより小さくした（３６９ｍｍ³対２５５ｍｍ³）。さらに、実施例１のＬＬＣ細胞を用いた実験でも、実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験でも、１２種類のサイトカインカクテルと温熱療法との併用療法は、いずれの細胞の肺転移も強力に抑制した。他の治療法はいずれの細胞の肺転移も抑制しなかった。最終的な生存率も、この治療方法で最も長い結果が得られた。特に実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、この治療方法により６０％のマウスで腫瘍が消失し、それらのマウスでは２４５日の観察期間中に局所再発も肺・リンパ節への転移も生じなかった。ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞を誘導・分化させることが報告されている。樹状細胞（ＤＣ）は腫瘍関連抗原をその細胞膜上に提示して細胞障害性Ｔ細胞を誘導することで、腫瘍特異的な免疫応答を生じさせるのに重要である。ＴＮＦ−αはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を活性化したり、リンパ球を増殖させたり、マクロファージから炎症誘導サイトカインであるＩＬ−１やＩＬ−６を誘導したり、血管内皮細胞を活性化させたり、発熱反応を生じさせることが報告されている。ＩＬ−１αは、リンパ球や血管内皮細胞を活性化させたり、炎症部位で局所組織を破壊することによりエフェクター細胞の侵入を容易にしたり、単球やマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの炎症誘導サイトカインの産生を誘導したり、発熱反応を生じさせることが報告されている。 In both experiments using the LLC cells of Example 1 and experiments using the B16-BL6 cells of Example 2, the cytokine cocktail constituted by combining the 12 types of cytokines of the present invention is the most powerful anti-thermotherapy agent. Increased tumor effect. The combination therapy of these 12 kinds of cytokine cocktails and hyperthermia suppressed the growth of the primary tumor of any cell. In the experiment using the LLC cells of Example 1, the combination therapy of 12 kinds of cytokine cocktails and thermotherapy was more effective on the 21st day after tumor inoculation than the combination of IFNs, Th1 cytokines and thermotherapy. It was smaller average diameter of the primary tumor (369 mm ³ vs. 255 mm ^3). Furthermore, in the experiment using the LLC cells of Example 1 and the experiment using the B16-BL6 cells of Example 2, the combination therapy of 12 kinds of cytokine cocktails and hyperthermia is strong in pulmonary metastasis of any cell. Suppressed. Other treatments did not inhibit lung metastasis of any cells. The final survival rate was also the longest with this treatment method. In particular, in the experiment using B16-BL6 cells of Example 2, tumors disappeared in 60% of mice by this treatment method. In these mice, local recurrence and metastasis to lungs and lymph nodes were observed during the observation period of 245 days. Also did not occur. IL-3 and GM-CSF have been reported to induce and differentiate dendritic cells. Dendritic cells (DC) are important in generating tumor-specific immune responses by presenting tumor-associated antigens on their cell membranes and inducing cytotoxic T cells. TNF-α activates natural killer cells (NK), proliferates lymphocytes, induces inflammation-inducing cytokines IL-1 and IL-6 from macrophages, activates vascular endothelial cells, It has been reported to cause an exothermic reaction. IL-1α activates lymphocytes and vascular endothelial cells, facilitates invasion of effector cells by destroying local tissues at the site of inflammation, IL-1, IL-6 from monocytes and macrophages, It has been reported that it induces the production of inflammation-inducing cytokines such as TNF-α and causes a fever reaction.

Ｔｈ２リンパ球とＴｈ１リンパ球はお互いに制御してバランスを取り合っている。Ｔｈ１リンパ球から産生されるＩＦＮ−γはＴｈ２リンパ球の分化と増殖を抑制し、Ｔｈ２リンパ球から産生されるＩＬ−４やＩＬ−１０はＴｈ１リンパ球の分化と増殖を抑制する。１２種類のサイトカインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルにより、最も強力に温熱療法の抗腫瘍効果が増強されたことは、担癌状態では従来言われているＴｈ１リンパ球だけでなく、Ｔｈ２リンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、多核白血球など、全ての免疫関連細胞が抑制されている可能性がある。実際に、卵白アルブミンを人工的に遺伝子導入したマウス腫瘍細胞の系を用いた免疫療法実験では、治癒機転としてＴｈ１リンパ球が誘導される場合とＴｈ２リンパ球が誘導される場合があることが報告されている。また、細胞障害性Ｔ細胞の増殖と活性化に必要なＩＬ−２が、逆に一度活性化されたＴリンパ球の機能を抑制するＣＴＬＡ−４という分子を誘導するという知見もある。一種類のサイトカインだけを使用すると、担癌状態といえども生体内でその経路に対する抑制経路が生じて、十分な抗腫瘍効果が得られない可能性も考えられる。これまでの多くの知見より、強い免疫抑制状況にある担癌状態においては１〜２種類のサイトカインを用いても、抗腫瘍効果に関与する免疫系全体を活性化することは極めて困難なことであると考えられる。培養細胞や正常のマウスを使用して得られたサイトカインの免疫活性化作用の実験結果は、担癌状態では機能していない可能性もある。実際に、ペプチドワクチンを用いた臨床試験では、せっかく細胞障害性Ｔ細胞が誘導されていても免疫抑制環境の強い腫瘍内では腫瘍細胞に対して障害活性を示さないという報告もされている。多種類のサイトカインを併用することにより、担癌状態での多種類の免疫抑制機序に対処し、多種類の免疫細胞を同時に活性化して有効な腫瘍免疫応答を誘導できる可能性がある。サイトカインストームを人工的に起こすことにより、自己免疫疾患を引き起こす可能性も否定できないので、その点は治療対象の選択と長期間の観察などの注意が必要である。今回の実施例２のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験で、２４５日間の経過観察をした３匹の治癒マウスでは、治療終了後は体重減少、脱毛、神経麻痺などの症状は見られなかった。逆に、Ｔｈ１サイトカイン類とＴｈ２サイトカイン類の併用により、どちらか一方だけが活性化されることを防ぎ、生体内で免疫応答のバランスが適切にとれる可能性も期待できる。また、多種類のサイトカインを併用することで、一つ一つのサイトカインの投与量を減らせる可能性があり、有害事象を減らせる可能性も期待できる。 Th2 lymphocytes and Th1 lymphocytes control each other and balance each other. IFN-γ produced from Th1 lymphocytes suppresses differentiation and proliferation of Th2 lymphocytes, and IL-4 and IL-10 produced from Th2 lymphocytes inhibit differentiation and proliferation of Th1 lymphocytes. The anti-tumor effect of hyperthermia was most potently enhanced by a cytokine cocktail composed of 12 types of cytokines. In addition to Th1 lymphocytes that have been conventionally said in cancer-bearing states, Th2 lymphocytes, All immune-related cells such as dendritic cells (DC), macrophages, and multinucleated leukocytes may be suppressed. In fact, in an immunotherapy experiment using a mouse tumor cell system in which ovalbumin has been artificially introduced, Th1 lymphocytes and Th2 lymphocytes may be induced as healing mechanisms. Has been. There is also a finding that IL-2, which is necessary for the proliferation and activation of cytotoxic T cells, induces a molecule called CTLA-4 that suppresses the function of T lymphocytes once activated. If only one kind of cytokine is used, there is a possibility that even in a cancer-bearing state, a suppression pathway for that pathway occurs in vivo, and a sufficient antitumor effect cannot be obtained. Based on many findings so far, it is extremely difficult to activate the entire immune system involved in the antitumor effect even if one or two cytokines are used in a cancer-bearing state in a strong immunosuppressed state. It is believed that there is. The experimental results of the immunostimulatory effect of cytokines obtained using cultured cells and normal mice may not function in a cancer-bearing state. In fact, in clinical trials using peptide vaccines, it has been reported that even if cytotoxic T cells are induced, no cytotoxic activity is shown against tumor cells in tumors with a strong immunosuppressive environment. By using multiple types of cytokines together, it may be possible to cope with multiple types of immunosuppressive mechanisms in a cancer-bearing state and simultaneously activate multiple types of immune cells to induce an effective tumor immune response. Since the possibility of causing an autoimmune disease by artificially causing a cytokine storm cannot be denied, attention should be paid to selection of a treatment target and long-term observation. In the experiment using the B16-BL6 cells of Example 2 in this time, in the three cured mice that were observed for 245 days, symptoms such as weight loss, hair loss, and nerve paralysis were not observed after the treatment was completed. Conversely, the combined use of Th1 cytokines and Th2 cytokines prevents only one of them from being activated, and the possibility of appropriately balancing the immune response in vivo can also be expected. Moreover, by using many kinds of cytokines together, there is a possibility that the dose of each cytokine can be reduced, and the possibility of reducing adverse events can be expected.

温熱療法に併用した１２種類のサイトカインカクテル療法の抗腫瘍効果は、Ｂ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の方がＬＬＣ細胞を用いた実施例１よりも強かった。前者では６０％（３／５）のマウスで足背の原発腫瘍が消失し、また全てのマウスで肺転移が認められなかった。しかし、治癒マウス３匹のうち２匹のマウスでは、治療中に腫瘍形成した左足が壊死により欠失し、また全てのマウスで後肢に一時的な脱毛が生じた。一方で、後者では足の欠失や脱毛は見られなかったが、原発腫瘍は完全には消失せず、肺転移も認められた。これらの理由としては、ＬＬＣ細胞の増殖速度がＢ１６−ＢＬ６細胞よりも速かったこと、治療開始時点の腫瘍径の平均値の違い（ＬＬＣ細胞群：７２．６ｍｍ³、Ｂ１６−ＢＬ６細胞群：４０．６ｍｍ³）が考えられる。また、２つの実験では、温熱療法の温度と処理時間（前者は４３．５℃±０．２℃×９０分、後者は４３．０℃±０．２℃×１２０分）、サイトカイン類の投与間隔（前者は２〜３日毎か１週間毎、後者は連日か３日毎）が異なっていた点もある。 The antitumor effect of 12 types of cytokine cocktail therapy combined with hyperthermia was stronger in Example 2 using B16-BL6 cells than in Example 1 using LLC cells. In the former, 60% (3/5) of mice lost the primary tumor on the back of the foot, and no lung metastasis was observed in all mice. However, in 2 out of 3 cured mice, the left paw that formed a tumor during treatment was lost due to necrosis, and all mice had temporary hair loss in the hind limbs. On the other hand, in the latter, there was no foot loss or hair loss, but the primary tumor did not disappear completely and lung metastases were also observed. The reason for this is that the proliferation rate of LLC cells was faster than that of B16-BL6 cells, and the difference in mean value of tumor diameter at the start of treatment (LLC cell group: 72.6 mm ³ , B16-BL6 cell group: 40 .6 mm ³ ) is conceivable. In two experiments, the temperature and treatment time of the thermotherapy (the former is 43.5 ° C. ± 0.2 ° C. × 90 minutes, the latter is 43.0 ° C. ± 0.2 ° C. × 120 minutes), and administration of cytokines There is also a difference in the interval (the former is every 2-3 days or every week, the latter is every day or every 3 days).

ＬＬＣ細胞を用いた実施例１とＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実施例２の２つの実験結果より、十分な抗腫瘍効果を得るためには１２種類のサイトカインの投与は１週間に２回以上必要であることが推測される。抗腫瘍効果を高めて有害事象を減らすためには、腫瘍壊死誘導療法の最適化、例えば、温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の場合には、その強度や処理時間や処理間隔の最適化、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法の場合には、その投与量や投与間隔の最適化などに加え、サイトカイン類の投与量や投与間隔や投与量の最適化などを検討して、個々の患者に対する最適な方法を確立しなければいけない。また、各サイトカインの併用時における作用機序やその有用性についても検討しなければいけない。過去に施行した別のＢ１６−ＢＬ６細胞を用いた実験では、温熱療法のみで腫瘍形成させた足が欠失した場合には、１週間前後で必ずその断端への局所再発や膝リンパ節への転移が生じ、腫瘍の根治は決してできなかった。しかし、今回の温熱療法に１２種類のサイトカインカクテル療法を併用した場合には、局所再発や膝リンパ節への転移が認められたのは２０％（１／５）のみであった。サイトカインが免疫応答の調節を担っていること、治癒マウスにおいてリンパ系組織の過形成と腫瘍の転移先である肺においてのみリンパ球の集積が認められたことより、温熱療法とサイトカインカクテル療法により、何らかの抗腫瘍免疫学的なメカニズムが作用した可能性が示唆される。 From the two experimental results of Example 1 using LLC cells and Example 2 using B16-BL6 cells, 12 types of cytokines need to be administered at least twice a week to obtain a sufficient antitumor effect. It is estimated that. To increase anti-tumor effects and reduce adverse events, optimization of tumor necrosis induction therapy, such as physical therapy such as hyperthermia, cryotherapy, radiation therapy, photocoagulation, photodynamic therapy, tumor vascular embolization, etc. In the case of therapy, optimization of strength, treatment time and treatment interval, in the case of drug therapy with anticancer agents, hormonal agents, angiogenesis inhibitors, molecular targeted drugs, etc., optimization of dosage and administration interval, etc. In addition, it is necessary to examine the dosage of the cytokines, the dosage interval, and the optimization of the dosage, and establish the optimal method for each patient. In addition, the mechanism of action and the usefulness of each cytokine should be examined. In an experiment using other B16-BL6 cells performed in the past, if a foot that had formed a tumor by thermotherapy alone was deleted, local recurrence to the stump or to the lymph nodes of the knee always occurred around one week. Metastasis occurred and the tumor could never be completely cured. However, when 12 types of cytokine cocktail therapy were used in combination with the present hyperthermia, only 20% (1/5) showed local recurrence or metastasis to the knee lymph nodes. Due to the fact that cytokines are responsible for regulating the immune response, and that hyperplastic lymphoid tissues were found in the cured mice and the lymphocytes were accumulated only in the lungs where the tumors were metastasized, thermotherapy and cytokine cocktail therapy This suggests that some anti-tumor immunological mechanism may have worked.

温熱療法、凍結療法、放射線療法、光凝固法、光線力学的治療法、腫瘍血管塞栓療法などの物理療法の他、抗癌剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、分子標的薬などによる薬物療法を含め、腫瘍に壊死を誘導する様々な治療方法が施行されている。それらの腫瘍壊死誘導療法においては、いかに効率よく多くの腫瘍細胞を壊死させられるかという点が重要である。腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果を増強する目的で、前述の通り、いくつかの種類のサイトカインとの併用が試行されてきた。腫瘍壊死誘導療法とサイトカインの併用による癌治療は、壊死した腫瘍細胞をもとに、担癌宿主において抗腫瘍免疫応答を誘導して腫瘍の縮小や再発・転移予防を行うことを目的としている。その際、腫瘍壊死誘導療法の種類によって、抗腫瘍効果の点で併用するサイトカインの種類が変わるという報告はこれまでのところ存在しない。むしろ、メラノーマにはＩＦＮ−γが、肝臓癌にはＩＦＮ−αやＩＦＮ−βが、腎臓癌にはＩＬ−２が効くなど、腫瘍の種類や個々の腫瘍の性質によって抗腫瘍効果のあるサイトカインの種類が規定されていて、サイトカインと併用する腫瘍壊死誘導療法は様々な種類が試みられている。以上の点に鑑みれば、今回の知見で得られたサイトカインカクテルは、腫瘍に壊死を誘導できる方法であれば、物理療法に限らず薬物療法に対しても、その抗腫瘍効果を増強できるものと考えられる。 In addition to physical therapy such as hyperthermia, cryotherapy, radiation therapy, photocoagulation, photodynamic therapy, tumor vascular embolization, and drug therapy with anticancer drugs, hormone drugs, angiogenesis inhibitors, molecular targeted drugs, etc. Various therapies that induce necrosis in tumors have been implemented. In these tumor necrosis induction therapies, it is important how efficiently many tumor cells can be necrotized. In order to enhance the anti-tumor effect of tumor necrosis induction therapy, as described above, combinations with several types of cytokines have been tried. The purpose of cancer treatment using a combination of tumor necrosis-inducing therapy and cytokines is to induce an anti-tumor immune response in a tumor-bearing host based on necrotic tumor cells to prevent tumor shrinkage or recurrence / metastasis. At that time, there has been no report so far that the type of cytokine used in combination with the tumor necrosis-inducing therapy varies in terms of antitumor effect. Rather, IFN-γ is effective for melanoma, IFN-α and IFN-β are effective for liver cancer, and IL-2 is effective for kidney cancer. There are various types of tumor necrosis-inducing therapies used in combination with cytokines. In view of the above points, the cytokine cocktail obtained in this finding can enhance its antitumor effect not only for physical therapy but also for drug therapy as long as it can induce necrosis in the tumor. Conceivable.

本発明は、効果的、かつ、重篤な有害事象の招来を回避することができる、サイトカインを利用した腫瘍壊死誘導療法の抗腫瘍効果増強剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is industrially applicable in that it can provide an anti-tumor effect potentiator for tumor necrosis-inducing therapy using cytokines that can effectively and avoid the occurrence of serious adverse events. Have sex.

実施例１における各試験群についての生存率を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the survival rate for each test group in Example 1. 実施例２における各試験群についての生存率を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the survival rate for each test group in Example 2.

Claims

インターフェロンと、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインと、炎症誘導サイトカインと、樹状細胞誘導サイトカンインを組み合わせて構成されるサイトカインカクテルとして、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦからなることを特徴とする腫瘍壊死誘導療法としての温熱療法の抗腫瘍効果増強剤。 As cytokine cocktails composed of a combination of interferon, Th1 cytokine, Th2 cytokine, inflammation-inducing cytokine, and dendritic cell-inducing cytocanin , IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL- 12, IL-15, IL- 18, IL-4, IL-1α, TNF-α, IL-3, anti-tumor effect enhancer of hyperthermia as a tumor necrosis induction therapy, comprising the GM-CSF .