JP4558948B2 - 卵巣癌において過剰発現される膜貫通型セリンプロテアーゼおよびその使用 - Google Patents
卵巣癌において過剰発現される膜貫通型セリンプロテアーゼおよびその使用 Download PDFInfo
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Description
発明の背景
関連出願への相互参照
本出願は一部継続特許出願であり、1999年3月3日に出願の米国特許出願第09/261,416号に基づき米国特許法第120条による優先権を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、概して、細胞生物学および新生物性疾患の診断の分野に関連する。より詳細には、本発明は、卵巣癌において過剰発現される、腫瘍関連差別的発現遺伝子−12(Tumor Associated Differentially-Expressed Gene-12)(TADG−12)と称される膜貫通型セリンプロテアーゼに関するものである。
【0003】
関連技術
腫瘍細胞は、その原発部位から遊離される一連のプロテアーゼの発現に基づき、さらに離れた部位に移動して致死性をもたらす。その転移性は腫瘍細胞および腫瘍周囲のストローマ細胞によるプロテアーゼの異常発現パターンの結果である[1−3]。転移性となるほとんどの腫瘍において、腫瘍周囲の細胞外マトリックス成分を破壊し、基底膜を破壊して血流またはリンパ系へ接近し、さらに逆向きにその過程を繰り返して第二の宿主部位に定着することが必要である[3−6]。それら過程の全ては、同調プロテアーゼカスケードと現在思われているものに基づく。さらには、腫瘍細胞は、進行的に腫瘍を増殖させる増殖因子および血管新生促進因子を活性化するためにプロテアーゼの力を用いる[1]。従って、腫瘍関連プロテアーゼの同定、および治療手段としてのそれら酵素の阻害を目的とした多数の研究がなされてきた。より重要なこととして、多くのそれらプロテアーゼの分泌性および/高レベルでの発現は、患者血清における異常レベルでの検出を可能とし、例えば前立腺特異的抗原(PSA)は前立腺癌の早期診断を可能とする[7]。
【0004】
プロテアーゼは、腫瘍増殖、腫瘍細胞の脱落およびターゲット器官の浸潤に直接関連している。各クラスのプロテアーゼは、限定はされないが、(1)最初の腫瘍領域の周囲のストローマの消化、(2)腫瘍細胞の解離をもたらす細胞接着分子の消化、および(3)転移性増殖および腫瘍増殖因子と血管新生促進因子の両方の活性化のための基底膜の浸潤に関連する。
【0005】
多くの形態の癌において、この10年間に診断および治療が劇的に改善されている。しかしながら、診断前に進んだステージに疾患を進行させるあいまいな兆候のため、卵巣癌の5年生存率は、依然として50%未満である。CA125抗原の利用は卵巣癌の再発をモニターするためのマーカーとして有用であるが、早期診断のための理想的マーカーであることは証明されていない。従って、細胞から分泌または遊離されかつ卵巣癌において高発現される新しいマーカーは、早期診断のためおよび卵巣癌患者における治療的介入のために有用な手段を提供することができる。
【0006】
先行技術は、癌において過剰発現されるプロテアーゼの完全な同定を欠き、従って、特に卵巣癌のための、早期疾患の指標として有用な腫瘍マーカーを欠いている。詳細には、膜貫通型セリンプロテアーゼであるTADG−12は、これまで核酸またはタンパク質の何れも同定されていなかった。本発明は、本技術分野における長年の必要性および要求を満たすものである。
【0007】
発明の概要
本発明は、腫瘍関連差別的発現遺伝子(TADG)ファミリーの新しいメンバーであるTADG−12、ならびに切断タンパク質産物をもたらし得るTADG−12の変異スプライシング形態(TADG−12V)について開示する。TADG−12は卵巣癌において過剰発現される膜貫通型セリンプロテアーゼである。TADG−12の完全なcDNAが同定されている(配列番号1)。その配列は454アミノ酸から成る推定上のタンパク質(配列番号2)をコードし、そのタンパク質は潜在的な膜貫通領域、LDL受容体様領域、スカベンジャー受容体システインリッチ領域およびセリンプロテアーゼ領域を包含する。それらの特性は、TADG−12が細胞表面において発現され、さらに治療および診断マーカーの分子ターゲットととして用いられ得ることを暗示する。
【0008】
本発明の1つの実施形態において、(a)TADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;(b)上記(a)の単離DNA断片に対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記(a)および(b)の単離DNA断片と異なり、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片:より成る群から選択されたTADG−12タンパク質をコードするDNA断片を提供する。詳細には、そのDNA断片は、配列番号1または配列番号3に示される配列を有する。
【0009】
本発明の別の実施形態において、本発明のDNAを発現し得るベクター/宿主細胞を提供する。
【0010】
本発明のさらに別の実施形態において、(a)TADG−12タンパク質をコードする単離DNA;(b)上記(a)の単離DNAに対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において(c)上記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA:より成る群から選択されたDNAによってコードされる単離および精製したTADG−12タンパク質を提供する。詳細には、そのTADG−12タンパク質は配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する。
【0011】
本発明のさらに別の実施形態において、(a)細胞から採取したmRNAを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ;さらに(b)そのプローブとmRNAとのハイブリダイゼーションを検出する:工程を含むTADG−12タンパク質の発現を検出する方法を提供する。
【0012】
本発明は、さらに、この中に開示のTADG−12タンパク質またはmRNAを検出することによって癌または他の悪性過形成(malignant hyperplasia)を診断する方法を提供する。
【0013】
本発明のさらに別の実施形態において、細胞内でベクターが発現に必要な要素に作動可能に結合した逆配向のTADG−12のDNA断片を包含するように細胞にベクターを導入することによって細胞中における内因性TADG−12mRNAの発現を阻害する方法を提供する。
【0014】
本発明のさらに別の実施形態において、TADG−12タンパク質またはその断片に対する抗体を導入することによって細胞中におけるTADG−12タンパク質の発現を阻害する方法を提供する。
【0015】
本発明のさらに別の実施形態において、TADG−12タンパク質に特異的なターゲット部分および治療部分を有する化合物を投与することによって、ターゲット治療の方法を提供する。詳細には、TADG−12タンパク質は、配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。
【0016】
本発明は、さらに、TADG−12タンパク質またはその断片を個体に接種することによって、個体にTADG−12に対するワクチン接種を行う方法を提供する。詳細には、TADG−12タンパク質は、配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。TADG−12断片として、配列番号8に示す配列を有するTADG−12Vの切断形態、およびTADG−12タンパク質の9残基断片から12残基断片までの断片が挙げられる。
【0017】
本発明のさらに別の実施形態において、TADG−12タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含む免疫原組成物を提供する。TADG−12断片として、配列番号8に示す配列を有するTADG−12Vペプチドの切断形態、およびTADG−12タンパク質の9残基断片から12残基断片までの断片が挙げられる。
【0018】
本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の開示の目的で提供された本発明の現在の好ましい実施形態の記載から明らかであろう。
【0019】
図面の簡単な説明
本発明の上記の特徴、利点および目的、ならびに明らかになるであろう他のことが達成されかつ詳細に理解され得るように、添付図面に例示された本発明のある実施形態を参照することによって上記において簡単に要約された本発明についてのより詳細な説明を行う。それら図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示したものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことに注意すべきである。
【0020】
図1Aは、重複セリンプロテアーゼプライマーを用いた約180bpの予測されたPCR産物および約300bpの予測外のPCR産物が、正常卵巣cDNAからは増幅されない(レーン1)が、卵巣腫瘍cDNAから異常に増幅される(レーン2)ことを示す。PCR反応のためのプライマー配列を水平の矢印で示唆する。図1Bは、TADG−12が180bpバンドからサブクローン化され、一方、大きな300bpバンドがTADG−12Vを指定することを示す。その配列において、180bp(ヌクレオチド配列が配列番号5、推測アミノ酸配列が配列番号6)が、追加の133塩基の挿入を有する300bpTADG−12V(ヌクレオチド配列が配列番号7、推定アミノ酸配列が配列番号8)と重複することが分かった。その挿入(垂直の矢印)はフレームシフトをもたらし、TADG−12Vの転写を生じさせて変異アミノ酸配列を有するTADG−12の切断形態を潜在的に産生する。
【0021】
図2は、TADG−12のノーザンブロット分析において、2.4、1.6および0.7kbの3つの転写物が顕示されたことを示す。それら転写物は、卵巣腫瘍および癌細胞株において顕著なレベルで認められたが、正常卵巣では低レベルでのみ認められた。
【0022】
図3はTADG−12を詳細に調べたRNAドットブロット(CLONTECH)を示す。最も転写量の多い心臓に代表されるように、50全てのヒト組織において、転写物が検出された(バックグラウンドレベルで)。被殻、扁桃、腎臓、肝臓、小腸、骨格筋および副腎が中間レベルのTADG−12転写物を有することも分かった。
【0023】
図4は、オープンリーディングフレームの予測454アミノ酸(配列番号2)と共に、TADG−12のcDNA配列(配列番号1)を示す。ヌクレオチド配列内において、転写開始のためのコザックのコンセンサス配列およびポリアデニル化シグナルに下線を引いている。タンパク質配列において、潜在的な膜貫通領域を線で囲んでいる。セリンプロテアーゼ領域の触媒三つ組残基を丸で囲み、さらに潜在的なタンパク質分解部位として指定されている触媒領域の先頭に矢印で印をつけている。*は転写を終結させる終止コドンを表す。
【0024】
図5Aは、セリンプロテアーゼTMPRSS2(U75329、配列番号14)からの他のLDLR−Aモチーフ、補体サブユニットC8(P07358、配列番号9)、糖タンパク質GP300の2つのLDLR−A領域(P98164、配列番号11−12)およびセリンプロテアーゼのマトリプターゼ(matriptase)(AF118224、配列番号10)と整列させて、TADG−12の35アミノ酸LDLR−A領域(配列番号13)を示す。TADG−12は他のセリンプロテアーゼと最も高い類似性を有し、TMPRSS2に対して54%類似し、マトリプターゼに対して53%類似する。高度に保存されたシステイン残基を太字で示す。図5Bは、ヒトマクロファージスカベンジャー受容体(P21757、配列番号16)、ヒトエンテロキナーゼ(P98073、配列番号19)、ウシエンテロキナーゼ(P21758、配列番号15)およびセリンプロテアーゼTMPRSS2(配列番号18)等の他のドメインファミリーメンバーと整列させて、TADG−12のSRCR領域(配列番号17)を示す。前記と同様にTADG−12はその領域内においてプロテアーゼTMPRSS2に対して最も類似性を示し、43%類似する。図5Cは、プロテアーゼM(U62801、配列番号20)、トリプシノーゲンI(P07477、配列番号21)、血漿カリクレイン(P03952、配列番号22)、ヘプシン(P05981、配列番号25)およびTMPRSS2(配列番号24)等の他のヒトセリンプロテアーゼと整列させて、TADG−12のプロテアーゼ領域(配列番号23)を示す。各配列のコンセンサス配列を示している。
【0025】
図6は、TADG−12(上段パネル)およびTADG−12V(下段パネル)について実施した半定量的PCR分析を示す。内部対照としてのβ−チューブリン産物のPCR増幅と並行して、TADG−12またはTADG−12Vの増幅を実施した。TADG−12転写物は55の癌の内41において過剰発現していることが認められた。TADG−12V転写物は調べた22の癌の内8において過剰発現していることが認められた。上段パネルの試料は下段パネルの試料と必ずしも同じでないことに注意すべきである。
【0026】
図7は、TADG−12特異的ペプチドに対して作成されたポリクロナールウサギ抗体を用いて実施した正常卵巣および卵巣腫瘍の免疫組織化学染色を示す。正常卵巣(図7A)において顕著な染色は検出されなかった。調べた29の癌の内22において強い陽性染色が観察された。図7Bおよび図7Cは、それぞれ、漿液性癌および粘液性癌を示す。何れも腫瘍細胞の細胞質に亘り広汎な染色を示したが、ストロ−マ細胞は相対的に染色されずに残った。
【0027】
図8は、細胞内でのTADG−12の経過を示す。正常環境において、TADG−12転写物は適切にスプライシングされて、得られたタンパク質は細胞表面において発現され、そこでプロテアーゼによって活性形態に分解される。残されたリガンド結合領域の役割は特定されていないが、活性化、内在化またはその両方のために他の分子に結合し得ることを想像できる。いくつかの腫瘍において生じるTADG−12Vの転写物は突然変異の結果でありおよび/またはmRNAの弱いプロセシングは機能的プロテアーゼ領域を持たないTADG−12の切断形態を産生し得る。さらには、その切断産物は腫瘍細胞表面における新規なエピトープを提供し得る。
【0028】
発明の詳細な説明
卵巣癌において発現されているセリンプロテアーゼを調べるため、それらタンパク質における最も高度に保存されたアミノ酸に対して設計された重複PCRプライマーを利用するPCRに基づく差別的表示技術を用いた[9]。結果として、腫瘍関連差別的発現遺伝子−12(TADG−12)と称される新規な細胞表面のマルチドメイン(multi-domain)セリンプロテアーゼを同定した。TADG−12は多くの卵巣腫瘍において過剰発現すると思われる。TADG−12の細胞外特性は、TADG−12特異的測定法を介した腫瘍の検出を可能とする。さらには、調べた腫瘍の35%において、TADG−12Vと称されるTADG−12のスプライシング変異体が上昇レベルで検出された。TADG−12Vは将来の治療的アプローチのための独特な腫瘍特異的ターゲットとなり得る変化したアミノ酸配列と共に、TADG−12の切断形態をコードする。
【0029】
TADG−12 cDNAは2413塩基対長(配列番号1)であり、454アミノ酸タンパク質(配列番号2)をコードする。変異形態のTADG−12V(配列番号3)は294アミノ酸タンパク質(配列番号4)をコードする。TADG−12よび/またはTADG−12V遺伝子を利用し得ることは、種々の応用につながる多くの研究を可能とする。例えば、卵巣癌、ならびに乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌等の他の癌における診断的または治療的ターゲットとしてTADG−12および/またはTADG−12V遺伝子を用いることができる。
【0030】
本発明に基づき、当業技術内の従来の分子生物、微生物および組換えDNA技術を用いて差し支えない。そのような技術は文献に全て記載されている。例えば、Maniatis, Fritsch&Sambrook, “Molecular Cloning”: A Laboratory Manual (1988); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” [B.D.Hames&S.J.Higgins eds. (1985)]; “Transcription and Translation” [B.D. Hames &S.J. Higgins eds. (1984)]; “Animal Cell Culture” [R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984)を参照。
【0031】
従って、この中に出てきた場合に、以下の用語は次に示す定義を有する。
【0032】
この中で用いられた「cDNA」の用語は遺伝子のmRNA転写物のDNA複製物を称する。
【0033】
この中で用いられた「誘導アミノ酸配列」の用語は、cDNAにおける3塩基連鎖を読むことによって特定されるアミノ酸配列を意味する。
【0034】
この中で用いられた「ライブラリーをスクリーニングする」の用語は、標識プローブを用いて、適切な条件下においてプローブに対して相補的である配列が特定DNAライブラリ−中に存在するか否かを調べる方法を称する。さらには、「ライブラリーをスクリーニングする」ことは、PCRによって実施しても差し支えない。
【0035】
この中で用いられた「PCR」の用語は、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号(Mullis)の主題であるポリメラーゼ連鎖反応、ならびに当業界で現在公知である他の改良法を称する。
【0036】
この中に記載のアミノ酸は、好ましくは、「L」異性体である。しかしながら、ポリペプチドによる免疫グロブリン−結合の所望の機能的特性が維持される限り、「D」異性体の残基もLアミノ酸残基を代用し得る。NH2はポリペプチドのアミノ末端に存在するフリーのアミノ基を称する。COOHはポリペプチドのカルボキシ末端に存在するフリーのカルボキシル基を称する。標準ポリペプチド命名法, J Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969)を踏まえて、アミノ酸残基の省略形は当業界で公知である。
【0037】
この中で、全てのアミノ酸残基配列は、左から右への方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向で示されていることに注意すべきである。さらには、アミノ残基配列の始めまたは終わりにおけるダッシュ記号は、1つ以上のアミノ酸残基から成る別の配列に対するペプチド結合を指示する。
【0038】
「レプリコン」は、インビボにおいてDNA複製の自律単位として機能する;すなわち、それ自体の制御下において複製し得る任意の遺伝要素(例えば、プラスミド、染色体、ウィルス)である。
【0039】
「ベクター」は、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、それに対して別のDNA断片が結合してその結合した断片の複製をもたらすことができる。
【0040】
「DNA分子」は、一本鎖形態または二本鎖螺旋形態の何れかのデオキシリボヌクレオチド(アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン)の重合体を称する。DNA分子の用語は、その分子の1次および2次構造のみを称し、特定の3次構造に限定されない。従って、DNA分子の用語は、特に、直線DNA分子(例えば制限酵素断片)、ウィルス、プラスミドおよび染色体において認められる二本鎖DNAを含む。この中で構造について議論する際に、DNAの転写されない鎖(すなわちmRNAに相同な配列を有する鎖)に沿って5’から3’方向にある配列のみを与える通常のやり方に従う。
【0041】
「複製起点」は、DNA合成を開始するDNA配列を称する。
【0042】
DNA「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビボにおいて、転写されかつポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列を称する。5’(アミノ)末端における開始コドンおよび3’(カルボキシル)末端における翻訳終止コドンによって、コード配列の境界を特定する。コード配列として、限定はされないが、原核生物の配列、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核生物(例えば、哺乳類)のDNA由来のゲノムDNA配列および合成DNA配列等が挙げられる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の3’側に位置する。
【0043】
転写および翻訳の制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のDNA調節配列である。
【0044】
「プロモーター配列」は、細胞においてRNAポリメラーゼに結合しかつ下流(3’側)のコード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明を特定する目的において、プロモーター配列は、その3’末端において転写開始部位に結合し、さらに、バックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流(5’側)に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼに対する結合を担うタンパク質結合部位(コンセンサス配列)が認められるであろう。真核生物のプロモーターは、必ずではないが、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを包含することが多い。原核生物プロモーターは、−10および−35コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガーノ配列を包含する。
【0045】
「発現調節配列」は、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列である。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、さらにその転写物がそのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は転写および翻訳調節配列の「制御下」にある。
【0046】
「シグナル配列」はコード配列の近くに包含されていて差し支えない。その配列は、宿主細胞に伝達してそのポリペプチドを細胞表面に方向付けしあるいはそのポリペプチドを媒体中に分泌するようなそのポリペプチドのN末端にあるシグナルペプチドをコードし、そのシグナルペプチドは、そのタンパク質が細胞から遊離する前に宿主細胞によって切り離される。シグナル配列は原核生物および真核生物に天然に存在する種々のタンパク質に関連することが分かるであろう。
【0047】
本発明のプローブについて言及する際にこの中で用いられる「オリゴヌクレオチド」の用語は、2つ以上、好ましくは3つより多くのリボヌクレオチドを包含する分子として定義される。その正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終機能および用途に依存する多くの因子に基づくであろう。
【0048】
この中で用いられている「プライマー」の用語は、精製制限酵素消化物の場合のような自然に生じたものあるか、あるいは合成したものであるかにかかわらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導されるような条件下、すなわち適切な温度およびpHにおいてヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような誘発剤の存在下に置かれた場合に、合成の開始地点として働き得るオリゴヌクレオチドを称する。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であっても差し支えなく、誘発剤の存在下において所望の伸長産物の合成を開始するのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源および使用する方法等の多くの因子に依存するであろう。例えば、診断に用いる場合には、ターゲット配列の複雑さに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーは通常15−25以上のヌクレオチドを包含するが、それより少ないヌクレオチドを包含するものであっても差し支えない。
【0049】
この中のプライマーは、特定ターゲットDNA配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーが各鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残り部分がその鎖に相補的であるプライマーの5’末端に、非相補的ヌクレオチド断片が結合していて差し支えない。あるいは、プライマー配列がその鎖に十分な相補性を有しまたはその鎖とハイブリダイズして伸長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー中に散在していて差し支えない。
【0050】
この中で用いられている「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」の用語は、特異的ヌクレオチド配列部分またはその近くで二本鎖DNAを切断する酵素を称する。
【0051】
外因性または異種DNAが細胞内に導入された場合、細胞はそのようなDNAによって「形質転換されている」。形質転換DNAは細胞のゲノム中に(共有結合して)一体化されても一体化されなくても差し支えない。例えば、原核細胞、酵母および哺乳類細胞において、形質転換DNAは、プラスミドのようなエピソーム要素上に保持されていて差し支えない。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換DNAが染色体に一体化されて染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるような細胞である。その安定性は、真核細胞が、形質転換DNAを包含する娘細胞の集団から成る細胞株またはクローンを樹立する能力によって説明される。「クローン」は、有糸***によって単一の細胞または祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は何世代にも亘りインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【0052】
ヌクレオチドの約75%以上(好ましくは約80%以上、さらに最も好ましくは約90%または95%以上)がDNA配列の特定された長さに亘り一致する場合、2つのDNA配列は「実質的に相同である」。配列データバンクにおいて利用可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、例えば、特定の系のために決定された厳しい条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同である配列を同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を決定することは、当業技術の範囲内である。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I&II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supraを参照。
【0053】
DNA構築物の「異種」領域は、より大きなDNA分子内の同定可能なDNA断片であって、そのより大きな分子に関連して天然では認められないDNA断片である。従って、その異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺伝子は、その由来生物のゲノム中ではその哺乳類遺伝子に隣接しないようなDNAに隣接するであろう。別の例において、コード配列は、そのコード配列自体が天然では認められないような構造である(例えば、ゲノムコード配列がイントロンまたは天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を包含するようなcDNA)。対立遺伝子変異または自然に生じる突然変異事象は、この中で定義されたDNAの異種領域を生じさせない。
【0054】
そのような研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に暴露された際に蛍光を発する化学物質等である。多くの蛍光物質が公知であり、標識として用いることができる。蛍光物質として、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルーおよび黄燐イエロー(Lucifer Yellow)が挙げられる。特定検出物質は、ヤギにおいて調製しかつイソチオシアネートを介してフルオレセインに結合させた抗ウサギ抗体である。
【0055】
また、放射性元素または酵素を用いてタンパク質を標識しても差し支えない。任意の現在利用可能な測定法によって放射能標識を検出することができる。3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131Iおよび186Reから好ましいアイソトープを選択することができる。
【0056】
酵素標識も同様に有用であり、任意の現在利用されている比色、分光測光、蛍光測光、電流滴定またはガス定量技術によって検出することができる。カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタールアルデヒド等のような架橋分子を用いた反応によって、選択された粒子に酵素を結合させる。それら方法において用いられる多くの酵素は公知でありかつ利用できる。好ましい酵素は、ペロキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペロキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。代用の標識物質および方法の開示を例示する目的で、米国特許第3,654,090号、第3,850,752号および第4,016,043号を参照する。
【0057】
本技術分野において開発されかつ利用される特定測定系は受容体測定法として知られている。受容体測定法において、測定すべき物質を適切に標識し、次に、多くのその標識物質を特定細胞試験コロニーに接種して、その後、標識物質が細胞受容体に結合する割合を特定するために結合試験を行う。その方法において、物質間の親和性の違いを確かめることができる。
【0058】
本技術分野において有用である測定法は、「シス/トランス」測定法として知られている。詳細には、その測定法は2つの遺伝子構築物を用い、第一の構築物は通常適切な細胞株にトランスフェクトされた場合に特定の関心受容体を連続的に発現するプラスミドであり、第二の構築物は受容体/リガンド複合体の制御下においてルシフェラーゼのような受容体を発現するプラスミドである。従って、例えば、特定受容体に対するリガンドとして化合物を評価するのが望ましい場合、第一のプラスミドは選択された細胞株において受容体の発現をもたらす構築物であり、一方、第二のプラスミドは特定受容体に対する応答要素が挿入されたルシフェラーゼ遺伝子に結合したプロモーターを有するであろう。試験された化合物が受容体のアゴニストである場合、そのリガンドは受容体と複合体を形成し、さらに得られた複合体はその反応要素に結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させるであろう。得られた化学ルミネセンスを光度測定によって測定し、さらに用量反応曲線を作成して公知リガンドのものと比較する。前記プロトコルは米国特許第4,981,784号に詳細に記載されている。
【0059】
この中で用いられている「宿主」の用語は、原核細胞のみでなく、酵母、植物および動物細胞等の真核細胞も含むことを意味する。本発明のヒトTADG−12タンパク質をコードする組換えDNA分子または遺伝子を用いて、当業者に周知な任意の技術を利用して、宿主を形質転換させて差し支えない。原核生物を形質転換させる目的で、本発明のヒトTADG−12タンパク質をコードする遺伝子のコード配列を包含するベクターを用いることが特に好ましい。原核宿主として、大腸菌、S・ティムフィムリウム(S. tymphimurium)、セラシア・マルセッセンスおよび枯草菌が挙げられる。真核宿主として、ピッチア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【0060】
通常、宿主との関連において、挿入DNA断片の効率的な転写を促進させるプロモーターを包含する発現ベクターを用いる。発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、ターミネーター、ならびに形質転換細胞において表現型の選択をもたらし得る特定遺伝子を包含する。当業界で公知の手段に従って形質転換宿主を発酵および培養して、最適な細胞増殖を得ることができる。
【0061】
本発明は、実質的に純粋なTADG−12タンパク質をコードするDNAを含み、そのDNA鎖は、配列番号1または配列番号3に示す配列の少なくとも15連続ヌクレオチドから成る配列を包含するプローブに対して、非常に厳しい条件下でハイブリダイズするであろう。本発明のDNAによってコードされるタンパク質は、配列番号2または配列番号4に記載されたアミノ酸と80%以上(好ましくは85%以上、さらに最も好ましくは95%以上)の配列の一致を有するであろう。より好ましくは、そのDNAは、図4のヌクレオチド(配列番号1)のコード配列、またはそのような配列の縮重変異体を包含する。
【0062】
本発明のDNAがハイブリダイズするプローブは、図4に記載したヌクレオチド(配列番号1)のコード配列またはその相補体の好ましくは20連続ヌクレオチド、より好ましくは40ヌクレオチド、よりさらに好ましくは50ヌクレオチド、最も好ましくは100ヌクレオチド以上(100%まで)の配列から成る。そのようなプローブは、(a)細胞から採取したmRNAを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ;さらに(b)そのプローブとmRNAとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む方法によってヒト細胞におけるTADG−12の発現を検出するのに有用である。
【0063】
また、本発明は、配列番号1に記載のヌクレオチドの1から2413までのヌクレオチドの領域または配列番号3に記載のヌクレオチドの1から2544までのヌクレオチドの領域の15連続ヌクレオチド以上(好ましくは20、より好ましくは30、さらにより好ましくは50、最も好ましくは全てのヌクレオチド)の配列を包含する実質的に純粋なDNAを含む。また、本発明は、その新規なDNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明の技術を考慮して、当業者は本DNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを容易に開発することができる。
【0064】
「非常に厳しい条件」は、例えば約0.1xSSCの塩濃度による65℃での洗浄条件のような、高温および低い塩濃度によって特徴付けされるDNAハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、あるいは機能的にそれに対応するような条件を意味する。例えば、非常に厳しい条件として:50%ホルムアミドの存在下における約42℃でのハイブリダイゼーション;1%SDSを含有する約2xSSCによる約65℃での1回目の洗浄;続く約0.1xSSCによる約65℃での2回目の洗浄:が挙げられる。
【0065】
「実質的に純粋なDNA」は、その環境中のいくつかのまたは全ての分子の分離(部分精製または全精製)によって、あるいは請求DNAに隣接する配列の変化によって生じた、そのDNAが自然に生じた環境の一部ではないDNAを意味する。従って、その用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウィルスに組み込まれたまたは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは他の配列から独立した分離分子(例えば、cDNA、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または制限エンドヌクレアーゼ消化によって作成されたゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。また、その用語は、例えば融合タンパク質のような追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。また、その用語は、TADG−12の選択的スプライシング変異体(TADG−12V)をコードする、配列番号3に示すヌクレオチドの一部を包含する組換えDNAを含む。
【0066】
DNAは、配列番号1または配列番号3に記載のヌクレオチドのコード配列に対して、約70%以上、好ましくは75%以上(例えば80%以上)、最も好ましくは90%以上の配列同一性を有する。その2つの配列間の同一性はマッチングまたは同一位置の数の一次関数である。例えば2つのDNA分子のそれぞれにおいて所定の位置がアデニンによって占められている場合のように、その2つの配列両方におけるサブユニット部位が同じ単量サブユニットで占められている場合に、その位置においてそれら2つの配列は同一である。例えば、長さが10ヌクレオチドの配列中の7つの位置が、第二の10ヌクレオチド配列中の対応する位置と同一である場合に、その2つの配列は70%配列同一性を有する。比較配列の長さは、通常、50ヌクレオチド以上であり、好ましくは60ヌクレオチド以上、より好ましくは75ヌクレオチド以上、最も好ましくは100ヌクレオチドである。通常、配列分析ソフトウェア(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)を用いて、配列同一性を測定する。
【0067】
本発明は、ヒトTADG−12タンパク質をコードするDNA配列を包含するベクターを含み、そのベクターは、作動可能に結合したa)複製起点;b)プロモーター;およびc)TADG−12タンパク質をコードするDNA配列:を包含する宿主細胞において複製することができる。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号1または配列番号3に示すDNA配列の一部を包含する。「ベクター」は、例えばプラスミドまたはウィルス核酸のような複製可能な核酸構築物として定義される。TADG−12タンパク質をコードする核酸を増幅および/または発現させるためにベクターを用いることができる。発現ベクターは、細胞においてポリペプチドの発現をもたらし得る適切な制御配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列が作動可能に結合した複製可能な構築物である。そのような制御配列の必要性は、選択された細胞および選択された形質転換法に依存して変化するであろう。通常、制御配列は、転写プロモーターおよび/またはエンハンサー、適切なmRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。適切な転写および調節制御シグナルを包含する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. に記載の技術を参照のこと。転写制御配列が効率的に遺伝子の転写を制御する場合には、遺伝子およびその転写制御配列が「作動可能に結合している」と定義される。本発明のベクターとして、限定はされないが、プラスミドベクターおよびウィルスベクターが挙げられる。本発明の好ましいウィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、SV40ウィルスまたはヘルペスウィルスが挙げられる。
【0068】
「実質的に純粋なタンパク質」は、天然において付随する成分の少なくともいくつかから分離されたタンパク質を意味する。通常、インビボにおいて目的タンパク質と共に自然に生じたタンパク質および天然の他の有機分子を含まないで60重量%以上の純度である場合に、そのタンパク質は実質的に純粋である。好ましくは、調製物の純度は、75重量%以上、より好ましくは90重量%以上、さらに最も好ましくは99重量%以上である。例えば、天然供給源からの抽出によって;TADG−12ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって;またはタンパク質の化学合成によって:実質的に純粋なTADG−12タンパク質を得ることができる。カラムクロマトグラフィー、TADG−12に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析のような任意の適切な方法によって純度を測定することができる。天然の状態で目的タンパク質に付随する不純物の少なくともいくつかから分離された場合には、そのタンパク質は天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたまたはそれが天然において由来する細胞と異なる細胞系において産生されたタンパク質は、定義によれば、天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋なタンパク質は、大腸菌または他の原核生物において合成された原核生物タンパク質、あるいは自然に生じた任意の他の有機体を含む。
【0069】
実質的に完全長のタンパク質に加えて、本発明はTADG−12タンパク質の断片(例えば抗原性断片)も含む。この中で用いられたポリペプチドに適用される「断片」は、一般的に10残基以上、より一般的に20残基以上、さらに好ましくは30残基以上(例えば50残基)の長さであるが、完全な無傷の配列より短い。例えば、天然のまたは組換えのTADG−12タンパク質の酵素消化によって、または特定されたTADG−12の断片をコードする発現ベクターを用いた組換えDNA技術によって、または化学合成によって、当業者に公知の方法でTADG−12タンパク質の断片を作成することができる。この中に記載の方法によって、候補断片がTADG−12の特性(例えばTADG−12に特異的な抗体に結合する)を示す能力を評価することができる。当業者に公知の標準プロトコルによって、精製TADG−12またはTADG−12の抗原性断片を用いて新規な抗体を作成しまたは既存の抗体を試験する(例えば、診断的測定における陽性コントロールとして)ことができる。免疫原としてTADG−12またはTADG−12の断片を用いることによって例えばウサギにおいて作成されたポリクロナール抗血清も本発明に含まれる。当業者に公知であるモノクロナールおよびポリクロナール抗体作成の標準プロトコルを用いる。組換えTADG−12cDNAクローンを同定する能力、および公知のcDNAクローンからTADG−12cDNAクローンを区別する能力について、本方法によって作成したモノクロナール抗体をスクリーニングすることができる。
【0070】
さらには、例えば選択的mRNAスプライシングまたは選択的タンパク質プロセッシング事象の産物のような配列番号1または配列番号3の一部によって少なくともその一部がコードされているTADG−12タンパク質、あるいはTADG−12の配列の一部分が欠失しているTADG−12タンパク質も本発明に含まれる。例えば標識、リガンドまたは抗原性を高める手段として作用するような別のポリペプチドに、その断片または完全TADG−12ポリペプチドを共有結合させて差し支えない。
【0071】
また、本発明は、TADG−12に特異的に結合するポリクロナールまたはモノクロナール抗体も含む。本発明は、完全なモノクロナール抗体のみならず、例えばFabまたは(Fab)2断片;人工単鎖Fv分子;または例えばマウス由来の1つの抗体の結合特異性および例えばヒト由来の別の抗体の残りの部分を有する抗体のようなキメラ分子:等の免疫活性抗体断片も含む。
【0072】
1つの実施形態において、抗体またはその断片を毒素、または放射性標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、常磁性標識、酵素標識または比色標識等の検出可能な標識に結合させて差し支えない。適切な毒素の例として、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素A、リシンおよびコレラ毒素が挙げられる。適切な酵素標識として、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−5−ステロイドイソメラーゼ、アルコール脱水素酵素、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。適切な放射性標識として、3H、125I、131I、32P、35S、14C等が挙げられる。
【0073】
本発明の方法に基づいて、インビボ診断のために常磁性同位体を用いて差し支えない。磁気共鳴映像法において有用である元素について多くの例がある。インビボでの核磁気共鳴映像法について検討するために、例えば、Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415を参照。適切な蛍光標識の例として、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オフタルデヒド(ophthaldehyde)標識、フルオレサミン標識等が挙げられる。化学ルミネセンス標識の例として、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識等が挙げられる。
【0074】
当業者は、本発明に基づいて用い得る他の適切な標識を知っているであろう。当業者に公知の標準技術を用いて、それら標識を抗体またはその断片に結合させることができる。一般的な技術は、Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1-31; and Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40に記載されている。後者の文献に記載のカップリング技術はグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、m−マレイミドベンジル−N−ヒドロキシ−スクシニミドエステル法である。それら方法の全てが参照によってこの中に組み込まれる。
【0075】
生物試料中のTADG−12タンパク質を検出する方法も本発明の範囲内であり、その方法は、例えば放射性にタグ付けしたTADG−12特異的抗体のような標識抗体と試料とを接触させ、さらにその抗体が試料中の成分に結合したか否かを特定する工程を含む。
【0076】
この中に記載のように、本発明は多くの診断的利点および用途を提供する。例えば、本発明において開示されたTADG−12タンパク質は、そのタンパク質が腫瘍細胞において高度に過剰発現されていることから、様々な組織における癌を診断するのに有用である。TADG−12に特異的なエピトープに結合する抗体(またはその抗原結合断片)は癌または新生物の形質転換を診断するための生物試料中のTADG−12タンパク質を検出する方法において有用である。その方法は、癌を有することが疑わしい患者から生物試料(例えば細胞、血液、血漿、組織等)を採取し、さらにELISAのような標準免疫測定技術を用いてTADG−12を検出する工程を含む。生物試料に対する抗体結合は、その試料がTADG−12内のエピトープに特異的に結合する成分を含むことを示唆する。
【0077】
同様に、標準のノーザンブロット法を用いて、当業者に公知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に基づいて、癌を有することが疑わしい細胞または組織中におけるTADG−12mRNAの相対的量を確かめることができる。そのノーザン法は、例えば、配列番号1または配列番号3に相補的である配列を有する完全長の一本鎖DNA、あるいは20以上(好ましくは30以上、より好ましくは50以上、さらに最も好ましくは100以上の連続ヌクレオチドの長さ)の上記DNA配列の断片の何れかを包含する放射性標識TADG−12cDNAのようなハイブリダイゼーションプローブを用いる。当業者に周知の任意の多くの異なる方法によってそのDNAハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。
【0078】
免疫測定においてTADG−12タンパク質に対する抗体を用いて、新生物性形質転換の疑いが高い組織におけるTADG−12タンパク質発現レベルの上昇を検出することができる。ノーザンブロット法および分析を用いてそれら同じ用途を達成できる。
【0079】
本発明は、(a)TADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;(b)上記(a)の単離DNA断片に対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記(a)および(b)の単離DNA断片と異なり、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片:より成る群から選択されたTADG−12タンパク質をコードするDNA断片に関する。好ましくは、そのDNAは、配列番号1または配列番号3に示す配列を有する。より好ましくは、そのDNAは配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有するTADG−12タンパク質をコードする。
【0080】
また、本発明は、本発明のDNAを発現し得るベクターおよび/または宿主細胞に関する。好ましくは、そのベクターは、配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有するTADG−12タンパク質をコードするDNAを包含する。代表的宿主細胞として、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【0081】
また、本発明は(a)TADG−12タンパク質をコードする単離DNA;(b)上記(a)の単離DNAに対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA:より成る群から選択されたDNAによってコードされる単離および精製したTADG−12タンパク質に関する。好ましくは、その単離および精製したTADG−12タンパク質は配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。
【0082】
また、本発明は、(a)細胞から採取したmRNAを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ;さらに(b)そのプローブとmRNAとのハイブリダイゼーションを検出する:工程を含む、この中に記載のTADG−12タンパク質の発現を検出する方法に関する。
【0083】
切断産物TADG−12Vを含む、TADG−12遺伝子および遺伝子産物のための多くの潜在的用途がある。
【0084】
本発明の1つの実施形態において、生物試料中のTADG−12タンパク質を検出することによって癌を診断する方法を提供しており、その方法において、TADG−12タンパク質の存在または不在が癌の存在または不在を示唆する。好ましくは、生物試料は、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍組織生検試料および循環腫瘍細胞である。さらに好ましくは、TADG−12タンパク質の検出は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、ELISAサンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、DNAアレイチップおよびフローサイトメトリーより成る群から選択される手段によって成される。卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびTADG−12が過剰発現する他の癌を検出するためにそのような方法を用いる。
【0085】
本発明の別の実施形態において、生物試料中におけるTADG−12タンパク質またはTADG−12mRNAを検出することによって悪性過形成を検出する方法を提供する。さらに、TADG−12タンパク質またはTADG−12mRNAを基準情報と比較することによって、診断または治療を提供することができる。好ましくは、TADG−12mRNAを検出するためにPCR増幅を用い、ここで用いられるプライマーは配列番号28−31より成る群から選択される。さらに好ましくは、TADG−12タンパク質に対する抗体への免疫親和性によって、TADG−12タンパク質の検出を行う。
【0086】
本発明のさらに別の実施形態において、発現に必要な要素に作動可能に結合した逆配向のTADG−12のDNA断片を包含するベクターを導入することによって、細胞中の内因性TADG−12mRNAの発現を阻害する方法を提供する。結果として、そのペクターは細胞中においてTADG−12アンチセンスmRNAを産生し、そのアンチセンスmRNAは内因性TADG−12mRNAにハイブリダイズし、それによって内因性TADG−12mRNAの発現を阻害する。
【0087】
本発明のさらに別の実施形態において、TADG−12タンパク質またはその断片に対する抗体を導入することによってTADG−12タンパク質の発現を阻害する方法を提供する。結果として、その抗体がTADG−12タンパク質またはその断片に結合することによって、TADG−12タンパク質の発現を阻害する。
【0088】
切断形態を含むTADG−12遺伝子産物をターゲット治療のために用いることができる。詳細には、そのような治療を必要とする個体に、TADG−12タンパク質に特異的なターゲット部分および治療部分を有する化合物を投与する。好ましくは、ターゲット部分は、TADG−12タンパク質に治する抗体およびTADG−12タンパク質に結合するリガンドまたはリガンド結合領域より成る群から選択される。TADG−12タンパク質は、配列番号2および配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。好ましくは、治療部分は、放射性同位体、毒素、化学療法剤、免疫促進剤および細胞傷害性物質より成る群から選択される。卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌およびTADG−12が過剰発現する他の癌より成る群から選択される疾患を有する個体を治療するために、そのような方法を用いることができる。
【0089】
本発明のさらに別の実施形態において、個体にTADG−12タンパク質またはその断片を接種することによって、個体にTADG−12に対するワクチン接種を行いまたは免疫反応を生じさせる方法を提供する。詳細には、TADG−12タンパク質またはその断片は、TADG−12活性を欠き、その接種によって個体中に免疫反応を誘導し、それによって個体にTADG−12に対するワクチン接種を行う。好ましくは、その個体は、癌を有し、癌を有する疑いが高く、あるいは癌になる危険性がある。さらに好ましくは、TADG−12タンパク質は、配列番号2または配列番号4に示すアミノ酸配列を有するが、一方TADG−12断片は配列番号8に示す配列を有しまたは9残基断片から20残基断片までの断片である。9残基断片の例として、配列番号35、36、55、56、83、84、97、98、119、120、122、123および136が示されている。
【0090】
本発明のさらに別の実施形態において、TADG−12タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含む免疫原組成物を提供する。好ましくは、TADG−12タンパク質の免疫原断片は、配列番号8に示す配列を有し、あるいは9残基断片から20残基断片までの断片である。9残基断片の例として、配列番号35、36、55、56、83、84、97、98、119、120、122、123および136が示されている。
【0091】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、何ら本発明を限定することを意図していない。
【0092】
実施例1
組織採取および保存
患者の子宮摘出、両方の卵巣摘出、または新生組織の外科的除去の際に、標本を回収して氷上に置いた。特定組織試料の単離および同定のために、その標本を研修医の病理学者に渡した。最終的に、液体窒素中においてその試料を凍結し、実験記録に記入して、−80℃に保存した。時々、ヒト組織ネットワーク協会(CHTN)から追加の標本を得た。それら試料はCHTNによって調製され、ドライアイスに入れて出荷された。到達すると、それら標本を実験記録に記入して、−80℃で保存した。
【0093】
実施例2
mRNA抽出およびcDNA合成
69の卵巣腫瘍(4の良性腫瘍、10の低悪性潜在的腫瘍(low malignant potential tumor)、および55の癌)、ならびに10の正常卵巣を外科的標本から得て、液体窒素中において凍結した。American Type Culture Collection(Rockville, MD)から、ヒト卵巣癌細胞株SW626およびCaov3、ヒト乳癌細胞株MDA−MB−231およびMDA−MB−435Sを購入した。10%(v/v)ウシ胎児血清および抗生物質を補足したダルベッコの調製イーグル培地中において、サブコンフルエントになるまで細胞を培養した。
【0094】
以前記載された方法[14−16]によって、mRNAの抽出およびcDNA合成を実施した。RiboSep mRNA単離キット(Becton Dickinson Labware)を用いてmRNAを単離した。その方法において、オリゴ(dT)セルロースを介したアフィニティークロマトグラフィーを用いて、組織溶解物からポリA+mRNAを直接単離した。第一鎖cDNA合成キット(CLONTECH)を用いたランダムヘキサマープライミング(random hexamer priming)によって、mRNA(5.0μg)を用いてcDNAを合成した。
【0095】
実施例3
重複プライマーを用いたPCRおよびTADG−12cDNAのクローニング
セリンプロテアーゼのための触媒三つ組残基の周囲のアミノ酸のコンセンサス配列のための重複プライマーとして、前進の5’−TGGGTIGTIACIGCIGCICA(CT)TG−3’(配列番号26)、および反対の5’−A(AG)IA(AG)IGCIATITCITTICC−3’(配列番号27)を用いて、正常および癌のcDNAからの産物を比較した。プロメガT−ベクタープラスミド中に適切なバンドを連結し、さらに選択培地中で増殖するJM109細胞(Promega)を形質転換するためにその連結産物を用いた。個々のコロニーを選択した後、それらコロニーを培養し、さらにウィザードミニプレップDNA精製システム(Promega)によってプラスミドDNAを単離した。PRISM Ready Reaction Dye Deoxyターミネーターサイクルシークエンスキット(Applied Biosystems)を用いて、ヌクレオチド配列決定を実施した。直接cDNA配列決定のために、Applied Biosystemsモデル373A DNAシークエンスシステムを用いた。
【0096】
初代のTADG−12サブクローンを無作為に標識して、標準ハイブリダイゼーション技術[11、15]によって卵巣腫瘍cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。そのライブラリーは、ステージIII/グレードIIIの卵巣腺癌患者の癌細胞から単離したmRNAを用いて、λZAP中において構築された。2315ヌクレオチドの長さの3つの重複するクローンを得た。遺伝子バンクESTデータベースにおいて利用可能なクローンとの相同性によって、ポリAテイルを含むほとんどの3’配列をコードする最後の99ヌクレオチドを同定した。
【0097】
実施例4
定量的PCR
定量的PCRを用いて、TADG−12のmRNA過剰発現を特定した。以前報告された方法[16]に基づいて、定量的PCRを実施した。オリゴヌクレオチドプライマーとして:TADG−12のために、前進の5’−GAAACATGTCCTTGCTCTCG−3’(配列番号28)、および反対の5’−ACTAACTTCCACAGCCTCCT−3’(配列番号29);変異TADG−12のために、5’−TCCAGGTGGGTCTAGTTTCC−3’(配列番号30)、反対の5’−CTCTTTGGCTTGTACTTGCT−3’(配列番号31);β−チューブリンのために、前進の5’−CGCATCAACGTGTACTACAA−3’(配列番号32)、反対の5’−TACGAGCTGGTGGACTGAGA−3’(配列番号33):を用いた。内部対照としてβ−チューブリンを利用した。PCR反応混合物は、最終容積25μl中に、反応バッファー(Promega)と共に、mRNA(50ng)から誘導されたcDNA、TADG−12遺伝子およびβ−チューブリン遺伝子のためのセンスおよびアンチセンスプライマー(5pmol)、dNTPs(200μmol)、α−32PdCTP(5μCi)、ならびにTaq DNAポリメラーゼ(0.25unit)を含む。β−チューブリン遺伝子と並行させて、ターゲット配列を増幅した。サーマルサイクラー(Thermal Cycler)(Perkin-Elmer Cetus)において、PCRを30サイクル実施した。PCRの各サイクルは、94℃での30秒間の変性、60℃での30秒間のアニーリング、および72℃での30秒間の伸長を含む。2%アガロースゲル上でPCR産物を分離し、さらに、ホスホイメージャー(Molecular Dynamics)を用いることによって、各PCR産物の放射能を特定した。本研究は、ホスホイメージャーによって測定した発現比(TADG−12/β−チューブリン)を用いて遺伝子発現を評価し、さらに、正常卵巣の平均値+2SDを、過剰発現を特定するためのカットオフ値として定義した。正常卵巣と腫瘍の平均値を比較するために、student’s t testを用いた。
【0098】
実施例5
TADG−12/TADG−12Vの配列決定
クローニング部位近くのプラスミド特異的プライマーを利用して、使用説明書に従って、PRISMTM Ready Reaction Dye DeoxyTMターミネーター(Applied Biosystems cat#401384)を用いて配列決定反応を実施した。Centri-stepTMスピンカラム(Princeton Separation cat.# CS-901)を用いて、完了した配列決定反応から残留染色ターミネーターを除去した。Applied Biosystemsモデル373A DNAシークエンスシステムを利用可能であり、配列分析のために用いた。
【0099】
実施例6
抗体産生
TADG−12カルボキシ末端タンパク質配列であるNH2−WIHEQMERDLKT−COOH(WIHEQMERDLKT、配列番号34)由来の多価抗原ペプチドにポリリジンを結合させたものでホワイトニュージーランドウサギを免疫することによって、ポリクロナールウサギ抗体を作成した。そのペプチドは、完全長TADG−12中に存在するが、TADG−12Vには存在しない。RiBiアジュバント中において乳化させたペプチド(約100μg)でウサギを免疫した。続く追加免疫を6週間に3回実施し、さらに最終免疫の10日後に、ウサギの血清を採取した。ドットブロット分析によって血清を試験して、TADG−12特異的ペプチドに対する親和性を特定した。ウサギの免疫前血清を陰性対照として用いた。
【0100】
実施例7
ノーザンブロット分析
1%ホルムアルデヒド−アガロースゲルにmRNA(10μg)を装填し、電気泳動し、さらにHybond-N+ナイロン膜(Amersham)上にブロットした。Prime-a-Gene標識システム(Promega)によって、32P標識cDNAプローブを作成した。上記と同じプライマーによって増幅したPCR産物をプローブのために用いた。ブロットを30分間プレハイブリダイズさせ、さらにExpressHybハイブリダイゼーション溶液(CLONTECH)中の32P標識cDNAプローブと、68℃で60分間ハイブリダイズさせた。β−チューブリンプローブを用いて、相対的ゲル装填量を特定するための対照ハイブリダイゼーションを実施した。
【0101】
同じハイブリダイゼーション法によって、正常なヒト組織;脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児組織;脳、肺、肝臓および腎臓を評価した(Human Multiple Tissue Northern Blot; CLONTECH)。
【0102】
実施例8
免疫組織化学
Vectastain Elite ABCキット(Vector)を用いて、免疫組織化学染色を実施した。ホルマリン固定およびパラフィン包埋した標本をいつものように脱パラフィン処理し、さらに、0.01Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)中においてマイクロ波熱処理を用いて処理した。加湿チャンバー中において30分間、正常なヤギ血清と共にその標本をインキュベートした。加湿チャンバー中において1時間、TADG−12ペプチド抗体をその標本と共にインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で過剰な抗体を洗浄して除いた。ビオチン化抗ウサギIgGと共に30分間インキュベートした後、その標本をABC試薬(Vector)と共に30分間インキュベートした。ABC基質系(DAKO)を用いて最終産物を可視化し、さらに標本にする前にヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の代わりに正常血清を用いることによって、陰性対照を実施した。
【0103】
実施例9
TADG−12およびTADG−12変異体の触媒領域サブクローンの単離
卵巣腫瘍において発現されているセリンプロテアーゼを同定するために、それら酵素の触媒三つ組残基の保存領域に対して設計された重複PCRプライマーを用いた。鋳型としての正常卵巣または卵巣腫瘍の何れかのcDNAと共に、保存ヒスチジンの周囲の領域に対して設計されたセンスプライマー、および保存アスパラギン酸の周囲の領域に対して設計されたアンチセンスプライマーを用いた。卵巣腫瘍cDNAとの反応において、約180bpの予測されたサイズの強い産物のバンド、ならびにいくつかの卵巣腫瘍cDNAにおいて強い発現を示した約300kbの予測外のPCR産物が観察された(図1A)。それらPCR産物の両方をサブクローン化し、さらに配列決定した。180bpバンドからのサブクローンの配列(配列番号5)は、大きい方のバンドが133ヌクレオチドの追加の挿入部分を有することを除いて、その大きい方の予測外のバンドにおいて同定された配列(配列番号7)に相同であることが見出された(図1B)。適切なサイズの小さい方の産物は他の公知のプロテアーゼと相同であるタンパク質配列(配列番号6)をコードするが、一方、挿入部分(配列番号8)を有する配列はセリンプロテアーゼ触媒領域からのフレームシフト、およびそれに続く未熟な翻訳終止コドンをコードする。また、4つの各腫瘍由来のTADG−12変異体をサブクローン化し、さらにその配列を決定した。その配列および挿入部分は一致することが分かった。PCRによってそれらcDNA派生クローンのゲノム配列を増幅しかつ調べて、変異転写産物をもたらすであろう潜在的なAG/GTスプライシング部位を包含することがわかった。
【0104】
実施例10
TADG−12発現のノーザンブロット分析
転写サイズおよび組織分布を調べるため、触媒領域サブクローンを無作為に標識して、正常卵巣組織、卵巣腫瘍、ならびに癌細胞株SW626、CAOV3、HeLa、MD−MBA−435SおよびMD−MBA−231のノーザンブロットを調べるのに用いた(図2)。2.4、1.6および0.7kbの3つの転写物が観察された。正常卵巣および卵巣腫瘍のブロットにおいて、正常卵巣では最も小さい転写サイズの0.7kbのバンドの発現が低かったが、一方、漿液性癌では全ての転写物(2.4、1.6および0.7kb)が異常に存在していた。さらには、正常ヒト組織:膵臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児組織:脳、肺、肝臓および腎臓についてノーザンブロットを調べた。同じ3つの転写物が全てのそれら組織において弱く発現されていることが分かった(データは示していない)。相対的な試料装填量の対照として、ヒトβ−チューブリン特異的プローブを利用した。さらには、50のヒト組織についてRNAドットブロットを調べて、示された全ての組織において、そのクローンが弱く発現されていることを特定した(図3)。心臓において最も高いレベルであり、被殻、扁桃、腎臓、肝臓、小腸、骨格筋および副腎において中間レベルであることが分かった。
【0105】
実施例11
TADG−12の配列決定および特徴付け
プローブとして触媒領域サブクローンを用い、標準ハイブリダイゼーション技術によって、λZAP中に構築された卵巣腫瘍cDNAライブラリーをスクリーニングした。プローブと重複した2つのクローンを同定し、さらに2316ヌクレオチドに相当することが分かった。遺伝子バンクのESTデータベースにおいて利用可能なクローンとの相同性によって、ポリ−アデニル化シグナルおよびポリ(A)テイルを包含するその転写物の3’末端の97ヌクレオチドを同定した。これによって、転写物の全サイズを2413塩基とした(配列番号1、図4)。それに続く遺伝子バンクのゲノムデータベースのスクリーニングは、TADG−12が17染色体からのコスミドに相同であることを示した。そのコスミドは登録番号AC015555を有する。
【0106】
同定されたcDNAは、腫瘍関連差別的発現遺伝子12(TADG−12)と称される、454アミノ酸(配列番号2)から成る予測タンパク質を産生するであろうオープンリーディングフレームを包含する。その配列を遺伝子バンクデータベースに提出して、登録番号#AF201380を与えられた。相同配列プログラムを用いたところ、そのタンパク質は、アミノ末端細胞質領域、潜在的なII型膜貫通領域およびそれに続く低密度リポタンパク質受容体様クラスA領域(LDLR−A)、スカベンジャー受容体システインリッチ領域(SRCR)、および細胞外セリンプロテアーゼ領域等のいくつかの領域を包含する。
【0107】
TMPredプログラムによって予測したところ、TADG−12は潜在的な膜貫通領域として働き得る疎水性の高いアミノ酸領域を包含し、その領域は細胞質内にタンパク質のアミノ末端を残して、リガンド結合領域およびプロテアーゼ領域を細胞外空間に曝している。その一般構造はヘプシン[17]およびTMPRSS[18]等の他の公知の膜貫通型プロテアーゼと一致し、さらにTADG−12はTMPRSS2プロテアーゼにその構造が特に類似している。
【0108】
TADG−12のLDLR−A領域は、アミノ酸74から108の配列(配列番号13)によって表される。LDLR-A領域は、当初は、LDL受容体内において、6不変システイン残基および高度に保存されたアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を包含する一連の約40アミノ酸の反復配列として同定された[19]。その最初の同定以来、その領域に相同なモチーフを包含する多数の他の遺伝子が同定された[20]。マトリプターゼ、TMPRSS2およびいくつかの補体成分等のLDLR−Aモチーフを包含するいくつかのプロテアーゼが同定された。TADG−12と他の公知のLDLR−A領域との比較を図5Aに示す。それら配列の類似性は、44%から54%の類似または同一アミノ酸の範囲である。
【0109】
LDLR−A領域に加えて、TADG−12は、SRCRファミリーのA群に対する相同性を有する別の細胞外リガンド結合領域を包含する。そのタンパク質領域のファミリーは、一般的に、約100アミノ酸から成る配列内の6システイン残基の保存によって定義される[23]。TADG−12のSRCR領域は、アミノ酸109から206によってコードされ(配列番号17)、その領域を他のSRCR領域と整列させることによって、36%から43%の間の類似性を有することが分かった(図5B)。しかしながら、TADG−12は6つの保存システイン残基の内4つしか持たない。このことは、プロテアーゼTMPRSS2において認められるSRCR領域に類似する。
【0110】
また、TADG−12タンパク質は、プロテアーゼのチロシンファミリーのセリンプロテアーゼ領域を包含する。TADG−12の触媒領域を他の公知のプロテアーゼと整列させて図5Cに示す。それら配列間の類似性は、48%から55%の範囲であり、TADG−12はセリンプロテアーゼTMPRSS2に最も類似しており、TMPRSS2も膜貫通領域、LDLE−A領域およびSRCR領域を包含する。SRCR領域の下流側に、そのファミリーの多くのセリンプロテアーゼに共通の潜在的な分解/活性化部位である保存アミノ酸モチーフ(RIVGG)がある[25]。このことは、TADG−12が細胞表面に運ばれ、そこで、リガンド結合領域が細胞外分子と相互作用することができかつプロテアーゼ領域が潜在的に活性化されることを示唆する。また、TADG−12は保存システイン残基(アミノ酸208および243)を包含しており、その残基は、他のプロテアーゼにおいて、活性化プロテアーゼを他の細胞外領域に結合させ得るジスルフィド結合を形成する。
【0111】
実施例12
選択的転写産物の定量的PCRによる特徴付け
本来のTADG−12サブクローンは、最初の重複プライマーPCR実験において高発現されているとして同定された。133bpの挿入部分を有するTADG−12変異体(TADG−12V)もその最初の実験において容易に検出された。その発現の頻度、および正常卵巣と卵巣腫瘍との間でその発現レベルが異なるか否かを特定するために、既に認証されている半定量的PCR技術を用いた[16]。PCR分析において、放射性標識ヌクレオチドの存在下、TADG−12またはTADG−12Vの何れかに特異的な産物と共に、β−チューブリンの産物を同時増幅させた。アガロースゲル電気泳動によってその産物を分離し、さらに各PCR産物の相対的装填量を定量化するためにホスホイメージャーを用いた。TADG−12およびTADG−12Vの両方におけるそれら増幅産物の例を図6に示す。正常卵巣試料中において調べたβ−チューブリンに対するTADG−12(またはTADG−12V)の平均比+/−2SDとして、正常な発現を定義した。その結果を表1および表2に要約する。TADG−12は評価した55の癌の内41において過剰発現されているが、一方、変異体は22の癌の内8において異常に高いレベルで存在することが認められた。student’s t testによって特定したところ、それらの差は統計的に有意であった(p<0.05)。
【0112】
【表1】
【表2】
実施例13
卵巣腫瘍細胞におけるTADG−12の免疫組織化学分析
TADG−12タンパク質について調べるために、カルボキシ末端のアミノ酸配列中に位置するペプチドに対するポリクロナールウサギ抗血清を開発した。それら抗体を用いて、TADG−12タンパク質の発現レベルを調べ、さらに免疫学的局在決定によって正常卵巣および卵巣腫瘍細胞内でのその局在性を調べた。正常卵巣組織では全く染色が観察されなかった(図7A)が、一方、試験した29の腫瘍の内22において顕著な染色が観察された。図7Bおよび7Cにおいて、代表的腫瘍試料を示している。TADG−12は細胞質に亘り広汎に認められ、輸送経路中のタンパク質であることが示唆されることに注意すべきである。また、予想通り、それら腫瘍試料において、TADG−12は細胞表面において認められる。免疫組織化学分析のために開発されかつ用いられた抗体はTADG−12V切断タンパク質を検出しないことに注意すべきである。
【0113】
免疫組織化学染色の結果を表3に要約する。29の卵巣腫瘍の内22がTADG−12の陽性染色を示したが、正常卵巣上皮はTADG−12抗原の発現を全く示さなかった。10の漿液性腺癌の内8つ、8の粘液性腺癌の内8つ、2の明細胞癌の内1つ、さらに6の子宮内膜癌の内4つが陽性染色を示した。
【0114】
【表3】
実施例14
ペプチドの順位付け
ワクチンまたは免疫刺激のために、それぞれ9−マーから11−マーのTADG−12タンパク質を調べて、一般人口の上位8つのハプロタイプに対する各ペプチドの結合を順位付けした[Parker et al., (1994)]。http://www-bimas. dcrt. nih. gov/ molbio /hla bind/において、その分析に用いられるコンピュータープログラムを見つけることができる。表4は、各ペプチドの特定HLA対立遺伝子に対する結合の予測半減期に基づくペプチドの順位付けを示す。より長い半減期は、そのペプチドと特定HLA分子とのより強い結合を示唆する。HLA対立遺伝子に対して強く結合するTADG−12ペプチドは推定上の免疫原であり、かつ個体にTADG−12に対するワクチン接種を行うために用いられる。
【0115】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
結論
本研究において、PCRに基づく方法によって、セリンプロテアーゼを同定した。ノーザンブロットによって、その遺伝子の最も大きな転写物は約2.4kbであり、その転写物は卵巣腫瘍において高レベルで発現されているが、調べた他の全ての組織では最少レベルでのみ認められることが分かった。新規な細胞表面マルチドメインセリンプロテアーゼをコードする完全長cDNAをクローン化し、TADG−12と命名した。その454アミノ酸タンパク質は、細胞質領域、2型膜貫通領域、LDLR−A領域、SRCR領域およびセリンプロテアーゼ領域を包含する。半定量的PCR分析を用いて、TADG−12が多くの試験した腫瘍において過剰発現していることが分かった。免疫組織化学染色によって、場合によってそのタンパク質が腫瘍細胞の細胞表面に局在することを確認し、このことはTADG−12がいくつかの細胞外タンパク質分解機能を有することを示唆する。興味深いことに、TADG−12は調べた腫瘍の35%において存在する変異スプライシング形態も有する。その変異mRNAは、腫瘍細胞表面上に独特なペプチド配列をもたらす切断タンパク質を生じさせる。
【0116】
そのタンパク質は、そのマルチドメイン分子に対して独特な特性を与え得る2つの細胞外領域を包含する。プロテアーゼに関連したLDLR−A機能の正確な役割は不確かであるが、その領域がカルシウムおよび他の正電荷を持つリガンドに結合する能力を有することは確かである[21,22]。このことは、プロテアーゼの調節またはそれに続くその分子の内在化において重要な役割を果たすであろう。SRCR領域は、当初はマクロファージスカベンジャー受容体内において同定され、かつリポタンパク質に結合することが機能的に説明された。SRCR領域はリポタンパク質に結合し得るのみならず、様々なポリヌクレオチド分子にも結合することができる[23]。より最近の研究において、免疫系の成熟に関連する細胞接着分子に対するプロテアーゼと異なる機能を有するタンパク質において、その領域ファミリーのメンバーが同定された。さらには、TMPRSS2と同様にTADG−12は、そのSRCR領域内に、6つの保存システイン領域の内4つしか持たない。その違いによって、独特なリガンド結合特性を与えるそれら領域の異なる構造特性がもたらされる。現時点では、CD6をコードするSRCRのみがよく証明されている。CD6の場合、SRCR領域は細胞接着分子ALCAMに結合する[23]。その細胞接着の仲介は、新規に同定されたSRCR領域に基づく新規な研究のための有用な出発点であるが、その領域の複数の機能の可能性を見過ごすことはできない。SRCR領域が細胞接着型の相互作用をし得ることは確かであるが、他の型のリガンドに結合する能力も考慮すべきである。
【0117】
現時点では、TADG−12の正確な役割は不確かなままである。プロテアーゼ領域に対する基質は同定されておらず、また細胞外LDLR−AおよびSECR領域のリガンドも同定されていない。図8は、本発明において開示された情報と共に、TADG−12の作用モデルを表す。TADG−12または切断TADG−12Vタンパク質の何れかの産生をもたらす2つの転写物が産生される。それらタンパク質の何れかが細胞表面に潜在的に標的化される。TADG−12は活性化セリンプロテアーゼになることができるが、TADG−12Vは細胞表面にある場合には腫瘍特異的エピトープを表わすことができる切断タンパク質産物となる。
【0118】
今日における卵巣癌の治療における問題は、依然として初期ステージでの疾患の診断ができないことである。腫瘍細胞増殖に必須であるプロテアーゼのような疾患過程において初期に発現される遺伝子を同定すること[26]は、治療を改善するための重要なステップである。その知識によって、より早期ステージにおいてそのような癌を診断するために、例えばこの中に記載のTADG−12プロテアーゼまたは以前記載されたプロテアーゼ等の高発現遺伝子を検出する方法を設計することが可能であろう。また、マーカーのパネルは、予測情報を提供し、さらに個々の患者のための治療計画をもたらすことができる。あるいは、プロテアーゼ等の酵素の阻害は卵巣癌の進行を遅くしかつ患者の生活の質を改善するための効果的な手段と成り得る。TADG−12およびTADG−12Vの他の特性も将来の研究に重要であると考えなければならない。細胞外リガンド結合領域は薬剤送達システムのための天然のターゲットである。TADG−12Vタンパク質に関連する異常なペプチドは、優れたターゲット薬剤の送達または免疫刺激をもたらすことができる。
【0119】
以下の引例がこの中で挙げられている
【表11】
【表12】
本明細書に記載の任意の特許または公報は本発明が属する分野の当業者のレベルを示唆する。各公報が参照によって組み込まれることを特異的にかつ個別に指示している場合と同範囲で、それら特許および公報は参照によってこの中に組み込まれる。
【0120】
当業者は、本発明をうまく応用して、その目的を達成しかつ記載のおよび本来の結果ならびに利点を得ることを容易に理解するであろう。この中において方法、手段、処置、分子および特定化合物と共に記載した本実施例は、現在での好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として見なされない。当業者はそれらに対する変化および他の用途を考えつき、それらは本請求の範囲によって特定された本発明の精神に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aは、重複セリンプロテアーゼプライマーを用いた約180bpの予測されたPCR産物および約300bpの予測外のPCR産物が、正常卵巣cDNAからは増幅されない(レーン1)が、卵巣腫瘍cDNAから異常に増幅される(レーン2)ことを示す
【図1B】 図1Bは、TADG−12が180bpバンドからサブクローン化され、一方、大きな300bpバンドがTADG−12Vを指定することを示す
【図2】 図2は、TADG−12のノーザンブロット分析において、2.4、1.6および0.7kbの3つの転写物が顕示されたことを示す
【図3】 図3は、TADG−12を詳細に調べたRNAドットブロット(CLONTECH)を示す
【図4】 図4は、オープンリーディングフレームの予測454アミノ酸(配列番号2)と共に、TADG−12のcDNA配列(配列番号1)を示す
【図5A】 図5Aは、セリンプロテアーゼTMPRSS2(U75329、配列番号14)からの他のLDLR−Aモチーフ、補体サブユニットC8(P07358、配列番号9)、糖タンパク質GP300の2つのLDLR−A領域(P98164、配列番号11および12)およびセリンプロテアーゼのマトリプターゼ(matriptase)(AF118224、配列番号10)と整列させて、TADG−12の35アミノ酸LDLR−A領域(配列番号13)を示す
【図5B】 図5Bは、ヒトマクロファージスカベンジャー受容体(P21757、配列番号16)、ヒトエンテロキナーゼ(P98073、配列番号19)、ウシエンテロキナーゼ(P21758、配列番号15)およびセリンプロテアーゼTMPRSS2(配列番号18)等の他のドメインファミリーメンバーと整列させて、TADG−12のSRCR領域(配列番号17)を示す
【図5C】 図5Cは、プロテアーゼM(U62801、配列番号20)、トリプシノーゲンI(P07477、配列番号21)、血漿カリクレイン(P03952、配列番号22)、ヘプシン(P05981、配列番号25)およびTMPRSS2(配列番号24)等の他のヒトセリンプロテアーゼと整列させて、TADG−12のプロテアーゼ領域(配列番号23)を示す
【図6】 図6は、TADG−12(上段パネル)およびTADG−12V(下段パネル)について実施した半定量的PCR分析を示す
【図7】 図7は、TADG−12特異的ペプチドに対して作成されたポリクロナールウサギ抗体を用いて実施した正常卵巣および卵巣腫瘍の免疫組織化学染色を示す
【図8】 図8は、細胞内でのTADG−12の経過を示す
【配列表】
Claims (10)
- 配列番号2又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連差別的発現遺伝子−12(TADG−12)タンパク質をコードするDNA断片であって:
(a)配列番号1又は配列番号3に示される配列を含む単離DNA断片;
(b)前記(a)の単離DNA断片に対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;および
(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNA断片と異なり、かつ配列番号2又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;
より成る群から選択されるDNA断片。 - 請求項1記載のDNA断片、および細胞における該DNA断片の発現に必要な調節要素を含むことを特徴とするベクター。
- 前記DNA断片が、配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むTADG−12タンパク質をコードすることを特徴とする請求項2記載のベクター。
- 請求項3記載のベクターで形質転換され、配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むTADG−12タンパク質を発現することを特徴とする宿主細胞。
- 細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞または昆虫細胞であることを特徴とする請求項4記載の宿主細胞。
- 前記細菌細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項5記載の宿主細胞。
- 請求項1記載のDNA断片に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 単離および精製した配列番号2又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連差別的発現遺伝子−12(TADG−12)タンパク質であって:
(a)配列番号1又は配列番号3に示される配列を含む単離DNA断片;
(b)前記(a)の単離DNA断片に対してハイブリダイズし、かつTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;および
(c)遺伝暗号の縮重のためコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNA断片と異なり、かつ配列番号2又は配列番号4に示されるアミノ酸配列に含まれるTADG−12タンパク質をコードする単離DNA断片;
より成る群から選択されるDNAによってコードされることを特徴とする単離および精製TADG−12タンパク質。 - 請求項8記載のTADG−12タンパク質に対する抗体。
- 配列番号8、35、36、55、56、83、84、97、98、119、120、122、123または136に示される配列を含むTADG−12タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含むことを特徴とする免疫原組成物。
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US6942978B1 (en) * | 1999-03-03 | 2005-09-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Transmembrane serine protease overexpressed in ovarian carcinoma and uses thereof |
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EP1252300B1 (en) * | 2000-02-03 | 2011-01-19 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
US7700341B2 (en) * | 2000-02-03 | 2010-04-20 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
US6797504B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-09-28 | Dendreon San Diego Llc | Inhibitors of serine protease activity of matriptase or MTSP1 |
US7265216B2 (en) * | 2000-03-02 | 2007-09-04 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas System | Transmembrane serine protease overexpressed in ovarian carcinoma and uses thereof |
WO2001083781A2 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 14094, a novel human trypsin family member and uses thereof |
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US20060063152A1 (en) | 2000-12-22 | 2006-03-23 | Osamu Ohara | Novel gene and protein encoded by the gene |
US20040086875A1 (en) * | 2001-11-05 | 2004-05-06 | Agee Michele L. | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
US7601825B2 (en) | 2001-03-05 | 2009-10-13 | Agensys, Inc. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 121P1F1 useful in treatment and detection of cancer |
US6924358B2 (en) * | 2001-03-05 | 2005-08-02 | Agensys, Inc. | 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers |
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WO2003088898A2 (en) * | 2002-04-17 | 2003-10-30 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
AU2002357004A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Dendreon San Diego Llc | Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon |
US20040001801A1 (en) * | 2002-05-23 | 2004-01-01 | Corvas International, Inc. | Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof |
US7799742B2 (en) * | 2008-03-07 | 2010-09-21 | Elementis Specialties Inc. | Equivalent circulating density control in deep water drilling |
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WO2004099779A1 (en) * | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human transmembrane serine protease 3 (tmprss3) |
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US5972616A (en) * | 1998-02-20 | 1999-10-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | TADG-15: an extracellular serine protease overexpressed in breast and ovarian carcinomas |
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