JP4557699B2 - Patterned microchip and manufacturing method thereof - Google Patents

Description

本発明は、パターン化したマイクロチップ及びその製造方法に関する。   The present invention relates to a patterned microchip and a method for manufacturing the same.

ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等、各種の核酸プローブ分子を利用した解析は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。従来、ＤＮＡチップを用いた解析システムでは、構造が既知のＤＮＡを定着したＤＮＡチップを用い、該ＤＮＡチップ上に未知のＤＮＡを滴下して既知のＤＮＡと反応（ハイブリダイゼーション）させ、未反応のＤＮＡを洗浄し、ＤＮＡ同士が結合したものと、結合しないものとを選別し、その反応を発色等により解析していた。   Analysis using various nucleic acid probe molecules such as DNA chip, RNA chip, etc. provides important indicators for diagnosis, prognosis prediction, treatment policy determination, etc. of cancer, genetic diseases, lifestyle-related diseases, infectious diseases, etc. Expected. Conventionally, in an analysis system using a DNA chip, a DNA chip on which DNA of a known structure is fixed is used, and the unknown DNA is dropped onto the DNA chip to react with the known DNA (hybridization). The DNA was washed, and the DNAs that were bonded and those that were not bonded were selected, and the reaction was analyzed by color development or the like.

これらのＤＮＡチップは、すでに構造が解析されているＤＮＡを、スポッターと呼ばれる塗布装置を用いて平面状のガラスやシリコンの基板上などに、数千〜数万ポイント塗布することによって高密度にＤＮＡ分子を定着させたものである。また、この反応（ハイブリダイゼーション）でＤＮＡチップに用いるＤＮＡ分子と検査用のＤＮＡとが結合するか否かを解析することにより、試料中に目的のＤＮＡが存在するかを調べることができる。例えば疾患等によりＤＮＡの一部が損傷している場合、ＤＮＡ間の相補性が損なわれることを検知することが可能である。   These DNA chips have a high density by applying several thousand to tens of thousands of points of DNA whose structure has already been analyzed on a flat glass or silicon substrate using a coating device called a spotter. A DNA molecule is fixed. Further, by analyzing whether or not the DNA molecule used for the DNA chip and the test DNA are bound in this reaction (hybridization), it is possible to check whether the target DNA exists in the sample. For example, when a part of DNA is damaged due to a disease or the like, it is possible to detect that the complementarity between DNAs is lost.

既知のＤＮＡを定着させたＤＮＡチップは、現在極めて高価である。ＤＮＡチップの製造方法としては、幾つかの手法が知られている。例えば、フォトリソグラフィーを用いて、直接基板上にＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（特許文献１及び２）、並びに予め合成したＤＮＡまたはｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給して結合する方法（特許文献３〜５、及び非特許文献１）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。一般的には、上記の何れかの方法によって核酸チップは作製されるが、作製された核酸チップを前記用途に使用しようとする場合、解析の信頼性、すなわち、定量性や再現性を保証するためには、各マトリクスに存在するプローブ、すなわち、プローブに利用する核酸の量、つまり、密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するかを知ること（イメージング）も、定量性や再現性の確保の見地から重要である。   A DNA chip on which a known DNA is fixed is currently very expensive. As a method for manufacturing a DNA chip, several methods are known. For example, a method of sequentially synthesizing DNA probes directly on a substrate using photolithography (Patent Documents 1 and 2), and supplying pre-synthesized DNA or cDNA (complementary DNA) on the substrate. The binding method (Patent Documents 3 to 5 and Non-Patent Document 1) is a typical method for producing a DNA chip. In general, a nucleic acid chip is produced by any of the above methods, but when the produced nucleic acid chip is to be used for the above-mentioned purpose, the reliability of analysis, that is, the quantitativeness and reproducibility are guaranteed. For this purpose, it is important to know the amount of nucleic acid used for the probe, that is, the nucleic acid used for the probe, that is, the density. It is also important from the viewpoint of securing quantitativeness and reproducibility to know what matrix shape (shape, size, state) actually exists (imaging).

また、アビジンをパターニングする以下のような方法（非特許文献２）が提案されている。まず、酸化膜を有するシリコン基板上に3-メルカプトプロピル−トリメトキシシランを用いメルカプト基を基板表面に形成する。その後、フォトアクティブなビオチンである1-[4-アジド-アリシラアミド]-6-[ビオチンチンアミド]-ヘキサンを、2μg/mlとなるように無水メタノールで調整し、前記メルカプト基を有する基板上に塗布する。次に所望のパターンを有するフォトマスクを介してUV光（365nm、5min）で露光することにより、フォトアクティブなビオチンと基板表面のメルカプト基が共有結合することになる。次いで、ジメチルスルホキシドで15分間リンスし、さらにH₂Oで簡単にリンスすることにより、ビオチンのパターンが完成する。パターン化されたビオチンにアビジンを結合させることにより、アビジンのパターンも得ることができる。しかしながら、この方法は、UV光による露光工程があるため、露光して無水メタノールで洗浄するまで周囲からの光による暴露がないような環境に基板を保管する手間が必要になる。即ち、本発明と比較すると従来技術の方法は、現像する必要があるため工程数が多くなり、周囲からの光による影響を遮断する環境設備が必要となるという問題点がある。 Moreover, the following methods (nonpatent literature 2) which pattern avidin are proposed. First, a mercapto group is formed on a substrate surface using 3-mercaptopropyl-trimethoxysilane on a silicon substrate having an oxide film. Thereafter, 1- [4-azido-alisilamide] -6- [biotintinamide] -hexane, which is a photoactive biotin, is adjusted with anhydrous methanol so as to be 2 μg / ml, and is placed on the substrate having the mercapto group. Apply. Next, by exposing with UV light (365 nm, 5 min) through a photomask having a desired pattern, the photoactive biotin and the mercapto group on the substrate surface are covalently bonded. The biotin pattern is then completed by rinsing with dimethyl sulfoxide for 15 minutes, followed by a brief rinse with H ₂ O. By binding avidin to patterned biotin, an avidin pattern can also be obtained. However, in this method, since there is an exposure step using UV light, it is necessary to store the substrate in an environment where there is no exposure by light from the surroundings until exposure and washing with anhydrous methanol. That is, compared with the present invention, the method of the prior art has a problem that the number of steps is increased because development is required, and an environmental facility that blocks the influence of light from the surroundings is required.

一方、基材上にコーティングされた生体高分子材料に対してイオンビームを照射することにより細胞粘着性が制御され、照射部位が細胞非粘着面とされていることを特徴とする細胞粘着性制御材料が報告されている（特許文献６）。ここでは、生体高分子材料としてゼラチン、コラーゲン等を使用し、イオンビームとしては、加速エネルギー５０〜１５０ｋｅＶ、照射量１×１０¹⁵個／cm² 以上で照射することが記載されている。また、イオン種等の条件を選定することで、照射部位が癌細胞非粘着面、正常細胞粘着面とされた選択的粘着性表面が形成されることが記載されている。また、細胞外マトリックスをコートした培養基質にイオンビーム照射を行うことによって細胞接着を制御する技術も報告されている（非特許文献３及び４） On the other hand, cell adhesion control is characterized in that cell adhesion is controlled by irradiating an ion beam to a biopolymer material coated on a substrate, and the irradiation site is a cell non-adhesive surface. Materials have been reported (Patent Document 6). Here, it is described that gelatin, collagen, or the like is used as the biopolymer material, and the ion beam is irradiated at an acceleration energy of 50 to 150 keV and an irradiation amount of 1 × 10 ¹⁵ pieces / cm ² or more. Further, it is described that by selecting conditions such as ionic species, a selective adhesive surface is formed in which the irradiation site is a cancer cell non-adhesive surface or a normal cell adhesive surface. In addition, a technique for controlling cell adhesion by irradiating an ion beam to a culture substrate coated with an extracellular matrix has been reported (Non-Patent Documents 3 and 4).

特表平４−５０５７６３号公報Japanese National Patent Publication No. 4-505863 米国特許第５４０５７８３公報等US Pat. No. 5,405,783, etc. 特表平１０−５０３８４１号公報Japanese National Patent Publication No. 10-503841 米国特許第５６０１９８０公報US Pat. No. 5,601,980 特開平１１−１８７９００号公報JP 11-187900 A 特開平７−１０８０６０号公報JP-A-7-108060 Science Vol.270,467,1995Science Vol.270,467,1995 Chandran R.Sabanayagam,Cassandra L.Smith, Charles R.Cantor, “Oligonucleotide immobilization on micropatterned Streptabidin surfaces", Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, No.8Chandran R. Sabanayagam, Cassandra L. Smith, Charles R. Cantor, “Oligonucleotide immobilization on micropatterned Streptabidin surfaces”, Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, No.8 細胞外マトリックスをコートした培養基質へのイオンビーム照射による細胞接着制御、鈴木嘉昭ほか、人工臓器，23 (3), (1994) pp 700-707Cell adhesion control by irradiation of ion beam to culture matrix coated with extracellular matrix, Yoshiaki Suzuki et al., Artificial organ, 23 (3), (1994) pp 700-707 Cell Adhesion Control by Ion Implantation into Extracellular Matrix, Y. Suzuki, 他、Nucl. Instr. and Meth., B91, (1994) pp 588-592Cell Adhesion Control by Ion Implantation into Extracellular Matrix, Y. Suzuki, et al., Nucl. Instr. And Meth., B91, (1994) pp 588-592

本発明は、タンパク質などのパターニングすべき目的物質をマイクロパターン化した基板を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、定量性や再現性に優れ、任意の目的物質を任意にパターン化して、微細構造の表面を形成している基板を提供することを解決すべき課題とした。   An object of the present invention is to provide a substrate on which a target substance to be patterned such as protein is micropatterned. In particular, the present invention has an object to be solved by providing a substrate which is excellent in quantification and reproducibility, and which is formed by arbitrarily patterning an arbitrary target substance to form a microstructured surface.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基板表面に物理的あるいは化学的に吸着されたタンパク質などの目的物質に高エネルギー荷電粒子（イオンビーム）を照射することにより上記目的物質を消失させ、残存する面（イオンビームを照射しなかった面）の機能を利用して任意の物質をパターン化した表面を作成できることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have radiated high-energy charged particles (ion beams) onto target substances such as proteins physically or chemically adsorbed on the substrate surface. The present inventors have found that a surface in which a substance is patterned can be created by using the function of the remaining surface (surface not irradiated with the ion beam) by disappearing the material, and the present invention has been completed.

即ち、本発明によれば、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板が提供される。   That is, according to the present invention, the target substance is patterned on the surface, which is produced by performing ion implantation on the patterned region of the substrate on which the target substance to be patterned is physically or chemically adsorbed. A substrate is provided.

本発明の別の側面によれば、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされている基板の製造方法が提供される。   According to another aspect of the present invention, the target substance is a surface, wherein ion implantation is performed on a patterned region of the substrate on which the target substance to be patterned is physically or chemically adsorbed. A method of manufacturing a substrate that has been patterned is provided.

好ましくは、パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う。
好ましくは、目的物質は、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸である。
好ましくは、親和性物質はアビジン類である。
好ましくは、ドース量φが１×１０¹²≦φ＜１×１０¹⁶個／ｃｍ² となる範囲でイオン注入を行う。 Preferably, ion implantation is performed on the patterned region of the substrate by performing ion implantation after mounting the patterned mask on the substrate surface.
Preferably, the target substance is an affinity substance, protein, peptide or nucleic acid.
Preferably, the affinity substance is an avidin.
Preferably, a dose of phi is the ion implantation within an amount of ^{1 × 10 12 ≦ φ <1} × 10 16 pieces / cm ^2.

本発明により、任意のタンパク機能あるいは官能基集団を任意にパターン化して、微細構造表面の形成が可能となる。   According to the present invention, an arbitrary protein function or functional group population can be arbitrarily patterned to form a microstructured surface.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、パターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされている基板、並びにパターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされている基板の製造方法に関するものである。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a substrate on which a target substance is patterned on a surface, which is produced by performing ion implantation on a patterned region of a substrate on which a target substance to be patterned is physically or chemically adsorbed. Manufacturing a substrate on which a target substance is patterned on the surface, wherein ion implantation is performed on a patterned region of the substrate on which the target substance to be patterned is physically or chemically adsorbed It is about the method.

表面・表層加工技術は新しい優れた機能や複合機能を持つ表面表層を形成する手法として発達してきた。この技術には母材の性質を変化させずに母材表層のみを改変する方法と表面上に新しい層を形成する方法とがある。本発明で用いるイオン注入法（イオンビーム照射技術）は前者にあたり、添加効果を目的にした例ではすでにシリコンへの不純物添加法として確立された技術である。   Surface / surface layer processing technology has been developed as a method for forming surface layers with new superior functions and composite functions. This technique includes a method of modifying only the surface layer of the base material without changing the properties of the base material and a method of forming a new layer on the surface. The ion implantation method (ion beam irradiation technique) used in the present invention is the former, and is an established technique as an impurity addition method to silicon in the example for the purpose of the addition.

イオン注入法とは、添加を目的とする粒子を高真空（例えば、10^-4 Pa）中でイオン化し、数十 kV から数 MV に加速して固体基板に添加する方法である。これによって作られるイオンビームは質量分離されるため、イオンの純度が極めてよく、また加速エネルギー、照射量など制御性が高く、再現性、均一性がよい加工が可能である。また照射材料の構造変化に対するイオンビーム照射効果が解析しやすい利点を有する。 The ion implantation method is a method in which particles to be added are ionized in a high vacuum (for example, 10 ⁻⁴ Pa), accelerated from several tens of kV to several MV, and added to a solid substrate. Since the ion beam produced by this is mass-separated, the ion purity is very good, the controllability such as acceleration energy and irradiation amount is high, and processing with good reproducibility and uniformity is possible. In addition, there is an advantage that the ion beam irradiation effect on the structural change of the irradiation material can be easily analyzed.

イオンビームによる表層の改質方法は大きく２つに分かれる。１つはイオンを添加することによるドーピング効果であり、他方はイオンが通過することにより生じる結合の切断などの照射損傷効果である。目的物質（例えば、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸など）にイオンビームを照射すると、目的物質の一次構造あるいは高次構造は破壊され、目的物質はその機能を消失する。また目的物質中の官能基にイオンビームが照射されることにより、官能基が破壊され、反応性を消失する場合もある。   The surface layer modification method using an ion beam is roughly divided into two. One is a doping effect due to the addition of ions, and the other is an irradiation damage effect such as bond breakage caused by the passage of ions. When a target substance (for example, an affinity substance, protein, peptide, or nucleic acid) is irradiated with an ion beam, the primary structure or higher-order structure of the target substance is destroyed, and the target substance loses its function. Further, when the functional group in the target substance is irradiated with an ion beam, the functional group may be destroyed and the reactivity may be lost.

イオン注入法におけるイオンビームは直進性を有する。この性質を利用して金属などのパターン化したマスクを試料表面に装着した後にイオンビームを照射すると、作成したパターンに従った照射面を形成が可能となる。パターンの形状は線状、円状など任意であり、それらの大きさはサブミクロンでも数mmでも任意に選択できる。本発明では、この特色を利用して、照射部分の目的物質の機能を消失させることによってパターン化機能化表面を形成することができる（図１）。   The ion beam in the ion implantation method has straightness. When an ion beam is irradiated after a patterned mask made of metal or the like is mounted on the sample surface using this property, an irradiation surface according to the created pattern can be formed. The shape of the pattern is arbitrary such as a linear shape or a circular shape, and the size thereof can be arbitrarily selected whether it is submicron or several mm. In the present invention, a patterned functionalized surface can be formed by using this feature to eliminate the function of the target substance in the irradiated portion (FIG. 1).

一方、DNAマイクロチップ及びマイクロアレイを作製するためには、プローブDNAを基板上に固定することが必要である。プローブDNAを基板上に固定するためには、例えばチオール（SH）基が末端に修飾されたプローブDNAをAu表面あるいはシランカップリング反応によりSH基が形成された基板表面にチオール結合により固定する方法、あるいは、アミノ基が修飾されたプローブDNAをシランカップリング反応等によりカルボキシル基が形成された基板表面にペプチド結合により固定する方法、基板上に形成されたゲルあるいは高分子層にプローブDNAを取り込み固定する方法など、様々な方法がある。中でも、基板表面にアビジンを均一に固定することで、末端がビオチン化されたプローブDNAを用いて固定する方法は、アビジンが4量体構造を持つことでビオチン化されたプローブDNAの固定位置が定まることから、プローブ固定密度を制御しやすいという利点を持つ。   On the other hand, in order to produce DNA microchips and microarrays, it is necessary to fix probe DNA on a substrate. In order to immobilize probe DNA on a substrate, for example, a method of immobilizing probe DNA modified with a thiol (SH) group at its end to the Au surface or the substrate surface on which the SH group is formed by silane coupling reaction by thiol bond Alternatively, probe DNA modified with amino groups can be fixed to the surface of the substrate on which carboxyl groups are formed by silane coupling reaction, etc. by peptide bonds, or probe DNA can be incorporated into a gel or polymer layer formed on the substrate. There are various methods such as fixing. Above all, the method of immobilizing avidin on the substrate surface and immobilizing it with a biotinylated probe DNA has a fixed position of the biotinylated probe DNA due to the tetramer structure of avidin. Since it is determined, it has an advantage that the probe fixing density can be easily controlled.

本発明で用いる、パターニングすべき目的物質としては、親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸などが挙げられる。   Examples of the target substance to be patterned used in the present invention include affinity substances, proteins, peptides, and nucleic acids.

親和性物質としては、アビジン類などが挙げられる。ここで言うアビジン類としては、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンと安定な複合体を形成することができるこれらの改変化合物などが挙げられる。   Examples of the affinity substance include avidins. Examples of the avidins mentioned here include avidin, streptavidin, or modified compounds capable of forming a stable complex with biotin.

タンパク質又はペプチドの種類も特に限定されず、生理活性を有する任意のタンパク質又はその断片ペプチドでもよいし、抗原、レセプター、抗体又は抗体フラグメント、核酸認識タンパク質などでもよい。核酸認識タンパク質としては、転写因子などの２本鎖ＤＮＡ認識物質などが挙げられる。   The type of the protein or peptide is not particularly limited, and may be an arbitrary protein having physiological activity or a fragment peptide thereof, an antigen, a receptor, an antibody or antibody fragment, a nucleic acid recognition protein, or the like. Examples of nucleic acid recognition proteins include double-stranded DNA recognition substances such as transcription factors.

核酸の種類も特に限定されないが、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びペプチド核酸などを挙げることができる。核酸は、天然由来の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの断片）でもよいし、化学合成した核酸でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え核酸でもよい。例えば、遺伝子の発現を調べる場合には、ＤＮＡとしてｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、又はＥＳＴ等を使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を分析する場合には、既知の塩基配列に基づいて変異や多型に対応する各種のオリゴヌクレオチドを化学合成して使用することができる。   The type of nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include oligonucleotides, polynucleotides, and peptide nucleic acids. The nucleic acid may be a naturally occurring nucleic acid (DNA, RNA or a fragment thereof), a chemically synthesized nucleic acid, or a recombinant nucleic acid produced by a gene recombination technique. For example, when examining the expression of a gene, cDNA, a part of cDNA, or EST can be used as DNA. Further, when analyzing gene mutations and polymorphisms, various oligonucleotides corresponding to the mutations and polymorphisms can be chemically synthesized and used based on known base sequences.

本発明では上記した目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板を用いる。基板としては、目的物質を固定できるものであれば特に限定されず、表面が平滑な基板でもよいし、表面に凹凸を有する基板でもよい。基板の材質も特に限定されないが、例えば、シリコン、多孔質シリコン、ガラス、多孔質ガラス、セラミックス、多孔質セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリスチレン、又はポリメチルメタクリレートなどを挙げることができる。基板が多孔質である場合の多孔質物質の細孔の大きさは、１〜１０００ｎｍ程度であることが好ましい。基板は、表面に被覆層を有していてもよく、例えば、熱酸化膜を有するシリコン基板、又は有機質被覆層で被覆されたガラス基板などを使用することもできる。   In the present invention, a substrate on which the target substance is physically or chemically adsorbed is used. The substrate is not particularly limited as long as the target substance can be fixed, and may be a substrate having a smooth surface or a substrate having irregularities on the surface. The material of the substrate is not particularly limited, and examples thereof include silicon, porous silicon, glass, porous glass, ceramics, porous ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polystyrene, and polymethyl methacrylate. When the substrate is porous, the pore size of the porous material is preferably about 1 to 1000 nm. The substrate may have a coating layer on the surface. For example, a silicon substrate having a thermal oxide film or a glass substrate coated with an organic coating layer may be used.

本発明では、目的物質が吸着されている基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行う。具体的には、例えば、パターン化したマスクを基板表面に装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことができる。   In the present invention, ion implantation is performed on the patterned region of the substrate on which the target substance is adsorbed. Specifically, for example, ion implantation can be performed on a patterned region of the substrate by performing ion implantation after mounting a patterned mask on the substrate surface.

注入するイオン種としてはＨ⁺ ，Ｈｅ⁺ ，Ｃ⁺ ，Ｎ⁺ ，Ｎｅ⁺ ，Ｎａ⁺ ，Ｎ⁺ ，Ｏ⁺ ，Ｎ₂ ⁺，Ｏ₂ ⁺，Ａｒ⁺，Ｋｒ⁺ 等が例示されるが、目的物質の構造及び／又は機能を消失できるものであれば、これらに限定されるものではない。イオン種は特に好ましくは、Ｈｅ⁺、Ｎｅ⁺、Ａｒ⁺ 又はＫｒ⁺である。 Examples of ion species to be implanted include H ⁺ , He ⁺ , C ⁺ , N ⁺ , Ne ⁺ , Na ⁺ , N ⁺ , O ⁺ , N ₂ ⁺ , O ₂ ⁺ , Ar ⁺ and Kr ⁺ . It is not limited to these as long as the structure and / or function of the target substance can be lost. The ionic species is particularly preferably He ⁺ , Ne ⁺ , Ar ⁺ or Kr ⁺ .

イオン注入の際のドース量φは１×１０¹²≦φ＜１×１０¹⁶個／ｃｍ² となる範囲であることが好ましい。ドース量φが1×10¹² 個/ cm²より低いと目的物質の構造の破壊が生じず、改善効果が小さくなり好ましくない。 The dose amount φ at the time of ion implantation is preferably in the range of 1 × 10 ¹² ≦ φ <1 × 10 ¹⁶ pieces / cm ² . If the dose amount φ is lower than 1 × 10 ¹² pieces / cm ² , the structure of the target substance is not destroyed, and the improvement effect becomes small, which is not preferable.

ビーム電流密度は約3μA/cm² を越えない範囲に設定することが望ましい。これはビーム電流密度が過大になるとターゲットである材料の温度が上がりすぎ、パターン化部以外の材料自体が劣化する上、ガス透過性が低下するおそれがある。 It is desirable to set the beam current density within a range not exceeding about 3 μA / cm ² . This is because when the beam current density is excessive, the temperature of the target material is excessively increased, and the material itself other than the patterned portion is deteriorated and the gas permeability may be decreased.

イオン加速エネルギーに関してはこの高低によりエネルギー伝達機構に差異が生じるものと考えられるが、実際的には数MeV以下の範囲で設定することができ、好ましくは2 MeV 以下である。   Regarding the ion acceleration energy, it is considered that the energy transfer mechanism varies depending on the height, but in practice, it can be set within a range of several MeV or less, preferably 2 MeV or less.

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。   The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.

実施例１：試料の作成（アビジン固定工程）
50nm程度の熱酸化膜を有するシリコン基板にシランカップリング反応によりアミノ基を形成し、カルボキシル化、活性エステル化工程を経て、アビジンを共有結合により基板上に固定し、試料を作製した。具体的には、下記の通り試料を作製した。 Example 1: Preparation of a sample (Avidin fixing step)
A sample was prepared by forming an amino group on a silicon substrate having a thermal oxide film of about 50 nm by a silane coupling reaction, followed by carboxylation and active esterification steps, and fixing avidin on the substrate by a covalent bond. Specifically, a sample was prepared as follows.

5mm×10mmの酸化膜を有するシリコン基板の表面をプラズマアッシング（200W, 5min）でクリーニングした後、過酸化水素水に10分間浸すことで基板表面に-OH基を形成する。純水でリンスした後、オーブン（120℃, 5分）で乾燥させる。次に、2％3-aminopropyltriethoxysilaneの無水トルエン溶液に、前記基板を浸し、50℃で30min、揺動攪拌しながら基板表面に-NH₂基を形成する。トルエンでリンス後、120℃1時間乾燥させ、-NH₂基を定着させる。次に、10mg/mlの無水コハク酸と0.05M のジメチルアミノピリジンを溶解した無水ジメチルホルムアミドの中に前期基板を浸し、50℃で2時間反応を行うことによりカルボキシル基が形成される。ジメチルホルムアミドでリンスした後、1-ethyl-3-(3-dimethylamino)propylcarbodiimid Hydrochloride（塩酸1-エチル-3（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとN-hydroxysiccinimide（N-ヒドロキシコハク酸イミド）をそれぞれ100mg/ml溶解した水溶液に常温で30min浸すことにより、カルボキシル基を活性エステル化する。100mM HEPES Bufferでリンス後、その表面を0.1mg/mlのアビジンもしくはストレプトアビジン水溶液に常温で1時間浸すことによりアビジンが固定され、100mM HEPES Bufferでリンスし余剰なアビジンを除去することでアビジン固定基板が完成する。 The surface of a silicon substrate having an oxide film of 5 mm × 10 mm is cleaned by plasma ashing (200 W, 5 min), and then immersed in hydrogen peroxide for 10 minutes to form —OH groups on the substrate surface. After rinsing with pure water, it is dried in an oven (120 ° C, 5 minutes). Next, the substrate is immersed in an anhydrous toluene solution of 2% 3-aminopropyltriethoxysilane, and —NH ₂ groups are formed on the surface of the substrate while stirring at 50 ° C. for 30 minutes. After rinsing with toluene, drying is performed at 120 ° C. for 1 hour to fix the —NH ₂ group. Next, the substrate is immersed in anhydrous dimethylformamide in which 10 mg / ml succinic anhydride and 0.05 M dimethylaminopyridine are dissolved, and the reaction is carried out at 50 ° C. for 2 hours to form a carboxyl group. After rinsing with dimethylformamide, 100 mg each of 1-ethyl-3- (3-dimethylamino) propylcarbodiimid Hydrochloride (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysiccinimide (N-hydroxysuccinimide) Carboxyl group is activated ester by immersing in water solution at room temperature for 30 min.After rinsing with 100 mM HEPES Buffer, the surface is immersed in 0.1 mg / ml avidin or streptavidin aqueous solution at room temperature for 1 hour. Is fixed and rinsed with 100 mM HEPES Buffer to remove excess avidin, thereby completing the avidin-fixed substrate.

実施例２：イオンビーム照射
イオン注入器RIKEN 200kV Low Current Implanter で、He⁺, Ne⁺, Ar⁺, 又はKr⁺イオンを加速電圧150keV、照射量を1x10¹³, 1x10¹⁴ , 1x10¹⁵ ions/cm²に設定し、イオンビーム照射を行った。イオンビーム電流は0.1μA/cm²以下で行った。パターン化はパターン化されたステンレスマスクを試料表面に装着してイオンビーム照射することで行った。金属部分に照射されたイオンビームは試料表面に到達できないためにパターン化される。 Example 2: Ion beam irradiation In an ion implanter RIKEN 200 kV Low Current Implanter, He ⁺ , Ne ⁺ , Ar ⁺ , or Kr ⁺ ions are accelerated at 150 keV, and irradiation dose is 1 × 10 ¹³ , 1 × 10 ¹⁴ , 1 × 10 ¹⁵ ions / cm ² And ion beam irradiation was performed. The ion beam current was 0.1 μA / cm ² or less. Patterning was performed by attaching a patterned stainless steel mask to the sample surface and irradiating with an ion beam. Since the ion beam irradiated to the metal portion cannot reach the sample surface, it is patterned.

実施例３：イオンビーム照射アレイの評価１
一末端がビオチン化、他方の末端にCy3が修飾されたpoly-T 30merを含む溶液の濃度を1μMに調整し、試料（基板）に滴下、室温で30min放置した。その後、0.5％のTween（界面活性剤）を含むPhosphate Buffer Solution（PBS） を用いて5min間常温で揺動洗浄を行い、余剰なCy3修飾poly-Tを除去した。そして、以下の撮影条件により、蛍光顕微鏡でCy3の蛍光観察を行なった。 Example 3: Evaluation 1 of ion beam irradiation array
The concentration of a solution containing poly-T 30mer modified with biotin at one end and Cy3 modified at the other end was adjusted to 1 μM, dropped onto a sample (substrate), and left at room temperature for 30 min. Thereafter, rocking washing was performed at room temperature for 5 min using Phosphate Buffer Solution (PBS) containing 0.5% Tween (surfactant) to remove excess Cy3-modified poly-T. Then, Cy3 fluorescence observation was performed with a fluorescence microscope under the following imaging conditions.

（撮影条件）
・露光時間：1500 ms
・閾値： Low 800, High 3000 (Shooting conditions)
・ Exposure time: 1500 ms
・ Threshold: Low 800, High 3000

図２および図３にイオンビーム照射したアビジン固定化試料のBiotin-Cy3ラベリング結果を示す。イオンビーム照射によってアビジンは破壊され、不活性となり、蛍光強度が低下することが観察された。これらの結果よりイオンビームにより新規なバイオチップ、マイクロアレイの形成が可能であることが実証された。   2 and 3 show the results of Biotin-Cy3 labeling of an avidin-immobilized sample irradiated with an ion beam. It was observed that avidin was destroyed and inactivated by ion beam irradiation, and the fluorescence intensity decreased. From these results, it was demonstrated that a new biochip and microarray can be formed by an ion beam.

実施例４：イオンビーム照射アレイの評価２
また、イオンビームが照射されたアビジン固定基板に、実施例３と同じ操作により一末端がビオチン化されたpoly-T 30merを固定した後、一末端にCy3が標識されたpoly-A 30merを含む1μMの溶液を用いて、55℃で3時間、揺動させながらハイブリダイゼーションを行った。0.5％のTween（界面活性剤）を含むPhosphate Buffer Solution（PBS） を用いて5min間常温で揺動洗浄を行い、余剰なpoly-Aを除去した。その結果、プローブ固定時と同様のパターンが得られることを確認した。 Example 4: Evaluation of ion beam irradiation array 2
In addition, poly-T 30mer with one end biotinylated is immobilized on an avidin-immobilized substrate irradiated with an ion beam by the same operation as in Example 3, and then poly-A 30mer labeled with Cy3 at one end is included. Hybridization was performed using 1 μM solution while shaking at 55 ° C. for 3 hours. Using a Phosphate Buffer Solution (PBS) containing 0.5% Tween (surfactant), washing was performed at room temperature for 5 minutes to remove excess poly-A. As a result, it was confirmed that the same pattern as that obtained when the probe was fixed was obtained.

図１は、本発明によるパターン化機能化表面の形成の概要を示す。FIG. 1 shows an overview of the formation of a patterned functionalized surface according to the present invention. 図２は、イオンビーム照射したアビジン固定化試料をBiotin-Cy3でラベリングした結果（He⁺, 又はNe⁺）を示す。FIG. 2 shows the result (He ⁺ , or Ne ⁺ ) obtained by labeling an avidin-immobilized sample irradiated with an ion beam with Biotin-Cy3. 図３は、イオンビーム照射したアビジン固定化試料をBiotin-Cy3でラベリングした結果（Ar⁺, 又はKr⁺）を示す。FIG. 3 shows the result (Ar ⁺ , or Kr ⁺ ) obtained by labeling an avidin-immobilized sample irradiated with an ion beam with Biotin-Cy3.

Claims (8)

親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸から選択される目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板の表面に、パターン化したマスクを装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことによって作製される、目的物質が表面にパターニングされているマイクロアレイ。 A substrate is patterned by mounting a patterned mask on the surface of a substrate on which a target substance selected from affinity substances, proteins, peptides or nucleic acids is physically or chemically adsorbed, and then performing ion implantation . A microarray in which a target substance is patterned on the surface, which is produced by performing ion implantation on a formed region. 親和性物質がアビジン類である、請求項１に記載のマイクロアレイ。 The microarray according to claim 1 , wherein the affinity substance is avidin. ドース量φが１×１０¹²≦φ＜１×１０¹⁶個／ｃｍ² となる範囲でイオン注入を行う、請求項１又は２に記載のマイクロアレイ。 The microarray according to claim 1 or 2 , wherein ion implantation is performed in a range where the dose amount φ is 1 × 10 ¹² ≦ φ <1 × 10 ¹⁶ pieces / cm ² . イオン種が、He⁺、Ne⁺、Ar⁺ 又はKr⁺である、請求項１から３の何れかに記載のマイクロアレイ。 The microarray according to any one of claims 1 to 3 , wherein the ion species is He ⁺ , Ne ⁺ , Ar ⁺ or Kr ⁺ . 親和性物質、タンパク質、ペプチド又は核酸から選択されるパターニングすべき目的物質が物理的又は化学的に吸着されている基板の表面に、パターン化したマスクを装着した後にイオン注入を行うことによって、基板のパターン化された領域に対してイオン注入を行うことを特徴とする、目的物質が表面にパターニングされているマイクロアレイの製造方法。 By performing ion implantation after mounting a patterned mask on the surface of a substrate on which a target substance to be patterned selected from affinity substances, proteins, peptides or nucleic acids is physically or chemically adsorbed, A method for producing a microarray in which a target substance is patterned on the surface, wherein ion implantation is performed on the patterned region of 親和性物質がアビジン類である、請求項５に記載の方法。 The method according to claim 5 , wherein the affinity substance is an avidin. ドース量φが１×１０¹²≦φ＜１×１０¹⁶個／ｃｍ² となる範囲でイオン注入を行う、請求項５又は６に記載の方法。 7. The method according to claim 5 , wherein the ion implantation is performed in a range where the dose amount φ is 1 × 10 ¹² ≦ φ <1 × 10 ¹⁶ pieces / cm ² . イオン種が、He⁺、Ne⁺、Ar⁺ 又はKr⁺である、請求項５から７の何れかに記載の方法。 The method according to claim 5, wherein the ionic species is He ⁺ , Ne ⁺ , Ar ⁺ or Kr ⁺ .