JP4544601B2 - 環状ペプチド - Google Patents
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Description
環状ペプチド
関連発明の説明
本願は、1998年12月18日出願の米国仮出願第60/112,723号と、「環状ペプチドと生体蛋白質の生成」と称する1999年10月7日出願の米国仮出願に基づき仮出願の利益を主張し、その両方の出願に本願の中で言及することにより、内容を組入れている。
【0002】
連邦政府
本発明は、米国厚生省により認定されたGM13306号及びGM19891号の下で連邦政府の支援を受けて完成されたものである。本発明に対し、連邦政府が何らかの権利を有する可能性がある。
【0003】
発明の分野
本発明は、生化学の分野に係わり、特に、環状ペプチド、環状ペプチドの製造方法、及び環状ペプチドを特定の特徴のために選別(screening)する方法に係わる。
【0004】
発明の背景
直鎖状の(linear)小ペプチドは、生理学上の(physiological)種々の現象を調べるのに有用である。なぜなら、それらは、広範囲の生物学的活動を示現し、固相法(solid phase synthesis)と組合せ化学(combinational chemistry)における従来の技術を利用してほとんど無限に変更可能な配列で合成できるからである。又、これらの特質のため、新薬を識別し開発するために直鎖状の小ペプチドが特に役立つことになる。例えば、無数の異なった直鎖状小ペプチドの大きなライブラリー(library)を人工的に用意し、種々の生物学的検定法(biological assays)で特定の特徴のために選別可能である。例えば、Scotty, J.K. 及びG.P. Smithによる1990年サイエンス誌249:386、同じく、Delvin, J.J.他の1990年サイエンス誌、24:404, Furka, A.他による1991年Int. J. Pept. Protein Res.37:487、及びLam.K.S. 他による1991年ネィチャー誌354:82参照。特定の特徴を発現する前記ライブラリー内のペプチドは、将来の研究対象の候補として分離できる。ミクロシーケンシング(microsequencing)又はその他の化学分析を使用して選別されたペプチド、例えばアミノ酸配列などを特徴付けることができる。これらの利点にもかかわらず、従来、ごくひと握りの直鎖状小ペプチドしか用途の広い医薬品に開発されてこなかった。その1つの理由は、直鎖状小ペプチドは、通常人体からあまりに早く排出されてしまい治療効果を発揮できなかったことがある。
【0005】
環状に閉じること、即ち、環化はペプチドが生体内で劣化する速度を減少し、薬効協働力学的 (pharmocokinetic)特性を劇的に改善する。既知の医療価値のある環状ペプチドの大多数は、天然資源(たとえば、カルシトニン、オキシトシン、バソプレシンなど)から分離して同定されてきた。不幸にも、特定の生物学的活動の為に選別可能な天然に存在する環状ペプチドの集合(pool)は本来的に限定されている。その上、天然資源から環状ペプチドを分離し純化するために必要な工程は煩雑で、そのような選別を割高で非実用的なものにする。従って、無限に変形可能なアミノ酸配列の多数の異種ペプチドを生成する合成方法は、新薬の候補として特定の環状ペプチドをつきとめることに多いに役立つことになる。
【0006】
従来、環状ペプチドを生成する種々の方法が記述されてきた。たとえば、米国特許第4,033,940号や4,102,877号に記述されているような化学反応プロトコールが、環化ペプチドを生成するために考案されてきた。別の技術では、生物学的方法と化学的方法が組み合わされ、環状ペプチドを製造する。その後者の方法では、細胞内(例えばバクテリア)の環状ペプチドの直鎖状前駆体(precursor)を先ず表現して環状ペプチドの直鎖状前駆体を生成し、次いで外因性の(exogenous)作用因子、例えばプロテアーゼや求核試薬を添加し、これらの直鎖状前駆体を化学的に環状ペプチドに変える。Camerero, J.A. 及びMuir, T.W.による1999年 J.Am.Chem.Societyの121:5597及び Wu,H. 他による1998年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9226 参照。
【0007】
一旦生成されると、環状ペプチドは、薬理的な活動のために選別可能になる。例えば、多数の異なった環状ペプチドを包含するライブラリーを用意し、特別の特徴、例えば特定のターゲットリガンド(目標配位子)を結合する能力など、のために選別可能である。そのライブラリーはターゲットリガンドと混合し、そのターゲットリガンドと結合するライブラリーの構成要素が分離されアミノ酸配列により同定可能である。同様に、環状ペプチドのライブラリーは特定の生物学的活動の検定法に付加できる。そして、その生物学的活動を調整する環状ペプチドは、分離・配列化により同定できる。
【0008】
不幸にも、アクティヴなペプチドを同定する工程は困難なため、それらの選別検定法は労力と時間がかかる。例えば、選別検定法は通常は逆方向のマッピング工程を必要とする。なぜなら、ターゲットリガンドと結合したり又は生物学的活動を調整(modulate)する環状ペプチドの実際の量は、通常はそのまま直接的にシーケンシングできないほど微量であるからである。この問題を避けるため、ライブラリーを備える種々の環状ペプチドの物理的位置を示すマップを作成してもよい。
【0009】
異なった位置からの環状ペプチドの選別物(aliquots)は、次に選別検定法内で対応した位置に移される。そして、ある活動に対応して選別されたもの(例えば生物学的活動の結合や調整を発現する検定法内の領域が前記ライブラリー内のその対応位置にマップ化される。そのライブラリーの領域の環状ペプチドは、次に分離し配列化できる。標本取扱による空間的解決の必要性とそれにより課せられる制限から生じる困難により、所定時間内で選別可能な候補ペプチドの数が限定される。
【0010】
検定法で選別可能なペプチドの数は、ペプチドを発現する細胞を使用することで劇的に増加できる。例えば、直鎖状ペプチドのライブラリーを発現するように設計されたバクテリアを選別検定法に添加し、特定の特徴に対応して選別されたものを発現するバクテリアを、その検定法から直接拾うことができる。その拾われたバクテリアは、次に多数複製可能で選別された直鎖状ペプチドを大量に生成し(例えばシーケンシングにより)その同定化と生産を促進できる。
しかし、生体内の直鎖状小ペプチドの生成・選別は、結果的に厄介であることが判明した。なぜなら、直鎖状小ペプチドは通常の細胞代謝(metabolic)過程で急速により劣化するからである。ペプチドの環化は、ペプチドを細胞内で安定化することによりこの問題を回避できる。
【0011】
それにも係わらず、従来は環状ペプチドの大ライブラリーの細胞内の生成は実行可能ではなかった。なぜなら、一般的で容易に実行可能な生体内ペプチド環状化方法は利用できなかったからである。例えば、生体内で環状ペプチドを生成する周知の方法は非リボソームペプチドシンテターゼ(NRPS)コンプレックスを利用する(Cane他、1998年サイエンス誌 282:63)。しかし、そのようなNRPSコンプレックスは作用し易いわけでもなく一度に単一環以上の環状ペプチドを製造するのに有用なわけでもない。その上、単量体(アミノ酸)の直鎖状配列がそれをエンコードする核酸分子でベース(bases)直鎖状配列により書取られるリボソームペプチド合成と異なり、前記NRPS法により生成される単量体の直鎖状配列は前記NRPSコンプレックスのサブユニット組織により書き取られる。そのNRPS法により生成される環状ペプチドの配列の変更は、所望の単量体を組入れるサブユニットをクローニングし、そのサブユニットをその他の全てのサブユニットを既に取込んでいるホストセルに導入することを伴う。この技術を使用してライブラリーを制作するには、NPRSサブユニットの組合せ(組成と順序の両方)をホストセルに導入し、そのサブユニットが確実に正確な超分子構造に組立てられる方法を工夫することが求められる。
【0012】
本発明の要約
環状ペプチド・ライブラリの生体内生産と選別の一般的方法が発見されている。この方法に於いて、ペプチドの環状化を暗号化するヌクレオチド配列は、***(または遊離)インテイン(C−インテインまたはIc)のカルボキシ基末端部分を暗号化するヌクレオチド配列に一端を接し、他端においては***(または遊離)インテイン(N−インテインまたはIN)アミノ基末端部分を暗号化するヌクレオチド配列と接するように、アミノ酸分子は構成される。バクテリア或いは真核細胞のようなホストシステム内の構造を発現すると融合蛋白質が生産される。次に融合蛋白質の二つの***インテイン成分(例えばICとIN)は集合して活性酵素を形成し、アミノ基末端とカルボキシ基末端を共に***させて環状ペプチドの基幹を生成する。この化学反応は下記に述べられている。
【0013】
インテインに媒介される環状化作用
【0014】
【化1】
アミノ基末端とカルボキシ基末端の断片から活性インテインを形成することにより、N−インテインと環状化されるペプチド(上図BにおいてのX=S又は0)の間の結合点におけるアミノ酸のエステル異性体を安定化される。R=XHの時、C−インテインから生ずるヘテロ原子は保持されて、エステルに作用し環状エステル中間体(C)を生成する。インテインにより触媒作用されてアミノスシニマイドが形成されると環状ペプチド(ラクトン形で)を遊離し、環状ペプチドは転位して、熱力学的に基幹(ラクタム形)環状ペプチド生成物を形成する(E)。この方法は、予定された特性を持つ環状ペプチドの選択或いは選別を容易にする。
【0015】
従って、***したインテインの1番目の部分、2番目の部分そして、1番目と2番目の部分の中間に存在するターゲットインテインを有するポリペプチドを暗号化する核酸分子を人工的に発生させる特徴を、本発明は有する。ホストシステムにおける核酸分子の発現はポリペプチドを生成し、ポリペプチドはホストシステムにおいて自然に***しターゲットペプチドの環化形を発生させるか、又は活性インテイン中間体、チオエステル中間体又はラリアット中間体のような環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間体を発生させる。
【0016】
***したインテインの1番目の部分、2番目の部分の両方とも、SSp DnaEのような自然***したインテインから誘導される。別の変化では、***インテイン部分の一方又は両方がRecA,DnaB,PspPol-I,そしてPlfインテインから誘導されるような人工的発生の***インテインから誘導され得る。
【0017】
もう一つの局面に於いては、本発明は、***したインテインの1番目の部分、2番目の部分、3番目の部分そして4番目の部分を有するポリペプチドを暗号化する人工的核酸分子を特徴とする。この分子は、***したインテインの1番目の部分と2番目の部分の間に置かれている1番目のターゲットペプチド及び***したインテインの3番目の部分と4番目の部分の間に置かれている2番目のターゲットペプチドを持つことができる。***したインテインの1番目の部分は、***したインテインの3番目の部分に対して相補的であり得るが2番目の部分に対しては相補的であり得ない。そして***したインテインの2番目の部分は、***したインテインの4番目の部分に対して相補的であり得るが3番目の部分に対しては相補的であり得ない。
【0018】
また本発明に於いて、本発明の核酸分子を構成する表現ベクターも含まれる。ホストシステムに於ける表現ベクターは、ホストシステム中で自然に***して環状ペプチド又はスプライシング中間物を生じさせるポリペプチドを生成する。本発明の表現ベクターは又、ホストシステム中でポリペプチドの発現を容易にする規定配列を持つことができる。ベクターの核酸分子は、特別の特性を持った環化形ターゲットペプチドの選別を容易にするペプチドを暗号化するヌクレオチド配列、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドの精製を容易にするペプチドを暗号化するヌクレオチド配列、の双方又は一方を有する。
【0019】
もう一方の局面では、本発明は、***したインテインの1番目の部分に対して融合した1番目の端部と、***したインテインの2番目の部分に対して融合した2番目の端部を有するターゲットペプチドを持つポリペプチドを暗号化する表現ベクトルを特徴とする。本発明の表現ベクターは、プラスミド、バクテリアファージ、ヴィールス、線状核酸分子又は他の型のベクターであり得る。
【0020】
更に本発明は、***したインテインの1番目の部分、2番目の部分と***したインテインの1番目の部分と2番目の部分の間に存在するターゲットペプチドを有する本質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、ホストシステム中で自然に***することができ環化形ターゲットペプチドを生ずるか、或いはスプライシング中間物を生じることができる。
【0021】
又、本発明中のホストシステムは、本発明の核酸分子を内在する。このホストシステムは、バクテリア、原始バクテリアの様な原核細胞であり、イースト菌又は哺乳類の細胞、植物細胞、生体外での転写/翻訳システム、細胞溶解物の様な真核細胞であり得る。
【0022】
他の面では、本発明はペプチド分子の製作方法を特徴とする。この方法は次の手段を有する。本発明による分離した核酸分子を用意する、ホストシステムを用意する、分離した核酸分子をホストシステムに誘導する、そして分離した核酸分子を発現する。一つの変形方法として、分離した核酸分子を発現する手段でポリペプチドが生成され、ホストシステム中で自然に***して環化形ターゲットペプチドを生じる。この方法は、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドを精製する手段を特徴とする。
【0023】
この方法のもう一つの変形では、分離した核酸分子を発現する手段により、環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物が生成される。この方法は又、ホストシステムから環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物を精製する手段を特徴とする。またこの方法のもう一つの変形は、スプライシング中間物から環状ペプチドを形成する手段を有する。またこの方法のもう一つの局面では、プロテーゼ又はチオールの様な外来附加物無しに、ホストシステムに於いて、環化形としてターゲットペプチドが生産される。
【0024】
本発明のもう一つの局面は、ポリペプチドのライブラリを用意する方法である。この方法は、異なるアミノ酸配列を持つ複数のターゲットペプチドを暗号化する複数の核酸分子を供給する手段である。複数の核酸分子の各々を表現ベクターに組み込み複数の表現ベクターを形成し、ホストシステムに於いて表現ベクターを発現させる。
【0025】
ホストシステムに於いて自然に***して環化形ターゲットペプチドを生じさせるポリペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物の様な複数のペプチド分子がホストシステムに於ける表現ベクターの発現により生成される様に、各々の発現ベクターを形成した状態で、複数の核酸分子は、***したインテインの1番目の部分を暗号化する核酸分子と2番目の部分を暗号化する核酸分子の間に位置している。
【0026】
そしてもう一つの局面では、本発明は、予定された特性をもつペプチド分子を選別する方法を有する。この方法は、次の様な手段を有する。***したインテインの1番目の部分、2番目の部分と、***したインテインの1番目の部分と2番目の部分の間に在るターゲットペプチドで構成されるポリペプチドを暗号化する核酸分子を用意する、ホストシステムを用意する、分離した核酸分子をホストシステムに誘導する、ペプチド分子が生産される条件下にホストシステムを置く、そのペプチド分子が予定の特性であるかをテストする。ホストシステムに於ける核酸分子の発現は、ホストシステムに於けるポリペプチドの自然***から発生する環化形ターゲットペプチド或いは環化形ターゲットペプチドのスプライシング中間物を生成する。
【0027】
この方法の一つの変形は、予定された特性はターゲット分子を特に拘束する能力を有し、予定の特性であるかどうかのテスト手段は、(a)ペプチド分子をターゲット分子に接触させ、(b)ペプチド分子がターゲット分子に結合するかどうかを決定する手段を有する。もう一つの変形では、予定された特性とは生化学反応を調節する能力のことである。そのペプチド分子が予定の特性であるかをテストする手段は、(a)ペプチド分子を生化学反応を有するシステムに接触させ(b)ペプチド分子が生化学反応を調節するかどうかを決定する手段で構成される。ペプチド分子がターゲット分子に結合するか或いは生化学反応を調節するかどうかを決定する手段は、細胞周期或いは有機物の生成の分析により、色彩の変化、蛍光信号を観測することにより測定できる。
【0028】
これ等の方法に於けるターゲット分子は、薄膜連合分子或いは細胞内分子(例えば、ミトコンドリア、リソソーム、内質網状組織、緑葉体、ゴルジそして原形質膜の様な細胞核分子或いは一つ又はそれ以上の細胞小器官)の様な細胞連合分子であり得る。又、細胞外分子でもあり得る。生化学反応は、細胞内の代謝現象、薄膜連合現象、細胞核現象の様な細胞連合過程である。
【0029】
これ等の方法に於いて、ペプチド分子が予定された特性を持つかどうかののテストの手段は、ハイブリッドシステムと固相支持体の上にペプチド分子を固定する手段の双方か一方を使って行われる。
【0030】
本発明は又、混合物から環状ペプチドを精製する方法をも特徴とする。この方法は、次の手段を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体を含む混合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体と、アフィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、その支持体が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄して支持体から特別でない結合をしている物質を除去する、スプライシング中間体から環状ペプチドを作る試剤を支持体に付加する、そして環状ペプチドを支持体から溶離する。
【0031】
前述の変形として本発明は、混合物から環状ペプチドを精製する次の手段を持つ方法を有する。アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体を含む混合物を用意する、アフィニティ標識を付けられたスプライシング中間体と、アフィニティ標識を特に上部に付けられた浮標を持った固相支持体とを、その支持体が特にスプライシング中間体と結合するように混合する、支持体を洗浄して支持体から特別な結合はしていない物質を除去する、そしてスプライシング中間体を支持体から溶離する、そしてスプライシング中間体から環状ペプチドを作る溶離されたスプライシング中間体に試剤を加える。
【0032】
加えるに、本発明は、スプライシング中間体を結び付けているターゲット分子を混合物から精製する方法を有する。この方法は、次の手段から成っている。上部に特に結合しているスプライシング中間体を有する固相支持体を用意する、支持体を混合物中のターゲット分子に接触させる、支持体を洗浄して支持体から特別な結合はしていない物質を除去する、ターゲット分子を支持体から溶離する。
【0033】
ここで使用されている「非自然的発生」という句は、直接又は間接的に人体の活動を介して行われることを意味する。従って「非自然的発生」の核酸は、人間による操作を介して生成されるもので、自然な進化プロセスを介して生成されるものではない。
【0034】
「核酸分子」という句は、順次に結合した2つ以上のヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、核酸分子はDNAやRNAであり得る。
【0035】
ここで使用されている「ペプチド」とは、順次に結合した2つ以上のアミノ酸の鎖を意味し、ポリペプチドとプロテインを包含する。「ポリペプチド」とは、長さや翻訳後(post-translational)の変性に係わらず、2つ以上のペプチドからなるポリマーを意味する。「プロテイン」とは、アミノ酸の鎖を意味し、ペプチド、ポリペプチド、プロテイン、及び糖蛋白(glycoprotein),リポ蛋白(lipoprotein),燐蛋白(phosphoprotein),金属蛋白質 (metalloprotein)等の変性プロテインを包含する。
【0036】
直鎖状ペプチドとは、一般的に環状でなく、カルボキシル基の遊離端を備えたカルボキシル基アミノ酸とアミノ基の遊離端を有するアミノ基アミノ酸の双方を有する。
【0037】
これと比較して、「環状ペプチド」とは環状化されたペプチドを指す。ここで「環状」とは環(リング)を形成する構成原子を有することを意味する。ペプチドに言及する場合、「環化」という意味は、そのペプチドを環状すなわち環状化させることを意味する。したがって、例えば,直鎖状のペプチドが環化されるのは、その遊離アミノ基がその遊離カルボキシル基と共有結合して遊離基がペプチドに残っていない時である。
【0038】
ここで使用する「スプライシング中間体」とは、開放された環状ペプチド生成物が形成される前に前述したインテインにより媒介される環状化反応の間に発生するポリペプチドである。スプライシング中間体は「アクティヴ‐インテイン中間体」(すなわち、前述の例でAラベルのポリペプチドと類似した化学構造のもの)、「チオエステル中間体」(すなわち、前述の例でBラベルのポリペプチドと類似した化学構造のもの)、及び「輪縄形(lariat)形中間体」(すなわち、前述の例でCラベルのポリペプチドと類似した化学構造のもの)、を包含する。
【0039】
「ターゲットペプチド」とは、スプライシング中間体で環状化又は表示されるべき対象としてのペプチドを意味する。例えば,前駆体プロテインにおいてスプリットインテインのカルボキシル基部分とアミノ基部分の中間に介在させたペプチドは、そのペプチドがその前駆体プロテインのスプライシングにより環化されるか又はその前駆体プロテインの処理(例えば折り畳み‐folding)によりスプライシング中間体の一部となるならば、ターゲットペプチドになるであろう。
【0040】
ここで使用する「インテイン」という言葉は、プロテインの翻訳後処理の間にスプライシング反応に触媒作用可能な前駆体プロテイン内に埋込まれた自然発生又は人工的に構成されるポリペプチド配列を意味する。周知のインテインのリストは、http://www.neb.com/inteins.htmlで公開されている。「スプリットインテイン」とは、互いに融合していない2つ以上の分離成分を有するインテインである。
【0041】
ここで使用する「介在させる」という言葉の意味は、“間に置く”ことである。従って、第2と第3のペプチドの間に介在させた第1のペプチドを有するポリペプチドにおいて、その第1のペプチドを構成するアミノ酸の鎖は,物理的に、第2のペプチドを構成するアミノ酸鎖と第3のペプチドを構成するアミノ酸鎖の間に位置することになる。
【0042】
「異質のアミノ酸配列」を有する複数のペプチドとは、その複数のペプチドが、少なくとも2つ以上で通常は多数の,本質的に全く異なるアミノ酸配列の異なるペプチドから成ることを意味する。
【0043】
ここで使用する「ホストシステム」という句は、核酸分子が転写、複製及び/又は翻訳される媒体又は媒介物、及び/又はポリペプチドが継合わされる(スプライスされる)か翻訳後処理される媒体又は媒介物を指す。
【0044】
ここで使用する「自発的」という言葉は、記述された作用が外因性物質の添加なしで発生することを意味する。例えば、ホストシステム内の前駆体ポリペプチドは、その前駆体ポリペプチドか又はその前駆体ポリペプチドをエンコードする核酸分子以外には何もそのホストシステムに添加されない際に自発的にスプライスして環状ペプチドを生成する。対照的に、ホストシステムへの外因性作用因子(agent)が環状ペプチドを生成するために必要だと、ホストシステム内の前駆体ポリペプチドは自発的にはスプライスしなくなる。
【0045】
ここで使用する「スプライス」という言葉は、ポリペプチドの中央部を切り取って2つ以上の小ポリペプチド分子を形成することを意味する。スプライシングは、時として、2つ以上の小ポリペプチドを融合して新しいポリペプチドを形成する工程を含むことがある。
【0046】
ここで使用する「由来する」という言葉は、あるものから取得、分離、純化、発生することを意味する。
【0047】
ここで使用する発現ベクター(expression vector)という句は、ホストシステムでの核酸の転写及び/又は翻訳を助長する媒介物を意味する。発現ベクターは,その発現ベクターを包含するホストシステムに外因性物質を添加することでその発現ベクターが発現化する際(例えば、ベクター内の核酸分子がmRNAに転写される際)には不可誘導的である。
【0048】
核酸の「発現」という句は、その核酸がポリペプチドに転写及び/又は翻訳、及び/又は、複製されることを意味する。
【0049】
ここで使用する調節塩基配列(regulatory sequence)という句は、核酸分子の発現を転調(例:転写)するヌクレオチド配列を意味する。たとえば,プロモーターやエンハンサーは調節塩基配列である。
【0050】
「融合」という言葉は、共有結合されることを意味する。例えば、2つのペプチドが違いに共有結合する(例えばペプチド結合)際に第1のペプチドと第2のペプチドが融合される。
【0051】
ここで使用する「分離」又は「実質的に純粋な物質」という句は、自然状態のある物質に包含されるその物質以外の成分からその物質を分離したものを意味する。通常、ポリペプチドは、それが付帯する他のプロテインや自然発生有機分子を少なくとも50重量%(例えば、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95重量%及び99重量%)分離すると実質的に純粋であると言える。
【0052】
前駆DNA(progenitorDNA)は突然変異体を作成又はその作成時の母体とする特別のデオキシリボ核酸である。
【0053】
「ターゲット分子」という句は、別の分子の結合又は機能的特徴を決定するために使用される分子を意味する。
【0054】
ここで「結合」とは、標本内で、ある分子が別の分子を識別しそれに結合する一方、それ以外の分子は識別や結合をしないことを意味する。ある分子は、もしそれが別の分子との結合親和力が約105から106リッター/モルより大きい場合は、その別の分子と特定的に結合する。
【0055】
「細胞関連プロセス」(cell-associated process)とは、細胞内又は細胞の近傍で発生するプロセスである。
【0056】
「細胞膜関連事象」とは、細胞の原形質膜(plasma membrane)に
起きる細胞関連プロセスである。
【0057】
「核事象」とは、細胞の核に起きる細胞関連プロセスである。
【0058】
細胞関連事象と比較して、細胞外反応は細胞内で発生しない反応である。
【0059】
「ハイブリッドシステム」とは、二重ハイブリッドシステム、逆二重ハイブリッドシステム、1ハイブリッドシステム、スプリットハイブリッド、及びその他の類似したシステムであってペプチドと他の分子(例えばプロテインや核酸分子)間の相互作用を同定するものを意味する。ハイブリッドシステムの例として、VidalとLegrainによる、1999年「核酸研究」27:919参照。
【0060】
他に別に定義されていない限り、此処に使用した全ての技術的用語は、本発明の属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同様の意味を有する。此処に記述したものと類似又は均等な方法と材料は本発明の試験や実習で使用してもよいが、以下では適当な方法と材料を記述するものである。全ての出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は此処に言及することでその全体が組入れられる。利害の抵触があった場合、定義を包含する本明細書が基準となる。更に、以下に述べる特別の実施例は例示にとどまり、限定を意図したものではない。本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記述及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【0061】
発明の詳細な説明
分離インテインのトランス−スプライシング能力は、環状ペプチドの製造及び環状配列においてペプチドを表示する中間生成物のスプライシングの一般的方法の発展に活用されている。この方法において、ターゲットペプチドは、前駆ポリペプチド中の分離インテインの間に配置される。適当なホストシステムにおいて、分離インテインの二つ部分は環状配置にターゲットペプチドを強制する配列中で活性インテインを形成するために組み合わされる。この配列において、インテイン部分の一部(例えばIN)とターゲットペプチドとの間の接合におけるアミノ酸のエステル異性体は、他のインテインの部分(例えばIC)からのヘテロ原子が環状エステル中間体を形成するためのエステルと反応することを安定化させる。そのとき、この活性インテインは、ターゲットペプチドの環化形(すなわちラクトン形)を遊離させるアミノサクシニミドの構成に触媒作用を及ぼし、そしてそのとき、環状ペプチド生成物骨格(すなわちラクタム形)を熱力学的に好ましい形に自発的に転位する。環状ペプチドの遊離前に反応を拘束することにより、環状配列におけるターゲットペプチドを運ぶスプライシング中間体を生成することができる。2つのインテイン部分間に配置されるターゲットペプチド配列を有するポリぺプチドをコード化する核酸分子は、このようなペプチドを生成するために構成される。発現ベクターにおけるこれらの構造の誘導は、ホストシステムにおけるポリぺプチドを製造する方法を提供する。そして、そのポリぺプチドは、環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体にスプライシングされる。この方法を用いることは、いくつかの異なる環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体が、特有の性質のためにスクリーンされる環状あるいは部分環状ぺプチドのライブラリーを生じさせうる。
【0062】
図1を参照するに、本発明の実施態様の概要は、核酸分子から環状ぺプチドを製造する方法を含んでいる。この方法において、核酸分子は、そのヌクレオチド配列が分離インテインの第1の部分(例えばIC)と環状化されたぺプチド(すなわちターゲットぺプチド)と分離インテインの第2の部分(IN)とが連続するポリぺプチドをコード化するために用意される。その核酸分子はホストシステムにおいてその発現を容易にするために発現ベクター中で混合され、このホストシステムでは、2つの分離インテイン部分間に配置される環状ぺプチドを有する前駆ポリぺプチドを複写して翻訳することができる。前述したステップにより、分離インテインの2つの部分は組み合わされ、最終的に環状ペプチドを生じる化学反応を発生させる配座に前駆ポリぺプチドを配置する(図2参照)。
【0063】
核酸分子
本発明における核酸分子は、分離インテインの第1の部分、第2の部分及びこれら第1の部分と第2の部分との間に位置したターゲットペプチドとを有するポリぺプチドをコード化するものを含む。本発明の一実施態様において、ホストシステムにおける核酸の発現は、ターゲットペプチドの環化形を生じるためにホストシステム中で自発的にスプライシングするポリぺプチドに帰着する。本発明の他の実施態様では、ホストシステムにおける核酸分子の発現は、ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であるポリぺプチドに帰着する。本発明の核酸分子は、前述した方法により用意され、そして公知技術である核酸分子を生成し扱う方法とともにここで供給されるガイダンスを用いてもたらされる(例えば、オースベルら版 「分子生物学における現在のプロトコロル」ニューヨーク:ジョンウィリー社,1997年、サンプルックら「分子クローン 演習マニュアル」(第2版) コールドスプリングハーバー出版社,1989年参照)。例えば、本発明の核酸分子は、分離インテインの第1の部分をコード化するポリヌクレオチド、分離インテインの第2の部分をコード化するポリヌクレオチド、及びターゲットペプチドをコード化するポリヌクレオチドを別々に用意することにより得られる。この3つのポリヌクレオチドは、分離インテインの第1の部分と第2の部分との間に挿入したターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化する核酸分子を形成するために一緒に接合される。
【0064】
インテインコード化核酸
本発明の核酸分子の分離インテインの第1の部分と第2の部分をコード化するヌクレオチドの配列は、公知のインテインから得られる。そのようなインテインを正確に記述したリストがニューイングランド バイオ研究所により「http//www.neb.com/inteins/int reg.html.」で公表されている。これら公知のインテインの多くは、本発明に合致する限り使用することができる。
【0065】
自然発生あるいは人工生成分離インテインのいずれをもコード化するヌクレオチドの配列は、本発明の核酸のインテイン部分を生成するのに使用される。自然発生分離インテインは、一つの活性スプライシング物を形成するために互いに結合した2つの分離成分として自然に発現する。これらの自然発生成分をコード化する核酸分子は、このようにして本発明において使用される。使用可能な自然発生分離インテインの一例としては、Ssp DnaE(ウら 「会報ナショナルアカデミー サイエンス」 米国95:9226,1998年)が挙げられる。
【0066】
自然状態において分離していないインテイン(すなわち、アミノ酸の一連鎖として存在するもの)は、公知の技術により人工的に分離される。例えば、そのようなインテインの相違する部分をコード化する2あるいはそれ以上の核酸分子は、それらの発現が2あるいはそれ以上の人工分離インテイン構成物を生成するために製造される。エバンスら、「生化学ジャーナル」274:18359,1999、ミルズら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」 USA95:3543,1998を参照されたい。そのような非自然発生インテイン構成物(部分)をコード化した核酸は本発明に用いることができる。環状ペプチドあるいはスプライシング中間体を生成するための同じ前駆ポリぺプチドに効率よく相互作用する非自然発生分離インテイン部分をコード化する核酸分子を用意する。そのような核酸分子を形成する非自然発生分離インテインの一例は、Psp Pol−1(サウスワース,エム.ダブリューら 「ザ イーエムビーオー ジャーナル」 17:918,1998)、マイコバクテリウム ツベルクロシス RecAインテイン(リュー,ビー.エムら 「生化学ジャーナル」273:15887,1998、シングレデッカー,ケイら 「遺伝子」207:187,1998、ミルズ,ケイ.ブイ ら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」 米国95:3543)、Ssp DDnaB/MxeGyrA(エバンス,ティー.シー.ら 「生化学ジャーナル」274:18359,1999)及びPfu(オートモら 「生化学」38:16040,1999、ヤマザキ ら 「アメリカ化学学会ジャーナル」120:5591,1998)を含んで誘導される。
【0067】
ターゲットペプチドをコード化する核酸あるいはスプライシング中間体において表示されるぺプチド
公知あるいはランダムに配列したぺプチドをコード化する核酸を製造する多くの方法が知られている。例えば、予め決まったあるいはランダムな配列を有するポリヌクレオチドは、商業的に入手可能な機材及び試薬を用いて固相法により化学的に合成される。ポリメラーゼ鎖反応も公知あるいはランダムに配列したポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、オースベルらの「スープラ」を参照されたい。他の例としては、制限酵素エンドヌクレアーゼはより大きな核酸分子、あるいは本発明の核酸分子を合成するために使用可能なより小さいポリヌクレオチド断片の大多数中の全部の染色体DNAでさえも酵素分解するのに用いることができる。
【0068】
環状化されたぺプチド配列をコード化するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一端が環化反応を促進するために、アスパラギン、セリン、システイン、あるいはトレオニン残基をコード化するために好ましくは用意される。同じ理由によりスプライシング中間体の生成物に適したペプチド配列をコード化するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一端が、環化反応を抑制するためにアスパラギン、セリン、システイン、あるいはトレオニン残基をコード化するため好ましくは用意される。
【0069】
インテイン部分をコード化するポリヌクレオチドぺプチドの連結及びターゲットペプチドあるいはスプライシング中間体において表示されるぺプチド
一度反応すると、第1のインテイン部分−ターゲットペプチド−第2のインテイン部分の順番を有するポリぺプチドをコード化するより大きな核酸分子を形成するために、ターゲットペプチド(あるいはスプライシング中間体中のぺプチド)をコード化する核酸にインテイン部分をコード化する核酸を連結するための伝統的な方法を用いることができる。例えばオースベルらの「スープラ」を参照されたい。
【0070】
多数の分離インテイン及び多数のぺプチドをコード化する核酸分子
これら前述したのと同様の技術を用いれば、熟練した技術もまたペプチドとともに挿入した分離インテインの2つの部分のうちの少なくとも1セットをコード化する核酸構造を生成することができる。例えば、本発明は、Nポリぺプチド(Nは1又はそれ以上の整数)からなり、いかなるターゲットペプチドi(iは1以上の整数で、前駆ポリぺプチドにおけるターゲットペプチドの位置を意味する。)もインテイン部分2i−1と2iとの間(例えば、ターゲットペプチド1は、インテイン部分1及び2間であり、ターゲットペプチド2はインテイン部分3及び4間であるなど)に存在するのと同様に2Nインテイン部分間に置かれているNターゲットペプチドを有する前駆ポリペプチド分子をコード化する核酸分子を含んでいる。同じ長さのインテイン部分2i−1と2iとは相補的でなく(すなわち、スプライシング現象に触媒作用を及ぼすための自然の相互作用を起こし)、ターゲットペプチドiは環化できない。しかしながら、もしインテイン部分2iがインテイン部分2i+1と相補的であり、インテイン部分2Nがインテイン部分1と相補的であれば、Nポリぺプチドの完全な集合は、1−Nターゲットペプチドが環状ぺプチド/たんぱく質において互いに電子対を共有して結合するところを生成することを増加させるためにN−1トランススプライス(2ポリぺプチド間)と1シススプライス(両端を接合する)を実行する(すなわち、インテイン部分2及び3はターゲットペプチド1及び2をトランス−スプライスし、インテイン部分4及び5はターゲットペプチド2及び3をトタンス−スプライスし、インテイン部分2N−2及び2N−1はターゲットペプチドN−1及びNをトタンス−スプライスし、並びにインテイン部分N及び1はNターゲット配列を含む環状生成物を閉鎖するためにシス−スプライスする)。そのトランス/シススプライシング事象の順序は不適当である。最も遅いスプライシング種類はシス−スプラスの不遂行によりなされるだろう(相補的なインテイン部分2N及び1、2及び3あるいは80及び81のいずれにせよ)。
【0071】
したがって核酸構造物は、分離インテインの2つの部分間に配置されるインテイン成分が相補的でないターゲットペプチドにより互いに構成される2あるいはそれ以上のポリぺプチドを発現することにより得られる(すなわち、同じインテインあるいはいかなる環化反応を引き起こす別の協働を由来としない)。このような構造においては、適当な相補的インテイン構成物を有する第2のポリぺプチドの存在による発現がなければ環化しない。本発明におけるこのような核酸の構成は、構造ごとにただ1つのポリぺプチドを、あるいは構造ごとに1より多くのポリぺプチドをコード化することができる(例えば、二機能を有するプラスミド)。
【0072】
発現ベクター
本発明の発現ベクターは、ホストシステム中におけるポリヌクレオチドの発現を促進可能ないくつかの好ましい発現ベクターの中にターゲットペプチドをコード化するポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。このような好ましいベクターは、プラスミド、バクテリオファージ及びウィルス性のベクターが含まれる。これらの多くは公知であり、ほとんどは商業的に入手可能か科学団体から手に入れることができる。これらの技術は特定の適用に基づいて用いるために好適なベクターを選択することができ、例えば、選択されたホストシステム(すなわち、生体外システムにおけるバクテリアのような原核細胞、及び酵母菌あるいは哺乳類細胞のような真核細胞)及び選択された発現状態である。
【0073】
本発明における発現ベクターは、ターゲットペプチドをコード化するヌクレオチドの範囲及びそのベクターにおけるヌクレオチド配列の発現(例えば転写)を調整あるいはコントロールする調整ドメインとして機能するヌクレオチドの範囲を包含する。
【0074】
本発明における発現ベクターは、特有の性質(例えば、キチン質接合ドメインあるいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標識など)のためにターゲットペプチドあるいはスプライシング中間体の環化形のスクリーニングを促進し、もしくはホストシステムからターゲットペプチドあるいはスプライシング中間体の環化形の精製(すなわち、キチン質接合ドメインあるいはビオチン標識のようなアフィニティ標識、着色や光反射標識、放射性標識など)するぺプチドをコード化するヌクレオチド配列を包含する。
【0075】
好ましい実施態様としては、本発明における発現ベクターは、制限サイトと、環状ターゲットあるいはスプライシング中間体の多様性のクローンを可能にするための分離インテイン部分をコード化する核酸との間で生成される。他の態様として、本発明における発現ベクターは、誘導発現ベクターであり、それはアラビノース誘導ベクターである。このようなベクターはホストシステムにおける環化前駆体あるいはスプライシング中間体の発現をコントロールするために利用することができる。他のベクターは、公知のバクテリアの発現系統及び混成システムとの適合性に基づいて本発明に使用するために選択される。例えば、チャンら 「カー バイオロジー」9:417 1999年、ペルティエら「ナショナル バイオテクノロジー」17:683 1999年、カリモバら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」米国95:5752、1998年、ドミトローバら 「分子 ゼネラル、ジェネット」257:205 1998年、クら「会報ナショナル アカデミー サイエンス」米国96:151 1999年、ロッシら 「会報ナショナル アカデミー サイエンス」米国94:8405 1997年を参照されたい。
【0076】
ポリぺプチド
本発明におけるポリぺプチドは、本発明の核酸の発現により製造されるどのようなものも含む。例えば、分離インテインの第1の部分と分離インテインの第2の部分間に配置されるターゲットペプチドを有するほぼ純粋な前駆ポリぺプチド(あるいはスプライシング中間体により表示されるぺプチド)が本発明においては含まれる。前駆ポリぺプチドのいくつかの例においては、ターゲットペプチドは、第1及び第2のインテイン部分から直接融合される。その前駆ポリぺプチドはターゲットペプチドの環化を形成するためにホストシステムにおいて自発的にスプライスする。
【0077】
ターゲットペプチドの環化形及びぺプチドを表示するスプライシング中間体もまた本発明に含まれる。好ましくは、これらは本発明の前駆ポリぺプチドのスプライシングにより製造される。このターゲットペプチドの環化形は、本発明の方法により環化されるアミノ酸配列のいくつかであることがある。このスプライシング中間体は、活性インテイン、チオエステル中間体あるいはラリアット中間体であり、そしてそれは反応しないアミノ酸配列のぺプチドを表示する。
【0078】
ホストシステム
本発明において使用されるホストシステムは、転写、翻訳及び/又は本発明の核酸の複製をサポートし、あるいはポリぺプチドの改変(例えばスプライシング)又は本発明のタンパク質の翻訳をサポートする。そのような多数のホストシステムが知られている。例えば、本発明においては特に人為構造やホストシステムの活動により引き起こされる干渉を避けたい時には、生体外での転写/翻訳システムの形を受け入れる。このようなシステムは公知の技術により実験室で構築することができ、あるいは商業的に購入することができる。例えば、STP2−T7(カタログ番号69950−3)及びSTP−SP−6(カタログ番号69997−3)はノバゲン(ウイスコンシン州 マディソン)から入手できる。プロメガ(ウイスコンシン州 マディソン)もまたそのようなシステムを売っており(例えば、カタログ番号L1170、L2080、L4600、L4610、L4130、L4140、L1130、L1020及びL1030)、同様にストラタジェン(カリフォルニア州 ラジョーラ)はイン ビトロ エクスプレス(カタログ番号200360)の商標のシステムを売っている。本発明で使用するための不生ホストシステムは生微生物を由来として得られる。例えば網状赤血球可溶化液としての細胞可溶化液は、幾つかの応用例に用いることができる。
【0079】
ホストシステムはまた生微生物からも得られる。生微生物は、一般に連続的で発展が容易でかつ取り扱い容易な選択された核酸分子源による大量の複写物において通常再生産できるのでホストシステムのために好適である。本発明においてホストシステムとして使用可能な生微生物は、バクテリアのような原核生物(例えば、大腸菌)並びに酵母菌及び哺乳類(例えば、人、マウス、牛、ひつじ、ブタなど)の細胞を含む。古細菌、植物細胞、及び本発明の方法に使用するに好適な幾つかの他の微生物もまたホストシステムとして機能することができる。
【0080】
特別の用途のために最も好適なホストシステムは、多くの異なる要素に依存して変化するであろう。しかしながら、その技術は、異なるホストシステムの公知の適用例に基づく特有の応用のために好適なホストシステムを選択すべきである。例えば、環状ぺプチドの大量な生成物を必要とするときには、バクテリアホストあるいは昆虫のホスとが好適である。他の例としては、人細胞構成要素の相互作用を分析することを希望するときには、バクテリアシステムを用いるよりもホストシステムとしての人細胞がおそらく好適である。
【0081】
ポリぺプチド、環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体の製造方法
本発明のポリぺプチドは、公知のアミノ酸配列のポリぺプチドを製造する常法により得られる。例えば、本発明におけるポリぺプチドは、商業的に入手可能な設備及び試薬を用いる固相法により製造することができる。環状ぺプチドを製造するに使用可能な生体外での製法は公知である。しかしながら、多くの場合において、本発明のポリぺプチドはホストシステムにおいてそれらをコード化する核酸を発現することにより好ましくは製造される。例えば、本発明の核酸は、発現ベクトル中に合成され、そしてホストシステム中にもたらされる。その後、そのホストシステムは、発現されるベクターと、前駆ぺプチドの形態の生成及び続いてターゲットペプチドの環化形又はぺプチドを表示するスプライシング中間体とをもたらす条件下に置かれる。
【0082】
環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体を製造するための好ましい方法は、(a)分離インテインの第1の部分と分離インテインの第2の部分との間に配置されたターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化する単離された核酸分子を供給し、(b)ホストシステムを供給し、(c)ホストシステム中に単離された核酸分子をもたらし、(d)単離された核酸分子を発現させる、ステップを含む。ホストシステム中における核酸分子の発現は、ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体の形状におけるぺプチド分子、あるいはターゲットペプチドの環化計をもたらすための自発的にスプライシングするポリぺプチドを製造する。
【0083】
この方法の好ましい態様としては、ぺプチドの環化を触媒作用する外因的に添加される作用剤(例えば、プロテアーゼやチオール)がないときは、ポリぺプチドの生成物、環状ぺプチド、あるいはスプライシング中間体は、生体内(例えば、生ホストシステムとともに)に置かれる。
【0084】
ポリぺプチドの生成物、環状ぺプチド、あるいはスプライシング中間体は、特定のタンパク質の一般的技術を用いることで絶えず監視される。例えば、サンブルックらの「スープラ」を参照されたい。使用可能な代表的な技術としては、常法によるクロマトグラフィー、HPLC、FPLC及びこれと同種のもの、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS/PAGE)、2次元電気泳動のような電気泳動、電磁放射スペクトグラフィー、生成物消化酵素の分析、熱安定性の評価などが含まれる。
【0085】
ポリぺプチド、環状ぺプチド、あるいは本発明のスプライシング中間体の精製
通常用いられるタンパク質の精製法は、ポリぺプチド、環状ぺプチド、あるいは本発明のスプライシング中間体の精製に適用可能である。本発明はまた混合物から環状ぺプチドを精製するための好ましい方法をも含む。この方法は、(a)アフィニティ標識を伴って接合した環状ぺプチドを含む混合物を供給し、(b)支持体が環状ぺプチドと明らかな結合を形成するためにリガンドを有するとともにアフィニティ標識を明らかに結合した固相支持体と接合された環状ぺプチドとを混合し、(c)結合が明白でない部分を取り去るために支持体を洗浄し、そして(d)支持体から環状ぺプチドを溶離するステップを含む。
【0086】
この方法においては、アフィニティ標識は、固相支持体上のリガンドを結合可能な幾つかの分子を含んでいる。例えば、アフィニティ標識は、リガンドがキチン質である場合にキチン質結合ドメインであり、また、それはリガンドがストレプトアビジンである場合にはビオチンである。その他の多くのアフィニティ標識とリガンドとの組は公知であり、本発明に用いることができる。固相支持体上でアフィニティ標識はリガンドと確実に結合するので、環状ぺプチド(アフィニティ標識を取り付けたもの)は、支持体と確実に結合するであろう。そして、混合物中で支持体と確実な結合を形成していない部分を除去する緩衝剤(例えば、高塩類、酸あるいはアルカリ緩衝剤)で洗浄される。それから、そのアフィニティ標識を有する環状ぺプチドは、リガンドからアフィニティ標識を分離する物質(例えば、過剰量の非接合アフィニティ標識のような拮抗的反応抑制剤、あるいは変性剤)、あるいは酵素又はアフィニティ標識から環状ぺプチドを分離する化学反応物質を含有する緩衝剤を用いて固相支持体から溶離される。
【0087】
類似する方法においては、スプライシング中間体は環状ぺプチドよりむしろ精製することができる。環状ぺプチドは、またスプライシング中間体を用いる混合物からも精製することができる。例えば、混合物から環状ぺプチドを精製するための方法は、(a)アフィニティ標識とともに接合したスプライシング中間体を含む混合物を供給し、(b)支持体がスプライシング中間体と明確な結合を形成するようなアフィニティ標識を結合したリガンドを有する固相支持体と接合されたスプライシング中間体とを混合し、(c)確実でない結合部分を除去するために支持体を洗浄し、(d)スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造する試薬を支持体に添加し、そして(e)支持体から環状ぺプチドを溶離する、ステップを含む。上述のバリエーションにおいては、ステップ(d)は支持体からスプライシング中間体を溶離し、ステップ(e)はスプライシング中間体から環状ぺプチドを製造する試薬をスプライシング中間体を溶離するためには、ステップ(b)及び(e)は反対である。スプライシング中間体から環状ぺプチドを製造するために加えられる試薬は、チオール、プロテアーゼ及びスプライシング中間体の環化に作用する他の物質を含む。
【0088】
具体的な例として、ICをアフィニティ標識に融合することにより、必須のアスパラギン残留物が除去され(FIG3のd参照)、環状エステルがアフィニティカラム上に固定される。環状ぺプチドカラムでの結果は、環状ぺプチド自身のアフィニティ精製のために使用することができる。タンパク質分解方法の広い範囲は、アフィニティ標識及び環状ぺプチド生成物の配列に依存するICから環状エステルを遊離するのに使用される。
【0089】
FIG8には、環状ぺプチドを精製する方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(スピーシ1)は、触媒作用を及ぼすアスパラギン(ステップA)と非作用性のアミノ酸(Y)が入れ替わり、スピーシ2を生成するためにINの下流にアフィニティ標識をもたらす変異(ステップB)を起こす。このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する(ステップC)。そして、この分子は、アフィニティ標識と確実に結合するリガンドを含む固相支持体を有するアフィニティカラムを通過し(ステップD)、このとき保持されIN/IC非共有合成物(スピーシ3)が精製される。それから、このIN/IC反応は、ラリアット中間体の合成を中断させ(スピーシ4)、そしてそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あるいはアミノ酸Yでの化学開裂(ステップF)はラクトン中間体を遊離させる(スピーシ5)。アシル基とNとの再編成(ステップG)は熱力学的に好ましいアミド循環生成物をもたらす(スピーシ6)。
【0090】
FIG9には、前述したのとは異なる環状ぺプチドを精製する方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(スピーシ1)は、触媒作用を及ぼすアスパラギン(ステップA)と非作用性のアミノ酸(Y)が入れ替わり、スピーシ2を生成するためにICの上流にアフィニティ標識をもたらす変異(ステップB)を起こす。このインテイン生成物環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する(ステップC)。そして、この分子は、アフィニティ標識/IC中間体と明確に結合するリガンドを含む固相支持体を有するアフィニティカラムを通過する(ステップD)。リガンドからのアフィニティ標識の分離(ステップE)(例えば、標識とリガンド間の相互作用を拮抗的に抑制する分子を用いること、高塩緩衝剤又は変性物質を用いること、あるいは化学試薬又は標識を開裂するプロテアーゼを用いること)ラリアット中間体の回収を許容する(スピーシ4)。そしてそれはアフィニティカラムから溶離される。タンパク質分解あるいはアミノ酸Yでの化学開裂(ステップF)はラクトン中間体を遊離させる(スピーシ5)。アシル基とNとの再編成(ステップG)は熱力学的に好ましいアミド循環生成物をもたらす(スピーシ6)。
【0091】
環状ぺプチドのライブラリー及びスプライシング中間体の製造方法
直鎖状ぺプチドライブラリを作る多くの方法が公知である。そのような公知の方法の変更は、環状ぺプチド及びスプライシング中間体を製造する方法に有用であり、ここで環状ぺプチド及びスプライシング中間体のライブラリを生じるための方法の変更を示す。一般に、環状ぺプチド及び/又はスプライシング中間体のライブラリを製造する方法は、(a)雑多なアミノ酸配列を有するターゲットペプチドの大半をコード化する核酸の大半を供給し、(b)発現ベクターの大半を形成するための発現ベクター中に核酸の大半のおのおのを混合し、それにより核酸の大半のおのおのは、分離インテインの第1の部分をコード化する核酸と核酸の大半のおのおのを形成された発現ベクターのおのおのに分離インテインの第2の部分をコード化する核酸との間に配置され、そして、それはターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体又はターゲットペプチドの環化形を生じるホストシステムにおいて自然発生的にスプライシングするポリぺプチドの大半の生成物を結果として生じるホストシステムにおいて発現ベクターの発現ということであり、(c)ホストシステムにおける発現ベクターを発現する、ステップを含む。
【0092】
より具体的な例としては、Chllds他により「Sequeunce Specificity in Transcription and Translation」(alan R.Liss.Inc,1985年)で述べられている方法、Schumacher他 「Science」(271:1854,1996)で述べられている2倍連結法は、この発明に使用するために変更することができる。PCRをベースとした公知の方法もまた環化可能なランダム配列あるいは本発明のスプライシング中間体としての発現を伴うぺプチドをコード化するポリぺプチドを生じるために使用することができる。例えば、Caidwell and Joyce,「PCR Methods APPL」2:22,1999年、Ostermeiier他「Proc.natl.Acad.Sci.米国96:3562,1999年」、「the Nested Delection Protocol and Reagent from Promega」及びStemmer,W.P.naturee370:389,1994年(DNA shuffling)を参照されたい。雑多の配列を有するぺプチドをコード化するポリヌクレオチドの大半は、核酸分子におけるターゲットペプチド(又はスプライシング中間体において表示されるぺプチド)と、前述した本発明の発現ベクターと混合され、そして、環状化ぺプチドあるいはスプライシング中間体のライブラリーを生成するためのホストシステムにおいて発現する。
【0093】
あらかじめ決定された性質の環状化ぺプチドをスクリーニングする方法
特有の性質の小さい分子をスクリーニングする多くの技術が存在している。例えば、Fernades,P,Current Opin.Chem.Biol.2:597,1998年、Science286:1759,1999年、米国特許番号5,585,277号及び5,989,814号参照。より具体的には、結合のぺプチドライブラリーにおけるターゲットタンパク質に明確に結合するぺプチドを決定する方法もまた知られている。例えば、米国特許5,834,318号。これらの方法の多くは特有の性質のための本発明の方法で得られる環状ぺプチド及び/又はスプライシング中間体をスクリーンするために適用可能である。
【0094】
あらかじめ決定された性質のためのぺプチド分子をスクリーニングする一般的な方法は、(a)分離インテインの第1の部分と第2の部分との間に配置され、ターゲットペプチドの環化形(ホストシステムにおけるポリヌクレオチドの自発的スプライシングの結果としての)、あるいはターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体のどちらかのぺプチド分子を生成するホストシステムにおける核酸分子の発現と同様のターゲットペプチドを有するポリぺプチドをコード化する核酸分子を供給し、(b)ホストシステムを供給し、(c)単離した核酸をホストシステムに誘導し、(d)生成されるぺプチド分子をもたらす条件下にホストシステムを置き、そして(e)あらかじめ決定された性質のぺプチド分子をテストするステップを含む。
【0095】
ステップ(a)は、例えば、ターゲットペプチド、インテインの第1の部分及びインテインの第2の部分をコード化するポリヌクレオチドを製造するための分子生物学的技術(Ausubel他及びSambrook他「supra」参照)を用いることが、ここでのいずれかで述べられている。そして、三つのポリヌクレオチドは結果として、核酸分子を形成するために共に融合(例えば、縛りつけ)される。供給されたホストシステムについては、核酸分子の発現(例えばバクテリア、酵母菌、哺乳類細胞など)の中で述べられている。この核酸は、核酸分子の形状と使用されるホストシステムに依存する公知の方法によりホストシステムに導かれる。例えば、核酸分子は、エレクトロポイレーション、リポフェクション、塩化カルシウム媒介トランスフォーメーションの使用、遺伝子ガンの使用、バクテリオファージベクター(ホストシステムがバクテリアの場合)の使用、プラスミド構造の使用、ウィルスベクターの使用などにより細胞に導かれる。
【0096】
ホストシステムは、核酸分子の特定の形状と使用されるホストシステムによる条件を調節することにより製造されるぺプチド分子に起因する条件下に置かれる。人細胞ホストシステムの場合には、これは、細胞を栄養に富んだ適当な培養液に配置し、37℃で加湿した5〜10%二酸化炭素培養器で培養することを意味する。誘導発現ベクターの場合には、ベクターにおいて核酸分子の発現を誘導する物質をホストシステムに加えることを意味する。例えば、アラビノーゼ誘導発現ベクターを用いるときには、このステップはホストシステムにアラビノーゼを加えることを含む。
【0097】
あらかじめ決定された性質によるぺプチド分子をテストすることは、非常に多くの異なる方法により行うことができ、例えば、公知のリガンドに対するぺプチド分子の結合を測定し、生化学反応を調節(すなわち割合の減少あるいは増加)するためのぺプチド分子の能力を分析することである。あらかじめ決定された特性のぺプチドをテストするために用いられる多くの種々の方法記述としてFernandes,P.「supra」を参照されたい。
【0098】
より具体的で代表的な特定の性質の環状化ぺプチドあるいはスプライシング中間体をスクリーンするために使用されうる方法は、固相支持体と環状化ぺプチドあるいはスプライシング中間体を明確に結合する分子を見分けるためにアフィニティクロマトグラフィーとを用いること、ファージディスプレイテクノロジーを用いること、及び具体的な生化学反応あるいは細胞内の事象を調整可能な環状ぺプチドあるいはスプライシング中間体を見分けるためのアプタマーぺプチド融合構造及び/又は混合システムを用いることを含む。
【0099】
環状ペプチドおよび/またはスプライシング中間体と相互作用する分子を同定するための固相支持/アフィニティークロマトグラフィー
環状ペプチドまたはスプライシング中間体は、与えられた環状ペプチドまたはスプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および/または精製を容易にするために、固相支持体に固定化可能である。精製のためのペプチドアフィニティーカラムの一般的な概要については、Bumbach, G.A. and D.J. Hammond, Biopharm., 5:25, 1992を参照。下記は、本発明においてどのようにこれを行うことができるか、という例である。
【0100】
図10を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および/または精製の方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(化学種1)は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Y)で触媒作用のあるアスパラギンを置換し(ステップA)、ICの上流にアフィニティ標識(アフィニティタグ)を導入し(ステップB)、化学種2を得る。インテイン媒介環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する(ステップC)。この分子は、つぎにアフィニティ標識/IC中間体(化学種3)と特異的に結合する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通される(ステップD)。ターゲット分子(すなわち、スプライシング中間体に結合する候補)を含有した溶液は、つぎにカラムに通される(ステップE)。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。これらターゲット分子は、カラムから取り除かれて生化学的に分析(例、塩基配列)可能である。
【0101】
図11を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および/または精製の別の方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(化学種1)は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Y)で触媒作用のあるアスパラギンを置換し(ステップA)、INの下流にアフィニティ(親和性)標識を導入し(ステップB)、化学種2を得る。インテイン媒介環化反応は、ラリアット中間体が形成されるまで進行する(ステップC)。この分子は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通され(ステップD)、IN/IC非共有結合錯体(化学種3)の保持および精製を可能にする。アフィニティ標識の切断は(ステップE)は、ラリアット中間体(化学種4)の回収を可能にする。ターゲット分子(すなわち、スプライシング中間体に結合する候補)を含有した溶液は、つぎにカラムに通される(ステップE)。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。
【0102】
図12を参照すると、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および/または精製の別の方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(化学種1)は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Z)でIN求核分子を置換し(ステップA)、INの下流にアフィニティ(親和性)標識を導入し(ステップB)、IC-ペプチド-IN-標識−融和蛋白質(化学種2)を得る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する(ステップC)。この蛋白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通され(ステップD)、蛋白質錯体(化学種3)の保持および精製を可能にする。ターゲット分子(すなわち、スプライシング中間体に結合する候補)を含有した溶液は、つぎにカラムに通される(ステップE)。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。
【0103】
図13を参照すると、さらに、与えられたスプライシング中間体と特異的に結合する分子の同定および/または精製の別の方法が示されている。この方法において、活性インテイン中間体(化学種1)は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Z)でIN求核分子を置換し(ステップA)、ICの上流にアフィニティ(親和性)標識を導入し(ステップB)、標識-IC-ペプチド-IN−融和蛋白質(化学種2)を得る。インテイン媒介環化反応は、融和蛋白質を生成する(ステップC)。この蛋白質は、つぎにアフィニティ標識と特異的に結合する結合基を有する固相支持体を備えたアフィニティカラムに通され(ステップD)、蛋白質錯体(化学種3)の保持および精製を可能にする。ターゲット分子(すなわち、スプライシング中間体に結合する候補)を含有した溶液は、つぎにカラムに通される(ステップE)。スプライシング中間体と特異的に結合するターゲット分子は、カラム中に選択的に保持される。
【0104】
ファージディスプレイ
ファージディスプレイを用いた分子をスクリーニングする方法もまた本発明の範囲である。従来のファージディスプレイを用いた方法を、本発明の環状ペプチドおよび/またはスプライシング中間体を示すファージを用いることによって変更することができる。例えば、仮に図1のZがファージコート蛋白質であり、図2においてXH=Hであるとすると、スプライシング反応は最初のエステル中間体を超えて進行せず、したがって、ターゲットペプチドがループとして示される結果となる。この方法で、ループターゲットペプチドを示すファージ粒子からなるライブラリーは、示されたループに結合する分子をピックアップするために準備され使用されることが可能である。例えば、ターゲット分子を固相支持体に固定化可能である。また、異なったループ状のペプチドを示すファージライブラリーは、支持体に混合可能である。それらのターゲット分子に結合するファージディスプレーを行うループ状のペプチドは、選択的に支持体に保持される。支持体から溶離した後(例えば、高濃度の強力な求核分子と、ファージディスプレイされたループペプチドのエステル結合を開裂させることにより)、ループ状ペプチドのアミノ酸塩基配列は、標準的な分子生物学の方法で決定可能である。
【0105】
アプタマー
ペプチドアプタマーは、立体配置的に束縛されたターゲットペプチド領域を含んだポリペプチドであり、そのターゲットペプチド領域は骨格から示される様々な塩基配列になっている。環状ペプチドまたはスプライシング中間体はアプタマーとして機能可能であるので、アプタマーを分析する既知の方法は、環状ペプチドまたはスプライシング中間体の特定の特性の決定における補助のために変更可能である。例えば、Geyer et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8567, 1999; Caponigro et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:7508, 1998; Mikhail et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:14266, 1998; Norman et al, Science 285:591, 1999を参照。
【0106】
例えば、図14を参照すると、環状蛋白質は、ペプチドライブラリーのメンバーを環状蛋白骨格のN-終端とC-終端との間の束縛されたループとして示すことができる技術において、アプタマー骨格として使用可能である。図14に示されるように、アプタマーライブラリーは、IC-骨格-IN−融合蛋白質(化学種1)として表すことができる。生体内のインテイン媒介環化反応の進行(ステップA)により、IN、IC、および環状骨格蛋白質(化学種2)が得られる。アプタマーライブラリーは、N-終端とC-終端との間のリンカー領域において示される。図14において、Nはアミノ酸を表し、添字nおよびmは0以上の総数であり、Xはセリン、トレオニンまたはシステインを示す。
【0107】
アプタマーを用いたその他の方法も本発明の範囲である。図15を参照して、2つのそのような方法を記述する。反応Iにおいて、活性インテイン中間体は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Z)でINからの求核アミノ酸を置換する(ステップA)。これらのプロセスは、スプライシング反応を不活性化し、化学種2が得られる。ICとINの間の強い相互作用のために、この技術によって、ペプチドライブラリーのメンバーを2つのインテイン部分の間のリンカー領域(ターゲット)において束縛されたループとして示すことが可能となる。反応IIにおいて、活性インテイン中間体は変異誘発され、触媒作用のないアミノ酸(Y)で触媒作用のあるアスパラギンを置換して化学種2を得る(ステップA)。生体内のインテイン媒介環化反応の進行(ステップB)、およびラリアット中間体段階(化学種3)の拘束により、ペプチドライブラリーのメンバーを束縛されたラクトンとして示すことが可能となる。
【0108】
ハイブリッドシステム
イースト二重ハイブリッドシステムは、生体内のプロテイン間の相互作用を分析する方法として良く研究されている(Fields, S. 及びO. Song, 1989年ネーチャー雑誌(ロンドン)、340:245参照)。そのシステム及びその変形としての、1ハイブリッドシステム、三重ハイブリッドシステム、逆二重ハイブリッドシステム、スプリットハイブリッドシステム、選択的n―ハイブリッドシステム、小分子系ハイブリッドシステムなどが、周知の方法を適用して環状ペプチドやスプライシング中間体の特徴を分析するために使用可能である(Drees, B.L による.,1999 年Current Opin.Chem.Biol., 3:64; Vidal, M., 及びP. Legrainによる 1999年Nucleic Acids Research, 27:919; Ausubel, F.M. 他編集1996年 Wiley, New York, 「Current Protocols in Molecular Biology」;Huang, J.及びS.L., Schreiberによる1997年アメリカProc. Natl Acad. Sci94:13396; Yang, M.他による 1995年Nucleic Acids Res. 23:1152; Colas, P. 他による1996年ネーチャー雑誌(ロンドン), 380-548;Xu, C.W., 他による1997年アメリカProc. Natl. Acad.Sci.94:12473、を夫々参照)
たとえば、図16を参照すると、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテインを同定する方法は本発明の範囲に含まれる。この方法では、アクティヴインテイン中間体(種1)が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性アミノ酸(Y)と置換し(ステップA)、INの下流でDNA結合ドメインを導入(ステップB)して種2を得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート中間体(種3)が形成される(ステップC)まで進行する。IN、ICは強い共有結合コンプレックスを形成する。その帰結としてラリアート中間体はDNA結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される(ステップD)。ラリアート中間体のターゲットプロテイン(種4)との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし(ステップE)、レポータ遺伝子(*)を発現させる。この方法により、ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、(未知のターゲットプロテインの代わりに)既知の分子をDNA結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート中間体を同定するように変形可能である。
【0109】
図17を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテインを同定する別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン中間体(種1)が変異誘発され触媒性アスパラギンを非触媒性アミノ酸(Y)と置換し(ステップA)、ICの下流でDNA結合ドメインを導入(ステップB)して種2を得る。インテインに媒介された環化反応はラリアート中間体(種3)が形成される(ステップC)まで進行する。次に、この分子は、DNA結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される(ステップD)。ラリアート中間体のターゲットプロテイン(種4)との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし(ステップE)、レポータ遺伝子(*)を発現させる。この方法により、ラリアート中間体を結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、(未知のターゲットプロテインの代わりに)既知の分子をDNA結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示すラリアート中間体を同定するように変形可能である。
【0110】
図18を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテインを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン中間体(種1)が変異誘発されIN求核試薬を非触媒性アミノ酸(Z)と置換し(ステップA)、INの下流でDNA結合ドメイン(DBD)を導入する(ステップB)。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、IC―ペプチドーIN―DBD融合プロテイン(種2)を発生させる。次に、この分子は、DNA結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される(ステップC)。その融合プロテインのターゲットプロテイン(種3)との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし(ステップD)、レポータ遺伝子(*)を発現させる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、(未知のターゲットプロテインの代わりに)既知の分子をDNA結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示す融合プロテインを同定するように変形可能である。
【0111】
図19を参照して、スプライシング中間体と相互作用するターゲットプロテインを同定するさらに別の方法を記述する。この方法では、アクティヴインテイン中間体(種1)が変異誘発されIN求核試薬を非触媒性アミノ酸(Z)と置換し(ステップA)、ICの下流でDNA結合ドメイン(DBD)を導入する(ステップB)。これらのプロセスはスプライシング活動を不活性化し、DBD−IC―ペプチドーIN融合プロテイン(種2)を発生させる。次に、この分子は、DNA結合ドメインに付着したターゲットプロテインで同時発現される(ステップC)。ステップDでの当該融合プロテインのターゲットプロテイン(種3)との相互作用は、プロモータ領域の活性化を引起こし(ステップE)、レポータ遺伝子(*)を発現させる。この方法により、融合プロテインを結合できるターゲット分子を同定する。この方法は、(未知のターゲットプロテインの代わりに)既知の分子をDNA結合ドメインに付着し、その既知の分子を結合するループ状ペプチドを示す融合プロテインを同定するように変形可能である。
【0112】
生体内での環状ペプチド及びスプライシング中間体のターゲティング
本発明の環状ペプチド及びスプライシング中間体は、従来周知のターゲティング方法を変形することで特定の細胞内の位置や細胞外液の分泌をターゲット化できる(例えば、Willkinson他による1997年J. membrane Biol., 155:189; Komiya他による1998年The EMBO, 17:3886; Kouranov及びSchnellによる1996年J.Biol.Chem.271:31009; Bhagwat 他による1999年J.Biol.Chem.274:24014; Adam, S.A.,による1999年Current Opin.Cell Biol.11402-406; Gorlich, D.による1997 年Current Opin.Cell Biol.9:412; Pemberton 他による1998年Current Opin.Cell Biol.10:292; Sakaguchi M.による1997年Current Opin.Cell Biol.8:595;Folsch他による1998年The EMBO, J.17:6508を夫々参照)。たとえば、本発明の環状ペプチドやスプライシング中間体に種々のシグナルペプチドを付着し、それらを所定の細胞区画に局部集中させたり翻訳後外部空間に分泌させることが可能である。このようにして、本発明の環状ペプチドやスプライシング中間体は、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、葉緑体、ゴルジ体、ぺリプラズム、核、原形質膜等の細胞局部をターゲット化(標的化)できる。このターゲット方法は、ペプチドライブラリーを発生させる方法及び所定の細胞局部で相互作用又は活発化する分子を同定することを所望する場合にそのようなライブラリーを選別する方法に使用可能である。
【0113】
環状ジヒドロ葉酸(DHFR)と環状擬似ステラリンFの合成
材料および方法
ベクターの作成
Ssp DnaE N−インテイン(IN)の遺伝子は、Taqポリメラーゼと、5’−Bgl11とNsi1と3’−PstI制限部位を導入するプライマーとを用いて、Ssp 6803ゲノムDNAから増幅された。Ssp DnaE IC遺伝子は、同様に、5’−Nco1と3’−Nde1とSac1制限部位を導入するプライマーを用いて増幅された。核外遺伝子pDIMCPは、インテイン断片をpDIMC7[BamHI制限部位のBgl11への変換を除いてpDIMC6と同一(Ostermeier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:3562,1999を参照)]へ個々にクローニングした結果として生じる。IC遺伝子(A35H)におけるアラニンからヒスチジンへの変異は、pDIMCPAHに起因するクイック・チェンジ突然変異生成(遺伝子層)により影響される。Nco1/Pst1消化としてのインテイン断片の除去と、pAR4[複数のクローニング部位における固有のNco1を用いてpAR3(Perez-Perez, J. and J. Gutierrez, Gene, 158:141, 1995; American Type Culture Collection(ATCC)#87026)から誘導]への連結とによって、pARCP(図3のa)とpARCPAHが生成した。大腸菌DHFRは、(CAC)6(6つのヒスチジン残余をコード化する)と3’−PstI部位に続く5’−Nde1部位を導入するプライマーを用いてpET22b−DHFR(Miller, G.P. and S.J. Benkivuc, Biochemistry 37:6327, 1998)から増幅され、NdeI/PstIを用いて消化されて、NdeI/PstI消化されたpARCPまたはpARCPAHに連結され、pARCP−DHFR(図3のb)およびpARCPAH−DHFR(図3のc)を生成した。ポリヒスチジンの塩基配列は、Nde1、Nsi1およびBspM1部位を用いて合成的に作成され、pARCPAHへ結合されてシクロ−[CHMHHHHHHGAGAA]をコード化する核外遺伝子pARCP2−6Hを作成した。核外遺伝子pARCP−pは、pDIMCPAHから3段階で作成された:(1)クイック・チェンジ突然変異生成は、INへAflI1部位を導入し、pDIMCPMAが生成した;(2)擬似ステラリンF遺伝子は、合成的に作成され、Mfe1/AflI1消化されたpDIMCPMAへ連結されてpDIMCP−pを生成した;(3)融合構造は、NcoI/Pst1断片としてのpDIMCP−pから除去され、Nco1/Pst1消化されたpAR4へ連結されてpARCP−p(図3のe)が生成した。核外遺伝子pARCBD−pを作成するために、Kpn1部位は、クイック・チェンジ突然変異生成によってpARCP−pのIN遺伝子のカルボキシル終端へ導入され、pARCPpKを生成した。キチンが結合した領域をコード化する遺伝子は、5’Kpn1と3Hind111部位を導入するプライマーを用いて核外遺伝子pCYBI(New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts)から増幅された。PCR生成物とpARCPpKの両方は、KpnIとHind111を用いて消化され、一緒に連結されてpARCBD−p(図3のf)が生成した。全ての酵素は、別に付記していなければ、PromegaまたはNew England Biolabsから入手した。
【0114】
DHFRの精製
pARCP−DHFRまたはpARCPAH−DHFRの一方を収容したXLI−ブルー細胞は、37℃で50μg/mlのクロラムフェニコールを加えたLB培地で培養物がOD600Of0.7に達するまで培養された。培養物は、L−(+)−アラビノースが最終濃度0.5%になるまで誘導され、28℃で24時間培養された。細胞は、遠心分離(7,000 x g、10分)によって収集され、液体窒素中で冷凍された。細胞は溶解され、DHFR含有蛋白質は既述(Miller and Benkovic, id)のとおり精製された。環状生成物は、30分以上50mMのトリス−HCl中の勾配0−1MのNaClに溶出されたモノ−Qカラム(Amersham Pharmacia)を用いたFPLCによって、ほかのDHFR含有中間体から分離された。ウエスタンブロット法は、抗ヒスチジン(Qiagen)とヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ抱合抗体(Pierce)を用いて、製造者の説明書に従って行われた。
【0115】
エンドプロテアーゼ・リジン−C消化
野生型または環状DHFR(50μg)は、37℃で0.1MのNH4HCO3中の0.5μgのエンドプロテアーゼ・リジン−Cで処理された。サンプルは、6および24時間で採取され、SDS/16%PAGEゲルで明視化され、マトリックス支持レーザー脱離イオン化(MALDI)飛行時間マススペクトロメトリー(Moore, W.T., Methods Enzymol., 289:520, 1997)に提出された。
【0116】
DHFRの検定
熱安定性は、MTEN緩衝液[50mMの2−(N−モルフォリノ)エタンスルフォン酸(MES)、25mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、25mMのエタノールアミンと100mMのNaCl]中、25℃または65℃のいずれかにおいて、100nMの野生型あるいは環状のDHFRの前保温によって検定された。一定分量が、種々の時間に採取され、100μMの7,8−ジヒドロ葉酸の存在下で5分間室温で平衡化された。活性の検定は、前述(Miller and Benkovic, supra)のとおり還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADPH)を用いて開始された。
【0117】
シクロ−[ Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu ]の合成
3.5mg(4μmol)のNH2-Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu-CO2Hと、1.8mg(16μmol)のN−ヒドロキシスクシニミドの20mlのジメチルホルムアミド溶液に、3.0mg(16μmol)の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)が加えられた。反応は、25℃で10時間攪拌された。追加の3.0mgのEDCが次に加えられ、25℃でさらに10時間攪拌が継続された。溶媒はロータリーエバポレーションによって除去され、残渣は2mlの水で溶解され、30分以上0.1%トリフルオロ酢酸/水中の直線勾配0−50%(vol/vol)のアセトニトリルに溶出されたWhatman Partisil 10 ODS-3 9.4-mM X 50-cmカラムの逆相HPLCによって精製された。適正な画分は、凍結乾燥され、2.8mg(80%)の白色の固体が得られた[m/z 785(MH+)]。この合成的に作成した物質の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されている単離された天然の生成物に関するスペクトルと一致した(Morita, H., et al, Tetrahedron 50:9975, 1994)。
【0118】
擬似ステラリンFの精製
pARCP−pに収容された大腸菌株XL1−ブルー、DH5aまたはBL21−DE3は、培養され、既述のDHFRの精製と同様に収集された。培地(500ml)は、1−ブタノールで3回(3x100ml)抽出された。抽出物は、混合されてエバポレートされ、固形の残さは2mlの0.1MのK2HPO4(pH8.0;溶解緩衝液)で再懸濁された。細胞は、10mlの溶解緩衝液で再懸濁され、超音波処理され、遠心分離(20,000x g、20分間)によって不純物が除去された。可溶化液は抽出され(3x5ml、n−ブタノール)、抽出物は混合され、エバポレートされて500μlの溶解緩衝液で再懸濁された。組換え生成物は、上述のHPLCによって可溶化液と培地抽出物から精製された。可溶化液と培地抽出物からの適正な画分の凍結乾燥から、油状の残分、m/z785.47(MH+), 807.43(MNa+), 823.44(MK+)が得られた。凍結乾燥物の1H−NMRとUV−可視スペクトルは、発刊されている単離された天然の生成物に関するスペクトルと一致した(Morita rt al, supra)。キチン結合領域に融合した蛋白質は、上述したように不純物が除去された可溶化液を作成することから準備された。可溶化液は、キチンカラム(New England Biolabs, Inc)に通され、溶解緩衝液と平衡化された。カラムは、定組成溶離で溶離され、スプライシング中間体を含んだ画分は、貯蔵され、MALDIマススペクトル分析に提出された。
【0119】
チロシナーゼのクローニング
ストレプトマイセス・アンチバイオチクス(Streptomyces antibioticus) (Bernan et al, Gene 37:101, 1985)からのチロシナーゼ遺伝子(ORF 438を含む)は、5’Nde1と3’EcoRI制限部位を導入するプライマーを用いたpIJ702(ATCC no.35287)からのベント−ポリメラーゼを用いて増幅された。PCR生成物は、Nde1とEcoRIを用いて消化され、同様に消化されたpDIMN2(Ostermeier et al, supra)へ結合され、pDNMN−Yを生成する。形質転換された連結混合物は、外界温度で5日間培養され、チロシナーゼを発現したコロニーは、FeCuYプレート[アンピシリン(200μg/ml)、FeCl3・6H2O(0.2mM)、CuSO4・5H2O(0.2mM)、L−チロシン(0.3mg/ml、Y)、イソプロピル-B-D-ガラクトシド(0.3mg/ml、Y)を含んだLB寒天板](Della-Cioppa, G. et al., Biotechnology 8:634, 1990)上の色素形成によって同定された。
【0120】
結果
遺伝子作成の計画
Ssp ICとINをコード化する遺伝子は、標準的な分子生物学的方法(Sambrook, et al., supra)によってSspゲノムDNAから増幅され、連続的にpDIMC7へ結合される。生成した環化前駆体(CP)断片は、pDIMC7から切除され、隣接するpAR3のAraBプロモーターにクローニングされ、pARCPベクターシリーズ(図3)を生成する。これらのベクターは、アラビノースの存在下で環化前駆体の発現を活性化する。大腸菌DHFR遺伝子は、pARCPのNde1およびNsi1部位の間でクローニングされ、各分割インテイン遺伝子(図3のbとc)との枠内融合を作成した。DHFRの増幅に用いられたPCRプライマーもまた、DHFR遺伝子の5’端の6ヒスチジン標識をコード化する塩基配列が導入され、環化される領域の免疫検出を可能にした。2つのDHFRの生成は、アスパラギン側鎖環化の酸/塩基触媒作用におけるICの最後から2番目の残基の役割を研究するために構築された。核外遺伝子pARCP-DHFR(図3のb)は、野生型のICをコード化し、末端アスパラギンに隣接するアラニン残基を有する。核外遺伝子pARCPAH-DHFR(図3のc)は、IC遺伝子の最後から2番目の位置のアラニンからヒスチジンへの変異を組み入れる。擬似ステラリンF(シクロ−[SGGYLPPL])を生成させるために、ベクターはIN遺伝子の5’端のAflI1部位を作成する沈黙突然変異によって修飾される(図3のd)。MfeI部位は、自然に、野生型のIC遺伝子の3’端に生じる。擬似ステラリンFをコード化する、合成的に作成された二重鎖の挿入断片が修飾されたベクターへ連結することによって、核外遺伝子pARCP-pが生成する。Kpn1部位は、キチン結合領域の遺伝子を擬似ステラリン生成構成体へ融合させるためにIN遺伝子の3’端に導入された(図3のf)。
【0121】
環状 DHFR の生成とキャラクタリゼーション
DHFRの環化は、図4に示すとおり、pARCP-DHFRをアラビノース誘導したSDS-PAGEによって直ちに明らかになった(F: IC-DHFR-IN 融合蛋白質。T: IC-DHFR-IN 融合チオエステル中間体。R: IC-DHFR ラリアット(輪縄形)中間体。L:直鎖状DHFR。O:環状DHFR。IN:N-インテイン。IC:C-インテイン。1レーン:非誘導XL1-ブルー/pARCP-DHFR。2レーン:アラビノース誘導されたXLI-ブルー/pARCP-DHFR。3レーン:アラビノース誘導されたXLIブルー/pARCPAH-DHFR。4レーン:3レーンのメトトレキセートアガロース後、未精製の可溶化液。5レーン:4レーンのFPLC後の物質。6レーン:野生型DHFR)。
【0122】
直鎖状(L,23kDa)および環状(O,21kDa)DHFR生成物、融合蛋白質(F,37kDa)、IN(14kDa)およびIC(4kDa)に相当する明らかな分子量と一体となったバンドがはっきりと現れ、チオエステル(T,36kDa)およびラリアット中間体(R,26kDa)として仮に割り当てられたバンドも同様である(図4、2レーン)。アラニンからヒスチジンへのIC(A35)の最後から2番目の残基の変異(図3のc)は、環状DHFRの収量を改善させた(図4、3レーン)。未精製の可溶化液のメトトレキセートアガロース親和性クロマトグラフィー(図4、4レーン)は、誘導されたバンドの大多数が正確に折り畳まれたDHFRを含有することを支持した。INはDHFRに共有結合的に結合していないが、おそらくIC-DHFRラリアット中間体(R)との非共有錯体構造のために、メトトレキセートカラムに保持された。メトトレキセートアガロース溶離剤はFPLCによって分画され、培養液1リットルあたり5mgの環状生成物の精製を可能にした。抗ヒスチジン抗体のウエスタンブロット(図示せず)は、FPLCで精製された蛋白質のポリヒスチジンリンカー塩基配列(図3のd)の存在を証明した。蛋白質は、SDS/PAGE分析において、付加的な形態上の束縛を意味する余分な11-アミノ酸リンカー塩基配列(図3のb)にも関わらず、組換え型のDHFR(図4、6レーン)よりも早く移動する。さらに、FPLCで精製された蛋白質をフェニルイソチオシアネート(Edman, P., Acta Chem)と反応させたときに、何の反応も検出されなかったが、これはアミノ終端が有用でないことを示唆している。
【0123】
環状DHFRは、定常状態の動力学パラメータと基質、補助因子、25℃における野生型酵素から識別不能なメトトレキセート解離定数を有していた。野生型と環状のDHFRの65℃前保温後に行われた活性度の測定は、環化によって酵素の熱安定性が改善されたことを示した(図5)。エンドプロテアーゼリジン-C消化は、FPLCで精製された蛋白質が環状DHFRであることを明らかに示すために用いられた。野生型の蛋白質の消化は、アミノ末端(4.4kDa)およびカルボキシ末端(6.3kDa)の断片を生成する;環状の蛋白質では、これら2つの断片は結合し、10.7kDaの消化生成物となる(図6)。FPLCで精製された物質は、野生型の酵素と比較してタンパク分解に耐性があり、消化混合物のマススペクトル分析は、野生型蛋白質には存在せず、環状蛋白質に由来する物質の10.7kDaのピークを確認した(データは示さない)。
【0124】
疑似ステラリン F (Pseudostellarin F) の生成と特徴
疑似ステラリンFは、組み換え型スレプトマイセス・アンチバイオチクス チロシナーゼ (streptomyces antibioticus tyrosinase)(図7参照)の抑制を通じて生体内で容易に検出された。図7の実験において、XLI-ブルー細胞は、pDIM-NY及びpARC2−6H(a&b)又はpARCP-p (c & d)で同時形質転換(co-transformed)された。その細胞は、クロラムフェニコール(chloramphenicol)(50μg/ml)を備え、(a&c)なしか又は (b& d)L-(+)アラビノース(arabinose)(0.5%)を備えるFeCuYプレート培養皿に蒔かれた。
【0125】
チロシナーゼを発現する細胞における疑似ステラリンFの同時発現は、色素フォーメーション(図7のd参照)を劇的に減少した。pARC2−6Hからの関連性の無い環状ペプチドの発現は、チロシナーゼ(図7のaとb)を阻害せず、阻害には絶対的にアラビノース誘導を必要とした(図7のcとdを比較)。いくつかの菌種(BL21‐DE3,DH5a及びXLI−ブルー)のアラビノース誘導pARCP-pのSDS/PAGE分析により、融合プロテイン(F)、チオエステル中間体(T)及びINに対応したバンドが視覚化された。強い、低分子量バンドも視認されたが、解像度は、ラリアット中間体(R)とIC(データ表示せず)を分離するには不十分であった。疑似ステラリンFは小さすぎてSDS/PAGE分析では視覚化できなかったが、質量分光分析では粗細胞溶菌液 (lysate)と媒体の両方で存在が示された。組換え型環状ペプチドの約30μgが湿細胞質量のグラム当り細胞溶菌液から分離された。また、疑似ステラリンFは、1-ブタノール抽出後高速液体クロマトグラフィー (HPLC)により、発現系次第で2mg/リットル(XLIブルー)と20mg/リットル(BL21−DE3)の間で変化する収率で媒体から分離された。その組換え型材料のNMRスペクトルはその天然生成物に関し報告されている数値と合致し(森田他、SUPRA参照)、そのバクテリア的に発現された環状ペプチドの滞留時間は合成的に用意した標準と同一であった。前記組み換え型材料は、ニンヒドリン(ninhydrin)と反応せず(Gordon, A.J., 及びR.A.Ford ; The Chemist's Companion誌、及び、1972年ニューヨーク Willey Interscience社の「実践データ、技術及び参考文献ハンドブック」
参照)、ラクトン生成物というよりむしろ中堅(backbone)環状ペプチド(ラクタム)を示した。HPLCと質量スペクトル分析のいずれも直鎖状の親ペプチドが生成されたという証拠を与えなかった。
【0126】
キチン結合ドメインは、インテインが媒介するライゲーション(核酸連結)反応中間体を親和・純化するINカルボキシル基に融合され、それらをMALDI質量分光測定で特徴付ける(表1)。
【0127】
【表1】
ICを含むスプライシング反応の全ての中間体は、XLI−ブルー内のアラビノース誘導形pARCBD-pからの粗細胞溶菌液 がキチンアフィニティーカラム
(affinity column)を通過する際に保持された。疑似ステラリンFは1−ブタノール抽出により保持されない材料から回収された。融合プロテイン(F)、チオエステル中間体(T)及びIN に対する観察された分子質量は、遺伝子配列から予測された値に極めて良く合致した。ICの質量は、製品リリースの提案されたメカニズムから予測されたアスパラギン環化形状と合致した。ラリアート中間体(R)の分子質量は、エステル転移反応 (transesterification)から予想された分枝鎖ラクトン生成物とよりも直鎖状IC―疑似ステラリンF融合生成物とよく合致した。
【0128】
その他の実施例
上述の明細書は多くの特定事項を含むが、それらは本発明を限定するものと解釈されるべきではなく、好適な実施例の例示と解されるべきである。多くの他の実施例が可能である。従って、本発明の範囲は上述の実施例ではなく、添付の特許請求の範囲及びその法律的な均等物により制限されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明における通常の環化反応の概要を示す概略図である。
【図2】 本発明のペプチド環化方法で起こる一連の化学反応ステップを示す概略図である。
【図3】 (a)核外遺伝子pARCP、(b)核外遺伝子pARCP−DHFR、(c)核外遺伝子pARCPAH−DHFR、(d)MfeIサイトへのクローニングによって生成したシステイン(TGY)またはセリン(TCN)コドン(Nは核酸塩基、SはC、GとYはピリミジンを表す)、(e)核外遺伝子pARCP−p、(f)核外遺伝子pARCBD−pの遺伝地図である。
【図4】 10〜20%勾配のトリス/グリシン既製ゲル(Biorad)でのジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)環化の硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分析の写真である。
【図5】 65℃での前保温後の野生型(三角形)と環状DHFR(菱形)活性のDHFR活性のグラフである。
【図6】 直鎖状および環状DHFRの予想されるエンドプロテナーゼLys−C消化パターンを示す概略図である。
【図7】 擬似ステラリンFによるチロシナーゼ抑制を検出するために生体内の検定で用いたFeCuYプレートの写真である。
【図8】 本発明における環状ペプチドを精製する方法の概略図である。
【図9】 本発明における環状ペプチドを精製する別の方法の概略図である。
【図10】 特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定/精製する固相支持体/アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図11】 特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定/精製する別の固相支持体/アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図12】 特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定/精製する別の固相支持体/アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図13】 特異的にスプライシング中間体に結合する分子を同定/精製する別の固相支持体/アフィニティークロマトグラフィーに基く方法の概略図である。
【図14】 本発明におけるアプタマー骨格の使用を示す概略図である。
【図15】 本発明におけるアプタマーを合成する2つの反応を示す概略図である。
【図16】 本発明におけるスクリーニングの方法を示す概略図である。
【図17】 本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
【図18】 本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
【図19】 本発明におけるスクリーニングの別の方法を示す概略図である。
Claims (139)
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子であって、ホストシステムにおける核酸分子の発現は、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれた形態のポリペプチドを生成することを特徴とする非自然発生核酸分子。
- 前記ポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載の非自然発生核酸分子。
- 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項1に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項1に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、Ssp DnaEから誘導されたことを特徴とする請求項4に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項1に記載の非自然発生核酸分子。
- 前記非自然発生分離インテインは、RecA、DnaB、Psp Pol−I、Pfuインテインからなるグループから誘導されたことを特徴とする請求項6に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項1に記載の非自然発生核酸分子。
- 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であることを特徴とする請求項3に記載の非自然発生核酸分子。
- 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体であることを特徴とする請求項3に記載の非自然発生核酸分子。
- 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であることを特徴とする請求項3に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの第3の部分と、分離インテインの第4の部分とを含むポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子において、第1のターゲットペプチドが分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれ、第2のターゲットペプチドが分離インテインの前記第3の部分と分離インテインの前記第4の部分との間に挟まれることを特徴とする非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの前記第1の部分は分離インテインの前記第3の部分に相補的であるが分離インテインの前記第2の部分には相補的でなく、分離インテインの前記第2の部分は分離インテインの前記第4の部分に相補的であるが分離インテインの前記第3の部分には相補的でないことを特徴とする請求項12に記載の非自然発生核酸分子。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドをコード化する発現ベクターであって、ホストシステムにおける核酸分子の発現は、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれた形態のポリペプチドを生成することを特徴とする発現ベクター。
- 前記ポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記核酸分子は、さらに前記ホストシステムにおいてポリペプチドの発現を容易にする調節塩基配列を含むことを特徴とする請求項15に記載の発現ベクター。
- 前記核酸分子は、さらに個々の特性のための前記ターゲットペプチドの前記環化形の選別を容易にするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記核酸分子は、さらに前記ホストシステムから前記ターゲットペプチドの前記環化形の精製を容易にするペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記ターゲットペプチドは、分離インテインの前記第1の部分へ融合する第1の端部と、分離インテインの前記第2の部分へ融合する第2の端部とを有することを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、Ssp DnaEから誘導されたことを特徴とする請求項21に記載の発現ベクター。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記非自然発生分離インテインは、RecA、DnaB、Psp Pol−I、Pfuインテインからなるグループから誘導されたことを特徴とする請求項23に記載の発現ベクター。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項14に記載の発現ベクター。
- 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であることを特徴とする請求項16に記載の発現ベクター。
- 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体であることを特徴とする請求項16に記載の発現ベクター。
- 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であることを特徴とする請求項16に記載の発現ベクター。
- 前記ホストシステムは、原核細胞を含むことを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項29に記載の発現ベクター。
- 前記細菌は、大腸菌であることを特徴とする請求項30記載の発現ベクター。
- 前記ホストシステムは、真核細胞を含むことを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記真核細胞は、酵母菌であることを特徴とする請求項32に記載の発現ベクター。
- 前記真核細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項32に記載の発現ベクター。
- 前記ホストシステムは、始原細菌を含むことを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記ホストシステムは、植物細胞を含むことを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、核外遺伝子であることを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、細菌ウイルスであることを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、ウイルスであることを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 前記ベクターは、直鎖核酸分子であることを特徴とする請求項14記載の発現ベクター。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含む十分に純粋なポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれることを特徴とするポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 前記ターゲットペプチドは、分離インテインの前記第1の部分へ融合する第1の端部と、分離インテインの前記第2の部分へ融合する第2の端部とを有することを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、Ssp DnaEから誘導されたことを特徴とする請求項45に記載のポリペプチド。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の少なくとも一つは、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 前記非自然発生分離インテインは、RecA、DnaB、Psp Pol−I、Pfuインテインからなるグループから誘導されたことを特徴とする請求項47に記載のポリペプチド。
- 分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分の両方は、非自然発生分離インテインから誘導されたことを特徴とする請求項41に記載のポリペプチド。
- 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であることを特徴とする請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体であることを特徴とする請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であることを特徴とする請求項43に記載のポリペプチド。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子を含むホストシステムにおいて、前記ポリペプチドが、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれることを特徴とするホストシステム。
- 前記ポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする請求項53に記載のホストシステム。
- 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項53に記載のホストシステム。
- 前記ホストシステムは、原核細胞を含むことを特徴とする請求項53記載のホストシステム。
- 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項56に記載のホストシステム。
- 前記ホストシステムは、始原細菌を含むことを特徴とする請求項53記載のホストシステム。
- 前記ホストシステムは、真核生物を含むことを特徴とする請求項53記載のホストシステム。
- 前記真核生物は、酵母菌であることを特徴とする請求項59に記載のホストシステム。
- 前記真核生物は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項59に記載のホストシステム。
- 前記ホストシステムは、植物細胞を含むことを特徴とする請求項53記載のホストシステム。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドをコード化する単離核酸分子を準備するステップと、前記ホストシステムを準備するステップと、前記ホストシステムに前記単離核酸分子を導入するステップと、前記単離核酸分子を発現させるステップとを含むペプチド分子を作成する方法であって、ホストシステムにおける前記核酸分子の発現は、(a)前記ホストシステムにおいて前記ポリペプチドが自然にスプライシングしたことに由来する前記ターゲットペプチドの環化形と、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれた形態の前記ペプチド分子を生成することを特徴とする方法。
- 前記単離核酸分子を発現させるステップは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドを生成することを特徴とする請求項63に記載の方法。
- さらに前記ホストシステムから前記ターゲットペプチドの環化形を精製するステップを含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記単離核酸分子を発現させるステップは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体を生成することを特徴とする請求項63に記載の方法。
- さらに前記ホストシステムから前記ターゲットペプチドの環化形を精製するステップを含むことを特徴とする請求項66に記載の方法。
- 前記スプライシング中間体は、活性インテイン中間体であることを特徴とする請求項66に記載の方法。
- 前記スプライシング中間体は、チオエステル中間体であることを特徴とする請求項66に記載の方法。
- 前記スプライシング中間体は、ラリアット中間体であることを特徴とする請求項66に記載の方法。
- さらに前記スプライシング中間体から前記環化ペプチドを生成するステップを含むことを特徴とする請求項66記載の方法。
- 前記単離核酸分子は、前記ホストシステムにおいて前記単離核酸分子の発現を容易にする発現ベクターへ組込まれることを特徴とする請求項63記載の方法。
- 前記発現ベクターは、核外遺伝子であることを特徴とする請求項72に記載の方法。
- 前記発現ベクターは、細菌ウイルスであることを特徴とする請求項72に記載の方法。
- 前記発現ベクターは、ウイルスであることを特徴とする請求項72に記載の方法。
- 前記ホストシステムは、原核細胞を含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。
- 前記原核細胞は、細菌であることを特徴とする請求項76に記載の方法。
- 前記細菌は、大腸菌であることを特徴とする請求項77に記載の方法。
- 前記ホストシステムは、始原細菌を含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。
- 前記ホストシステムは、真核細胞を含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。
- 前記真核細胞は、酵母菌であることを特徴とする請求項80に記載の方法。
- 前記真核細胞は、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項80に記載の方法。
- 前記ホストシステムは、植物細胞を含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。
- 前記ホストシステムは、生体外での転写/翻訳システムを含むことを特徴とする請求項63に記載の方法。
- 前記生体外での転写/翻訳システムは、細胞溶解物を含むことを特徴とする請求項84に記載の方法。
- 環化形の前記ターゲットペプチドの前記生成は、外因添加試薬の非存在下で前記ホストシステムにて生じることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記外因添加試薬は、蛋白質分解酵素であることを特徴とする請求項86に記載の方法。
- 前記外因添加試薬は、チオールであることを特徴とする請求項86に記載の方法。
- 前記発現ベクターは、誘導できることを特徴とする請求項72に記載の方法。
- 異種のアミノ酸塩基配列を有する多数のターゲットペプチドをコード化する多数の核酸分子を準備するステップと、多数の発現ベクターを生成するためにそれぞれの多数の核酸分子を発現ベクターへ組込み、それによって、それぞれの多数の核酸分子がそれぞれの生成した発現ベクターにおいて分離インテインの第1の部分をコード化する核酸分子と分離インテインの第2の部分をコード化する核酸分子との間に挿入されるステップと、前記ホストシステムにおいて発現ベクターを発現させるステップとを含むペプチド分子のライブラリーを作成する方法であって、ホストシステムにおける前記発現ベクターの発現は、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれた形態の多数のペプチド分子を生成することを特徴とする方法。
- 前記多数のポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 前記多数のポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸分子は、固相法によって生成されたことを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成されたことを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸分子は、大きい核酸分子を酵素で消化することによって生成されたことを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 前記大きい核酸分子は、生物体から誘導されることを特徴とする請求項95に記載の方法。
- 多数のターゲットペプチドをコード化する前記多数の核酸分子は、原種核酸分子から生成され、この原種核酸分子は、前記原種核酸分子のヌクレオチド配列へ突然変異体を導入する条件下で増幅されたことを特徴とする請求項90に記載の方法。
- 分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドをコード化する核酸分子を準備するステップと、前記ホストシステムを準備するステップと、前記ホストシステムに単離核酸分子を導入するステップと、前記ペプチド分子を生成させる条件下に前記ホストシステムをおくステップと、前記予定された特性のための前記ペプチド分子を試験するステップとを含む予定された特性のためのペプチド分子を選別する方法であって、ホストシステムにおける前記核酸分子の発現は、(a)前記ホストシステムにおいて前記ポリペプチドが自然にスプライシングしたことに由来する前記ターゲットペプチドの環化形と、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれた形態のペプチド分子を生成することを特徴とする方法。
- 前記ペプチド分子は、前記ターゲットペプチドの環化形であることを特徴とする請求項98記載の方法。
- 前記ペプチド分子は、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする請求項98記載の方法。
- 前記予定された特性は、ターゲット分子に特異的に結合する能力を含み、前記予定された特性のためのペプチド分子を試験するステップは、(a)前記ペプチド分子を前記ターゲット分子に接触させるステップと、(b)前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合するかどうか測定するステップとを含むことを特徴とする請求項98に記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかどうか測定する前記ステップは、色の変化の観察によって測定されることを特徴とする請求項101記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかどうか測定する前記ステップは、蛍光シグナルの観察によって測定されることを特徴とする請求項101記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかどうか測定する前記ステップは、生物体の細胞サイクルの分析によって測定されることを特徴とする請求項101記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記ターゲット分子に結合したかどうか測定する前記ステップは、生物体の再生の分析によって測定されることを特徴とする請求項101記載の方法。
- 前記ターゲット分子は、細胞結合分子であることを特徴とする請求項101に記載の方法。
- 前記細胞結合分子は、膜結合分子であることを特徴とする請求項106に記載の方法。
- 前記細胞結合分子は、細胞内分子であることを特徴とする請求項106に記載の方法。
- 前記細胞内分子は、核分子であることを特徴とする請求項108に記載の方法。
- 前記細胞内分子は、細胞小器官であることを特徴とする請求項108に記載の方法。
- 前記細胞小器官は、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、葉緑体、ゴルジ体、ペリプラズムからなるグループから選ばれることを特徴とする請求項110に記載の方法。
- 前記ターゲット分子は、細胞外分子であることを特徴とする請求項101に記載の方法。
- 前記予定された特性は、生化学反応を調節する能力であり、前記予定された特性のためのペプチド分子を試験するステップは、(a)前記ペプチド分子を前記生化学反応を包含した系へ接触させるステップと、(b)前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定するステップとを含むことを特徴とする請求項98に記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定する前記ステップは、色の変化の観察によって測定されることを特徴とする請求項113記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定する前記ステップは、蛍光シグナルの観察によって測定されることを特徴とする請求項113記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定する前記ステップは、生物体の細胞サイクルの分析によって測定されることを特徴とする請求項113記載の方法。
- 前記ペプチド分子が前記生化学反応を調節するかどうか測定する前記ステップは、生物体の再生の分析によって測定されることを特徴とする請求項113記載の方法。
- 前記生化学反応は、細胞結合プロセスであることを特徴とする請求項113に記載の方法。
- 前記生化学反応は、細胞内代謝で生じることを特徴とする請求項118に記載の方法。
- 前記生化学反応は、膜結合で生じることを特徴とする請求項118に記載の方法。
- 前記生化学反応は、核で生じることを特徴とする請求項118に記載の方法。
- 前記生化学反応は、細胞外反応であることを特徴とする請求項113に記載の方法。
- 前記予定された特性のための前記ペプチド分子を試験する前記ステップは、ハイブリッドシステムを用いて行なわれることを特徴とする請求項98に記載の方法。
- さらに固相支持体で前記ペプチド分子を固定するステップを含むことを特徴とする請求項98記載の方法。
- 混合物から環状ペプチドを精製する方法であって、分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子を含む混合物を準備するステップと、前記結合したスプライシング中間体を特異的に前記アフィニティ標識と結合する配位子を有する固相支持体と混合し、それによって前記支持体が前記スプライシング中間体と特異的に結合するステップと、前記支持体から非特異的結合体を除去するために前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体に前記スプライシング中間体から環状ペプチドを生成させる試薬を添加するステップと、前記支持体から前記環状ペプチドを溶離するステップとを含み、前記ホストシステムにおける前記核酸分子の発現はスプライシング中間体の形態で前記ポリペプチドを生成し、前記スプライシング中間体はアフィニティ標識と結合することを特徴とする、方法。
- 混合物から環状ペプチドを精製する方法であって、分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子を含む混合物を準備するステップと、前記結合したスプライシング中間体を特異的に前記アフィニティ標識と結合する配位子を有する固相支持体と混合し、それによって前記支持体が前記スプライシング中間体と特異的に結合するステップと、前記支持体から非特異的結合体を除去するために前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体から前記スプライシング中間体を溶離するステップと、前記溶離スプライシング中間体に前記スプライシング中間体から環状ペプチドを生成させる試薬を添加するステップとを含み、前記ホストシステムにおける前記核酸分子の発現はスプライシング中間体の形態で前記ポリペプチドを生成し、前記スプライシング中間体はアフィニティ標識と結合することを特徴とする、方法。
- 混合物からスプライシング中間体に結合するターゲット分子を精製する方法であって、特異的に結合するスプライシング中間体を有する固相支持体を準備するステップと、前記支持体を前記混合物中の前記ターゲット分子に接触させるステップと、前記支持体から非特異的結合体を除去するために前記支持体を洗浄するステップと、前記支持体から前記ターゲット分子を溶離するステップとを含み、前記スプライシング中間体は、分離インテインの第1の部分と、分離インテインの第2の部分と、分離インテインの前記第1の部分と分離インテインの前記第2の部分との間に挟まれたターゲットペプチドとからなるポリペプチドをコード化する非自然発生核酸分子にコード化され、前記ホストシステムにおける前記核酸分子の発現はスプライシング中間体の形態で前記ポリペプチドを生成することを特徴とする、方法。
- 分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)と、分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)と、分離インテインの前記カルボキシル末端部分(C−インテイン)と分離インテインの前記アミノ末端部分(N−インテイン)との間に挟まれたターゲットペプチドとを含むポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、(a)前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドと、(b)前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体とからなるグループから選ばれることを特徴とする、細胞。
- 前記ポリペプチドは、前記ホストシステムにおいて自然にスプライシングして前記ターゲットペプチドの環化形を生成するポリペプチドであることを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記ポリペプチドは、前記ターゲットペプチドの環化形のスプライシング中間体であることを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記ターゲットペプチドは、分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)に融合された第1の端と、分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)に融合された第2の端とを有することを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)と、前記分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)とは両方とも自然発生分離インテインであることを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)と、前記分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)とは両方ともSsp DnaEであることを特徴とする、請求項132に記載の細胞。
- 前記分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)と、前記分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)とのうち少なくとも1つは非自然発生分離インテインであることを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記非自然発生分離インテインは、RecA、DnaB、Psp Pol−I、Pfuインテインからなるグループから選ばれることを特徴とする、請求項134に記載の細胞。
- 前記分離インテインのカルボキシル末端部分(C−インテイン)と、前記分離インテインのアミノ末端部分(N−インテイン)とは両方とも非自然発生分離インテインであることを特徴とする、請求項128に記載の細胞。
- 前記スプライシング中間体は活性インテイン中間体であることを特徴とする、請求項130に記載の細胞。
- 前記スプライシング中間体はチオエステル中間体であることを特徴とする、請求項130に記載の細胞。
- 前記スプライシング中間体はラリアット中間体であることを特徴とする、請求項130に記載の細胞。
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