JP4543917B2

JP4543917B2 - Method for analyzing terminal activation rate of polyoxyalkylene derivative

Info

Publication number: JP4543917B2
Application number: JP2004370875A
Authority: JP
Inventors: 叙子高野; 幸三三近
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: JP2005208050A

Description

本発明は、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率の分析方法に関する。さらに詳しくは、ポリペプチド、生理活性タンパク質、酵素などへのポリオキシアルキレン修飾剤や、生分解性ハイドロゲル、リポソーム、ポリマーミセルなどの薬物送達システム（ＤＤＳ）におけるポリオキシアルキレン修飾剤として用いるために、活性基を末端に有するポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率を求める方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing the terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative. More specifically, for use as a polyoxyalkylene modifier for polypeptides, bioactive proteins, enzymes, etc., and as a polyoxyalkylene modifier in drug delivery systems (DDS) such as biodegradable hydrogels, liposomes, and polymer micelles. And a method for determining a terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative having an active group at its terminal.

近年、医薬用途を目的とした高分子化合物の開発が盛んに行われており、そのひとつに末端活性化ポリオキシアルキレン誘導体がある。その主な用途としては、ポリペプチド、生理活性タンパク質や酵素などの生理活性物質への修飾剤や、生分解性ハイドロゲル、リポソーム、ポリマーミセルなどの薬物送達システム（ＤＤＳ）が挙げられる。
修飾剤としての用途では、両親媒性高分子であるポリオキシアルキレン誘導体を生理活性物質に化学修飾し、分子量を増大させ、溶解性を向上させることにより、免疫原性や抗原性、毒性の低減、薬剤の安定性増加、体内滞留時間の延長などの効果を得ることが出来る。 In recent years, polymer compounds for pharmaceutical use have been actively developed, and one of them is a terminal activated polyoxyalkylene derivative. The main uses include modifiers for bioactive substances such as polypeptides, bioactive proteins and enzymes, and drug delivery systems (DDS) such as biodegradable hydrogels, liposomes and polymer micelles.
For use as a modifier, the polyoxyalkylene derivative, an amphiphilic polymer, is chemically modified into a bioactive substance to increase molecular weight and improve solubility, thereby reducing immunogenicity, antigenicity, and toxicity. In addition, effects such as increased drug stability and prolonged residence time in the body can be obtained.

ポリオキシアルキレン誘導体の構造は通常、修飾するタンパク質などの表面に存在するアミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、不飽和結合などの官能基と化学的に結合する活性基をポリオキシアルキレン末端に有する。例えば、アミノ基に対して修飾させる場合はアルデヒド基、アセタール基、パラニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基などの活性基、メルカプト基に対してはメルカプト基、マレイミド基、アリル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基などの活性基、カルボキシル基に対してはメルカプト基、アミノ基などの活性基、不飽和結合に対してはメルカプト基などの活性基をポリオキシアルキレン末端に有する。
しかし、特に低分子薬剤やペプチドを修飾する場合には、ポリオキシアルキレン誘導体と結合させる反応性官能基が少ないため、溶解性の向上などの効果が得られにくいという問題点がある。また、数多くのポリオキシアルキレン誘導体で修飾すると、薬剤やペプチドの活性点を封鎖してしまい、それ自身が持つ機能、薬効を十分に発現できなくなるという問題点がある。そこで近年は、生理活性物質の機能や薬効を低下させずに、最小限の修飾数でも効率的にその効果を得るため、より高分子量のポリオキシアルキレン誘導体が用いられるようになっている。 The structure of the polyoxyalkylene derivative usually has an active group chemically bonded to a functional group such as an amino group, mercapto group, carboxyl group, or unsaturated bond present on the surface of the protein to be modified at the polyoxyalkylene terminal. For example, when modifying amino groups, active groups such as aldehyde groups, acetal groups, paranitrophenyl groups, N-hydroxysuccinimide groups, etc., mercapto groups are mercapto groups, maleimide groups, allyl groups, N-hydroxy groups. The polyoxyalkylene terminal has an active group such as a succinimide group, an active group such as a mercapto group and an amino group for a carboxyl group, and an active group such as a mercapto group for an unsaturated bond.
However, particularly when modifying low molecular weight drugs or peptides, there is a problem that it is difficult to obtain effects such as improved solubility because there are few reactive functional groups to be bonded to the polyoxyalkylene derivative. In addition, when modified with a large number of polyoxyalkylene derivatives, there is a problem that the active sites of drugs and peptides are blocked, and the functions and medicinal properties of the drugs and peptides cannot be fully expressed. Therefore, in recent years, higher molecular weight polyoxyalkylene derivatives have been used in order to efficiently obtain the effect even with the minimum number of modifications without degrading the function and medicinal effect of the physiologically active substance.

一方、生分解性ハイドロゲルなどは薬物の徐放運搬系として利用される。すなわち、ポリオキシアルキレン誘導体などの生体適合性高分子を用いて形成したハイドロゲル中に、難水溶性の生理活性物質などを取り込み、その生分解性を利用して活性物質の放出を制御する。それにより活性成分の血中レベルをコントロールし、より優れた効力、安全性、患者にとっての便宜性をもたらす。
生分解性ハイドロゲルで用いられるポリオキシアルキレン誘導体の構造は通常、分岐状で各末端に活性基を有しており、他のポリオキシアルキレン誘導体または生体適合性ポリマーの末端官能基と互いに架橋結合することにより網目状構造をとる。この架橋結合が分解することにより、生理活性物質が放出される。分解速度はポリオキシアルキレン誘導体の末端活性基数に依存し、それにより生理活性物質の放出をコントロールすることができる。 On the other hand, biodegradable hydrogels and the like are used as a sustained release delivery system for drugs. In other words, a poorly water-soluble physiologically active substance or the like is incorporated into a hydrogel formed using a biocompatible polymer such as a polyoxyalkylene derivative, and the release of the active substance is controlled using its biodegradability. This controls the blood level of the active ingredient, resulting in better efficacy, safety and patient convenience.
The structure of polyoxyalkylene derivatives used in biodegradable hydrogels is usually branched and has an active group at each end, and is cross-linked with the other polyoxyalkylene derivative or the terminal functional group of the biocompatible polymer. By doing so, a network structure is taken. The bioactive substance is released by the decomposition of the cross-linked bond. The degradation rate depends on the number of terminal active groups of the polyoxyalkylene derivative, and thereby the release of the physiologically active substance can be controlled.

このような末端活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体は、ポリオキシアルキレンの末端ヒドロキシル基に活性基を結合（末端活性化）することにより合成される。この末端活性化反応における反応率は末端活性化率と呼ばれる。言い換えると、末端活性化率とは、ポリオキシアルキレン誘導体の末端ヒドロキシル基数に対する、末端ヒドロキシル基に結合した活性基の百分率比である。 Such a polyoxyalkylene derivative having a terminal active group is synthesized by bonding an active group to the terminal hydroxyl group of polyoxyalkylene (terminal activation). The reaction rate in this terminal activation reaction is called terminal activation rate. In other words, the terminal activation rate is a percentage ratio of the active group bonded to the terminal hydroxyl group to the number of terminal hydroxyl groups of the polyoxyalkylene derivative.

修飾剤の用途におけるポリオキシアルキレン誘導体は、薬物との高い反応性が要求されることから、末端活性化率は極めて高いものが要求される。よって、このようなポリオキシアルキレン誘導体を評価する分析法についても、正確で高い精度が求められる。
生分解性ハイドロゲルなどの用途では、分解速度はポリオキシアルキレン誘導体の末端活性基数によりコントロールすることができる。生理活性物質の放出を正確に制御するために、末端活性化率を正確に求めることが必要とされる。
また、医薬品の生理活性や安全性は、製剤中に含まれる不純物にも依存することから、目的化合物と異なる分子量や異なる活性基数を持つ不純物などの含有量は低いものが要求され、さらにそれらの不純物と分離して目的のポリオキシアルキレン誘導体のみを特異的に定量できることが要求される。
このように、末端活性ポリオキシアルキレン誘導体を用いた製剤を設計する際に、末端活性化率は極めて重要な分析項目の一つであり、正確かつ高い精度、さらに不純物との特異性を有することが重要といえる。 The polyoxyalkylene derivative in the use of the modifier is required to have a very high terminal activation rate since high reactivity with the drug is required. Therefore, an analysis method for evaluating such a polyoxyalkylene derivative is also required to be accurate and highly accurate.
In applications such as biodegradable hydrogels, the degradation rate can be controlled by the number of terminal active groups of the polyoxyalkylene derivative. In order to accurately control the release of the physiologically active substance, it is necessary to accurately determine the end activation rate.
In addition, since the physiological activity and safety of pharmaceuticals depend on the impurities contained in the drug product, the content of impurities such as impurities having a different molecular weight or different number of active groups from the target compound is required. It is required to be able to specifically quantify only the target polyoxyalkylene derivative by separating from impurities.
Thus, when designing a preparation using a terminally active polyoxyalkylene derivative, the terminal activation rate is one of the most important analytical items, and it must have high accuracy and specificity with impurities. Is important.

ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率を求める、古くから知られている方法に滴定法があるが、一般に分析誤差が大きく、また分析試料の分子量が高いほどその誤差の影響は大きくなってしまう、という問題があった。
近年は、簡便かつ短時間で分析が可能である^１Ｈ−ＮＭＲ法が最も数多くのポリオキシアルキレン末端活性化率の分析手段として用いられている。たとえばポリオキシアルキレン末端マレイミド体の末端活性化率は、マレイミド基の水素ピークの理論積分値に対する実際の積分値から算出している（特許文献１）。
米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号明細書 There is a titration method as a long-known method for determining the terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative, but generally the analysis error is large, and the higher the molecular weight of the analysis sample, the greater the effect of the error. There was a problem.
In recent years, the ¹ H-NMR method, which is simple and can be analyzed in a short time, has been used as the most numerous means for analyzing polyoxyalkylene terminal activation rates. For example, the terminal activation rate of a polyoxyalkylene-terminated maleimide body is calculated from an actual integrated value with respect to a theoretical integrated value of a hydrogen peak of a maleimide group (Patent Document 1).
US Patent Application Publication No. 2001/0044526

その他によく用いられている方法として、分析対象となる末端活性基に適した発色試薬でラベル化した後、特定の波長で吸光度を測定し、先に作成した標準体の検量線を用いて活性化率を算出する方法（吸光度法）がある。例えば末端メルカプト基の定量法としては２，２−ジチオピリジンや４，４−ジチオピリジンのような発色試薬と反応させた後、波長４１０ｎｍでの吸光度を測定する方法が良く知られており、ポリオキシアルキレン誘導体にも応用されている（非特許文献１）。また、末端ｐ−ニトロフェニルカルバメート基を持つポリオキシアルキレン誘導体は、塩基性溶液中で完全に加水分解させた後、遊離したｐ−ニトロフェノールを波長４００ｎｍで吸光度を測定し定量することにより、末端活性化率を求めている（非特許文献２）。同様に末端アルデヒド基を持つポリオキシアルキレン誘導体では、Ｓｃｈｉｆｆ試薬を用いた吸光度法が用いられている（非特許文献３）。
ＳｈｍｕｅｌＺａｌｉｐｓｋｙ, Ｉｎｔ. Ｊ. ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ. ３０, １９８７, ７４０Ｆ.Ｍ.Ｖｅｒｏｎｅｓｅ, ｅｔａｌ, ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １１, １４１(１９８５) Ｊ. ＭｉｌｔｏｎＨａｒｒｉｓ, ｅｔａｌ, ＰｏｌｙｍｅｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙＥｄｉｔｉｏｎ, ２２, ３４１(１９８４) As another commonly used method, after labeling with a coloring reagent suitable for the terminal active group to be analyzed, the absorbance is measured at a specific wavelength and activated using the calibration curve of the standard prepared previously. There is a method (absorbance method) for calculating the conversion rate. For example, as a method for quantifying a terminal mercapto group, a method of measuring absorbance at a wavelength of 410 nm after reacting with a coloring reagent such as 2,2-dithiopyridine and 4,4-dithiopyridine is well known. It is also applied to oxyalkylene derivatives (Non-patent Document 1). A polyoxyalkylene derivative having a terminal p-nitrophenyl carbamate group is obtained by completely hydrolyzing in a basic solution, and then measuring the absorbance of the released p-nitrophenol at a wavelength of 400 nm and quantifying it. The activation rate is calculated | required (nonpatent literature 2). Similarly, for a polyoxyalkylene derivative having a terminal aldehyde group, an absorbance method using a Schiff reagent is used (Non-patent Document 3).
Shmuel Zalipsky, Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 740 F. M. Veronese, et al, Applied Biochemistry and Biotechnology, 11, 141 (1985). J. Milton Harris, et al, Polymer Chemistry Edition, 22, 341 (1984).

しかし、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率を^１Ｈ−ＮＭＲ測定で求める場合、分析試料の分子量が大きくなるほど、ポリオキシアルキレン鎖中のプロトンピークのマルチプレットが大きくなり、ノイズの増大やベースラインのゆがみなどに影響を与える。そのため高分子量のポリオキシアルキレン誘導体ほど、末端活性化率を求めるときの測定誤差が非常に大きくなってしまうという問題があった。 However, when determining the terminal activation rate of the polyoxyalkylene derivative by ¹ H-NMR measurement, the larger the molecular weight of the analytical sample, the larger the proton peak multiplet in the polyoxyalkylene chain, resulting in increased noise and baseline. Affects distortions. For this reason, the higher the molecular weight polyoxyalkylene derivative, the greater the measurement error when determining the terminal activation rate.

一方、吸光度法は、^１Ｈ−ＮＭＲ法と比べると、一般に測定誤差は少なく、高分子量でも誤差が大きくなることはない。しかしこの方法における活性化率は、モル吸光係数および分析試料の分子量から算出しており、この分子量はあらかじめ水酸基価やGPC分析などにより測定しているため、その測定誤差が活性化率に大きな分析誤差を与えるという問題点がある。また、目的分子量よりも低分子量または高分子量の末端活性化体が不純物として存在する場合、測定結果は実際の活性化率から大きく乖離する。 On the other hand, the absorbance method generally has a smaller measurement error than the ¹ H-NMR method, and the error does not increase even with a high molecular weight. However, the activation rate in this method is calculated from the molar extinction coefficient and the molecular weight of the analytical sample. Since this molecular weight is measured in advance by the hydroxyl value or GPC analysis, the measurement error greatly analyzes the activation rate. There is a problem of giving an error. In addition, when a terminal activated substance having a molecular weight lower than that of the target molecular weight or a high molecular weight is present as an impurity, the measurement result greatly deviates from the actual activation rate.

通常、ポリオキシアルキレン誘導体を合成する際、原料のポリオキシアルキレンの末端水酸基に活性基を持つ低分子化合物を結合させる方法が用いられているので、生成物中に活性基を持つ低分子化合物が残存することが多い。しかしこのような分析試料の末端活性化率を、吸光度法を用いて測定すると、発色試薬は残存する活性基を持つ低分子化合物とも反応するため、実際よりも高い活性化率が得られてしまう。 Usually, when synthesizing a polyoxyalkylene derivative, a method is used in which a low molecular weight compound having an active group is bonded to the terminal hydroxyl group of the starting polyoxyalkylene. Often remains. However, when the terminal activation rate of such an analytical sample is measured using the absorbance method, the coloring reagent reacts with the low molecular weight compound having the remaining active group, so that a higher activation rate than actual can be obtained. .

また、^１Ｈ−ＮＭＲ法や吸光度法で求められる末端活性化率は全末端官能基数に対する活性化された官能基数の割合でしか示されないため、たとえば構造的に対称で等価な2つ以上の活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体の場合、活性化された官能基数ごとの含有率を求めることはできない。また、分析対象と同じ活性基を持ち、異なる分子量の不純物が含まれている場合についてもそれらを分離することができない。たとえば、片末端活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体の製造時、目的分子量の二倍分子量の両末端活性化体が副生することが多い。このような両末端活性化体は、生理活性物質との修飾反応において、架橋反応を引き起こすため、特に好ましくない。しかし、上記の理由により、それらは目的の物質と分離して定量することはできない。 In addition, since the terminal activation rate obtained by ¹ H-NMR method or absorbance method is only shown by the ratio of the number of activated functional groups to the total number of terminal functional groups, for example, two or more structurally symmetrical and equivalent activities In the case of a polyoxyalkylene derivative having a group, the content of each activated functional group cannot be determined. Further, even when impurities having the same active group as the analysis target and different molecular weights are contained, they cannot be separated. For example, when a polyoxyalkylene derivative having a single-terminal active group is produced, a double-terminal activated product having a molecular weight twice the target molecular weight is often by-produced. Such a double-terminal activated product is not particularly preferable because it causes a crosslinking reaction in a modification reaction with a physiologically active substance. However, for the reasons described above, they cannot be quantified separately from the target substance.

本発明は、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率を求める分析方法において、ポリオキシアルキレン誘導体が高分子量であっても、あるいは目的物と異なる末端活性化体が不純物として存在する場合であっても、高精度で測定できる分析方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to an analytical method for determining the terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative, even if the polyoxyalkylene derivative has a high molecular weight or a terminal activated product different from the target product is present as an impurity. An object of the present invention is to provide an analysis method capable of measuring with high accuracy.

本発明は、末端に生理活性物質と化学結合する末端活性基を有し、分子量が１０００〜１０００００でポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率分析方法であって、イオン性官能基を持つラベル化試薬にて末端活性基をラベル化した後、イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーで分析を行い、ＲＩ検出器で得られるクロマトグラムにおける面積百分率より、末端活性化率を求めることを特徴とする。 The present invention relates to a method for analyzing a terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative having a terminal active group chemically bonded to a physiologically active substance at the terminal and having a molecular weight of 1000 to 100,000, and having an ionic functional group After the terminal active group is labeled with, the analysis is performed by liquid chromatography using an ion exchange column, and the terminal activation rate is obtained from the area percentage in the chromatogram obtained by the RI detector.

本発明は、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率の測定において、次の作用効果が得られる画期的な分析方法であり、医薬品等の分野においても標準的な分析方法となる可能性を有しており、産業上きわめて有用なものである。
（１）ポリオキシアルキレン誘導体が高分子量であっても正確かつ高精度で測定できる。
（２）ポリオキシアルキレン誘導体中に低分子不純物が存在する場合には、この低分子量不純物による定量の妨害を受けにくい。
（３）ポリオキシアルキレン誘導体中に、目的分子量と異なる分子量の末端活性化体が不純物として含まれる場合、目的分子量の誘導体および不純物をそれぞれを分離定量することができる。
（４）ポリオキシアルキレン誘導体が多官能末端活性基を持つ場合（複数の末端活性化率を有する場合）には、活性化された官能基数ごとの含有率をそれぞれ測定することができる。 The present invention is an epoch-making analytical method capable of obtaining the following effects in measuring the terminal activation rate of a polyoxyalkylene derivative, and may be a standard analytical method in the field of pharmaceuticals and the like. It is extremely useful in industry.
(1) Even if the polyoxyalkylene derivative has a high molecular weight, it can be measured accurately and with high accuracy.
(2) In the case where low molecular impurities are present in the polyoxyalkylene derivative, it is not easily disturbed by the determination by the low molecular weight impurities.
(3) When a polyoxyalkylene derivative contains a terminal activated product having a molecular weight different from the target molecular weight as an impurity, the target molecular weight derivative and the impurity can be separated and quantified.
(4) When the polyoxyalkylene derivative has a polyfunctional terminal active group (when it has a plurality of terminal activation ratios), the content for each activated functional group number can be measured.

以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明の分析対象となるポリオキシアルキレン誘導体のポリオキシアルキレン骨格は、直鎖状でも分岐状でも良い。本発明の分析方法では、従来の^１Ｈ−ＮＭＲ法や吸光度法とは違い、特に複数の末端活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体において、活性化された官能基数ごとの含有率をそれぞれ求めることができることから、分岐状で２以上の末端活性基を有することが好ましい。末端活性化率数の上限は特にないが、例えば、最大１４個の末端活性化率を有する場合でも分析の可能性がある。典型的には、末端活性基数が２、３あるいは４個である。 The present invention is described in detail below.
The polyoxyalkylene skeleton of the polyoxyalkylene derivative to be analyzed in the present invention may be linear or branched. In the analysis method of the present invention, unlike the conventional ¹ H-NMR method or absorbance method, in particular, in the polyoxyalkylene derivative having a plurality of terminal active groups, the content for each number of activated functional groups can be determined. Since it can do, it is preferable that it is branched and has 2 or more terminal active groups. The upper limit of the number of terminal activation rates is not particularly limited. For example, even when the number of terminal activation rates is 14 at the maximum, analysis is possible. Typically, the number of terminal active groups is 2, 3 or 4.

ポリオキシアルキレン骨格は、好ましくは炭素数２〜４のオキシアルキレン基からなり、具体的にはオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。なお、これらを１種または２種以上を用いても良い。２種以上のオキシアルキレン基を付加するときのその付加状態は、ブロック状でもランダム状でも良い。また、本分析法の測定を精度良く行うためには、分析対象となるポリオキシアルキレン誘導体は水溶性を有することが好ましい。そのため、ポリオキシアルキレン誘導体のオキシアルキレン骨格にオキシエチレン基が５０モル％以上含まれていることが好ましく、より好ましくは８０モル％以上、さらに好ましくは１００モル％である。 The polyoxyalkylene skeleton preferably comprises an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms, and specific examples include an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxybutylene group, and an oxytetramethylene group. In addition, you may use these 1 type or 2 types or more. When two or more oxyalkylene groups are added, the addition state may be block or random. Moreover, in order to perform the measurement of this analysis method with high accuracy, it is preferable that the polyoxyalkylene derivative to be analyzed has water solubility. Therefore, the oxyalkylene skeleton of the polyoxyalkylene derivative preferably contains 50 mol% or more of oxyethylene groups, more preferably 80 mol% or more, and still more preferably 100 mol%.

ポリオキシアルキレン誘導体の分子量は１０００〜１０００００で、好ましくは５０００〜１０００００である。本発明は、従来の滴定法や^１Ｈ−ＮＭＲ法とは異なり、高分子量でも高い精度で分析することが可能である。たとえば片末端に活性基を持つ直鎖状ポリオキシアルキレン誘導体の場合、分子量が１０００より大きくなると、滴定法では測定誤差が大きくなり、本発明による効果が必要となる。 The molecular weight of the polyoxyalkylene derivative is 1,000 to 100,000, preferably 5,000 to 100,000. Unlike the conventional titration method and ¹ H-NMR method, the present invention can analyze with high accuracy even at a high molecular weight. For example, in the case of a linear polyoxyalkylene derivative having an active group at one end, if the molecular weight is larger than 1000, the measurement error increases in the titration method, and the effect of the present invention is necessary.

本発明の分析対象となるポリオキシアルキレン誘導体は、末端にタンパク質やポリペプチド、薬物などの生理活性物質と特異的に反応する活性基を有する。末端活性基として具体的には、アルデヒド基、ニトロフェニルカルバメート基、メルカプト基、マレイミド基、アリル基、アミノ基、カルボキシル基などが挙げられ、好ましくはアルデヒド基、ニトロフェニルカルバメート基、メルカプト基、マレイミド基、アリル基が挙げられる。これらの活性基は一般に、反応触媒の添加を必要とせず、修飾目的の生理活性物質と混合するだけで容易に反応し、安定な反応化合物が得られる。また、末端活性基を２以上有するポリオキシアルキレン誘導体の場合、異なる末端活性基を有していても良い。 The polyoxyalkylene derivative to be analyzed in the present invention has an active group that specifically reacts with a physiologically active substance such as a protein, polypeptide, or drug at the terminal. Specific examples of the terminal active group include an aldehyde group, a nitrophenyl carbamate group, a mercapto group, a maleimide group, an allyl group, an amino group, and a carboxyl group, and preferably an aldehyde group, a nitrophenyl carbamate group, a mercapto group, and a maleimide group. Group and allyl group. In general, these active groups do not require the addition of a reaction catalyst, and can be easily reacted simply by mixing with a physiologically active substance to be modified to obtain a stable reactive compound. Further, in the case of a polyoxyalkylene derivative having two or more terminal active groups, it may have different terminal active groups.

本発明の分析方法では、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性基に対して、イオン性官能基を持つラベル化試薬を用いてラベル化を行う。
イオン性官能基はカルボキシル基またはアミノ基が挙げられ、それぞれのラベル化試薬の構造は式（５）または式（６）で表すことができる。なお、式（５）、式（６）においてイオン性官能基は２つ以上有していても良い。
Ｘ−Ｙ−ＣＯＯＨ（５）
Ｘ−Ｙ−NH₂ （６） In the analysis method of the present invention, the terminal active group of the polyoxyalkylene derivative is labeled using a labeling reagent having an ionic functional group.
Examples of the ionic functional group include a carboxyl group and an amino group, and the structure of each labeling reagent can be represented by formula (5) or formula (6). In formulas (5) and (6), two or more ionic functional groups may be present.
XY-COOH (5)
_{X-Y-NH 2 (6} )

Ｘ基はポリオキシアルキレン誘導体の末端活性基と特異的に反応する官能基であれば任意に用いることができる。具体的には、末端活性基がマレイミド基や末端アリル基の場合は、Ｘ基がメルカプト基であるラベル化試薬が好ましい。末端活性基がメルカプト基の場合はＸ基がマレイミド基、アリル基を持つラベル化試薬が好ましい。アルデヒド基やパラニトロフェニルカルバメート基などアミノ基と特異的に反応する末端活性基の場合は、式（６）のラベル化試薬では交差反応が起こって好ましくないため、式（５）のＸ基がアミノ基であるラベル化試薬を用いることが好ましい。 The X group can be arbitrarily used as long as it is a functional group that specifically reacts with the terminal active group of the polyoxyalkylene derivative. Specifically, when the terminal active group is a maleimide group or a terminal allyl group, a labeling reagent in which the X group is a mercapto group is preferable. When the terminal active group is a mercapto group, a labeling reagent having a maleimide group or an allyl group as the X group is preferable. In the case of a terminal active group that specifically reacts with an amino group, such as an aldehyde group or a paranitrophenylcarbamate group, a cross-reaction occurs in the labeling reagent of formula (6), which is not preferable. It is preferable to use a labeling reagent that is an amino group.

Ｘ基とカルボキシル基またはアミノ基の結合部位（Ｙ）には炭素数１〜２４の飽和または不飽和炭化水素基を任意に用いることができ、好ましくは炭素数１〜１２の飽和または不飽和炭化水素基、さらに好ましくは紫外吸収や蛍光吸収を持つ不飽和炭化水素基が用いられる。炭素数が１２より大きい場合は、ラベル化反応が進行しにくい可能性がある。Ｙが紫外吸収や蛍光吸収を持つ不飽和炭化水素基の場合、ラベル化反応後のHPLC分析において紫外吸光検出器や蛍光検出器を併用することができるため、より高感度の分析を行うことが可能である。紫外吸収や蛍光吸収を持つ不飽和炭化水素基として具体的には特にフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、アクリジニル基などが挙げられる。 A saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms can be arbitrarily used for the binding site (Y) of the X group and the carboxyl group or amino group, preferably a saturated or unsaturated carbon group having 1 to 12 carbon atoms. A hydrogen group, more preferably an unsaturated hydrocarbon group having ultraviolet absorption or fluorescence absorption is used. If the number of carbon atoms is greater than 12, the labeling reaction may not proceed easily. When Y is an unsaturated hydrocarbon group having ultraviolet absorption or fluorescence absorption, an ultraviolet absorption detector or a fluorescence detector can be used in combination with the HPLC analysis after the labeling reaction. Is possible. Specific examples of the unsaturated hydrocarbon group having ultraviolet absorption or fluorescence absorption include a phenyl group, a naphthyl group, an anthracenyl group, and an acridinyl group.

カルボキシル基を有するラベル化試薬（５）について具体的に例を挙げると、末端アルデヒド基や末端アセタール基の場合には、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシンなどのアミノ酸、ｐ−アミノ安息香酸などを用いることができ、好ましくはグリシン、ｐ−アミノ安息香酸である。末端ニトロフェニルカルバメート基や末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基の場合には、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、アミノカプロン酸、ｐ−アミノ安息香酸などを用いることができ、好ましくはグリシン、アラニン、アミノカプロン酸である。末端メルカプト基の場合には、マレイミドプロピオン酸などが挙げられる。末端マレイミド基や末端アリル基の場合には、メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、メルカプトナフチル酢酸、チオサリチル酸などが挙げられる。 Specific examples of the labeling reagent (5) having a carboxyl group include amino acids such as glycine, alanine, phenylalanine and tyrosine, p-aminobenzoic acid and the like in the case of a terminal aldehyde group or terminal acetal group. Preferred is glycine or p-aminobenzoic acid. In the case of a terminal nitrophenyl carbamate group or a terminal N-hydroxysuccinimide group, glycine, alanine, phenylalanine, tyrosine, aminocaproic acid, p-aminobenzoic acid, etc. can be used, preferably glycine, alanine, aminocaproic acid. . In the case of a terminal mercapto group, maleimidopropionic acid and the like can be mentioned. In the case of a terminal maleimide group or a terminal allyl group, mercaptopropionic acid, mercaptoacetic acid, mercaptonaphthylacetic acid, thiosalicylic acid and the like can be mentioned.

アミノ基を有するラベル化試薬（６）について具体的に例を挙げると、末端メルカプト基の場合には、アニリノナフチルマレイミド、アリルアミン、２−メチルアリルアミンなどが挙げられる。末端マレイミド基や末端アリル基の場合には、チオエタノールアミン塩酸塩などが挙げられる。 Specific examples of the labeling reagent (6) having an amino group include anilinonaphthylmaleimide, allylamine, 2-methylallylamine and the like in the case of a terminal mercapto group. In the case of a terminal maleimide group or a terminal allyl group, thioethanolamine hydrochloride and the like can be mentioned.

本発明で用いるラベル化反応は、末端活性化率を正確に測定するため、定量的に反応が進行し、分解や副反応が起こらずに安定なラベル化体が得られる方法であることが重要となる。また、できるだけ操作が簡便であることが望ましい。ラベル化反応の条件について以下に詳しく説明する。 It is important that the labeling reaction used in the present invention is a method in which the reaction proceeds quantitatively and a stable labeled product can be obtained without causing decomposition or side reactions in order to accurately measure the terminal activation rate. It becomes. It is desirable that the operation is as simple as possible. The conditions for the labeling reaction will be described in detail below.

ラベル化試薬の添加量は、定量的なラベル化反応を行うため、ポリオキシアルキレン誘導体に対して過剰量であれば任意であるが、好ましくは５〜５０等量、より好ましくは５〜２０等量である。なお、二官能または多官能の末端活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体の場合は、官能基数に応じて過剰量を調整することが好ましい。 The addition amount of the labeling reagent is arbitrary as long as it is an excess amount with respect to the polyoxyalkylene derivative in order to perform a quantitative labeling reaction, preferably 5 to 50 equivalents, more preferably 5 to 20 etc. Amount. In the case of a polyoxyalkylene derivative having a bifunctional or polyfunctional terminal active group, it is preferable to adjust the excess amount according to the number of functional groups.

必要に応じて、トリエチルアミン、ピリジンなどの塩基触媒を加えることもできる。特に末端アルデヒド基の場合には、ラベル化試薬とともに水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウムなどの還元剤試薬をラベル化試薬の等モル以上加えることにより、還元的アルキル化反応を行い、極めて安定なラベル化体を得ることができる。 If necessary, a base catalyst such as triethylamine or pyridine may be added. Especially in the case of terminal aldehyde groups, a reductive alkylation reaction is performed by adding a reductant reagent such as sodium borohydride and sodium cyanoborohydride together with the labeling reagent in an equimolar amount or more. Can be obtained.

反応溶媒は、ラベル化試薬の溶解性、反応性に応じ、水、緩衝液、有機溶媒またはこれらを混合して用いることができる。
緩衝液の種類およびそのｐＨは任意であり、ポリオキシアルキレン誘導体とラベル化試薬の反応性に応じて決定できる。例えば、末端アルデヒド基誘導体で還元的アルキル化反応を用いる場合、使用するラベル化試薬のアミノ基のｐＫａ（解離定数）より低いｐＨ条件下で反応することが好ましい。
緩衝液の塩濃度は任意であるが、通常１０〜５００ｍMで用いることができ、好ましくは５０〜３００ｍMが望ましい。１０ｍMより低い塩濃度では、ラベル化試薬の使用が過剰の場合、緩衝能が働かない可能性がある。 As the reaction solvent, water, a buffer solution, an organic solvent, or a mixture thereof can be used depending on the solubility and reactivity of the labeling reagent.
The type of buffer and its pH are arbitrary and can be determined according to the reactivity of the polyoxyalkylene derivative and the labeling reagent. For example, when a reductive alkylation reaction is used with a terminal aldehyde group derivative, the reaction is preferably performed under a pH condition lower than the pKa (dissociation constant) of the amino group of the labeling reagent to be used.
Although the salt concentration of a buffer solution is arbitrary, it can be normally used at 10-500 mM, Preferably 50-300 mM is desirable. At salt concentrations below 10 mM, the buffer capacity may not work if the labeling reagent is used in excess.

有機溶媒としてはポリオキシアルキレン誘導体およびラベル化試薬が可溶な溶媒であれば任意であり、メタノール、エタノール、アセトニトリル、２−メトキシエタノール、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等が挙げられる。末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基や末端パラニトロフェニルカルバメート基など、水や緩衝液中で速やかに加水分解が起こる活性基の場合は、有機溶媒のみを使用することも有効である。 The organic solvent is arbitrary as long as the polyoxyalkylene derivative and the labeling reagent are soluble, and examples thereof include methanol, ethanol, acetonitrile, 2-methoxyethanol, dioxane, methylene chloride, chloroform, benzene, toluene and the like. In the case of an active group that rapidly undergoes hydrolysis in water or a buffer solution such as a terminal N-hydroxysuccinimide group or a terminal paranitrophenyl carbamate group, it is also effective to use only an organic solvent.

反応溶媒の使用量は任意であるが、通常、ポリオキシアルキレン誘導体の１０〜１０００重量％、好ましくは２０〜５００重量％が望ましい。１０重量％より少ない場合は粘性の上昇により反応率が低くなる、また末端アルデヒド基の場合におけるアルデヒド基どうしの縮合反応や末端メルカプト基の場合におけるメルカプト基どうしのジスルフィド結合反応が起こる可能性があり、これらはラベル化反応を妨害する要因となる。また１０００重量％より多い場合も反応率が低くなる可能性がある。
反応温度、反応時間は任意であり、ラベル化反応に適した条件を決定することができる。 The amount of the reaction solvent used is arbitrary, but usually 10 to 1000% by weight, preferably 20 to 500% by weight of the polyoxyalkylene derivative is desirable. When the amount is less than 10% by weight, the reaction rate decreases due to an increase in viscosity, and there is a possibility that a condensation reaction between aldehyde groups in the case of terminal aldehyde groups or a disulfide bond reaction between mercapto groups in the case of terminal mercapto groups may occur. These are factors that interfere with the labeling reaction. Moreover, when it is more than 1000% by weight, the reaction rate may be lowered.
The reaction temperature and reaction time are arbitrary, and conditions suitable for the labeling reaction can be determined.

その他、末端マレイミド基の場合や、末端メルカプト基のラベル化試薬にマレイミド基を有する試薬を用いた場合などは、光による重合を防ぐため、遮光下で行うことが好ましい。 In addition, in the case of a terminal maleimide group, or when a reagent having a maleimide group is used as a labeling reagent for the terminal mercapto group, it is preferable to carry out under light shielding in order to prevent polymerization by light.

上記操作にてラベル化したポリオキシアルキレン誘導体反応溶液は、そのまま高速液体クロマトグラフィーのサンプルとし、迅速かつ簡便に分析することができるが、ゲルろ過カラムを用いて脱塩処理を行う方が好ましい。ゲルろ過カラムは分子量１０００以下の低分子物質を分離することができるものであれば任意である。脱塩処理は以下の操作により行う。まず高速液体クロマトグラフィー分析における溶離液とする緩衝液でゲルろ過カラムを平衡化した後、ラベル化反応溶液を添加する。さらに溶離液を加えて先に溶出する高分子量体分画を分取し、これを分析サンプルとする。この脱塩処理を行うことにより、反応溶液中に含まれる過剰のラベル化試薬などの低分子試薬を除去し、イオン交換カラムへの吸着汚染を防ぐことができる。また高速液体クロマトグラフィーの分析では一般に、溶離液とサンプル溶解液が異なる場合に定量を妨害するゴーストピークが溶出する場合があるが、この脱塩処理を行うことにより、サンプル溶解液を反応溶媒から溶離液へ交換することができるため、ゴーストピークを防ぎ、正確に定量を行うことができる。 The polyoxyalkylene derivative reaction solution labeled by the above operation can be used as a sample for high performance liquid chromatography as it is, and can be analyzed quickly and easily. However, it is preferable to perform a desalting treatment using a gel filtration column. The gel filtration column is optional as long as it can separate a low molecular weight material having a molecular weight of 1000 or less. The desalting treatment is performed by the following operation. First, after equilibrating a gel filtration column with a buffer solution as an eluent in high performance liquid chromatography analysis, a labeling reaction solution is added. Further, an eluent is added to collect a high molecular weight fraction that elutes first, and this is used as an analysis sample. By performing this desalting treatment, it is possible to remove low-molecular-weight reagents such as excess labeling reagent contained in the reaction solution and prevent adsorption contamination to the ion exchange column. In high-performance liquid chromatography analysis, generally, a ghost peak that interferes with quantification may be eluted when the eluent and the sample solution are different. By performing this desalting treatment, the sample solution is removed from the reaction solvent. Since the eluent can be exchanged, a ghost peak can be prevented and accurate quantification can be performed.

ラベル化することによりイオン性を付与したポリオキシアルキレン誘導体を、続いてイオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにて分離し、測定を行う。測定条件について以下に詳しく説明する。 The polyoxyalkylene derivative imparted with ionicity by labeling is subsequently separated by high performance liquid chromatography using an ion exchange column and measured. The measurement conditions will be described in detail below.

イオン交換カラムは、ラベル化試薬（５）を用いたラベル化反応物は陰イオン交換カラムを用いる。ラベル化試薬（６）を用いたラベル化反応物は陽イオン交換カラムを用いる。イオン交換カラムは、通常長さ５〜３０ｃｍ、内径２〜１０ｍｍ程度のステンレス製のものを用いることができ、この中に陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー充填剤を充填して用いるものまたは既にこれらが充填されたものを用いることができる。 As the ion exchange column, an anion exchange column is used as a labeling reaction product using the labeling reagent (5). A cation exchange column is used for the labeling reaction product using the labeling reagent (6). As the ion exchange column, a stainless steel column having a length of about 5 to 30 cm and an inner diameter of about 2 to 10 mm can be used, which is used by packing an anion or cation exchange chromatography packing material therein or has already been used. Can be used.

陰イオン交換クロマトグラフィー充填剤は、陰イオン交換官能基としてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基または第４級アンモニウム基を持つものを用いることができ、好ましくはＤＥＡＥ基を用いることができる。陽イオン交換クロマトグラフィー充填剤は、陽イオン交換官能基としてスルホプロピル（ＳＰ）基またはカルボキシメチル（ＣＭ）基を持つものを用いることができ、好ましくはスルホプロピル基を用いることができる。これらのイオン交換基を有する基材としては、ポリマー系ゲルまたはシリカ系のゲルを用いることができる。ポリマー系ゲルはポリアクリレート系のような親水性ゲルとポリスチレン系のような疎水性ゲルがあり、特に親水性高分子であるポリオキシアルキレン誘導体の分離に適している親水性ポリマー系ゲル基材を用いることが好ましい。 As the anion exchange chromatography filler, those having a diethylaminoethyl (DEAE) group or a quaternary ammonium group as an anion exchange functional group can be used, and preferably a DEAE group can be used. As the cation exchange chromatography packing material, those having a sulfopropyl (SP) group or a carboxymethyl (CM) group as a cation exchange functional group can be used, and preferably a sulfopropyl group can be used. As the base material having these ion exchange groups, a polymer gel or a silica gel can be used. There are two types of polymer gels: hydrophilic gels such as polyacrylates and hydrophobic gels such as polystyrenes. The polymer gels are particularly suitable for the separation of polyoxyalkylene derivatives that are hydrophilic polymers. It is preferable to use it.

溶離液は、用いるイオン交換カラムの分離に適した緩衝液であれば任意であり、具体的には、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、モノエタノールアミン−塩酸緩衝液などを任意に選択できる。陰イオン交換カラムを用いる場合、好ましくはギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、より好ましくはギ酸緩衝液を用いることができ、陽イオン交換カラムを用いる場合、好ましくはリン酸緩衝液を用いることができる。これらの緩衝液のように、緩衝作用を持つイオンがイオン交換体と同じ電荷を持つものの方が、より効果的に分離することができる。 The eluent is not particularly limited as long as it is a buffer suitable for separation of the ion exchange column to be used. Specifically, formate buffer, acetate buffer, phosphate buffer, carbonate buffer, borate buffer, glycine A buffer solution, Tris-hydrochloric acid buffer solution, monoethanolamine-hydrochloric acid buffer solution and the like can be arbitrarily selected. When using an anion exchange column, a formate buffer, an acetate buffer, more preferably a formate buffer can be used, and when using a cation exchange column, a phosphate buffer can be preferably used. Like these buffer solutions, ions having a buffering action having the same charge as the ion exchanger can be separated more effectively.

また緩衝液に塩水溶液や有機溶媒またはこれら両方を任意に混合して用いても良い。塩水溶液としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムなどの塩水溶液を用いることができる。有機溶媒としては、水と容易に混和するメタノール、エタノール、アセトニトリルなどを用いることができ、その濃度は０〜５０体積％の範囲で混合することができる。 Further, a salt solution, an organic solvent, or both of them may be arbitrarily mixed in the buffer solution. As the salt aqueous solution, a salt aqueous solution of sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate or the like can be used. As the organic solvent, methanol, ethanol, acetonitrile, etc. easily mixed with water can be used, and the concentration can be mixed in the range of 0 to 50% by volume.

溶離液のｐＨは使用するカラムの適用範囲内において任意であり、通常２．０〜１２．０の範囲で用いられる。陰イオン交換カラムを用いる場合にはｐＨ７．０〜１０．０、陽イオン交換カラムを用いる場合にはｐＨ４．０〜８．０の範囲で用いることが好ましい。 The pH of the eluent is arbitrary within the application range of the column to be used, and is usually in the range of 2.0 to 12.0. When an anion exchange column is used, the pH is preferably 7.0 to 10.0, and when a cation exchange column is used, the pH is preferably 4.0 to 8.0.

溶離液の緩衝液塩濃度は本発明において重要な条件の一つであり、ポリオキシアルキレン誘導体の構造および分子量によって適切な緩衝液塩濃度を設定する必要がある。一般にイオン交換カラムでは物質のイオン性の大きさの違いにより分離を行う。さらに分離度は溶離液として用いる緩衝液濃度によって調節することが可能である。 The buffer salt concentration of the eluent is one of the important conditions in the present invention, and it is necessary to set an appropriate buffer salt concentration depending on the structure and molecular weight of the polyoxyalkylene derivative. In general, in an ion exchange column, separation is performed based on the difference in ionic size of a substance. Furthermore, the degree of separation can be adjusted by the concentration of the buffer used as the eluent.

本分析方法の発明にあたり、優れた定量性および再現性が得られるピーク分離を得るために必要な、溶離液の緩衝液濃度の検討を行った。その結果、最適な緩衝液濃度はポリオキシアルキレン誘導体の一官能基あたりの分子量と相関が得られることがわかった。すなわち、緩衝液濃度は以下の式（ｐ）により設定することが可能である。
ｙ＝ａ／ｘ（ｐ） In the invention of the present analysis method, the buffer concentration of the eluent necessary for obtaining peak separation with excellent quantification and reproducibility was examined. As a result, it was found that the optimum buffer solution concentration correlated with the molecular weight per functional group of the polyoxyalkylene derivative. That is, the buffer solution concentration can be set by the following equation (p).
y = a / x (p)

式中、ｙは緩衝液濃度（ｍＭ）、ｘはポリオキシアルキレン誘導体の一官能基あたりの分子量を示し、ａは３０００〜６００００の範囲である。さらにポリオキシアルキレン誘導体の官能基数によって、イオン性の大きさは変わることから、好ましい範囲は次のように設定される。すなわち、１官能のポリオキシアルキレン誘導体ではａは３０００〜３００００が好ましく、二官能では１５０００〜３００００、三官能、四官能では３００００〜６００００が好ましい。ａが３０００より小さい場合、著しく緩衝液濃度が低いためにイオン交換カラムの汚染、吸着により、分離能の低下が起こる可能性がある。 In the formula, y represents the buffer concentration (mM), x represents the molecular weight per functional group of the polyoxyalkylene derivative, and a is in the range of 3000 to 60000. Furthermore, since the ionicity varies depending on the number of functional groups of the polyoxyalkylene derivative, the preferred range is set as follows. That is, in monofunctional polyoxyalkylene derivatives, a is preferably 3000 to 30000, bifunctional is 15000 to 30000, trifunctional and tetrafunctional is preferably 30000 to 60000. When a is smaller than 3000, the buffer solution concentration is extremely low, so that the resolution may decrease due to contamination and adsorption of the ion exchange column.

陽イオン交換カラムを用いて分析を行う場合には、ａは５０００〜１５０００であり、好ましくは６０００〜１２５００である。ａが５０００より小さい場合、著しく緩衝液濃度が低いためにイオン交換カラムの汚染、吸着により、分離能の低下が起こる可能性がある。
通常逆相カラムや順相カラムなどを用いて分析を行う場合、２種類の溶離液組成を変化させるグラジエント溶出でなければ、分離が困難である。しかし本分析方法では、例えば上記のように緩衝液濃度を設定することにより、あらゆる分子量、構造のポリオキシアルキレン誘導体でも、１種類の溶離液で分離するアイソクラティック溶出が可能となった。 When analyzing using a cation exchange column, a is 5000-15000, Preferably it is 6000-12500. When a is smaller than 5000, the buffer solution concentration is extremely low, so that the resolution may decrease due to contamination and adsorption of the ion exchange column.
Usually, when analysis is performed using a reverse phase column, a normal phase column, or the like, separation is difficult unless gradient elution that changes the composition of two types of eluents. However, in this analysis method, for example, by setting the buffer solution concentration as described above, it is possible to perform isocratic elution that separates polyoxyalkylene derivatives having any molecular weight and structure with one type of eluent.

本発明の分析方法において、高速液体クロマトグラフィーで使用する光学検出器は示差屈折検出器（ＲＩ）を用いる。一般には、グラジエント溶出を用いて分析を行う場合、ベースラインの屈折率が変化してしまうため示差屈折検出器（ＲＩ）は用いることが難しくなる。しかし、アイソクラティック溶出の場合には、示差屈折検出器（ＲＩ）を用いて、面積百分率から算出することができる。その結果、サンプルの分子量やモル吸光係数のような分析値に大きく影響するファクターを必要とせず、正確で精度の高い値を得ることができる。また、使用するラベル化試薬が紫外または蛍光吸収を有する場合は、紫外吸収検出器または蛍光検出器をＲＩと併用することが好ましい。紫外吸収検出器や蛍光検出器は極めて検出感度が高いので、微量の末端活性化体でも検出が可能となる。また、RIクロマトグラム上で複数のピークがある場合に、UVピークの保持時間から末端活性化体のピーク位置を同定することが可能となる。 In the analysis method of the present invention, a differential refraction detector (RI) is used as an optical detector used in high performance liquid chromatography. Generally, when performing analysis using gradient elution, the refractive index of the baseline changes, making it difficult to use a differential refraction detector (RI). However, in the case of isocratic elution, it can be calculated from the area percentage using a differential refraction detector (RI). As a result, an accurate and highly accurate value can be obtained without requiring a factor that greatly affects the analytical value such as the molecular weight or molar extinction coefficient of the sample. When the labeling reagent to be used has ultraviolet or fluorescence absorption, it is preferable to use an ultraviolet absorption detector or a fluorescence detector in combination with RI. Since the ultraviolet absorption detector and the fluorescence detector have extremely high detection sensitivity, even a very small amount of terminal activated substance can be detected. In addition, when there are a plurality of peaks on the RI chromatogram, the peak position of the terminal activator can be identified from the UV peak retention time.

従って、本発明の分析方法では、一種類の溶離液を用いて溶出を行うことが好ましい。ただし、複数種の溶離液を用いて溶出を行う場合であっても、溶離液の溶離性能の変化が小さい場合には、複数種の溶離液を使用することも可能である。例えば、溶離液が混合溶剤である場合に、混合溶剤の混合比率を若干変化させながら溶出することは可能である。また、一種の溶離液によって溶出を行いながら、溶出の途中でこの溶離液に少量の別種の溶媒を添加することも可能である。 Therefore, in the analysis method of the present invention, it is preferable to perform elution using one type of eluent. However, even when elution is performed using a plurality of types of eluents, it is possible to use a plurality of types of eluents if the change in elution performance of the eluent is small. For example, when the eluent is a mixed solvent, it is possible to elute while slightly changing the mixing ratio of the mixed solvent. It is also possible to add a small amount of another type of solvent to the eluent during the elution while elution is performed with a type of eluent.

本発明の分析方法においては、液体クロマトグラフィーにより得られるＲＩクロマトグラムにて末端活性化率を求める。すなわち、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化体と未活性化体が分離したピークとして得られるので、末端活性化体のピークの面積百分率により算出する。 In the analysis method of the present invention, the terminal activation rate is obtained from an RI chromatogram obtained by liquid chromatography. That is, since the terminal activated product and the non-activated product of the polyoxyalkylene derivative are obtained as separated peaks, the peak percentage of the terminal activated product is calculated.

本発明による分析方法では、片末端に活性基を持つ直鎖状のポリオキシアルキレン誘導体中に二倍分子量の両末端活性化体が含まれている場合でも、それぞれを分離、定量することができる。同様に、構造的に対称で、等価な二つ以上の末端活性基を持つ直鎖状または分岐状のポリオキシアルキレン誘導体の場合、活性化された末端数ごとの含有率をそれぞれ分離、定量することができる。 In the analysis method according to the present invention, even when a linear polyoxyalkylene derivative having an active group at one end contains a double molecular weight activated substance at both ends, each can be separated and quantified. . Similarly, in the case of a linear or branched polyoxyalkylene derivative having two or more terminal active groups that are symmetrical in structure, the content for each number of activated terminals is separated and quantified. be able to.

なお、本分析方法の対象となるポリオキシアルキレン誘導体の末端活性基の中では、ラベル化反応が簡便かつ短時間に進み、より安定なラベル化体が得られることから、末端アルデヒド基、末端ｐ−ニトロフェニルカルバメート基、末端マレイミド基、末端メルカプト基が好ましく、末端マレイミド基、末端アルデヒド基がより好ましい。 Among the terminal active groups of the polyoxyalkylene derivative to be analyzed, the labeling reaction proceeds easily and in a short time, and a more stable labeled product is obtained. -A nitrophenyl carbamate group, a terminal maleimide group, and a terminal mercapto group are preferable, and a terminal maleimide group and a terminal aldehyde group are more preferable.

一方、^１Ｈ−ＮＭＲ法では末端活性基中の水素の積分値から求めるため、ｓｐ２水素はｓｐ３水素に比べ、感度が低くなり、実際よりも末端活性化率が低く見積もられる場合がある。マレイミド基やアルデヒド基の水素はｓｐ２水素であるため、これらの末端活性化率の測定は定量性が問題となる可能性がある。以上の点からも、本発明の分析方法で対象となる末端活性基の中では末端マレイミド基、末端アルデヒド基が、より効果が得られることから好ましい。 Meanwhile, in order to obtain the integrated value of the hydrogen in the terminal active groups in the ^{1 H-NMR} method, sp2 hydrogen compared to sp3 hydrogen, sensitivity is low, and the actual terminal activation rate is estimated lower than. Since the hydrogen of the maleimide group or the aldehyde group is sp2 hydrogen, there is a possibility that the measurement of the terminal activation rate has a problem of quantitativeness. Also from the above points, the terminal maleimide group and the terminal aldehyde group are preferable among the terminal active groups to be analyzed by the analysis method of the present invention because the effect is obtained more.

本発明を実施例および比較例によりさらに詳しく説明する。
（実施例１）
ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２２５−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨＯ（６）
上記ポリオキシアルキレン誘導体（６）（分子量１００００）２０ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬに溶解した。次にｐ−アミノ安息香酸のメタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を６８mＬ加えて溶解し、さらにシアノ化水素ホウ素ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１２８ｍＬ加えて溶解した。室温で２時間撹拌反応させた。ＨＰＬＣ測定で用いる溶離液で平衡化させたゲルろ過カラム（ＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス））に反応溶液全量を添加し、さらに溶離液を加え、最初に溶出する高分子量体分画をＨＰＬＣ測定用バイアルに採取した。ＨＰＬＣ測定を以下の条件で行った。 The present invention will be described in more detail with reference to examples and comparative examples.
Example 1
_{_{_{_{CH 3 O- (CH 2 CH 2}}}} O) 225 -CH 2 CH 2 CHO (6)
20 mg of the above polyoxyalkylene derivative (6) (molecular weight 10,000) was dissolved in 2 mL of 0.1 M acetic acid buffer (pH 4.0). Next, 68 mL of a methanol solution (40 mg / mL) of p-aminobenzoic acid was added and dissolved, and 128 mL of an aqueous sodium borohydride solution (10 mg / mL) was further added and dissolved. The reaction was stirred at room temperature for 2 hours. Add the entire amount of the reaction solution to the gel filtration column (PD-10 (Amersham Biosciences)) equilibrated with the eluent used for HPLC measurement, add the eluent, and measure the high molecular weight fraction eluted first by HPLC measurement. Collected in a vial. HPLC measurement was performed under the following conditions.

（ＨＰＬＣ測定条件）
ＨＰＬＣ装置Ａｌｌｉａｎｃｅ６８９０（（株）Ｗａｔｅｒｓ）
分離カラムＥＳ−５０２Ｎ（Ａｓａｈｉｐａｋ）
溶離液１．５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐH８．０）
カラム温度３０℃
流速１．０ｍＬ／分
サンプル濃度１０ｍｇ／ｍＬ
注入量２０μＬ
検出器示差屈折検出器（ＲＩ）（（株）Ｗａｔｅｒｓ）
ＵＶ(２８６ｎｍ) （（株）Ｗａｔｅｒｓ） (HPLC measurement conditions)
HPLC apparatus Alliance 6890 (Waters Co., Ltd.)
Separation column ES-502N (Asahipak)
Eluent 1.5 mM ammonium formate buffer (pH 8.0)
Column temperature 30 ° C
Flow rate 1.0 mL / min Sample concentration 10 mg / mL
Injection volume 20μL
Detector Differential refraction detector (RI) (Waters Co., Ltd.)
UV (286 nm) (Waters)

測定試料のＲＩクロマトグラムおよびＵＶクロマトグラムをそれぞれ図１、図２に示す。図１において、ピーク１、ピーク２は、それぞれポリオキシアルキレン誘導体（６）中の未活性化体、末端活性化体に由来する。ピーク２が末端活性化体であることは、ＵＶクロマトグラム（図２）においてピーク２と同じ保持時間のピーク２’が検出されていることからも確認できる。すなわち、ラベル化試薬としてＵＶ吸収を持つｐ−アミノ安息香酸を用いたことにより、サンプル中の末端活性基を有する成分を特異的に検出することができる。ピーク２の面積百分率から末端活性化率を算出した結果、９１．７％であった。さらに同様の操作を５回繰り返したときの再現精度を調べた結果を表１に示す。 The RI chromatogram and UV chromatogram of the measurement sample are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. In FIG. 1, peak 1 and peak 2 are derived from an unactivated form and a terminal activated form in the polyoxyalkylene derivative (6), respectively. It can be confirmed from the fact that peak 2 'having the same retention time as peak 2 is detected in the UV chromatogram (Fig. 2), that peak 2 is a terminal activated product. That is, by using p-aminobenzoic acid having UV absorption as a labeling reagent, a component having a terminal active group in a sample can be specifically detected. As a result of calculating the terminal activation rate from the area percentage of peak 2, it was 91.7%. Further, Table 1 shows the results of examining the reproduction accuracy when the same operation is repeated five times.

（実施例２）
分析対象となるサンプルがより高分子量の場合に、本分析方法の分析結果および繰り返し再現性への影響を調べた。
ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_６８０−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨＯ（７） (Example 2)
When the sample to be analyzed has a higher molecular weight, the analysis results of this analysis method and the effect on repeatability were investigated.
_{_{_{_{CH 3 O- (CH 2 CH 2}}}} O) 680 -CH 2 CH 2 CHO (7)

実施例１で用いたポリオキシアルキレン誘導体と同じ構造を持ち、さらに高分子量である上記ポリオキシアルキレン誘導体（７）（分子量３００００）について、実施例１と同様の操作により末端活性化率を測定した。なおＨＰＬＣ測定条件における溶離液は０．５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液を用いた。末端活性化率は８３．３％であった。さらに同様の操作での繰り返し再現精度の結果を表１に示す。 For the polyoxyalkylene derivative (7) (molecular weight 30000) having the same structure as that of the polyoxyalkylene derivative used in Example 1 and having a high molecular weight, the terminal activation rate was measured in the same manner as in Example 1. . In addition, 0.5 mM ammonium formate buffer was used as the eluent under HPLC measurement conditions. The terminal activation rate was 83.3%. Further, Table 1 shows the results of repeated reproduction accuracy in the same operation.

（比較例１）
実施例１で用いたポリオキシアルキレン誘導体（６）（分子量１００００）の末端活性化率を^１Ｈ−ＮＭＲ分析により求めた。
（^１Ｈ−ＮＭＲ測定条件）
機種ＪＮＭ−ＥＣＰ４００
（日本電子データム（株）製）（４００ＭＨｚ）
サンプル濃度２０ｍｇ／ｍＬ
重溶媒クロロホルム
内部標準ＴＭＳ
積算回数６４回 (Comparative Example 1)
The terminal activation rate of the polyoxyalkylene derivative (6) (molecular weight 10,000) used in Example 1 was determined by ¹ H-NMR analysis.
⁽¹ H-NMR measurement conditions)
Model JNM-ECP400
(Manufactured by JEOL Datum) (400MHz)
Sample concentration 20mg / mL
Heavy solvent Chloroform internal standard TMS
Integration count 64 times

得られた^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、メトキシ基プロトンに帰属されるピーク（３．７ｐｐｍ）の積分強度を３としたとき、アルデヒド基プロトンに帰属されるピーク（９．４ｐｐｍ）の積分強度の理論積分値１に対する割合から、末端活性化率を算出した。さらに同様の操作での繰り返し再現精度の結果を表１に示す。 From the obtained ¹ H-NMR spectrum, when the integrated intensity of the peak attributed to the methoxy group proton (3.7 ppm) is 3, the integrated intensity of the peak attributed to the aldehyde group proton (9.4 ppm) From the ratio with respect to the integral value 1, the terminal activation rate was calculated. Further, Table 1 shows the results of repeated reproduction accuracy in the same operation.

（比較例２）
実施例２で用いたポリオキシアルキレン誘導体（７）（分子量３００００）の末端活性化率を比較例１と同様の操作により測定した。さらに同様の操作での繰り返し再現精度の結果を表１に示す。 (Comparative Example 2)
The terminal activation rate of the polyoxyalkylene derivative (7) (molecular weight 30000) used in Example 2 was measured by the same operation as in Comparative Example 1. Further, Table 1 shows the results of repeated reproduction accuracy in the same operation.

繰り返し測定を行ったときの誤差の大きさを示す相対標準偏差（％）を比較すると、本分析法は分析サンプルの分子量に関わらず、極めて測定誤差が小さいのに対し、^１Ｈ−ＮＭＲ法は高分子量のサンプルほど測定誤差が大きくなる結果となった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ法の結果は本分析法に比べて末端活性化率は低い値が得られた。 Comparing the relative standard deviation (%) indicating the magnitude of error when repeated measurements are performed, this analysis method has a very small measurement error regardless of the molecular weight of the analytical sample, whereas the ¹ H-NMR method is As a result, the measurement error increases as the sample has a higher molecular weight. Further, as a result of ¹ H-NMR method, the terminal activation rate was lower than that in this analysis method.

^１Ｈ−ＮＭＲ法では、分析サンプルの分子量が大きくなるほどポリオキシエチレン鎖プロトンのマルチプレットピーク（３．８〜４．３ｐｐｍ）の積分強度が大きくなり、それに伴ってサイドバンドノイズやベースラインのゆがみが大きくなる。その結果、ポリオキシエチレン鎖ピークに隣接するメトキシ基ピーク（３．７ｐｐｍ）の積分強度に影響し、測定誤差が大きくなる原因となる。また、ベースラインのゆがみによってメトキシ基ピークの積分強度は小さくなることがあり、その場合末端活性化率は実際より低い値となってしまう。
このように、本分析法は^１Ｈ−ＮＭＲ法と異なり、分析サンプルの分子量に関わらず測定誤差が極めて小さく、さらに定量性の高い方法といえる。 ^{In the 1} H-NMR method, as the molecular weight of the analysis sample increases, the integrated intensity of the polyoxyethylene chain proton multiplet peak (3.8 to 4.3 ppm) increases, which is accompanied by sideband noise and baseline distortion. Becomes larger. As a result, the integrated intensity of the methoxy group peak (3.7 ppm) adjacent to the polyoxyethylene chain peak is affected, resulting in an increase in measurement error. Further, the integrated intensity of the methoxy group peak may become small due to the distortion of the baseline, and in this case, the terminal activation rate becomes a value lower than the actual value.
Thus, unlike the ¹ H-NMR method, this analysis method has a very small measurement error regardless of the molecular weight of the analysis sample, and can be said to be a highly quantitative method.

（実施例３）

(Example 3)

上記ポリオキシアルキレン誘導体（７）（分子量２００００）の２つのサンプル（７−１、７−２）の末端活性化率測定を行った。
上記ポリオキシアルキレン誘導体（７−１、７−２）（分子量２００００）それぞれ２０ｍｇをマレイミドプロピオン酸水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬに溶解した。これを室温で３時間、遮光して撹拌した後、測定試料とした。このＨＰＬＣ測定を実施例１と同様の条件で行った。ただし、溶離液は1mMギ酸アンモニウム緩衝液（ｐH８．０）を用いた。 The terminal activation rate of two samples (7-1, 7-2) of the polyoxyalkylene derivative (7) (molecular weight 20000) was measured.
20 mg of each of the polyoxyalkylene derivatives (7-1, 7-2) (molecular weight 20000) was dissolved in 2 mL of a maleimidopropionic acid aqueous solution (2 mg / mL). This was stirred for 3 hours at room temperature with light shielding, and then used as a measurement sample. This HPLC measurement was performed under the same conditions as in Example 1. However, 1 mM ammonium formate buffer (pH 8.0) was used as the eluent.

測定試料（７−１）および（７−２）のＲＩクロマトグラムをそれぞれ図３、図４に示す。ピーク１は未活性化体、ピーク２、３、４、５はそれぞれ活性化された官能基数が１、２、３、４つのポリオキシアルキレン誘導体（７）に由来する。各ピークの面積百分率から活性化官能基数毎の末端活性化率を算出し、その合計から総活性化率を算出した。結果を表２に示す。 The RI chromatograms of the measurement samples (7-1) and (7-2) are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. Peak 1 is derived from an unactivated form, and peaks 2, 3, 4, and 5 are derived from polyoxyalkylene derivatives (7) having 1, 2, 3, and 4 activated functional groups, respectively. The terminal activation rate for each number of activated functional groups was calculated from the area percentage of each peak, and the total activation rate was calculated from the total. The results are shown in Table 2.

（比較例３）
実施例３で用いたポリオキシアルキレン誘導体（７−１、７−２）の末端活性化率を以下の吸光度法により求めた。
ポリオキシアルキレン誘導体（７−１、７−２）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解して、それぞれ正確に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した（試験サンプル溶液）。
次にシステイン標準液として、Ｌ−システインを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解して、正確に０．１５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した（システイン標準原液）。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）でそれぞれ１００倍、５０倍、２５倍、１６．７倍、１２．５倍に希釈した（システイン標準溶液希釈系列）。また、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）をブランクとした。 (Comparative Example 3)
The terminal activation rate of the polyoxyalkylene derivatives (7-1, 7-2) used in Example 3 was determined by the following absorbance method.
Polyoxyalkylene derivatives (7-1, 7-2) were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), and each was adjusted to a concentration of exactly 0.1 mg / mL (test sample solution).
Next, as a cysteine standard solution, L-cysteine was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) to prepare a concentration of 0.15 mg / mL accurately (cysteine standard stock solution). This was diluted 100-fold, 50-fold, 25-fold, 16.7-fold, and 12.5-fold with 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), respectively (cysteine standard solution dilution series). A 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) was used as a blank.

５，５−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、正確に４．６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した（ＤＴＮＢ溶液）。
ブランク、試験サンプル溶液、システイン標準溶液希釈系列それぞれ１４．７５ｍＬにＤＴＮＢ溶液０．２５ｍＬに加えて１０分間静置して誘導体化を行った。誘導体化後の各サンプルを分光光度計（島津（株）製、ＵＶ−２５００ＰＣ）を用いて４１０ｎｍでの吸光度を測定した。リファレンスには０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた。
システイン標準溶液希釈系列の濃度に対する各吸光度をプロットして検量線を作成し、この検量線から試験サンプルのシステイン濃度を算出した。これを試験サンプルの分子量で換算することにより、末端活性化率を求めた。その結果を表２に示す。 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a concentration of exactly 4.6 mg / mL (DTNB solution).
The blank, test sample solution, and cysteine standard solution dilution series were each added to 0.75 mL of the DTNB solution in 14.75 mL and allowed to stand for 10 minutes for derivatization. The absorbance at 410 nm was measured for each sample after derivatization using a spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation, UV-2500PC). A 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) was used as a reference.
A calibration curve was prepared by plotting each absorbance against the concentration of the cysteine standard solution dilution series, and the cysteine concentration of the test sample was calculated from the calibration curve. By converting this by the molecular weight of the test sample, the terminal activation rate was determined. The results are shown in Table 2.

表２から明らかなように、本分析法では総活性化率とともに、4官能のうち末端活性化された官能基数ごとの含量が定量できる。一方、吸光度法では総活性化率しか得られず、官能基数ごとの含量は定量できない。このように多官能の末端活性基を有するポリオキシアルキレン誘導体においては、本分析法では活性基数毎に特異的に定量することが可能である、非常に有用な方法であるといえる。 As is apparent from Table 2, in this analysis method, the total activation rate and the content of each of the four functional groups that are terminal activated can be quantified. On the other hand, only the total activation rate can be obtained by the absorbance method, and the content for each number of functional groups cannot be quantified. Thus, in the polyoxyalkylene derivative having a polyfunctional terminal active group, it can be said that this analysis method is a very useful method that can be quantified specifically for each number of active groups.

なお、サンプルのポリオキシアルキレン誘導体（７−１）は（７−２）に比べ総活性化率が低く、ポリオキシアルキレン誘導体の合成反応が完全に進んでいないことが予想される。その場合、合成原料はそのまま残存している可能性がある。 The total activation rate of the sample polyoxyalkylene derivative (7-1) is lower than that of (7-2), and it is expected that the synthesis reaction of the polyoxyalkylene derivative has not progressed completely. In that case, the synthetic raw material may remain as it is.

吸光度法の総活性化率が１００％を超えているのは、このようなポリオキシアルキレン誘導体の合成原料である低分子のメルカプト体試薬がサンプル中に残存していることにより、吸光度が大きく上昇したことが原因と考えられる。その結果、合成反応が完全に進んでいないことが予想されるサンプル（７−１）の方が、より高い活性化率が得られてしまっている。
このように、吸光度法ではサンプル中に残存する低分子のメルカプト体が存在する場合、定量は妨害され、正確に末端活性化率が測定できない。 The total activation rate of the absorbance method exceeds 100% because the absorbance of the low molecular weight mercapto reagent, which is a raw material for synthesizing such polyoxyalkylene derivatives, remains in the sample. This is thought to be the cause. As a result, a higher activation rate has been obtained in the sample (7-1) in which the synthesis reaction is expected not to proceed completely.
Thus, in the absorbance method, when a low-molecular mercapto body remaining in the sample is present, the determination is hindered, and the terminal activation rate cannot be measured accurately.

（実施例４）

Example 4

上記ポリオキシアルキレン誘導体（８）（分子量３００００）２０ｍｇをメルカプトプロピオン酸水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬに溶解した。これを室温で３時間、遮光して撹拌した後、測定試料とした。このＨＰＬＣ測定を実施例１と同様の条件で行った。ただし、溶離液は３ｍMギ酸アンモニウム緩衝液（ｐH８．０）を用いた。 20 mg of the above polyoxyalkylene derivative (8) (molecular weight 30000) was dissolved in 2 mL of a mercaptopropionic acid aqueous solution (1 mg / mL). This was stirred for 3 hours at room temperature with light shielding, and then used as a measurement sample. This HPLC measurement was performed under the same conditions as in Example 1. However, 3 mM ammonium formate buffer (pH 8.0) was used as the eluent.

測定試料のＲＩクロマトグラムからは３つのピークが得られた。保持時間の早いピークから順に未活性化体、片末端活性化体、両末端活性化体に相当し、面積百分率からそれぞれ１．５％、１９．５％、７９．０％であった。 Three peaks were obtained from the RI chromatogram of the measurement sample. Corresponding to the non-activated form, the one-end activated form, and the both-end activated form in order from the peak with the fastest retention time, the area percentages were 1.5%, 19.5%, and 79.0%, respectively.

（実施例５）
ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２２５−ＣＯＣ_６Ｈ_４ＮＯ_２（９）
上記ポリオキシアルキレン誘導体（９）（分子量１００００）の分子量分布測定を以下のＧＰＣ測定条件で行った。 (Example 5)
_{_{_{_{CH 3 O- (CH 2 CH 2}}}} O) 225 -COC 6 H 4 NO 2 (9)
The molecular weight distribution of the polyoxyalkylene derivative (9) (molecular weight 10,000) was measured under the following GPC measurement conditions.

（ＧＰＣ測定条件）
分離カラムＰＬｇｅｌＭＩＸＥＤ−Ｄ（ポリマーラボラトリー）２本
溶離液ＤＭＦ
カラム温度６５℃
流速０．７ｍＬ／分
検出器ＲＩ
サンプル濃度１ｍｇ／ｍＬ
注入量１００μＬ (GPC measurement conditions)
Separation column PLgel MIXED-D (polymer laboratory) 2 eluents DMF
Column temperature 65 ° C
Flow rate 0.7mL / min detector RI
Sample concentration 1 mg / mL
Injection volume 100μL

得られたクロマトグラムを図５に示す。分子量１００００のメインピークの左側に二倍分子量２００００の不純物ピークが確認でき、０．９％含まれていた。一般に、末端がメトキシ基で封鎖された直鎖状ポリオキシアルキレン誘導体は、その原料であるメトキシポリオキシエチレンの製造時にジオール体（２倍分子量のポリオキシエチレン）が副生する。 The obtained chromatogram is shown in FIG. An impurity peak having a double molecular weight of 20,000 was confirmed on the left side of the main peak having a molecular weight of 10,000, and contained 0.9%. In general, a linear polyoxyalkylene derivative whose end is blocked with a methoxy group produces a diol (by double molecular weight polyoxyethylene) as a by-product when the raw material methoxypolyoxyethylene is produced.

次に、上記ポリオキシアルキレン誘導体（９）の末端活性化率を以下の手順により測定した。
上記ポリオキシアルキレン誘導体（９）（分子量１００００）５０ｍｇにグリシン１０ｍｇを加え、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍLを加え溶解した。これを室温で２０時間撹拌した。ＨＰＬＣ測定で用いる溶離液で平衡化させたゲルろ過カラムに、反応溶液を溶離液で５倍に希釈したものを２ｍＬ添加した。さらに溶離液を加え、最初に溶出する高分子量体分画をＨＰＬＣ測定用バイアルに採取した。ＨＰＬＣ測定は実施例１と同様の条件で行った。ただし、溶離液は１．５mMギ酸アンモニウム緩衝液（ｐH８．０）を用いた。 Next, the terminal activation rate of the polyoxyalkylene derivative (9) was measured by the following procedure.
10 mg of glycine was added to 50 mg of the polyoxyalkylene derivative (9) (molecular weight 10,000), and 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) was added and dissolved. This was stirred at room temperature for 20 hours. 2 mL of the reaction solution diluted 5-fold with the eluent was added to the gel filtration column equilibrated with the eluent used in the HPLC measurement. Further, an eluent was added, and the first high molecular weight fraction eluted was collected in an HPLC measurement vial. The HPLC measurement was performed under the same conditions as in Example 1. However, 1.5 mM ammonium formate buffer (pH 8.0) was used as the eluent.

得られたＲＩクロマトグラムを図６に示す。メインピークの面積百分率から末端活性化率を求めたところ、７８．８％であった。 The obtained RI chromatogram is shown in FIG. When the terminal activation rate was determined from the area percentage of the main peak, it was 78.8%.

また、メインピークのさらに後ろに小さなピークが検出され、保持時間から二倍分子量のポリオキシエチレンの両末端に活性基が結合しているものと推測された。よって先のＧＰＣ測定で確認された二倍分子量体０．９％のうち、両末端に活性基を有する不純物が０．７％含まれていることが確認できた。このように本分析方法では、サンプル中に分子量の異なる活性化体不純物が含まれている場合、これを特異的に定量することが可能である。 In addition, a small peak was detected after the main peak, and it was estimated from the retention time that active groups were bonded to both ends of polyoxyethylene having a double molecular weight. Therefore, it was confirmed that 0.7% of impurities having active groups at both ends were contained in 0.9% of the double molecular weight body confirmed by the previous GPC measurement. As described above, in the present analysis method, when an activator impurity having a different molecular weight is contained in a sample, this can be specifically quantified.

（実施例６）
ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４５４−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ−ＭＡＬ（１０）
（ＭＡＬ：マレイミド基） (Example 6)
_{_{_{_{CH 3 O- (CH 2 CH 2}}}} O) 454 -CH 2 CH 2 CH 2 NHCO-MAL (10)
(MAL: Maleimide group)

上記ポリオキシアルキレン誘導体（１０）（分子量２００００）4０ｍｇにチオエタノールアミン塩酸塩１０ｍｇを加え、これらをクロロホルム２ｍＬに溶解した。これを室温で１０時間、遮光して撹拌した後、溶け残ったチオエタノールアミン塩酸塩をろ過して除去した。反応溶液の脱溶剤を行い、ＨＰＬＣ測定における溶離液８ｍＬに溶解し、測定試料とした。ＨＰＬＣ測定は以下の条件で行った。 10 mg of thioethanolamine hydrochloride was added to 40 mg of the above polyoxyalkylene derivative (10) (molecular weight 20000), and these were dissolved in 2 mL of chloroform. This was stirred for 10 hours at room temperature with light shielding, and then the undissolved thioethanolamine hydrochloride was removed by filtration. The reaction solution was desolvated and dissolved in 8 mL of an eluent in HPLC measurement to obtain a measurement sample. The HPLC measurement was performed under the following conditions.

（測定条件）
分離カラムＴＳＫ−ｇｅｌＳＰ−５ＰＷ（東ソー）
溶離液１．０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６．５）
カラム温度４０℃
流速０．５ｍＬ／分
検出器ＲＩ (Measurement condition)
Separation column TSK-gel SP-5PW (Tosoh)
Eluent 1.0 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)
Column temperature 40 ° C
Flow rate 0.5mL / min detector RI

測定試料のクロマトグラムを図７に示す。ピーク１は未活性化体、ピーク２は末端活性化体のポリオキシアルキレン誘導体（１０）に由来し、面積百分率から末端活性化率を求めたところ９０．５％であった。 The chromatogram of the measurement sample is shown in FIG. Peak 1 was derived from the non-activated product, and peak 2 was derived from the terminal activated polyoxyalkylene derivative (10). When the terminal activation rate was determined from the area percentage, it was 90.5%.

実施例１の液体クロマトグラフィーの測定によるＲＩクロマトグラムの結果を示す。The result of RI chromatogram by the measurement of the liquid chromatography of Example 1 is shown. 実施例１の液体クロマトグラフィーの測定によるＵＶクロマトグラムの結果を示す。The result of the UV chromatogram by the measurement of the liquid chromatography of Example 1 is shown. 実施例３の分析サンプル（７−１）の液体クロマトグラフィーの測定によるＲＩクロマトグラムの結果を示す。The result of the RI chromatogram by the measurement of the liquid chromatography of the analysis sample (7-1) of Example 3 is shown. 実施例３の分析サンプル（７−２）の液体クロマトグラフィーの測定によるＲＩクロマトグラムの結果を示す。The result of the RI chromatogram by the measurement of the liquid chromatography of the analytical sample (7-2) of Example 3 is shown. 実施例５のＧＰＣ測定結果を示す。The GPC measurement result of Example 5 is shown. 実施例５の液体クロマトグラフィーの測定によるＲＩクロマトグラムの結果を示す。The result of RI chromatogram by the liquid chromatography measurement of Example 5 is shown. 実施例６の液体クロマトグラフィーの測定によるＲＩクロマトグラムの結果を示す。The result of RI chromatogram by the liquid chromatography measurement of Example 6 is shown.

Claims

末端に生理活性物質と化学結合する末端活性基を有し、分子量が１０００〜１０００００であるポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率分析方法であって、イオン性官能基を持つラベル化試薬にて前記末端活性基をラベル化した後、イオン交換カラムを用いた液体クロマトグラフィーで分析を行い、ＲＩ検出器で得られるクロマトグラムにおける面積百分率より、末端活性化率を求めることを特徴とする、ポリオキシアルキレン誘導体の末端活性化率分析方法。 A terminal activation rate analysis method for a polyoxyalkylene derivative having a terminal active group chemically bonded to a physiologically active substance at a terminal and having a molecular weight of 1000 to 100,000, wherein the labeling reagent has an ionic functional group. After labeling the terminal active group, analysis is performed by liquid chromatography using an ion exchange column, and the terminal activation rate is obtained from the area percentage in the chromatogram obtained by the RI detector. Analysis method of terminal activation rate of alkylene derivative.

前記ポリオキシアルキレン誘導体がポリオキシエチレン誘導体である、請求項１に記載の分析方法。 The analysis method according to claim 1, wherein the polyoxyalkylene derivative is a polyoxyethylene derivative.

前記ポリオキシアルキレン誘導体の分子量が５０００〜１０００００である、請求項１または２に記載の分析方法。 The analysis method according to claim 1 or 2, wherein the polyoxyalkylene derivative has a molecular weight of 5,000 to 100,000.

前記ポリオキシアルキレン誘導体の分子量が１００００〜１０００００である、請求項３記載の分析方法。 The analysis method according to claim 3, wherein the polyoxyalkylene derivative has a molecular weight of 10,000 to 100,000.

前記ポリオキシアルキレン誘導体が複数の前記末端活性基を有する、請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載の分析方法。 The analysis method according to any one of claims 1 to 4, wherein the polyoxyalkylene derivative has a plurality of the terminal active groups.

前記ラベル化試薬の前記イオン性官能基がカルボキシル基であり、前記イオン交換カラムが陰イオン交換カラムである、請求項１〜５のいずれか一つの請求項に記載の分析方法。 The analysis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the ionic functional group of the labeling reagent is a carboxyl group, and the ion exchange column is an anion exchange column.

前記ラベル化試薬の前記イオン性官能基がアミノ基であり、前記イオン交換カラムが陽イオン交換カラムである、請求項１〜５のいずれか一つの請求項に記載の分析方法。 The analysis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the ionic functional group of the labeling reagent is an amino group, and the ion exchange column is a cation exchange column.

前記ポリオキシアルキレン誘導体の前記末端活性基が、マレイミド基およびアルデヒド基からなる群より選ばれた一種以上の官能基である、請求項１〜５のいずれか一つの請求項に記載の分析方法。 The analysis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the terminal active group of the polyoxyalkylene derivative is one or more functional groups selected from the group consisting of a maleimide group and an aldehyde group.

前記イオン交換カラムによる液体クロマトグラフィーでの分析における溶離液の緩衝液濃度（ｙ）が、下記式（ｐ）で表されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つの請求項に記載の分析方法。
ｙ＝ａ／ｘ（ｐ）
（式中、ｙは緩衝液濃度（ｍＭ）、ｘはポリオキシアルキレン誘導体の一活性基あたりの分子量であり、ａは３０００〜６００００を示す。） The buffer solution concentration (y) of the eluent in the analysis by liquid chromatography using the ion exchange column is represented by the following formula (p). The analysis method described in 1.
y = a / x (p)
(Wherein y is the buffer concentration (mM), x is the molecular weight per active group of the polyoxyalkylene derivative, and a is 3000 to 60000.)

前記式（ｐ）において、ａは５０００〜１５０００であることを特徴とする、請求項９に記載の分析方法。 In the said formula (p), a is 5000-15000, The analysis method of Claim 9 characterized by the above-mentioned.