JP4535359B2 - Insulin deficiency detection method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病や肥満に伴う動脈硬化の病態を診断する上で必要とされるインスリン作用不足の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリンは、体内でのグルコース利用を促進する唯一のホルモンであるが、このホルモンが不足したり有効に作用しなくなった場合、血中のグルコース濃度が異常に上昇して糖尿病となる。従って、尿糖値、空腹時血糖値や糖負荷試験に伴う血糖値の変動パターン等の解析から、高血糖の状態を把握し、「インスリン作用の不足」を間接的に判断して糖尿病を診断してきた。
【０００３】
このインスリン作用の不足は、膵臓からの「インスリン分泌の絶対量の低下」のみならず、「インスリン抵抗性」によるグルコース利用効率の低下とも関係している。例えば、肥満に伴う軽度の高血糖（ＩＧＴ）では、インスリンに対する感受性が低下し、結果的に、インスリンの過剰分泌が起こる。この高インスリン血症が、肥満に伴う動脈硬化の重要な要因になっているものと考えられている。
このように、インスリン作用の不足は、肥満や糖尿病と密接に関係している。
【０００４】
これまでのインスリン作用不足の検出方法は、簡便には、空腹時の血糖値、グルコース経口負荷後の血糖値やその経時変化を解析して行なわれている。また、さらに厳密には、インスリンの分泌量と、インスリンに対する感受性の低下（インスリン抵抗性）を把握するため、空腹時の血糖値と血中インスリン値の両方を測定して両者の関係（ＨＯＭＡ指数）を解析する方法等が行なわれている。もっとも厳密には、グルコースやインスリンを静注負荷し、血糖値と血中インスリン値の動的な関係を解析することで行なわれている。
【０００５】
一方、マンノース濃度測定の臨床的意義については、(1)血糖値とマンノース濃度は相関する（J. Clin. Endocrinol. Metab., 62, p984-989 (1986)、Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)）、(2)マンノース／グルコース濃度比が、インスリン非依存型糖尿病（Clin. Chim. Acta, 251, p91-103 (1996)）、異脂肪血症、尿蛋白***の亢進やＢＭＩ（Body Mass Index：肥満度指数）上昇（Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)）で増加するとの報告がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血糖値のみを用いるインスリン作用不足の検出方法では、組織でのグルコースの消費によって血糖値が大きく変動するという問題点があった。
また、血中インスリン値と血糖値を組み合わせるインスリン作用不足の検出方法は、より厳密ではあるが、インスリン負荷による患者負担が大きいという問題点があった。たとえ、空腹時採血だけの簡便法であったとしても、免疫学的にインスリンを測定することは、生化学的測定法よりもコストが高いという問題点もあった。
また、これまでのマンノース値の一点測定では、これまでの検査法を超える臨床的な有用性を認めることができなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、インスリンに反応して血中マンノース値が低下することを見出し、その結果、インスリン作用を簡便に把握できることに基づき本発明に至ったものである。
【０００８】
即ち、本発明は、
（１）血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いることを特徴とするインスリン作用不足の検出方法
（２）インスリン作用不足がグルコース放出の抑制の低下に起因するインスリン作用不足である上記（１）記載の検出方法
（３）グルコース負荷時における血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いる上記（１）または（２）に記載の検出方法
（４）インスリン作用不足を検出するための血中マンノース濃度の経時測定値の使用
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、インスリン作用不足の検出において、血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いることを特徴とする方法であり、更に、グルコース負荷時の血中マンノース濃度の測定値の経時変化を用いる方法である。本発明で使用する血中マンノース濃度の測定方法は、臨床的に意味のある精度で測定できる方法であれば何であっても良く、特に限定されない。例えば、ガスクロマトグラフ法（Pflugers Arch., 420, p367-375 (1992)、Biol. Mass Spectrom., 23, p590-595 (1994)）や液体クロマトグラフ法（Am. J. Clin. Pathol., 53, p793-802 (1970)）や最近臨床検査の現場で用いられている汎用の生化学分析装置で測定する方法（特開平１１−２６６８９６号公報）が挙げられるが、臨床現場でのルーチン測定に適した生化学的分析法が好ましい。
本発明におけるインスリン作用とは、前記したように、インスリンによる血中グルコース濃度の低下を意味し、インスリンの分泌量（血中濃度）及びインスリンの効き具合（＝グルコースの利用効率）を反映するものである。グルコースの利用効率の低下は、インスリン抵抗性と言われるものであるが、これはさらに、筋肉や脂肪組織等の末梢組織における糖利用の低下と、肝臓や腎臓でのグルコース放出の抑制の低下の両面によって説明されるものである。後記するように、肝臓におけるグリコーゲンの分解によりグルコース放出が促進され、その際にグルコースと共にマンノースが放出される。インスリンによる肝臓でのグルコース放出の抑制作用は知られているので、血中マンノースの測定値の経時変化はインスリン抵抗性の原因が糖利用の低下か、グルコース放出の抑制の低下かの検査を可能とする。この肝臓等の臓器におけるインスリン作用不足の検査法も本願発明に含まれる。
【００１０】
本発明に使用される血液は、全血、血漿または血清であるが、血漿または血清が好ましい。
本発明における血中マンノース濃度の測定は、血中インスリン濃度の変動が予想される場面で測定するのが好ましい。例えば、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後、就眠前後等における血中濃度及びその変化を測定し、糖尿病や肥満によるインスリン抵抗性患者の診断や、より詳細な病態の把握に都合の良い方法で解析すれば良い。
【００１１】
本発明におけるグルコース負荷とは、効率良く負荷できる方法であれば何であっても良く、特に制限されない。日常の食事による負荷試験、糖尿病の診断法として多用されているグルコースやマルトース等の経口負荷試験（ＯＧＴＴ）、静注によるグルコースの負荷試験等があるが、好ましくはＯＧＴＴであり、ＯＧＴＴによる糖尿病検査と同時に行なうことも可能である。
【００１２】
更に、グルコース負荷における血中マンノース濃度の測定は、グルコースに反応してインスリンが分泌され、この分泌されたインスリンによってマンノースが変動すると考えられるから、例えば、ＯＧＴＴの場合、血糖値がピークに達する時間の近傍から、さらに遅れた時点で測定するのが適切である。後記するように正常ラットでのグルコース負荷試験におけるマンノース濃度の最小値は２０分後であるが、ヒト（健常者）ではグルコース負荷後から徐々に低下して行き１２０分後に最小値（グルコース負荷前の値の５０〜８０％程度）に達した。マンノース値の変動を解析するための至適観測点は、動物の種差によって変化する。ヒトの場合、好ましくは負荷後１０分から３時間、さらに好ましくは負荷後３０分から２時間での測定が良い。
【００１３】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
実施例１ インスリン負荷試験
カニュレーション
正常ラットとしてWistar系ラット（♂、２４０〜２７０ｇ、日本クレア）に、無麻酔下、無拘束でストレスをかけずに、同一個体から連続採血するため、右心房にカニューレを留置する手術を施行した。具体的には、ネンブタール麻酔下に、ラットを保定台に背位に保定し、右側頚静脈上部の周辺を剃毛し、頚静脈が拍動している部分の皮膚を切開した。結合組織を、鉗子を用いて鈍性剥離し、頚静脈を露出させ、頚静脈の吻側及び尾側に縫合糸（２号）をかけ、吻側の糸を固く結んだ。尾側の糸は緩くかけたままにしておいた。
クリップで心臓側からの血流を止め、ウェッケル剪刀で血管に小さな切れ目を入れ、ヘパリン１０Ｕ／ｍＬ添加生理食塩水（ヘパリン加生食）で満たされたカニューレを挿入した。あらかじめカニューレのストッパーに掛けておいた糸で胸筋を縫い、カニューレを固定した。さらに、頚部背側の皮膚を小さく切開し、切れ目より鉗子を挿入してカニューレを引き出し、カニューレケース本体の中央の穴に通した。ケースを縫合糸（４号）により背側皮膚に固定した。カニューレ内に血液が残らないようにヘパリン加生食を適量注入し、充填液をカニューレ内部に詰めた後、先端を結んで栓をし、ケースに収納した。
【００１５】
投与及び採血
カニューレから０．２５Ｕ／ｍＬのインスリンを投与し、投与の５分前、投与直前、投与後５、１０、２０、３０、４５、６０分と合計８回にわたってカニューレから８０μＬづつ採血した。
【００１６】
血糖測定
採血した全血２０μＬを用い、アントセンスII（バイエル・三共）により血糖値を測定した。
【００１７】
マンノースの測定
採血した全血５０μＬにヘパリン加生食５０μＬを加え、７，５００×ｇで１５分間遠心分離し、その上清液７０μＬに、１．５Ｍ過塩素酸１０μＬを加えて、氷冷下で１０分間放置後、７，５００×ｇで１５分間遠心分離して除蛋白した。この上清液中のマンノース濃度を、糖分析用のカラムをセットした液体クロマトグラフィー分析装置（ＨＰＬＣ）を用い、下記の条件で定量した。
【００１８】
ＨＰＬＣの条件
カラム：Finepak gel SA-121
カラム温度：８０℃
カラム流速：０．５ｍＬ／分
移動相：緩衝液Ａ（０．２５Ｍホウ酸溶液）、緩衝液Ｂ（０．６０Ｍホウ酸溶液）
移動相組成：Ａ／Ｂ＝８／２（０分）→６／４（１７分）直線勾配
反応試薬：１００ｍＭホウ酸、５０ｍＭグアニジン塩酸塩及び０．５ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを含む２０％アセトニトリル水溶液
反応温度：１６０℃
試薬流速：０．５ｍＬ／分
蛍光検出：励起波長３１０ｎｍ、検出波長４１５ｎｍ
【００１９】
実験結果
これらの結果を、図１と表１に示した。これより、インスリンに応答し、血中マンノースが低下していると考えられた。
【００２０】

【００２１】
実施例２ グルコース負荷試験
実施例１のインスリンに代えて、５０％グルコース溶液１ｍＬを正常のWistar系ラット及び２型糖尿病モデルであるＧＫラット（♂、１８０〜２００ｇ、日本クレア）に負荷し、同様の試験を行った。これらの結果を、図２（正常Wistar系ラット）と図３（糖尿病ＧＫラット）に示した。両者とも、血糖値は５分後にピークとなったが、マンノース値はこれより約２０分遅れて、２０〜３０分後に最低値に達した。正常ラットのインスリンの分泌は、通常、グルコースとほぼパラレルになることから、インスリン分泌に要する時間分だけ、５〜１０分程インスリン負荷時よりも遅れる傾向を示した。さらに、正常ラットと糖尿病ラットの血中マンノース濃度の変化を比較するため、マンノース濃度がほぼ最小に達した時点の、グルコース負荷後２０分におけるマンノース値の低下量及び負荷前値に対する低下量の割合（％）を求め表２に示した。糖尿病ラットのマンノース値の低下量及び負荷前値に対する低下量の割合（％）は、それぞれ正常ラットの約１/３及び１／４と、著しく低下していた。このことは、糖尿病ラットにおけるインスリン作用の不足を反映していると考えられる。
【００２２】

【００２３】
実施例３ グルコース負荷試験２
カニュレーション
正常ラットとしてWistar系ラット（♂、７週齢、日本クレア）、及び、２型糖尿病モデルのＧＫラット（♂、9週齢、日本クレア）に、実施例１と同様にしてカニュレーションを行なった。
【００２４】
投与及び採血
カニューレから５０％グルコース溶液１ｍＬ（２ｇ／kg）を投与し、投与直前（０分）、投与後２、５、７、１０、１５、３０分と、合計７回にわたって１５０μＬづつカニューレから採血した。
【００２５】
血糖測定
実施例１と同様にして測定した。
マンノース測定
採血した全血９０μＬにヘパリン１０Ｕ／ｍＬ加生食９０μＬを加え、７，５００×ｇで１５分間遠心分離した。この上清液１２０μＬに１．５Ｍ過塩素酸１８．５μＬを加え、氷冷下で１０分間放置後、７，５００×ｇで１５分間遠心分離して除蛋白した。この上清液中のマンノース濃度は、液体クロマトグラフィー分析装置（ＨＰＬＣ）を用い、実施例１と同様の条件下で測定した。
【００２６】
インスリン測定
全血を、７，５００×ｇで１０分間遠心分離後、その上清液５μＬを用い、ＥＬＩＳＡ法によるインスリン測定キット（森永生化学研究所）で、インスリン濃度を測定した。
【００２７】
これらの結果を、図４（正常Wistar系ラット）と図５（糖尿病ＧＫラット）に示した。血糖値は、両者とも２分後にはピークとなった。正常ラットでは、血糖に反応して大量のインスリンが放出されたが、ＧＫラットでは、インスリンは存在するが、極めてわずかしか変化しなかった。これを反映し、正常ラットのマンノース値は徐々に低下し、３０分後には３４μＭ低下した。一方、ＧＫラットでは、僅かに１．７μＭ低下しただけであった。インスリンとマンノースの関係をさらに明確にするため、これらの数値を表３に纏めた。これらの結果から、マンノース値は、血糖ではなく、インスリンによって変動していることが明らかになった。
【００２８】

【００２９】
実施例４ ヒトでのグルコース負荷試験
健常者を対象にして７５ｇ経口グルコース負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）を行ない、血漿中のグルコース濃度とマンノース濃度の変化を追跡し、その結果を図６に示した。この図からも明らかなように、ヒトでのマンノース値は、糖負荷後から徐々に低下して行き１２０分後には最小値に達した。上記のようにラットでの最小値は２０分後であることから、マンノース値の変動を解析するための至適観測点は、動物の種差によって変化することが分かる。
【００３０】
実施例５ ラット肝での灌流実験（肝からのマンノース放出）
ラット灌流肝の調製（Ｍｉｌｌｅｒ ｔｙｐｅ）
Wistar系ラット（♂、３１０〜４００ｇ、日本クレア）を、ペントバルビタール麻酔下（０．1ｍＬ／１００ｇ体重）で開腹し、灌流肝分離の手術を行なった。即ち、門脈に、糸を２本（１本は肝動脈と一緒に、他の１本は小腸側で、門脈のみ）緩くかけ、カニューレ（直径１．１ｍｍ）を挿入後、小腸側の糸できつく固定し、３３３Ｕ／ｍＬに希釈したヘパリン０．６ｍＬを注射筒で注入した。灌流装置からの灌流液、ポンプ流速３０ｍＬ／分で、カニューレから肝に流入させ、直ちに腹腔大静脈を右腎臓の下の位置で切断した。カニューレを肝臓側の糸で縛り、固定すると同時に肝動脈を結紮した。この段階で、肝臓内の血液はほとんど抜け、肝臓は淡黄色となった。胸部を切開し、下行大静脈を切断した。右腎臓のすぐ上の位置で、腹腔大静脈を糸で結紮し、灌流液を門脈側より流入させ、肝臓内を通過し下行大静脈から流出するようにした。最後に、肝臓を傷つけないように、他の臓器から分離した。
【００３１】
肝灌流及び薬物投与
あらかじめ、酸素９５％、炭酸ガス５％の混合ガスでバブリングした灌流液を、ペリスタポンプを用いて吸入し、エアートラップで小気泡を除去した後、温水循環ヒーターで瞬時に３７℃に加温しながら、門脈のカニューレから肝臓内に送り込んだ。肝臓は、メッシュの上に置き、湿度と温度を保つためにプラスチックのケースで覆った。また、肝臓上部より、ライト（１００Ｗ）を照射し、３７℃の恒温となるようにした。分離した肝臓に、流速３０ｍＬ／分で灌流液を送りながら、メッシュの上に１５分程静置した後、１分毎に６回、６分間、灌流液の採取を行なった。この採取の始めから２分を取り終えたところで灌流ラインのバルブを切り換え、０．２μｇ／ｍＬ濃度のエピネフリンを加えて灌流液を流した。
【００３２】
なお、灌流液は、５ｍＭグルコース、１１８ｍＭ塩化ナトリウム、４．７ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸２水素１カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウム、２４．２ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．４）からなるグルコース添加Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液を用いた。
【００３３】
グルコース放出とマンノース放出の関係
採取した灌流液中のグルコースとマンノース濃度を測定し、肝グルコース放出に伴う両者の動態を比較した結果を図７に示した。エピネフリンは、肝でのグリコーゲン分解を促進しグルコース放出を促進する薬物であるが、エピネフリンを還流すると、グルコースの放出量とほぼ平行してマンノースの放出量も促進された。このことから血中のマンノース値の変動は、肝臓等の臓器からのグルコース放出の状況を反映し、従ってインスリンによるマンノース値の低下は、肝臓等の臓器からのグルコース放出の低下を反映しているものと考えられる。
【発明の効果】
血中マンノース値を測定してその経時的な変動を解析することにより簡便にインスリン作用の不足の程度を把握することができ、特にインスリンによる肝臓等の臓器からのグルコース放出の抑制状況を把握でき、例えば血糖関連マーカー等の他のマーカーと併用することにより糖尿病や肥満に伴う疾患の病態、例えば糖尿病におけるインスリン作用の不足がグルコース放出の抑制能の低下、あるいは糖利用能の低下のいずれによるか等のより詳細な判別が可能となること、及びインスリンによる肝グルコース放出抑制の効果を知るためのマーカーとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常ラットに対するインスリン負荷試験の結果を示す。
【図２】正常ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図３】糖尿病ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図４】インスリンの測定値を加えた正常ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図５】インスリンの測定値を加えた糖尿病ラットに対するグルコース負荷試験の結果を示す。
【図６】健常者（ヒト）のグルコース負荷試験でのグルコースとマンノースの動態
【図７】ラット灌流肝でのグルコースとマンノースの動態[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting insufficient insulin action required for diagnosing the pathological condition of arteriosclerosis associated with diabetes or obesity.
[0002]
[Prior art]
Insulin is the only hormone that promotes glucose utilization in the body, but if this hormone is deficient or fails to function effectively, the blood glucose concentration rises abnormally, resulting in diabetes. Therefore, from the analysis of urine sugar level, fasting blood glucose level, blood glucose level fluctuation pattern associated with glucose tolerance test, etc., the state of hyperglycemia is grasped, and “insufficient insulin action” is judged indirectly to diagnose diabetes I have done it.
[0003]
This lack of insulin action is related not only to “decrease in the absolute amount of insulin secretion” from the pancreas but also to reduction in glucose utilization efficiency due to “insulin resistance”. For example, mild hyperglycemia (IGT) associated with obesity reduces sensitivity to insulin, resulting in excessive secretion of insulin. This hyperinsulinemia is considered to be an important factor in arteriosclerosis associated with obesity.
Thus, the lack of insulin action is closely related to obesity and diabetes.
[0004]
Conventional detection methods for insufficient insulin action have been performed by analyzing blood glucose levels during fasting, blood glucose levels after oral glucose loading, and changes over time. More precisely, in order to grasp the amount of insulin secreted and the decrease in sensitivity to insulin (insulin resistance), both the fasting blood glucose level and the blood insulin level were measured and the relationship between them (HOMA index) ) Is analyzed. Most strictly, it is performed by intravenously injecting glucose or insulin, and analyzing the dynamic relationship between the blood glucose level and the blood insulin level.
[0005]
On the other hand, regarding the clinical significance of mannose concentration measurement, (1) blood glucose level and mannose concentration are correlated (J. Clin. Endocrinol. Metab., 62, p984-989 (1986), Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)), (2) Mannose / glucose concentration ratio is non-insulin dependent diabetes mellitus (Clin. Chim. Acta, 251, p91-103 (1996)), dyslipidemia, There are reports that it increases due to increased urinary protein excretion and increased BMI (Body Mass Index) (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 59, p607-612 (1999)).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, the method for detecting insufficient insulin action using only blood glucose levels has a problem that blood glucose levels fluctuate greatly depending on glucose consumption in the tissue.
Further, although the method for detecting insufficient insulin action combining blood insulin level and blood glucose level is more strict, there is a problem that the burden on the patient due to insulin load is large. Even if it is a simple method only for fasting blood sampling, there is a problem that it is more expensive to measure insulin immunologically than biochemical measurement.
In addition, the single point measurement of mannose so far has failed to recognize clinical usefulness that exceeds conventional testing methods.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the problems as described above, the present inventors have found that the blood mannose value decreases in response to insulin, and as a result, the insulin action can be easily grasped. This has led to the present invention.
[0008]
That is, the present invention
(1) A method for detecting insufficient insulin action, characterized by using a time-dependent change in the measured value of blood mannose concentration (2) The above-mentioned (1) wherein insufficient insulin action is insufficient insulin action due to a decrease in suppression of glucose release (1) (3) The detection method according to (1) or (2) above, wherein the change over time in the measured value of blood mannose concentration during glucose load is used. (4) The blood for detecting insufficient insulin action The use of mannose concentration over time.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a method characterized by using a time-dependent change in the measured value of blood mannose concentration in detection of insufficient insulin action, and further using a time-dependent change in the measured value of blood mannose concentration during glucose loading. Is the method. The method for measuring the blood mannose concentration used in the present invention is not particularly limited as long as it can be measured with clinically meaningful accuracy. For example, gas chromatography (Pflugers Arch., 420, p367-375 (1992), Biol. Mass Spectrom., 23, p590-595 (1994)) and liquid chromatography (Am. J. Clin. Pathol., 53 , p793-802 (1970)) and a method (JP-A-11-266896) for measuring with a general-purpose biochemical analyzer recently used in clinical laboratories. A suitable biochemical analysis method is preferred.
As described above, the insulin action in the present invention means a decrease in blood glucose concentration due to insulin, and reflects the secreted amount of insulin (blood concentration) and the effectiveness of insulin (= use efficiency of glucose). It is. The decrease in glucose utilization efficiency is said to be insulin resistance, but this is also due to the decrease in glucose utilization in peripheral tissues such as muscle and adipose tissue and the suppression of glucose release in the liver and kidney. It is explained by both sides. As will be described later, glucose release is promoted by the decomposition of glycogen in the liver, and mannose is released together with glucose. Since the inhibitory effect of insulin on glucose release in the liver is known, changes in blood mannose readings over time can be tested to determine whether insulin resistance is due to a decrease in glucose utilization or a decrease in glucose release. And This method of testing for insufficient insulin action in organs such as the liver is also included in the present invention.
[0010]
The blood used in the present invention is whole blood, plasma or serum, with plasma or serum being preferred.
The measurement of the blood mannose concentration in the present invention is preferably performed in a scene where the blood insulin concentration is expected to fluctuate. For example, before and after a glucose tolerance test on an empty stomach, before and after a meal in daily life, before and after the loading of a drug that causes fluctuations in insulin, before and after exercise, before and after sleep, etc. What is necessary is just to analyze by the method convenient for the diagnosis of the insulin resistant patient by obesity, and grasp of a more detailed disease state.
[0011]
The glucose load in the present invention may be any method as long as it can be efficiently loaded, and is not particularly limited. There are daily diet tolerance tests, oral tolerance tests (OGTT) such as glucose and maltose, which are frequently used as a diagnostic method for diabetes, and glucose tolerance tests by intravenous injection, preferably OGTT, and OGTT for diabetes testing It can also be done at the same time.
[0012]
Furthermore, in the measurement of blood mannose concentration under glucose load, insulin is secreted in response to glucose, and it is considered that mannose fluctuates due to the secreted insulin. It is appropriate to measure at a later time from the vicinity of. As will be described later, the minimum value of the mannose concentration in the glucose tolerance test in normal rats is 20 minutes later, but in humans (healthy subjects) it gradually decreases after glucose loading and reaches the minimum value after 120 minutes (before glucose loading). Of about 80 to 80%). The optimum observation point for analyzing the fluctuation of the mannose value varies depending on the species difference of animals. In the case of humans, the measurement is preferably performed at 10 minutes to 3 hours after loading, more preferably at 30 minutes to 2 hours after loading.
[0013]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to experimental examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
[0014]
Example 1 Insulin tolerance test cannulation As a normal rat, Wistar rats (Acupuncture, 240-270 g, Nippon Claire) were anaesthetized, unrestrained and unstressed and continuously blood-collected from the same individual. Surgery to place a cannula was performed. Specifically, under Nembutal anesthesia, the rat was held in a dorsal position on a holding table, the area around the upper right jugular vein was shaved, and the skin where the jugular vein was beating was incised. The connective tissue was bluntly detached using forceps, the jugular vein was exposed, sutures (No. 2) were applied to the rostral side and caudal side of the jugular vein, and the rostral thread was tightly tied. The caudal thread was left loose.
Blood flow from the heart side was stopped with a clip, a small cut was made in the blood vessel with a Weckel scissors, and a cannula filled with 10 U / mL of heparin-added physiological saline (heparin diet) was inserted. The pectoral muscle was sewed with a thread that had been hung on the stopper of the cannula in advance, and the cannula was fixed. Further, the skin on the dorsal side of the neck was cut small, forceps were inserted from the cut, the cannula was pulled out, and passed through the center hole of the cannula case body. The case was fixed to the dorsal skin with a suture (No. 4). An appropriate amount of heparinized diet was injected so that no blood remained in the cannula, and after filling the cannula inside the cannula, the tip was tied and stoppered and stored in a case.
[0015]
0.25 U / mL insulin was administered from the administration and blood collection cannula, and 80 μL of blood was collected from the cannula 5 times before administration, immediately before administration, and 5, 10, 20, 30, 45, 60 minutes after administration for a total of 8 times. .
[0016]
Blood glucose measurement Using 20 μL of whole blood collected, blood glucose level was measured by Antsense II (Bayer Sankyo).
[0017]
Measurement of mannose Add 50 μL of heparinized diet to 50 μL of whole blood collected, centrifuge at 7,500 × g for 15 minutes, add 10 μL of 1.5 M perchloric acid to 70 μL of the supernatant, and cool with ice. After standing for 10 minutes, the protein was removed by centrifugation at 7,500 × g for 15 minutes. The mannose concentration in the supernatant was quantified using a liquid chromatography analyzer (HPLC) with a sugar analysis column set under the following conditions.
[0018]
HPLC condition column: Finepak gel SA-121
Column temperature: 80 ° C
Column flow rate: 0.5 mL / min Mobile phase: Buffer A (0.25 M boric acid solution), Buffer B (0.60 M boric acid solution)
Mobile phase composition: A / B = 8/2 (0 minutes) → 6/4 (17 minutes) Linear gradient Reaction reagent: 20% acetonitrile aqueous solution containing 100 mM boric acid, 50 mM guanidine hydrochloride and 0.5 mM sodium periodate Reaction temperature: 160 ° C
Reagent flow rate: 0.5 mL / min Fluorescence detection: excitation wavelength 310 nm, detection wavelength 415 nm
[0019]
Experimental results These results are shown in FIG. From this, it was considered that blood mannose decreased in response to insulin.
[0020]

[0021]
Example 2 Glucose tolerance test In place of the insulin in Example 1, 1 mL of a 50% glucose solution was loaded on normal Wistar rats and GK rats (♂, 180-200 g, CLEA Japan), which is a type 2 diabetes model. The test was conducted. These results are shown in FIG. 2 (normal Wistar rats) and FIG. 3 (diabetic GK rats). In both cases, the blood glucose level reached a peak after 5 minutes, but the mannose level was delayed by about 20 minutes, reaching a minimum value after 20 to 30 minutes. Since insulin secretion in normal rats is usually almost parallel to glucose, it showed a tendency to be delayed by about 5 to 10 minutes from insulin loading by the time required for insulin secretion. Furthermore, in order to compare changes in blood mannose concentration between normal rats and diabetic rats, the amount of decrease in mannose value and the amount of decrease relative to the pre-load value at 20 minutes after glucose loading when the mannose concentration almost reached the minimum. (%) Was obtained and shown in Table 2. The ratio of decrease in mannose value and decrease in pre-load value in diabetic rats was significantly reduced to about 1/3 and 1/4 of normal rats, respectively. This is thought to reflect the lack of insulin action in diabetic rats.
[0022]

[0023]
Example 3 Glucose Tolerance Test 2
Cannulation was conducted in the same manner as in Example 1 on Wistar rats (♂, 7 weeks old, Japan Claire) as normal cannulation rats and GK rats of type 2 diabetes model (モ デ ル, 9 weeks old, Japan Claire). I did it.
[0024]
1 mL (2 g / kg) of 50% glucose solution was administered from the administration and blood collection cannula, immediately before administration (0 minutes), and 2, 5, 7, 10, 15, 30 minutes after administration. Blood was collected.
[0025]
Blood glucose measurement was performed in the same manner as in Example 1.
90 μL of heparin 10 U / mL raw diet was added to 90 μL of whole blood collected by mannose measurement, and centrifuged at 7,500 × g for 15 minutes. 18.5 μL of 1.5 M perchloric acid was added to 120 μL of this supernatant, left for 10 minutes under ice cooling, and then deproteinized by centrifugation at 7,500 × g for 15 minutes. The mannose concentration in the supernatant was measured under the same conditions as in Example 1 using a liquid chromatography analyzer (HPLC).
[0026]
Insulin measurement Whole blood was centrifuged at 7,500 × g for 10 minutes, and 5 μL of the supernatant was used to measure the insulin concentration with an ELISA measurement insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Laboratories).
[0027]
These results are shown in FIG. 4 (normal Wistar rats) and FIG. 5 (diabetic GK rats). Both blood glucose levels peaked after 2 minutes. In normal rats, a large amount of insulin was released in response to blood glucose, while in GK rats, insulin was present but changed very little. Reflecting this, the mannose value of normal rats gradually decreased and decreased by 34 μM after 30 minutes. On the other hand, in the GK rat, it decreased only 1.7 μM. These values are summarized in Table 3 to further clarify the relationship between insulin and mannose. From these results, it was revealed that the mannose value is not blood glucose but is changed by insulin.
[0028]

[0029]
Example 4 Human glucose tolerance test A 75 g oral glucose tolerance test (75 gOGTT) was performed on healthy subjects, and changes in plasma glucose concentration and mannose concentration were followed. The results are shown in FIG. As is apparent from this figure, the mannose value in humans gradually decreased after sugar loading and reached a minimum value after 120 minutes. As described above, since the minimum value in the rat is 20 minutes later, it can be seen that the optimal observation point for analyzing the fluctuation of the mannose value varies depending on the species difference of the animal.
[0030]
Example 5 Perfusion experiment in rat liver (Mannose release from liver)
Preparation of rat perfused liver (Miller type)
Wistar rats (♂, 310-400 g, Japan Claire) were opened under pentobarbital anesthesia (0.1 mL / 100 g body weight), and perfusion liver separation was performed. That is, loosely apply two threads to the portal vein (one with the hepatic artery, the other with the small intestine side, only the portal vein), and after inserting the cannula (diameter 1.1 mm), 0.6 mL of heparin, which was fixed tightly with a thread and diluted to 333 U / mL, was injected with a syringe. The perfusate from the perfusion device was pumped into the liver through a cannula at a pump flow rate of 30 mL / min, and the abdominal vena cava was immediately cut at a position below the right kidney. The cannula was tied with a thread on the liver side and fixed, and at the same time, the hepatic artery was ligated. At this stage, the blood in the liver was almost lost, and the liver became pale yellow. The chest was opened and the descending vena cava was cut. In the position just above the right kidney, the abdominal vena cava was ligated with a thread, and the perfusate was allowed to flow in from the portal vein side, passing through the liver and flowing out from the descending vena cava. Finally, it was isolated from other organs so as not to damage the liver.
[0031]
Liver perfusion and drug administration A perfusate previously bubbled with a mixed gas of 95% oxygen and 5% carbon dioxide was inhaled using a peristaltic pump, and after removing small bubbles with an air trap, it was instantaneously 37 ° C with a hot water circulating heater. It was fed into the liver through the portal vein cannula while warming. The liver was placed on a mesh and covered with a plastic case to maintain humidity and temperature. In addition, light (100 W) was irradiated from the upper part of the liver so that the temperature became 37 ° C. While the perfusate was sent to the separated liver at a flow rate of 30 mL / min, the perfusate was allowed to stand on the mesh for about 15 minutes, and then the perfusate was collected 6 times every minute for 6 minutes. At the end of 2 minutes from the beginning of this collection, the perfusion line valve was switched and 0.2 μg / mL epinephrine was added to allow the perfusate to flow.
[0032]
The perfusate was 5 mM glucose, 118 mM sodium chloride, 4.7 mM potassium chloride, 2.5 mM calcium chloride, 1.2 mM potassium dihydrogen phosphate, 1.2 mM magnesium sulfate, 24.2 mM sodium bicarbonate (pH 7. The glucose-added Krebs-Ringer solution consisting of 4) was used.
[0033]
Relationship between glucose release and mannose release FIG. 7 shows the results of measuring the glucose and mannose concentrations in the collected perfusate and comparing the kinetics associated with the release of hepatic glucose. Epinephrine is a drug that promotes glycogenolysis in the liver and promotes glucose release. However, when epinephrine was refluxed, the amount of mannose released was also promoted almost in parallel with the amount of glucose released. From this, fluctuations in the mannose level in blood reflect the state of glucose release from organs such as the liver. Therefore, the decrease in mannose value by insulin reflects the decrease in glucose release from organs such as the liver. It is considered a thing.
【The invention's effect】
By measuring blood mannose levels and analyzing changes over time, it is possible to easily grasp the degree of insulin action deficiency, and in particular, it is possible to grasp the state of suppression of glucose release from organs such as the liver by insulin. In combination with other markers such as blood glucose-related markers, the pathology of diseases associated with diabetes or obesity, for example, whether insulin action deficiency in diabetes is due to a decrease in the ability to suppress glucose release or a decrease in glucose utilization It is expected that it will become a marker for knowing the effect of inhibiting the release of hepatic glucose by insulin.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of an insulin tolerance test on normal rats.
FIG. 2 shows the results of a glucose tolerance test on normal rats.
FIG. 3 shows the results of a glucose tolerance test on diabetic rats.
FIG. 4 shows the results of a glucose tolerance test on normal rats with added insulin measurements.
FIG. 5 shows the results of a glucose tolerance test on diabetic rats with added insulin measurements.
[Fig. 6] Glucose and mannose dynamics in glucose tolerance test in healthy subjects (human). [Fig. 7] Glucose and mannose dynamics in rat perfused liver.

Claims (3)

血中マンノース濃度の測定値であって、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後または就眠前後の経時変化を用いることを特徴とするインスリン作用不足の検出方法。Measured blood mannose concentration using the time course before and after fasting glucose tolerance test, before and after meals in daily life, before and after drug loading that causes insulin fluctuations, before and after exercise, or before and after sleep. A method for detecting insufficient insulin action. インスリン作用不足がグルコース放出の抑制の低下に起因するインスリン作用不足である請求項１記載の検出方法。The detection method according to claim 1, wherein the insufficient insulin action is insufficient insulin action due to a decrease in suppression of glucose release. インスリン作用不足を検出するための血中マンノース濃度の、空腹時におけるグルコース負荷試験前後、日常生活における食事の前後、インスリンの変動を来すような薬剤の負荷前後、運動負荷前後または就眠前後の経時測定値間の差の使用。Blood mannose concentration to detect insufficient insulin action, before and after fasting glucose tolerance test, before and after meals in daily life, before and after loading with drugs that cause insulin fluctuations, before and after exercise, or before and after sleep Use of differences between measurements.

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