JP4528872B2 - ニトリラーゼ、それらをコードする核酸及びそれらの作製と使用 - Google Patents
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Description
別のアプローチは、単一エナンチオマー化合物でエナンチオマー混合物を化学的に誘導体化することである。このようにして、あるアキラルな定常相において分離することができる精製されたジアステレオマー混合物を生成する。ここでも、これは扱いにくいアプローチで、ハイスループットスクリーニングには適していない。
本発明は、本発明のポリペプチドの少なくとも一つを含む酵素標品を提供し、その標品は、液体又は乾燥品である。その酵素標品は、緩衝液、補欠因子、あるいは第二又は追加タンパク質を含む。一例として、その標品は、固相支持体に結合される。本発明の一例として、固相支持体は、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、極小電極及びそれらの如何なる組み合わせでもよい。他の一例として、その標品は、ゲル又はビーズに包埋されることができる。
更に、本発明は、ニトリラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドの少なくとも一つ又はその断片、あるいはそのペプチド擬似体、又はそれらの組み合わせを含む本発明の核酸を少なくとも一つ含む組成物を提供する。
本発明は、ニトリラーゼ活性にとって適切な条件において、ニトリラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドの少なくとも一つ又はその断片、あるいはそのペプチド擬似体と分子とを接触させることを含む、前記分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を加水分解するための方法を提供する。
本発明は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種の作製法を提供し、その変種は、天然に存在するニトリラーゼとは異なる生物学的活性を有している。この方法には、以下の工程(a)が含まれている:(a)(i)天然、若しくは非天然のヌクレオチド中の一以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドに置換すること;(ii)一以上のヌクレオチドを削除すること; (iii)一以上のヌクレオチドを付加すること;または(iv)これらの何れかの組み合わせ、によって核酸を改変する工程。一例として、この非天然のヌクレオチドにはイノシンが含まれている。他の一例として、この方法には、その改変された核酸によりコードされるポリペプチドの、改変されたニトリラーゼ活性に対するアッセイも含まれており、このアッセイにより、改変されたニトリラーゼ活性を有する、改変された核酸によりコードされるポリペプチドが同定される。一例として、工程(a)の改変は、PCR、変異性 PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異法、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR 変異法、インビボ突然変異、カセット変異法、再帰的アンサンブル変異法、エクスポネンシャルアンサンブル変異法、部位特異的変異法、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子飽和部位変異法、リガーゼ連鎖反応 (ligase chain reaction)、インビトロ突然変異、オリゴヌクレオチド合成、若しくはその他のDNA 作製技術やこれらの組み合わせによる工程により行われる。他の一例として、この方法は改変工程(a)を少なくとも一回は反復することを含む。
本発明は、以下を含むキットを提供する:(a)ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードした本発明の核酸又はその断片、又は、(b)本発明のポリペプチド、又はニトリラーゼ活性を有するその断片又はペプチド擬似体、又はその組み合わせ;及び、(c)緩衝液 。
本発明は、以下を含む、分子を改変するための方法を提供する:(a)反応混合物を生成するために、ニトリラーゼ活性を有する本発明のポリペプチド又は断片又はそのペプチド擬似体を出発分子と混合すること;(b)前記出発分子を前記ポリペプチドと反応させて改変分子を生成すること。
本発明は、改変された化合物を同定するための方法を提供する。その方法は、以下を含む:(a)本発明のポリペプチド、又はニトリラーゼ活性を有する断片若しくはそのペプチド擬似体と出発化合物とを混合し、反応混合物、及びその後、改変出発化合物のライブラリーを生成すること;(b)前記ライブラリーを試験し、所望の活性を示す改変された出発混合物がライブラリー中に存在するかどうかを決定すること;(c)所望の活性を示す改変された化合物を同定すること。
本発明は、ニトリラーゼ、ニトリラーゼにコードされた核酸、及びその使用に関連する。この中で使用される「ニトリラーゼ」という用語は、ニトリラーゼ活性、例えば、カルボン酸とアンモニアへ対応するニトリルの加水分解する能力、を有するどのようなポリペプチドをも含む。ニトリラーゼは、エナンチオマー選択的な芳香族及び脂肪族アミノ酸又はヒドロキシ酸の合成に使用される生体触媒として商業的有用性を有する。
本発明のニトリラーゼは、更に以下の特徴を共有する:(1)約333アミノ酸から約366アミノ酸という完全長アミノ酸配列、(2)約2サブユニットから約16サブユニットのホモマルチマーとしての集合と活性、(3)Glu-Lys-Cys連続アミノ酸の触媒トリアッドの存在、(4)約pH5から約pH9までの最適pH、及び、(5)約0℃から約100℃、あるいは約40℃から約50℃の至適温度。
本明細書中に開示するニトリラーゼは、バイオインフォマティクス及び配列比較プログラムを利用して調べられ、以下の共通した情報が収集された。保存モチーフの三つの領域が、ニトリラーゼポリペプチド内に同定された。これらは、ニトリラーゼ酵素中に存在する触媒トリアッド(E-K-C)に対応する(H. Pace and C. Brenner (Jan. 15、2001) "The Nitrilase Superfamily:classification、structure and function" Genome Biology Vol. 2、No. 1、pp 1-9)。
ニトリラーゼスーパーファミリーのニトリラーゼブランチ中のニトリラーゼの配列は、触媒トリアッドを持つものとして、PaceとBrennerの論文(Genome Biology、2001、Vol. 2、No. 1、pp. 1-9)中で述べられている。しかしながら、本発明のニトリラーゼの触媒トリアッド領域は、PaceとBrennerの引用において同定されたものと、以下の点において異なる。
本発明は、また、第一共通部分配列がFPETFであり、第二共通部分配列がRRKLXPTであり、第三共通サブ配列がLXCWEXXXPである三つの共通部分配列を含む、ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供する。
本発明は、また、第一共通部分配列がFPEXXであり、第二共通部分配列がXRKLXPTであり、第三共通サブ配列がLXCWEXXXPである三つの共通部分配列を含む、ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供する。
本明細書において「アルケニル (alkenyl) 」とは一つ以上の炭素-炭素二重結合を有し、2〜24 個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖、若しくは環状炭化水素基を意味する。
本明細書において「アルキニル (alkynyl) 」とは、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有し、2〜24 個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖、若しくは環状炭化水素基を意味する。
本明細書において「複素環 (heterocyclic) 」とは、一以上のヘテロ原子 (例えば、窒素、 酸素、 硫黄、リン、セレン、ホウ素など) をその環構造中に含み、約3 から約14 個の炭素原子を有する環状基を意味している。
本明細書において「アリール (aryl) 」とは、約6 から約14 個の炭素原子を含む芳香基 (即ち、共役二重結合系を有する環状基) を意味している。
本明細書中で使用される「若しくは」、「又は」とは、ある特定のリスト中の何れかの構成要素、及びそのリスト中の構成要素の組み合わせのうちの何れのものをも含んでいる。
更に、本明細書中で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合、若しくは改変されたペプチド結合(例えば、ペプチドイソスター)でお互いに連結されたアミノ酸を意味し、これらは遺伝子によりコードされる20種類のアミノ酸以外の改変されたアミノ酸を含み得る。これらのポリペプチドは、翻訳後修飾などの天然に存在するプロセス又は当業者に良く知られている化学的技術により改変することができる。これらの改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端など、そのペプチドの何れの部位においても可能である。同様のタイプの改変が、そのポリペプチド中の数ヶ所において、同一又は異なる程度に存在し得ることを理解するべきである。また、ポリペプチドは、多くのタイプの改変を受けることができる。これらの改変には、これらに限定されないが、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、共有結合的クロスリンク又は環化、フラビンの共有結合、ヘムの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、シスチン又はピログルタミン酸の形成、フォルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPI アンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ポリエチレングリコール化 (PEGylation) 、タンパク質加水分解酵素処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫化、及びアルギニル化などのtRNA により媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加 [Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed.、T.E. Creighton、W.H. Freeman and Company、New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C. Johnson、Ed.、Academic Press、New York、pp. 1-12 (1983) を参照] などが含まれる。
本明細書中で使用される「アミノ酸配列」は、アミノ酸残基を表している略語、文字、符号、若しくは単語のリストを意味している。
本明細書において、二又はそれ以上の核酸配列に関して、二つの配列が最大の一致を示すように整列され、上述の配列比較アルゴリズムを使用して比較したときに、これらが少なくとも99.5%のヌクレオチド同一性を示す場合、これら二つの配列は「実質的に同一」である。更に、これらの配列が実質的に同一であるかどうかを決定する上で、コード領域中の同一のアミノ酸をコードするコドンは、遺伝子コードの縮重性を考慮して、同一であると扱うことが出来る。典型的には、実質的同一性の決定が行われる領域は、少なくとも20残基の範囲であり、より一般的には、これらの配列は少なくとも25か200残基の範囲にわたって実質的に同一である。
既知の配列に基づくペプチド擬似体の作製法は、例えば、米国特許5,631,280;5,612,895;及び5,579,250に記載されている。ペプチド擬似体の利用には、非アミド結合による目的の位置への非アミノ酸残基の導入が含まれている。本発明の一例には、結合、ペプチド骨格、若しくはアミノ酸成分が適当な擬似体で置換されたペプチド擬似体が含まれている。適当なアミノ酸擬似体となる非アミノ酸の例には以下の物質が含まれる:β-アラニン、L-α-アミノ酪酸、L-γ-アミノ酪酸、L-α-アミノイソ酪酸、L-ε-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-リジン、N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-リジン、L-メチオニンスルホン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、N-α-Boc-N-δCBZ-L-オルニチン、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-オルニチン、Boc-p-ニトロ-L-フェニルアラニン、Boc-ヒドロキシプロリン、Boc-L-チオプロリン。
サブクローニング等の分子生物学的手法は、当業者に良く知られている常法を利用して行われた(Sambrook、J. Fritsch、EF、Maniatis、T. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed.)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview NY を参照) 。
本発明の一側面として、本発明の全ての核酸配列、及び/又はポリヌクレオチド配列は、コンピューターによって読まれ、アクセスすることのできる如何なる媒体上にも保存、記録、及び細工することができる。この中で使用される用語「記録される」及び「保存される」とは、コンピューター媒体上に情報を保存するためのプロセスを意味する。本発明の他の一例は、配列番号1-386 に記載されている配列のうちの少なくとも 2、5、10、15、若しくは20の核酸配列、及びそれらの配列と実質的に同一の配列を保存できる、コンピューターが読み取り可能な媒体である。更に他の一例は、コンピューターによる本発明の核酸配列間又はポリペプチド配列間での比較、及び本発明の配列とその他の配列との比較である。コンピューター読み取り可能媒体には磁気的に読める媒体、視覚的に読める媒体、電気的に読める媒体及び磁気/視覚媒体を含む。例えば、これらのコンピューター読み取り可能媒体は、ハードディスク、フロッピィーディスク、磁気テープ、CD-ROM、デジタル多様ディスク(DVD)、ランダムアクセスメモリー(RAM)、あるいはリードオンリーメモリー(ROM) や、他のタイプの当業者に既によく知られている他の媒体でもよい。
具体的な一側面として、このコンピューターシステムは、バスを通じてメインメモリー(好ましくはRAMとして装備)と連結された処理装置、及び一つ又はそれ以上の、ハードドライブ及び/又はデータの記録された、コンピューター読み取り可能媒体のような内部データ保存装置を含んでいる。或る例においてこのコンピューターシステムは、更に、内部データ保存装置上に保存したデータを読むための一つ又はそれ以上の読み出し装置を含んでいる。
ニトリラーゼは、高純度化成品企業において、貴重な中間体、及び薬物の中間体であるキラルα-ヒドロキシ酸を産生するための重要な酵素として同定された。本発明のニトリラーゼ酵素は、キラルα-ヒドロキシ及びα-アミノ酸をそれぞれ生産するシアノヒドリン及びアミノニトリルの立体選択的な加水分解の触媒に有用である。
別例として、本発明は、グループA核酸配列に示される核酸配列の一部分に同一な少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸、または、それに実質的に同一な配列、あるいはそれに相補的な配列を有する、ヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。
別例として、本発明は、グループBアミノ酸配列に示される配列を有する、あるいはそれに実質的に同一な配列を有するポリペプチドをコードした単離核酸を提供する。
別例として、本発明は、グループBアミノ酸配列に示されるような配列の一部分に同一な少なくとも10個の連続するアミノ酸、あるいは実質的にそれと同一の配列を有するポリペプチドをコードした単離核酸を提供する。
別例として、本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する単離抗体を提供する。本発明は、また、特異的にそのポリペプチドと結合する能力を有する抗体断片をも提供する。
別例として、本発明は、グループBアミノ酸配列に示される配列、及びそれに実質的に同一な配列を有するポリペプチドの作成方法を提供する。その方法は、そのポリペプチドをコードした核酸を宿主細胞中へ導入すること、及びその核酸の発現が可能な条件下で宿主細胞を培養することを含む。前記核酸は、動作可能にプロモーターに結合されている。
別例として、本発明は、グループBアミノ酸配列に示される配列に由来する少なくとも10個の連続するアミノ酸、及びそれと実質的に同一な配列を有するポリペプチドの生成方法を提供する。その方法は、そのポリペプチドをコードした核酸を宿主細胞中へ導入すること、及びその核酸の発現が可能な条件下で宿主細胞を培養することを含み、それによってポリペプチドを生成する。前記核酸は、動作可能にプロモーターに結合されている。
別例として、本発明は、グループBアミノ酸配列のポリペプチドの酵素的機能を保持するグループBアミノ酸配列の機能的変種を同定するためのアッセイを提供する。そのアッセイは、グループBアミノ酸配列又はその一部の配列と同一の配列、グループBアミノ酸配列又はその一部と実質的に同一な配列、あるいはニトリラーゼ活性を保持するグループBアミノ酸配列の変種である配列、を有する連続アミノ酸残基を含むポリペプチドを、そのポリペプチドが機能できる条件下において、基質分子と接触させ、基質レベルの低下、又はポリペプチドと基質間における反応の特異的な反応生成物のレベルの上昇を検出する。それにより、そのような配列の機能的変種を同定することを含む。
酵素は、選択性の高い触媒である。その優秀な点は、従来の合成化学において類のない優れた立体選択性、レジオ選択性、及びケモ選択性を伴った触媒作用能力である。更に、酵素は、著しい多様性を有する。それらは、有機溶媒中での機能させるため、極度なpH(例えば、酸又は塩基の条件)、極度な温度(例えば、高温及び低温)、極度な塩濃度(例えば、高塩分及び低塩分)で処理させるため、及び酵素学的な活性部位以外、構造的に、それらの天然、生理学的基質とは関係のない化合物と反応を触媒させるために改変することができる。
本発明は、ニトリラーゼ活性を保持するが望ましい特徴に関して改良された新しいポリペプチドを得るために、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチド又はそのようなポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを改変するための方法を提供する。そのような改良には、有機溶媒中で機能する能力(例えば、ニトリラーゼ活性の呈示)、あるいは極度又は非特徴的pHで機能する能力、あるいは極度又は非特徴的温度で機能する能力、あるいは極度又は非特徴的塩濃度で機能する能力、あるいは異なる基質との反応触媒能力等が含まれ得る。
その境界点により定義されるビルディングブロックは、混合し(文献的に、溶液中で、あるいは理論的に、紙上又はコンピューターで)、キメラニトリラーゼ遺伝子を作製するために再アッセンブルすることができる。一側面として、その遺伝子再アッセンブリプロセスは、全ての可能な組み合わせから成る網羅的ライブラリーを作製するために、網羅的に行われる。換言するとその核酸ビルディングブロックの全ての可能な並びの組み合わせが一群の最終的なキメラ核酸分子中に提示される。しかしながら、それと同時に、各アッセンブリにおける5'から3'方向における各ビルディングブロックの集合順序は、その鋳型におけるその順序を反映し、望まない、機能しない産物の産生を抑えるように設計される。
いくつかの例において、ビルディングブロックが作製又は再構成される工程の合成的性質は、後に、インビトロのプロセス(例えば、変異導入)又はインビボのプロセス(例えば、宿主細胞の遺伝子スプライシング能力を利用)において任意に除去できるヌクレオチド配列(例えば、コドン又はイントロン又は調節配列)の設計と導入を可能にする。これらヌクレオチドの導入は、有用な境界点を形成させる潜在的利点を含む多くの理由から望ましいかも知れない。
二本鎖核酸のビルディングブロックは、様々なサイズのものでよい。これらビルディングブロックの好ましいサイズは、一塩基対(突出部は一切含まない)から100,000塩基対(突出部は一切含まない)までの範囲である。これ以外の好ましいサイズ範囲として、下限が1〜10,000塩基対(その間の全整数を含む)、上限が2〜100,000塩基対(その間の全整数を含む)も与えられる。
本発明は、生物学的に活性な変種ポリペプチド(例えば、ニトリラーゼ変種)をコードする組換えポリヌクレオチドの作製する手段を提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、ある微生物に由来するある特定酵素をコードするかもしれない。ある生物体に由来する第一のポリヌクレオチドによりコードされる酵素は、例えば、特別な環境条件、例えば、高塩度、の下で効果的に機能するかもしれない。異なる生物に由来する第二のポリヌクレオチドにコードされる酵素は、超高温のような、異なる環境条件下で効果的に機能するかもしれない。第一及び第二の元のポリヌクレオチドに由来する配列を含む組換えポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドによりコードされた両酵素の特性を示す酵素をコードする。従って、組換えポリヌクレオチドによりコードされる酵素は、第一及び第二のポリヌクレオチドによりコードされる両酵素の各々が共有する環境条件、例えば、高塩度及び超高温、の下で効果的に機能することができる。
興味対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅のために改変された慣用される栄養培地で培養することができる。温度、pH及びその類などの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞について用いたものと同様であり、通常の当業者には明らかであろう。特別の酵素活性を有するものとして同定されたクローンは、次に、好ましい活性又は性質を有する酵素をコードする組換えポリヌクレオチド配列を同定するために配列決定されるかもしれない。
従って、一側面として、本発明は、生物学的に活性な組換えニトリラーゼポリペプチドを作製及び下記の工程により、そのようなポリペプチドを好ましい活性及び性質についてスクリーニングするための方法に関連する:
1)少なくとも、第一のニトリラーゼポリヌクレオチド及び第二のニトリラーゼポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入する工程であって、前記第一のニトリラーゼポリヌクレオチド及び第二のニトリラーゼポリヌクレオチドが、配列相同性を有する少なくとも一つの領域を共有している、前記工程;
2)組換えニトリラーゼポリヌクレオチドを生じる配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖させる工程;
3)組換えニトリラーゼポリヌクレオチドによりコードされた組換えニトリラーゼポリペプチドを発現させる工程;
4)好ましい活性又は性質について前記組換えニトリラーゼポリペプチドをスクリーニングする工程;および、
5)前記組換えニトリラーゼポリペプチドをコードする組換えニトリラーゼポリヌクレオチドを単離する工程。
発現ベクター中のDNA配列は、RNA合成を誘導するための、プロモーターを含む適切な発現調節配列と動作可能に結合している。有用な細菌のプロモーターには、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダ PR、PL及びtrpプロモーターが含まれる。有用な真核生物のプロモーターには、CMV 前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期 SV40プロモーター、レトロウイルス由来LTRプロモーター、及びマウス メタロチオネインIプロモーターが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、関連技術における通常の技術のレベルで決定してよい。発現ベクターは、また、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位及び転写終了配列を含む。ベクターは、また、発現を増幅するために適切な配列含んでもよい。プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコール転移酵素)ベクター又は選択マーカーを有するほかのベクターを利用して、好ましいどのような遺伝子から選択してもよい。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、ウイルス感染、遺伝子銃、あるいはTi-媒介遺伝子導入を含む様々な技術により宿主細胞に導入されてもよい。特有の方法として、カルシウムリン酸によるトランスフェクション、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーション法が含まれる。
a)一本鎖で作製された場合に方向を提供するような、ポリAヘッド及びポリTテイルを含むプライマーを利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製し、その結果、容易にRnaseHで除去することによって達成される。
b)唯一の制限酵素部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、一組の固有の配列、ならびに反復合成及びライゲーション段階が必要であろう。
c)プライマー内部の数塩基は、チオール化することができ、更に、適切にテイルを施された分子を作製するためにエキソヌクレアーゼを使用することができる。
1)構築物の複雑度が低下した場合にのみ安定して維持されるベクターの使用。
2)短かくなったベクターの物理的操作による物理的回収。この場合、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離法及びアガロースゲル又は低分子量カットオフのカラムのいずれかを利用したサイズ分画により回収される。
3)挿入サイズが減少した場合に選択することができる中途切断された遺伝子を含むベクターの回収。
4)発現ベクター及び適切な選択法を利用した直接的な選択技術の使用。
他の例として、本発明は、N,N,G/T配列に比べてより少ない縮重を有する縮重カセットの使用を提供する。例えば、ある例では、一つのNだけを含む縮重トリプレット配列を使用することが望ましいかもしれない。このNとは、トリプレットの第一、第二又は第三番目の位置にある。如何なる組合せ及びここに含まれる変換を含む他のどのような塩基でもトリプレットの残った部位に使用することができる。代わりに、ある例では、縮重N,N,Nトリプレット配列又はN,N,G/Cトリプレット配列を使用することが好ましいかもしれない。
従って、各飽和変異誘発反応容器には、親ポリヌクレオチド中の変異されるコドンに対応する特定アミノ酸部位で20種のアミノ酸全てが表示されるように、少なくとも20種の子孫ポリペプチド分子をコードしたポリヌクレオチドが含まれる。各飽和変異誘発反応から得られる32倍に縮重した子孫ポリペプチドは、クローンを増幅(例えば、発現ベクターを用いて、大腸菌のような適した宿主にクローン化される)したり、発現スクリーニングにかけることができる。特性の好ましい変化(親ポリペプチドと比較して)を表示する個々の子孫ポリペプチドがスクリーニングによって同定された場合、その中に含まれた相当する好ましいアミノ酸置換を同定するために配列決定が行われる。
従って、非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、雑種ポリヌクレオチドが組換え及び還元的再構成により産生されるように、二種以上の関連ポリヌクレオチドが適切な宿主細胞に導入されるような付加的な他の変異プロセスとの組み合わせによる飽和変異法に由来されることができる。
変異カセットに導入されることのできる変異のグループ分けの特に好ましい具体例において、本発明は、特に、各部位で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20種のアミノ酸をコードする縮重コドン置換(縮重オリゴを使用)、及びこれによってコードされるポリペプチドのライブラリーを提供する。
以下に更に詳述されるように、本発明の単離核酸は、グループBのアミノ酸配列、それらと実質的に同一の配列、又はグループBのアミノ酸配列及びそれらと実質的に同一の配列の一つのポリぺプチドの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150連続アミノ酸を含む断片のポリペプチドの一つを調製するために使用することができる。
本発明は、また、本発明のポリぺプチド(例えば、グループBのアミノ酸配列)においてアミノ酸置換、付加、融合、切断を生じるヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドに関連する。そのようなヌクレオチドの変化は、部位特異的変異法、ランダム化学変異法、エキソヌクレアーゼIII欠失、又は他の組換えDNA技術のような手法を用いて導入されることができる。代わりに、そのようなヌクレオチド変化は、グループAの核酸配列、又はそれらと実質的に同一の配列(又は相補的な配列)の一つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500連続塩基を含むプローブに対して本明細書中に示された高い、中程度又は低いストリンジェンシーの下で特異的にハイブリッドする核酸配列を同定することにより単離された天然に存在する対立遺伝子変種であるかもしれない。
酵素、その断片、その酵素と断片をコードしている核酸は、固相支持体に固定化させることができる。これは、工業的工程での酵素の使用においてしばしば経済的であり効率が良い。例えば、特別な化学反応に用いられる酵素(又はその活性断片)の共同体又は反応混液は、固相支持体に結合させ、プロセスバットへ浸漬させることができる。その酵素反応が起こり得る。次に、反復使用のために、固相支持体をそれに付けた酵素とともにバットから取り出すことができる。本発明の一側面として、単離核酸を固相支持体に固定化させる。本発明の別例として、固相支持体は、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極及びそれらの組合わせの中から選ばれる。
酵素、その断片、又は核酸を固相支持体に固定化するために、当業者に知られる多くの方法がある。そのような方法のいくつかの例は、静電的小滴生成、電気化学的手段、吸着、共有結合、架橋、化学反応又は工程、封入、からみつきに、アルギン酸カルシウム、又はポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)による方法が含まれる。同様の方法がMethods in Enzymology、Immobilized Enzymes and Cells、Part C. 1987. Academic Press. Edit. S. P. Colowick and N. O. Kaplan. Volume 136:Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Edit. G. F. Bickerstaff. Series:Methods in Biotechnology、Edit. J. M. Walkerに記載されている。
試料中の相補的核酸の存在を検出するための標識プローブの使用に関する多くの方法は、当業者によく知られている。これらには、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法、又はドットブロットが含まれる。これらの方法の各々のプロトコールは、Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc. 1997やSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989に記載され、本明細書中にその全体が引用により取り込まれる。
グループA核酸配列中に示される単離核酸配列、それと実質的に同一な配列、相補的な配列、又は前述の配列の一つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500連続塩基を含む断片は、関連した核酸を同定分離するためのプローブとして使用することができる。いくつかの例において、関連した核酸は、核酸が分離された生物以外の生物に由来するcDNA又はゲノムDNAであってもよい。例えば、その他の生物は、関連した生物であってもよい。そのような工程において、核酸サンプルは、関連した配列に対してプローブが特異的にハイブリダイズできる条件下でプローブと接触させられる。次に、関連した生物由来の核酸に対するプローブのハイブイリダイゼーションは、上記方法のいずれかを用いて検出される。
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で行われる場合は、融解温度は、以下の式を用いて計算される:Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(G+C断片)-(0.63% ホルムアミド)-(600/N)(式中、Nはプローブの長さ) 。
ある生物体から選択的に単離されたクローンの多様性が得られた後、そのようなクローンは、特別な酵素活性及び特定された生物活性を有するクローンを同定するためにスクリーニングされる。
(a)DNAライブラリーに由来する一本鎖DNA集団とリガンドに結合したDNAプローブを、ストリンジェントなハイブイリダイゼーション条件下で接触させ、前記プローブと前記DNAライブラリーのメンバー間の二本鎖を形成させる;
(b)前記二本鎖を、前記リガンドに対して特異的に結合する固相パートナーと接触させる;
(c)前記DNAライブラリーの非二本鎖メンバーから前記固相二本鎖複合体を分離する;
(d)前記DNAライブラリーのメンバーを遊離させるために前記二本鎖を変性させる;
(e)前記メンバーを二本鎖DNAにするために、工程(d)のメンバーの相補的DNA鎖を作製する;
(f)前記メンバーDNAによりコードされたポリペプチドを発現させるために、前記二本鎖DNAを適切な宿主へ導入する;および、
(g)発現させたポリペプチドが特定の酵素活性を有するかを調べる。
(i)(a)の一本鎖DNA集団と、与えられたクラスのタンパク質に固有の分泌シグナル配列に対して相補的なリガンド結合オリゴヌクレオチドプローブとを、二本鎖DNAを形成するハイブイリダイゼーション条件下で接触させる;
(ii)(i)の二本鎖と前記リガンドに対する特異的結合固相パートナーとを接触させ、固相複合体を生成する;
(iii)(a)の一本鎖DNA集団から前記固相複合体を分離する;
(iv)前記二本鎖を変性させ、ゲノム集団の一本鎖DNAメンバーを遊離させる;および、
(v)プローブに結合した固相から一本鎖DNAを分離する。
プローブの標的への結合は、スクリーニングのプロセスでFACS装置により検出され選別される蛍光シグナルを生じる。
変種を作製する他の方法は、アッセンブリPCRである。アッセンブリPCRは、小さなDNA断片の混合物に由来するPCR産物のアッセンブリを含む。ある反応の産物が他の反応産物にプライムする多くの異なるPCR反応が同じ反応バイアル中で並行して起こる。アッセンブリPCRは、米国特許5,965,408に記載されており、これは本明細書中にその全体が引用により取り込まれる。
変種を作製する他の方法は、セクシュアルPCR変異法である。セクシュアルPCR変異法では、強制的相同組換えが、配列相同性に基づくDNA分子のランダム断片化の結果として、インビトロで異なっているが非常に関連性の高いDNA配列のDNA分子間で起こり、続いてPCR反応においてプライマー伸張によるクロスオーバーの固定が起こる。セクシュアルPCR変異法は、Stemmer、W.P.、PNAS、USA、91:10747-10751、1994に記載されそれは、本明細書中にその全体が引用により取り込まれる。概要として、そのような手順では、組換えられる複数の核酸が、Dnaseにより平均サイズが50-200ヌクレオチド断片に消化される。好ましい平均サイズを有する断片が精製され、PCR混合物中に再懸濁される。PCRは、核酸断片間の組換えを容易にする条件下で行われる。例えば、PCRは、10-30ng/μl濃度の精製した断片を0.2mMの各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mMトリスHCl、pH 9.0、0.1% トリトンX-100の溶液に再懸濁することにより行うことができる。100μlの反応混合液に対して2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、次のレジメを用いてPCRを行う: 94℃で60秒間、94℃で30秒間、50〜55℃で30秒間、72℃で30秒間(30〜45回)、72℃で5分間。しかしながら、これらのパラメータは、適時変えてもよいことは理解される。一側面として、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含めてもよい。他の例において、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片をPCR反応の最初のセットに用いることができ、Taqポリメラーゼは、それに引き続くPCR反応のセットに用いられてもよい。組換え配列は分離され、コードしているポリぺプチドの活性が評価される。
変種は、また、インビボ変異法により作製することができる。ある例において、興味対象の配列内のランダム変異は、DNA修復経路に一以上の変異を有するE. coli株のような細菌株中において、興味対象の配列を増殖させることにより作製される。そのような “変異導入”株は、野生型の親よりランダム変異率が高い。そのような株の1つにおいてDNAを増殖すると、最終的にそのDNA内にランダム変異が生じる。インビボ変異法に用いるために適した変異導入株は、PCT WO 91/16427に記載され、それは、本明細書中にその全体が引用により取り込まれる。
変種は、また、カセット変異法を用いて作製することができる。カセット変異導入において、二本鎖DNA分子の小領域が、元の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置き換えられる。そのオリゴヌクレオチドは、往々にして、ランダム化された元の配列を完全に及び/又は部分的に含む。
再帰的アンサンブル変異法を用いて変種を作製してもよい。再帰的アンサンブル変異法は、アミノ酸配列が異なり、表現型の関連した変種の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質操作(タンパク質変異法)のためのアルゴリズムである。この方法は、連続ラウンドのコンビナトリアルカセット変異法を制御するためにフィードバックメカニズムを用いる。再帰アンサンブル変異法は、Arkin、A.P. and Youvan、D.C.、PNAS、USA、89:7811-7815、1992に記載され、本明細書中にその全体が引用として取り込まれる。
いくつかの例において、変種は、エクスポネンシャルアンサンブル変異法を用いて作製される。エクスポネンシャルアンサンブル変異法は、高割合のユニークで機能的な変種を有する組換えライブラリーを作製する方法であって、それぞの変異部位で機能的タンパク質に導くアミノ酸を同定するために小グループの残基が同時にランダム化される。エクスポネンシャルアンサンブル変異法は、Delegrave、S. and Youvan、D.C.、Biotechnol. Res.、11:1548-1552、1993に記載され、本明細書中にその全体が引用として取り込まれる。
無作為及び部位特異的変異法は、Arnold、F.H.、Current Opinion in Biotechnology、4:450-455、1993に記載され、本明細書中にその全体が引用として取り込まれる。
いくつかの例おいて、変種は、異なるポリぺプチドをコードしている複数の核酸の一部が共に融合してキメラポリぺプチドをコードするキメラ核酸配列を作製するシャッフリング法を利用して作製される。それは、米国特許5,965,408及び5,939,250に記載され、そのそれぞれは、本明細書中にその全体が引用として取り込まれる。
グループBのアミノ酸配列のポリぺプチドの変種は、グループBのアミノ酸配列のポリぺプチドの1つ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存的アミノ酸残基(例えば、保存的アミノ酸残基)で置換された変種であってもよく、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであってもなくてもよい。
保存的置換は、ポリぺプチド内のあるアミノ酸を同じような特性を有する他のアミノ酸で置換するものである。典型的には、保存的置換として見られるのは次の置換である:Ala、Val、Leu、又はIleのような脂肪族アミノ酸を他の脂肪族アミノ酸で置換する;SerをThrで置換する又はその逆の置換;AspやGluのような酸性残基を他の酸性残基で置換する;AsnやGlnのようなアミド基をもつ残基をアミド基をもつ他の残基で置換する;LysやArgのような塩基性残基を他の塩基性残基で置換する;Phe、Tyrのような芳香族残基を他の芳香族残基で置換する。
他の変種は、ポリぺプチドをポリぺプチドの半減期を増大させるような他の化合物(例えば、ポリエチレングリコール)と結合させたものである。
更なる変種は、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリぺプチドの精製、富化、又は安定化を促進させる配列のようなポリぺプチドに融合しているものである。
ある側面において、断片、誘導体、又は類似体は、グループBのアミノ酸配列のポリぺプチドやそれと実質的に同一の配列と同じ生物機能又は活性を保持している。別の側面として、断片、誘導体、又は類似体は、その断片、誘導体、又は類似体はプロタンパク質部分を切断されることにより活性化され、活性ポリぺプチドを生産するようなプロタンパク質を含む。
本発明の抗体は、固相支持体に結合することができ、本発明のニトリラーゼの固定化に利用することができる。そのような固定化ニトリラーゼは、前述されたように、ニトリルの広範囲に及ぶ有用な産物及び中間体への変換のための商業的プロセスに利用することができる。
本発明は、一以上の本発明のニトリラーゼをコードしている核酸(又はそれらの活性断片)で形質転換された細胞全体の使用を提供する。本発明は、また、ある基質のニトリラーゼ反応を起こしているそのような細胞全体の使用を提供する。従って、本発明は、この中に開示された少なくとも一つの核酸又はポリペプチド(配列番号1〜386)を含む細胞全体を用いた、シアノヒドリン又はアミノニトリル結合を加水分解する方法を提供する。例えば、あるニトリラーゼをコードしている核酸で安定に形質転換された細胞全体(本発明は、また、一過性にトランスフェクション又は形質転換された細胞全体も含む)は、本発明の一つの例である。そのような細胞は反応混合物中で基質に作用し、ニトリラーゼ活性を示す試薬として有用である。
二以上の配列間のパーセント同一性又は相同性は、典型的には配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、Madison、WI)を用いて測定することができる。そのようなソフトウェアは、パーセント同一性又は相同性を種々の欠失、置換、及び他の改変に帰属させることにより、類似の配列をマッチングさせる。二以上の核酸又はポリペプチド配列の関係に関する用語「パーセント同一性」は、指定された領域又は比較「ウィンドウ」の最大対応に対して比較し整列させた場合に同じであるヌクレオチド又はアミノ酸配列のパーセンテージを意味する。あるアルゴリズムの下では、保存的アミノ酸置換は「同一」であると考えることができ、コドンのゆらぎの部位における置換も「同一」であると考えることができる。
配列比較のために、典型的な一配列が対照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使用された場合、試験及び対照配列は、コンピューターに入力され、必要である場合にはサブ配列が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが特別なアルゴリズムのために指定される。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、又は代替的パラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に相対する試験配列のパーセント同一性又は相同性を計算する。
α-ヒドロキシ酸-ニトリラーゼは、シアノヒドリンの加水分解によりα-ヒドロキシ酸を生成する。マンデル酸やその誘導体の生成はこの一例である。この反応の重要な応用には、高収率、且つ高度に立体選択的なマンデロニトリルからの(R)-マンデル酸の商業的生産が含まれる。マンデル酸やその誘導体は、多くのキラル医薬品や農業用試薬生産における中間体及び解決試薬として広範に利用されている。数種の既知ニトリラーゼを利用した類縁基質を用いた方法による従来の試みは、非常に低い活性、生産性、及び選択性という問題を抱えている。
その他の利用法は、高収率、且つ高度に立体選択的な、(S)-フェニル乳酸の誘導体の生産である。フェニル乳酸誘導体は、多くのキラル医薬品や農業用試薬の生産に利用される。
ニトリラーゼは、商業的に重要な材料として、4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸のエナンチオマーの何れかを生産するために利用され、その(R)-エナンチオマーは、医薬品LIPITORTM の合成における主要な中間体である。
(1) 配列番号195、205、207、209、又は237と少なくとも50%の配列同一性を有する配列、または、配列番号195、205、207、209若しくは237の変種配列であって部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG又はACG;部位571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異を有する配列、又はその組み合わせを有する変種配列、を有する単離核酸または組換え核酸、又はそれらの断片であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸又は断片、またはそれらの相補物。
(2) 配列番号195、205、207、209、又は237と実質的に同一の配列を有するヌクレオチド、または、配列番号195、205、207、209若しくは237の変種配列であって部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位 178-180 GAA 又はGAG; 部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する配列を有するヌクレオチド、又は、それらの相補物を含む、請求項1記載の単離核酸または組換え核酸。
(3) 配列番号195、205、207、209、又は237と同一の配列若しくは前記配列の相補配列を有するヌクレオチド、または、ニトリラーゼ活性を有するそれらの断片、またはそれらの相補物を含む、単離又は組換え核酸。
(4) 以下のヌクレオチドを含む単離又は組換え核酸:配列番号195、205、207、209、又は237の部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA 又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する配列を有するヌクレオチド、ニトリラーゼ活性を有するそれらの断片、又はそれらの相補物。
(5) 以下の核酸とハイブリダイズする単離又は組換え核酸、または、ニトリラーゼ活性を有するそれらの断片、又はそれらの相補物:配列番号195、205、207、209、又は237の配列を有する核酸、又は前記配列の部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA 又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位 571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを含む変種配列を有する核酸。
(6) ストリンジェンなコンディションが、少なくとも50%ホルムアミド、約37℃から約42℃の温度を含む、(5)記載の単離又は組換え核酸。
(7) 約15ヌクレオチドから約50ヌクレオチドを含む核酸プローブであって、少なくとも15の連続したヌクレオチドが、
配列番号195、205、207、209、若しくは237の配列、又は、
配列番号195、205、207、209、又は237の部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA 又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位 571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する変種配列、又は、
それらの相補物、
中の核酸標的領域に対して少なくとも50%の相同性を有する前記核酸プローブ。
(8) 以下の配列中の核酸標的領域の少なくとも15連続ヌクレオチドを含む核酸プローブ:配列番号195、205、207、209、又は237の配列、又は配列番号195、205、207、209、又は237の部位163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA 又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位 571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する変種配列、又はそれらの相補物。
(9) (1)から(6)、(12)、又は(13)のいずれかに記載の核酸を含む、宿主細胞での複製が可能な核酸ベクター。
(10) (1)〜(6)、(12)、又は(13)のいずれか1項記載の核酸を含む宿主細胞。
(11) (10)記載の宿主細胞を含む宿主生物。
(12) 以下の配列と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸または、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片、またはそれらの相補物:配列番号196、206、208、210 又は238、あるいは配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンの少なくとも一つ以上に変異又は前記変異の組み合わせを有する配列。
(13) 以下の配列を有するアミノ酸配列を含む単離又は組換え核酸、または、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片、又はそれらの相補物:配列番号196、206、208、210 又は238配列、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンの少なくとも一つ以上または前記変異の組合せを有する配列。
(14) 固相支持体に固定化された、(1)〜(6)、(12)、又は(13)のいずれかに記載の単離又は組換え核酸。
(15) 固相支持体が、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、及びこれらの組み合わせから選択される、(14)記載の単離又は組換え核酸。
(16) 配列番号196、206、208、210又は238、又は、配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンの少なくとも一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する配列、と少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ニトリラーゼ活性を有する単離又は組換えポリペプチドまたはニトリラーゼ活性を有するその断片。
(17) 配列番号196、206、208、210又は238、又は、配列番号196、206、208、210又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンの少なくとも一つ以上の変異又はそれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、ニトリラーゼ活性を有する単離又は組換えポリペプチド、またはニトリラーゼ活性を有するその断片。
(18) 少なくとも20アミノ酸長であって、ニトリラーゼ活性を有する、(16)又は(17)記載の単離又は組換えポリペプチド。
(19) (16)又は(17)記載のポリペプチドのペプチド疑似体又は前記ポリペプチドの断片であって、ニトリラーゼ活性を有する前記擬似体又は断片。
(20) ニトリラーゼ活性を有する、(16)又は(17)記載のポリペプチドのコドン至適化ポリペプチド又はその断片であって、コドン使用頻度が特定の生物体又は細胞のために至適化された、前記ポリペプチド又はその断片。
(21) 固相支持体に固定化された、ニトリラーゼ活性を有する(16)又は(17)記載のポリペプチド又はその断片、あるいはニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体。
(22) 固相支持体が、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、(21)記載のポリペプチド。
(23) (16)又は(17)記載のポリペプチド又はニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片に特異的に結合する精製抗体。
(24) ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドに特異的に結合する(23)記載の抗体断片。
(25) (16)又は(17)のいずれか1項記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む酵素の、液体又は乾燥品である調製物。
(26) 固相支持体に固定化された、(25)記載の酵素調製物。
(27) (1)から(6)、(12)、又は(13)のいずれかに記載の核酸の少なくとも一つ、又は、ニトリラーゼ活性を有する、(16)又は(17)記載のポリペプチドの少なくとも一つ、または、それらの断片、またはそれらのペプチド疑似体、又はそれらの組み合わせを含む組成物。
(28) ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、ニトリラーゼ活性を有する(16)又は(17)記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はそれらの断片、又はそれらのペプチド疑似体をニトリルと接触させることを含む、ニトリルのカルボン酸への加水分解方法。
(29) 分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分のカルボン酸への加水分解方法であって、ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、ニトリラーゼ活性を有する、(16)又は(17)記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はそれらの断片、又はそれらのペプチド疑似体を前記分子と接触させることを含む、分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分の加水分解方法。
(30) シアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を有する分子と、鏡像選択性ニトリラーゼ活性を有する、(16)又は(17)記載のアミノ酸配列の少なくとも一つを有するポリペプチド、又はその断片、又はそれらのペプチド疑似体と前記分子とを混合を含む、キラルアルファヒドロキシ酸分子、又はキラルアミノ酸分子の作製方法。
(31) 組成物又は前記組成物の中間体の製造方法であって、前記組成物または中間体のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を含む前駆体を、ニトリラーゼ活性を有する(16)又は(17)記載のポリペプチドの少なくとも1つ又はそれらの断片又はそれらのペプチド疑似体と混合すること、および、前駆体中のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を加水分解することを含む、前記製造方法。
(32) (R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸の製造方法であって、以下の配列を有する核酸によりコードされ、選択的に(R)- 光学異性体を生成して(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸を生成する、少なくとも一つのポリペプチドとヒドロキシグルタリルニトリルとを接触させることを含む前記方法:配列番号195、205、207、209、又は237の配列、配列番号195、205、207、209、又は237の部位 163-165 AAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAG;部位178-180 GAA 又はGAG;部位331-333 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGC;部位568-570 CAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACG;部位571-573 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACG;部位595-597 GAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTG;部位664-666 TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに一つ以上の変異又は前記変異の組合せを有する変種配列、又はニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする断片。
(33) (S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸の製造方法であって、(S)-エナンチオマーを生成するニトリラーゼ活性を有し、以下のアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチド、又は、前記ポリペプチドの断片又はペプチド疑似体の少なくとも一つとヒドロキシグルタリルニトリルとを接触させることを含む前記方法:配列番号196、206、208、210 又は238、あるいは配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する配列。
(34) (R)-マンデル酸の製造方法であって、マンデルニトリルと以下のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一つ、または、ニトリラーゼ活性を有する、前記ポリペプチドの断片又はペプチド疑似体、とを混合することを含む前記方法:配列番号196、206、208、210 又は238、あるいは配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基の190セリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシン、又はそれらの組み合わせ。
(35) (S)-マンデル酸の製造方法であって、マンデルニトリルと以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一つ、又は、ニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片又はペプチド疑似体、とを混合することを含む前記方法:配列番号196、206、208、210 又は 238、あるいは配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンに一つ以上の変異又は前記変異の組み合わせを有する配列。
(36) (S)-フェニル乳酸誘導体又は(R)-フェニル乳酸誘導体の製造方法であって、フェニルラクトシアノニトリルと以下から選択されるポリペプチドの少なくとも一つを混合すること、を含む前記方法:配列番号196、206、208、210 又は 238、あるいは配列番号196、206、208、210 又は238における、残基55のリジン、グリシン、又はグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン、残基199のグルタミン酸、又はロイシン、残基222のロイシンに一つ以上の変異を有する変種又は前記変異の組み合わせを有する配列を有するポリペプチド、又はニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片又はペプチド疑似体、又は選択的に(S)-エナンチオマー又は(R)-エナンチオマーを産生する如何なる活性断片又はペプチド疑似体。
(37) 以下を含む、(16)又は(17)記載のポリペプチド又はそれらの断片の作製方法:
a) 宿主細胞によりポリペプチドが生合成される条件下でポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ導入すること;および、
b)生合成されたポリペプチドを回収すること。
(38) 下記により、(1)-(6)、(12)、又は(13)記載の核酸を改変することを含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸変種であって、天然に存在するものとは異なる、改変された生物学的な活性を有する前記変種の製造方法:
i.1つ以上のヌクレオチドを、天然又は非天然ヌクレオチドを含む異なるヌクレオチドで置換する;
ii.1つ以上のヌクレオチドを削除する;
iii.1つ以上のヌクレオチドを挿入する;または、
iv. i〜iiiの組み合わせ。
(39) 下記を含む、二つ以上の核酸からポリヌクレオチドを作製する方法:
a)少なくとも一つの核酸が(1)-(6)、(12)、又は(13)記載の核酸を含む二つ以上の核酸の間での同一領域と多様性領域を確認すること、
b)前記二つ以上の核酸の少なくとも二つ以上の核酸配列に一致するオリゴヌクレオチドの組を提供すること、および、
c)ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの伸長によりポリヌクレオチドを作製すること。
(40) 以下を含むニトリラーゼ同定のためのスクリーニングアッセイ:
a)(1)-(6)、(12)、又は(13)記載の核酸の少なくとも一つ、または(16)又は(17)記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はそれらの断片を含む複数の核酸又はポリペプチドを提供すること、
b)前記複数の核酸又はポリペプチドの中からニトリラーゼ活性をテストすべきポリペプチド候補を選択すること、
c)前記候補のニトリラーゼ活性をテストすること、および、
d)ニトリラーゼであるポリペプチド候補を同定すること。
(41) 以下を含むキット:
a)(1)-(6)、(12)、又は(13)記載のいずれかの核酸、又はニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸の断片、又は、
b)(16)又は(17)記載のポリペプチドのいずれか、又は、ニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片若しくはペプチド疑似体、又はそれらの組み合わせ、および、
c)緩衝液。
(42) 以下を含む、分子を改変する方法:
a)(16)又は(17)記載のいずれかのポリペプチド、又はニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片若しくはペプチド疑似体と出発分子とを混合して、反応混合物を作製すること、
b)前記出発分子と前記ポリペプチドとを反応させて改変された分子を生産すること。
(43) 以下を含む、改変された分子を同定する方法:
a) (16)又は(17)記載のポリペプチドのいずれか、又はニトリラーゼ活性を有する前記ポリペプチドの断片若しくはペプチド疑似体、と出発分子とを混合して反応混合物を生産し、改変された分子のライブラリーを生産すること、
b)前記ライブラリーをテストして、前記ライブラリー中に所望の活性を示す改変された分子が存在するかどうかを決定すること、
c)所望の活性を示す前記改変された分子を同定すること。
(44) 以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも一つのヌクレオチド配列:配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385の配列、および前記配列の変種、
および/又は、
以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列:配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386の配列、及び前記配列の変種、
が保存されているコンピューター読み取り可能媒体。
(45) 処理装置、及びデーター保存装置を含むコンピューターシステムであって、前記データー保存装置に、
以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも一つのヌクレオチド配列:配列番号 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385の配列および前記配列の変種、および/又は、
以下の配列からなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸配列: 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386,及びその変種、
が保存されている前記コンピューターシステム。
(46) 以下を含む、配列中の特徴を同定する方法:
a)配列をコンピューターへ入力すること、
b)前記配列における一つ又はそれ以上の特徴を同定するコンピュータープログラムを動作させること、
c)配列番号1-386の配列、前記配列の変種、又はこれらの組み合わせを含む配列における特徴を同定すること。
(47) 以下を含む、ポリペプチドの機能性断片を決定するアッセイ方法:
a)(16)又は(17)記載の少なくとも1つのポリペプチドの断片を取得する工程、
b)ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、工程(a)の少なくとも1つの断片と、シアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を含む基質とを混合する工程、
c)工程(b)の少なくとも一つの断片の各々によって生成された反応生成物の量を測定する工程、
d)ニトリラーゼ反応生成物を生成することのできる前記少なくとも一つの断片を同定し、それによりポリペプチドの機能断片を同定する工程。
(48) 以下を含む、ポリペプチドの機能性変種を同定するためのアッセイ方法:
a)(16)又は(17)の記載の少なくとも一つのポリペプチドの変種を取得する工程、
b)ニトリラーゼ活性に適した条件下で、工程(a)の少なくとも一つの変種と、シアノヒドリン部分またはアミノニトリル部分を含む基質と混合する工程、
c)工程(b)の少なくとも一つの変種の各々によって生成された反応生成物の量を測定する工程、
d)ニトリラーゼ反応生成物を産生することのできる少なくとも1つの断片を同定し、それにより、ポリペプチドの機能性変種を同定する工程。
(49) 以下を含む、鏡像選択的変換のスクリーニング方法:
a)分子中の二つのプロキラル部分又はエナンチオトロピック部分のうちいずれかを標識すること、
b)選択的触媒により前記二つの部分のうちの少なくとも一方を改変して生成物を作製すること、
c)質量分析によって最終産物を決定すること。
(50) 標識が、重又は軽同位体である、(49)記載の方法。
(51) 選択的触媒が酵素である、(49)記載の方法。
(52) 質量分析が、ポジティブモード又はネガティブモードである、(49)記載の方法。
(53) 分析が、親質量あるいはフラグメンテーション質量について行われる、(49)記載の方法。
(54) %エナンチオマー超過率又は%ジアステレオマー超過率を測定又は決定するために使用することが出来る、(49)記載の方法。
(55) 以下の配列を含む、ニトリラーゼ活性を有する単離又は組換えポリペプチド:配列番号196、206、208、210 または238から成る配列、および残基55のリジン、残基55のグリシン、残基55 のグルタミン、残基60のグルタミン酸、残基111のセリン、残基190のセリン、残基190のヒスチジン、残基190のチロシン、残基190のスレオニン、残基191のロイシン、残基191のバリン、残基191のメチオニン、残基191のアスパラギン酸、残基191のグリシン、残基191のグルタミン酸、残基191のチロシン、残基191のスレオニン、残基199のグルタミン酸、残基199のロイシン、残基222のロイシンからなる群より選ばれる位置において少なくとも一つ以上の変異または前記変異の組合せを含む配列。
(56) 以下の配列を含む、ニトリラーゼ活性を有する単離又は組換えポリペプチド:配列番号 196、206、208、210、又は238からなる配列において残基190又は同等の部位においてアラニンが水素結合性アミノ酸又はペプチド疑似体前記に置換された変異を有する配列。
(57) 以下の配列を含む、ニトリラーゼ活性を有する単離又は組換えポリペプチド:配列番号 196、206、208、210、又は238からなる配列において残基190又は同等の部位においてアラニンが疎水性アミノ酸又はペプチド疑似体により置換された変異を有する配列。
(58) 配列番号:196、206、208、210、又は238の残基55のリジン、グリシン又はグルタミン;残基60のグルタミン酸;残基111のセリン、残基190のセリン、ヒスチジン、チロシン、又は スレオニン;残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニン;残基199のグルタミン酸、又はロイシン;残基222のロイシンによる変異と同等の変異を少なくとも一つ以上有している、単離または組換え核酸。
(59) (1)の配列又はその部分配列を含む核酸を増幅することのできる、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー対。
(60) 少なくとも10〜50の連続した配列、又は12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上の連続した配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、(59)記載の増幅プライマー対。
(61) (59)の増幅プライマーペアを用いたポリヌクレオチドの増幅により産生される、ニトリラーゼをコードする核酸。
(62) 増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行われる(61)記載のニトリラーゼをコードする核酸。
(63) 遺伝子ライブラリーの増幅により作製される、(62)記載のニトリラーゼをコードする核酸。
(64) 遺伝子ライブラリーが環境ライブラリーである、(63)記載のニトリラーゼをコードする核酸。
(65) (61)記載のニトリラーゼをコードする核酸によりコードされる単離又は組換えニトリラーゼ。
ニトリラーゼのスクリーニングに使用される各々のライブラリーは、以下の方法で感染させられる:5 mlのOD600nm=1を有するSEL700 細胞の懸濁液と、1mlのスクリーニングすべきファージミドライブラリーとを混合する。この混合液を37℃の水浴中で45分間インキュベートする。
ライブラリーの力価 希釈倍率
〜105 cfu/ml 10-1 希釈
〜106 cfu/ml 10-1、10-2希釈
〜107 cfu/ml 10-1、10-2、10-3希釈
ライブラリーの力価 希釈倍率
〜105 cfu/ml 未希釈原液、10-1希釈
〜106 cfu/ml 10-1、10-2希釈
〜107 cfu/ml 10-2、10-3希釈
各々の感染プレート中の細胞を、〜4ml の10mM 硫酸マグネシウム溶液中に再懸濁し、一本のチューブに移した。各々のプレート上の残りの細胞は、〜3ml の10mM 硫酸マグネシウム溶液中に懸濁し、最初の細胞懸濁液と混ぜた。各々のチューブ中の溶液量は、10mM硫酸マグネシウム溶液により12ml に合わせ、徹底的に混合した。このチューブを、卓上用遠心分離機により、4℃、4.6k rpmにおいて10分間遠心分離した。その上澄み液は、ペレットよりデカンテーションにより除いた。各々のチューブ中の洗浄された細胞は、10ml の10mM硫酸マグネシウム溶液中に懸濁した。各々のライブラリーより得られた懸濁液は、選別培地が調製されるまで、4℃にて保存した。
1)ニトリラーゼ選別培地は以下のように調製した:窒素源を含まず、0.2% グルコース、及び50μg/mlカナマイシン(pBKファージミドライブラリーの場合)(pBS ライブラリーの場合は、アンピシリンを使用する)を含む 1X M9培地。
2)この培地の5mlを、50ml容量のスクリュートップコニカルチューブに分注した。
3)このチューブに、保存した再懸濁液の25μlを加えた。
4)このチューブに、5μlのアジポニトリルを加え最終濃度を 8.8 mM となるようにした。アジポニトリルの代わりに他のニトリル基質を使用してもよい。
5)この混合物を30℃にて培養した。
1-5の工程を、各々のニトリル基質に対して繰り返した。
生育させた選別培養液の10μlを小さなLB-kan50 プレート上に播き、30℃において二夜培養した。五つの単離されたcfuを採取し、それらの各々を2mlのニトリラーゼ選別培地中で30℃において培養した。各々の培養液を観察し(ここでの生育は、ポジティブなコロニーが選択されたことを示している)、その生育が定常期に入ったと判定されたときに取り出した。その 1mlからプラスミドを調製し、40μlの溶出バッファーにより溶出した。このうちの5から8μlのDNAを、Pst I/Xho I、若しくはSacI/Kpn I制限酵素で消化し、ベクター中の挿入配列を切り出した。制限断片長多型 (restriction fragment length polymorphism、RFLP)の決定は、挿入配列の長さを同定することにより行った。次に、その挿入配列の配列決定を行った。
本発明のニトリラーゼを標的基質に対してスクリーニングした。一次スクリーニングにおいて加水分解活性を示したもののうち、20% 以上の鏡像異性体超過率 [enantiomeric excess (ee)] を有する酵素を更なる特性決定のために選別した。これらの酵素は、以下に基づいて選択した:1) 目的基質のうちの一つに対する活性を有するもの、及び2) 35 %以上のeeを示すもの。このスクリーニング工程の結果は、上記の表 1 に記載されている。
スクリーニングに使用された生産物は以下の物質である:D-フェニルグリシン、L-フェニル乳酸、(R)-2-クロロマンデル酸、(S)-シクロヘキシルマンデル酸、L-2-メチルフェニルグリシン、(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸及び4-メチル-L-ロイシン。
予備的な特性決定実験に基づき、多くの推定上のヒットがフェニルグリシノニトリルに関して同定され、これらの酵素に関する非常に多くのデータが蓄積された。これらのデータは、多くの共通の特性を示していた:大多数の酵素はpH7で最適な酵素活性を示し、概して低い pH において高い立体選択性を示した。これらの酵素は、しばしば立体選択性を低下させるような高温(特に38℃)において、より高い活性を示した。反応における親水性溶媒の使用は実用的な選択肢の一つであることが示されている。酵素反応液中への10〜25%(v/v)メタノールの添加は実質的な酵素反応には影響を与えず、多くの場合、立体選択性の増加をもたらした。酵素活性を維持させるような、70%(v/v)までのヘキサン(時としてトルエン)の添加による二相系の使用もまた有用である。しかし、二相系における酢酸エチルの使用は、活性の低下をもたらした。
これらの酵素の最適pHは概してpH 7以上 (即ち pH 8若しくは 9) であり、そのpHにおいてこれらの酵素は高い立体選択性を示した。殆どの酵素は、より高い温度 (特に 38℃) において優れた活性を示した。これらの酵素の立体選択性における温度効果は様々であった; 殆どの場合、立体選択性は、高温下ではわずかに低下していた。これらの酵素は、特に 10 % (v/v)メタノールなどの付加的な溶媒に対して寛容性を示したが、これらの添加による活性や鏡像選択性の改善は見られなかった。二相系の利用もまた可能であることが示された。
これらの酵素の全ては、高いpHにおいてより高い鏡像選択性を示し、試験されたその他のニトリラーゼと比べて、溶媒添加による影響を受けやすいことが示された。酵素活性は有機溶媒存在下においても検出されたが、概して、対照である水溶液中での活性に比べ低下していた。更に、酵素活性は酸性の生産物、及びアルデヒドを有する出発物質により阻害された。
キラルα-ヒドロキシ酸及びα-アミノ酸を同定するための分光系の設計において、生産物の生成と鏡像選択性を検出できる酵素系アッセイを開発し、利用した。
乳酸デヒドロゲナーゼ(L-LDH 及びD-LDH)、及びアミノ酸オキシダーゼ (L-AA Oxid 、及び D-AA Oxid) を利用したα-ヒドロキシ酸及びα-アミノ酸の検出用分光系が図 6及び7に提示されている。これらの酵素が選ばれた理由は、これらの酵素がほぼ完全なエナンチオマー特異性を保持しつつ、適切で広範な基質特異性を示すことが報告されているからである。
以下の溶液を調製した:
・基質保存溶液:50 mMアミノニトリル基質の 0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7)溶液、若しくは 50 mMシアノヒドリン基質の0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5)溶液
・酵素保存溶液:20 mgの凍結乾燥された細胞溶解物を含む各々のバイアルに、3.33 mlの0.1 M リン酸緩衝液(pH 7)を加えたもの(最終濃度は 6 mgタンパク質/ml)
・100 μlの 50 mM基質溶液を96ウェルプレートの適当なウェルに加える
・80 μlの緩衝液を各々のウェルに加える
・20 μlの酵素溶液を各々のウェルに加える
・ブランクコントロールウェルには、酵素溶液の代わりに20 μlの緩衝液を加える
・この実験の多くの場合、180 μlの緩衝液中に20 μlの酵素溶液を含むネガティブコントロールが利用される。細胞溶解物が生産物の検出を妨害しないことが一旦立証された場合は、これらのコントロールは加えなかった。
・各々のウェル中の反応液の適量(15〜50 μl)を回収し、以下のように希釈した:
・非キラル系HPLC分析用試料:
・フェニルグリシン、2-クロロマンデル酸及びフェニル乳酸:先ず、試料は水により2 倍に希釈し、更にメタノール若しくはアセトニトリルにより2倍希釈した (最終希釈率:4 倍)。これらの試料を8倍希釈にすることにより、クロマトグラフィーによる分離が改善されることがわかった。
・(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸、4-メチルロイシン、t-ロイシン、2-メチルフェニルグリシン、及びシクロヘキシルマンデル酸:試料はメタノール、若しくはアセトニトリルにより1:1 に希釈した。溶媒は、HPLC分析において利用される溶媒に基づいて選択した。
・ フェニルグリシン、2-クロロマンデル酸及びフェニル乳酸:上述の非キラル分析に記載されたように、キラル分析用の試料も、先ず、2倍に希釈し、その後の段階においては4倍に希釈した。
・ (S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸、4-メチルロイシン、t-ロイシン、2-メチルフェニルグリシン:試料は、メタノール若しくはアセトニトリルにより1:1に希釈した。
予備的な特性決定実験において、酵素活性が直線性を示すような試料を調製した;この実験は、完全な変換に対する影響よりは、むしろ、反応速度に対する様々なパラメータの影響の違いを調べるために行った。試料の回収時間は、本報中の表に記載されている。
試料は表20及び21に示された方法を用いたHPLC により分析した。
酵素活性及び鏡像選択性に対するpHの影響を、様々な異なる緩衝液を用いた標準的アッセイにより検討した:
0.1 M クエン酸リン酸pH 5
0.1 M クエン酸リン酸pH 6
0.1 M リン酸ナトリウムpH 7
0.1 M トリス-塩酸pH 8
0.1 M トリス-塩酸pH 9
これらの試料を非キラル及びキラルHPLC法により分析し、その実験結果例を本表5 、8及び11に示した。
酵素活性及び立体選択性に対する温度の影響を室温、38℃及び55℃における標準的アッセイにより検討した。これらの試料は、非キラル及びキラルHPLC法により分析し、その実験結果例を表 5 、8及び11に示した。
酵素に対する水混和性溶媒、及び非水混和性溶媒の影響を調べるため、これらの溶媒の存在下、及び二相系における酵素反応を行った。緩衝液をメタノール若しくはイソプロパノールで置換した反応液中における、標準条件下での酵素反応がこれらの水混和性溶媒の存在下において行った。反応液中の溶媒の最終濃度は0、10、25及び40 %(v/v)であった。
活 性
酵素活性に対する反応成分の影響を、酵素反応系への個々の成分の添加により検討した。これらの成分には、ニトリル合成反応において触媒的に作用する量のトリエチルアミンに加え、ニトリル合成のための出発物質、アルデヒド、シアニド、及びアンモニウムが含まれた。これらの反応物の濃度は、可能な反応条件を考慮して選択し、酵素アッセイに使用した反応物の量に合わせた。いくつかの場合には、アルデヒド、及び生産物の溶解性は比較的低かった; このような場合、最も高濃度に溶解した溶液を最高濃度として、この溶解量の10 %を低濃度として反応液に添加した。
標準条件下での酵素活性測定アッセイに先立ち、その反応条件における酵素の安定性を、予め定められた一定の時間、個々の反応成分の存在下での酵素のインキュベーションにより測定した。これらの実験において1.2 mgタンパク質/mlの濃度の酵素を、以下に示した各々の反応成分の存在下においてインキュベートした:メタノール、ベンズアルデヒド、フェニルグリシン、フェニルアセトアルデヒド、フェニル乳酸、2-クロロベンズアルデヒド、2-クロロマンデル酸、5-ヒドロキシペンタナール、(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸、KCN、塩化アンモニウム。
これらの特定の添加物を加えてから 0、2、6及び24 時間のインキュベーション後、その酵素溶液の50 μlを取り除き、50 μlの50 mM基質保存溶液を加えて、標準条件下においてその酵素活性を測定した。基質添加後、以下に示した時間にその反応液をサンプリングした:フェニルグリシノニトリル: 10 分; フェニルアセトアルデヒドシアノヒドリン:1 時間;2-クロロマンデロニトリル:2 時間。対照反応は、何も加えず緩衝液のみの溶液中での酵素のインキュベーションにより行った。これらの試料は非キラルHPLCにより分析した。
ヒットと推定された酵素が高い変換活性を示した場合、予備的な特性実験に続き、それらの特性(特に鏡像選択性)を評価するために、適当な条件下におけるアッセイを行った。これらの酵素は、本報中の表に記述されたpH及び温度条件下において25 mMの基質を用いてアッセイした。特に記述されていない場合、各々の酵素は標準濃度である0.6 mgタンパク質/mlの濃度で使用した。
この実施例においては、各々の基質、及び生産物の組み合わせにおけるクロマトグラフィー分析の典型例が、この方法における幾つかの問題点に対する議論、及びその解決策と共に示される。
非キラル分析において、基質によるピークは2.6 分及び3.2 分に溶出された(図 8A-8E を参照)。この二本のピークは、高濃度のニトリルを含む全ての試料中に観察された;二番目のピークはニトリルに関連する生産物と思われた; このピークは時間経過に伴い減少し、生産物への変換が完全に行われると見られなくなった。図 8A に示されたクロマトグラムは、ニトリル及び緩衝液のみを含むブランクコントロールによるものである;これらの試料は、上記の項目1において説明されたように、全て水で希釈した。これは、以下に記述されるように、全ての試料に対して繰り返した。酵素反応試料により得られたクロマトグラムの一例が図 8B に示されており、ここでは0.4 分にその生産物が溶出されている。
クロロマンデル酸及びクロロマンデロニトリルのHPLC分析によりフェニルグリシン試料の分析に関する多くの問題が提起された。図7Aに示されている緩衝液中にクロロマンデロニトリルのみを含む試料のクロマトグラムより、図7Bのクロマトグラムに示されたクロロマンデル酸の標準物質とクロロマンデロニトリルとが同時に一本のピークとして溶出されることが明白である。このピークに対する細胞溶解物の影響は非常に少ないことが明らかにされた;このピークに対して多大に影響を与える物質は、クロロマンデロニトリルに由来する物質であると推定され、これは、生産物の分解物、若しくはニトリル調製物中に含まれる夾雑物であると思われる。ピーク面積は、各々の実験を通じて一定であり、適切な対照を利用し生産物のピーク面積を差し引くことで十分に正確なピーク面積が得られた。生産物のピークを遅く溶出させるための様々なHPLC条件の検討を行った;しかしこれらの試みは成功しなかった。図7Cのクロマトグラムは、生産物によるピークの出現と基質によるピークの減少を示している。
メチルフェニルグリシンの分析は問題なく行われたが、図 9A のクロマトグラムに示されたように、細胞溶解物によるピークと生産物によるピーク間でのベースラインにまで達する分離は得られなかった。この方法におけるアミノ酸標準物質は本実験の最終段階において提供されたため、分析法開発のための時間は最も短時間であった。図9Aに示されたクロマトグラムにおいて、このアミノ酸は0.7 分に、そしてアミノニトリルは5.0分に溶出された。生産物への変換を計算する上で、最初の二本のピークは十分な分離を示した。
この化合物のキラル分析は、図9Bのクロマトグラムに示されたように二種のエナンチオマー間の良好な分離を示した。L-エナンチオマーは 5 分に、D-エナンチオマーは8分に溶出されている。
これらの実験における一連の生産物の中で、t-ロイシンの非キラル分析における細胞溶解物の影響が最も大きな問題を生じさせた。この問題は、このアミノ酸の有する低い分光学的特性に由来し、細胞溶解物と生産物とのピークの識別を困難にさせた。図10Aのクロマトグラムに示されたように、個々のエナンチオマー生産物の良好な分離がキラル分析により得られた。一次スクリーニングにおいて、幾つかの試料中にL-アミノ酸標準物質と同時に溶出される小さなピークが観察され(図10Bを参照)、これはアミノ酸であると思われた。しかし、更に分析法を改良し適切な対照を利用することにより、このピークは細胞溶解物に由来するものであることが証明された。
(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸のキラル分析は確実且つ信頼性の高いものであった。これに反し、非キラル法には様々な問題があり、それらは、主に、ニトリルと酸性物質のピーク間での不十分な分離によるものである。本実験の後半に向け、活性確認法が開発され、首尾よく利用された。この方法が開発される以前は、殆どの場合、キラル法が利用されていた;反応を定量化するため、生産物の標準曲線が作成されていた。(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸の典型的なクロマトグラムが図11Aに示され、(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸が6分に溶出されている。アミノニトリルは、この方法によっては検出されなかった。
4-メチルロイシンの検出において、そのキラルHPLC法は、更に信頼性の高いものであることが示された。この方法の低い活性と低い感度の両方がこの化合物の非キラルHPLCによる検出を困難にしていた。図12Aに示されているように、このアミノ酸の25 mM標準物質は、約40 mAUの高さのピークを与える;これは芳香族化合物で検出されるピークの高さと比べ非常に低かった。図12BにキラルHPLC法により検出された酵素変換反応の一例が示されている;明白ではないが、2.7分に溶出される非常に低く狭い面積のピークが4-メチルロイシンであると思われた。このピークは、キラルHPLC 分析においてネガティブであった試料中では検出されなかった。
シクロヘキシルマンデル酸の標準物質、及びこれに対応するニトリルのクロマトグラムが図13A及び図13Bに各々示されている。この酸は、1.3分に、そしてシアノヒドリンは2.5分にそのピークが観察された。2.1分に溶出されているピークは、ケトン標準物質の溶出により示されたように、現段階ではシクロヘキシルフェニルケトンであると思われた。
生物触媒過程は、従来の化学的手法によっては困難である変換に対して特異な利点を提供できる (Wong、C.-H.; Whitesides、G.M. Enzymes in Synthetic Organic Chemistry; Pergamon、New York、1994; Drauz、K.; Waldmann、H.、Roberts、S.M. Eds. Enzyme Catalysis in Organic Synthesis; VCH: Weinheim、Germany、2nd ed.、2002) 。ニトリラーゼ (EC 3.5.5.1) は、有機ニトリル系物質の対応するカルボン酸への直接的な加水分解的変換を促進する (Kobayashi、M.; Shimizu、S. FEMS Microbiol. Lett. 1994、120、217; Bunch、A.W. In Biotechnology; Rehm、H.-J.; Reed、G.; Puhler、A.; Stadler、P.、Eds.; Wiley-VCH: Weinheim、Germany、Vol. 8a、Chapter 6、pp 277-324; Wieser、M.; Nagasawa、T. In Stereoselective Biocatalysis; Patel、R.N.、Ed.; Marcel Dekker: New York、2000、Chapter 17、pp 461-486.) 。現在までに、15 種類以下の微生物由来ニトリラーゼが同定され報告されている(Harper、D.B. Int. J. Biochem. 1985、17、677; Levy-Schil、S.; Soubrier、F.; Crutz-Le Coq、A.M.; Faucher、D.; Crouzet、J.; Petre、D. Gene 1995、161、15; Yu、F. 1999、US Patent 5872000; Ress-Loschke、M.; Friedrich、T.; Hauer、B.; Mattes、R.; Engels、D. PCT Appl. WO 00/23577、April 2000.) 。幾つかのニトリラーゼがカルボン酸の単一エナンチオマー調製のために研究されているが、実行可能な合成的手段としてのニトリラーゼの開発までには至っていない。本報では、多くの様々な一連のニトリラーゼの発見について記載しており、このニトリラーゼライブラリーが、効率的、且つ有用なカルボン酸誘導体の鏡像選択的生産を触媒する酵素の同定に利用できることを立証している。
(a) 表 13 に示される反応条件を使用した(0.016 mg/ml ニトリラーゼを除く)。化合物6への完全変換は、6時間以内に観察された。(b)-(d):表 13 を参照。
未培養DNAより作製された環境ゲノムライブラリーを調べることにより、我々は多くの一連の新規ニトリラーゼを発見した。この研究により4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸の何れか一方のエナンチオマーと同様に、マンデル酸及びアリル乳酸誘導体を高い変換率(95 % 以上)及びeeで生産する特異的なニトリラーゼが示された。
ヒドロキシグルタリルニトリルは、TCI Americaより購入し、そのまま利用した。アリール乳酸標準物質を調製するためのアミノ酸は、PepTech(Cambridge、MA)より購入した。3-ヒドロキシ-4-シアノ酪酸は Gateway Chemical Technology(St. Louis、MO)より入手した。(R)-及び (S)-マンデル酸、および、(R)-及び (S)-フェニル乳酸標準物質の全ては、Sigma Aldrichより購入した。その他全ての試薬は、Sigma Aldrichより入手し、精製せずに利用した。シリカゲル(70-230 メッシュ、60Å)は、Aldrichより購入し、クロマトグラフィーによる精製工程で利用された。1H NMR及び13C NMRは、全て、BrukerモデルAM-500により室温で測定され、1H NMRでは500 MHz、13C NMRでは125 MHzの分解能が利用された。質量分析は、Perkin-Elmer Sciex API-4000 TURBOIONTMスプレー LC/MS/MSシステムを利用したフローインジェクション分析により行われた。LC 系における流動相には、0.05 % 酢酸及びメタノールが利用され、LC-10Advpポンプ(島津製作所)により展開された。試料の注入には、Valco 注入バルブが利用された。HPLC分析は、Agilent 1100 HPLC システムが利用され、カラムにはAstec 社のChirobiotic R カラム(100 x 4.6 mm、カタログ番号 13022、若しくは 150 x 4.6 mm、カタログ番号 13023)又はDaicel社のChiralcel OD カラム(50 x 4.6 mm、カタログ番号14022)が使用され、DAD検出器は、210、220、230、及び 250 nm にセットされた。比旋光度測定には、Perkin Elmerモデル 341旋光計が使用され、長さ100 mmの光路長を有するセルを用い、ナトリウムランプによる室温での589 nmにおける旋光度が測定された。比旋光度測定における濃度は、溶媒100 mlあたりのグラム数で与えられる。
1. ニトリラーゼの選別
スクリーニング用宿主株 Escherichia coli、SEL700をニトリル基質に対するニトリラーゼの選別用に最適化した。このスクリーニングにおいてライブラリーを完全に網羅するために、スクリーニング用宿主SEL700を10 mM硫酸マグネシウム 溶液中にAbs600nm = 1で含む細胞懸濁液を、カナマイシン耐性遺伝子を含むDNAライブラリーにより45分間、37℃でインフェクションした。カナマイシン耐性を示す感染細胞をカナマイシンLB プレート上に播き、30℃で一夜培養した。インフェクション効率を決定するためのタイタープレートも調製した。翌日、回収された細胞は洗浄後、10 mM硫酸マグネシウム溶液中に懸濁した。形質転換されたクローンは、10 mMニトリル基質を含むM9培地 (窒素源を含まない) 中に植菌された。M9培地は 1X M9塩類(塩化アンモニウムを除く)、0.1 mM 塩化カルシウム、1 mM硫酸マグネシウム、0.2 %グルコース、及び約10 mMの選別用ニトリル基質を含んでいる。この選別用培養物を、30℃において 200 rpmの振とう数で最高5週間培養した。ニトリラーゼ陽性菌は、ニトリル基質を加水分解する能力を有するため、その生育により同定される。選別用培地上で生育した陽性クローンを単離し、そのコロニーの二次培養を同一の制限培地中で行った。ニトリラーゼ遺伝子の発見、及びその遺伝子の新規性を確認するために、ここで生育した全ての陽性菌よりDNAを単離し、それらの配列を決定した。
伝統的なフィルターリフトハイブリダイゼーションによるスクリーニング法では約106から107種類よりなるライブラリーしかスクリーニングできない。一つのライブラリーをスクリーニングするために、約5,000のフィルターリフトが必要となるであろう。よって、108種類までの環境ライブラリーを迅速にスクリーニングするために、配列に基づく超ハイスループットスクリーニングのための溶液法、及びその他のバイオパンニング法が開発されている。溶液法において、複数のクローンライブラリーより単離されたDNAがハイブリダイゼーションを促進する条件下で、タグを有する目的の分子と混合する。タグを有するクローンおよびハイブリダイズしたDNAを溶液中より分離し、このプローブと配列同一性を持たないクローンを除くために、特定のストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイズされたDNAを溶出および回収する。目的のクローンは、配列決定し、目的の酵素活性を得るためにクローニングする。この方法により目的の配列が1,000倍まで濃縮されることが立証されている。
活性測定は 25 mM(〜3 mg/ml)の基質、0.1 mg/mlのニトリラーゼを含む反応溶液中で行った。反応溶液は、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液中に0〜10 % (v/v)のメタノールを含み、その反応はpH 7から9において37℃又は22℃で行った。特に記述されない限り、変換反応は5分間行い、その特異的活性をユニットμmol mg-1 min-1 で表した。エナンチオマー過剰量(ee)及び変換率は、ハイスループットHPLC分析法により酵素による生産物の濃度と酸性物質ラセミ体の標準曲線との比較により決定した。生産物の分析条件は、以下の表の通りである。
(R)-(-)-マンデル酸 : 10 % (v/v) のメタノールを含む150 mlの 100 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8)にマンデロニトリル(1.005 g、7.56 mmol) を溶解し、37 ℃において窒素ガス置換を行った。この溶液に9 mgのニトリラーゼ 1(ニトリラーゼ含量で標準化)を添加した。反応は窒素ガス下で回転式シェーカーを用いて行った。反応の進行状態はこの反応液の一部を用いたHPLC 分析により確認した。3時間の反応後、反応混合液を1N塩酸によりpH 2に調整し、ジエチルエーテルで抽出した(50 mlで4回)。有機溶媒層を真空下で濃縮し、10 % の重炭酸ナトリウム溶液となるように調製した。この溶液はジエチルエーテル(50 ml で 3 回)で洗浄し、1N塩酸によりpH 2に調整した後、ジエチルエーテル(50 mlで 3回)で抽出した。分取された有機溶媒層を飽和塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後濾過し、真空下で濃縮した。(R)-(-)-マンデル酸が無色の粉末として単離された(933 mg、6.22 mmol、収率 86 %)。各種の物理化学的測定の結果は、以下のとおりであった:1H NMR (DMSO-d6、 500 MHz) δ 12.6 (br、s、1H)、7.41 (m、2H)、7.34 (m、2H)、7.28 (m、1H)、5.015 (s、1H)。13C NMR DMSO-d6、125 MHz) δ 174.083、140.216、128.113、127.628、126.628、72.359。C8H8O3の分子量の計算値は、150.07であり、実測値は、150.9 (ESI +)であった;ee = 98 % [HPLC]。[α]20 598 = -134.6 (c = 0.5、メタノール)。
3-ヒドロキシグルタリルニトリル(1.0 g、9.0 mmol、240 mM)を、窒素ガスでパージした 37.5 mlのリン酸ナトリウム緩衝液(100 mM、pH 7)中で、室温において懸濁した。ニトリラーゼ含有量で標準化した 30 mg の細胞溶解物を酵素濃度0.8 mg/mlとなるようにこの反応液に添加し、室温において100 rpmで振とうした。反応の進行状態は、TLCにより確認した(1:1 酢酸エチル/ヘキサン。ニトリルのRf 値は0.32であり、酸のRf 値は0.0である)。22 時間後、1M塩酸の添加により反応液を酸性にした。続いてこの反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。酸性生成物は、黄色い油状物として単離された(1.15 g、収率 98 %):1H NMR (DMSO、298K、500MHz) δ 12.32 (s、1H)、5.52 (s、1H)、4.10 (m、1H)、2.70 (dd、1H、J = 16.8、4.1 Hz)、2.61 (dd、1H、J = 16.9、6.3 Hz)、2.44 (dd、1H、J = 15.4、5.3 Hz)、2.37 (dd、1H、J = 15.6、7.8 Hz). 13C NMR (DMSO、298K、125 MHz) δ 171.9、118.7、63.4、41.2、25.2。C5H7NO3の分子量の計算値は、129.0であり、実測値は、130.0 [M+H+]、(ESI +)であった。
攪拌されている(R)-メチル(3-ヒドロキシ-4-シアノ)-ブタン酸 (71.7 mg、0.501 mmol)のピリジン溶液(2.0 ml)に塩化ベンゾイル(0.068 ml、0.752 mmol)を室温で添加した。19時間後、更に0.5等量の塩化ベンゾイル(0.023 ml、0.251 mmol)を加えた。TLCによって決定したところ、反応は23時間で完了した。1mlの水を加えた後、エーテルで抽出した(10 mlで3 回)。まとめられた有機溶媒層を飽和塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後濾過し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。残渣は、カラムクロマトグラフィー(2:1 ヘキサン/酢酸エチル)により精製した。この精製画分をロータリーエバポレーターにより濃縮し、生成物を黄色の油状物質として回収した(46 mg、0.186 mmol、収率 37 %)。各種の物理化学的測定の結果は、以下の通りであった:1H NMR (DMSO、298K、500MHz) δ 7.96 (d、2H、J = 7.8)、7.70 (t、1H、J = 7.25)、7.56 (t、2H、J = 7.8)、5.55 (m、1H)、3.59 (s、3H)、3.13 (m、2H)、2.90 (m、2H)。13C NMR (DMSO、298K、125MHz) δ 169.6、164.5、133.8、129.3、128.9、128.5、117.3、66.0、51.8、37.5、22.2。C13H13NO4の分子量の計算値は、247.25であり、実測値は、270.3 [M+Na+]であった。ee = 95 % [HPLC]。[α]20 598 32.4 (c = 0.5、クロロホルム)。
1.94 mlの無水エタノールに 50 mg(0.387 mmol)の(R)-3-ヒドロキシ-4-シアノ-ブタン酸を溶かした 0.2 M溶液を調製した。このエタノール溶液を、濾過された1 mlの1M無水塩酸(エーテルで希釈)と無水エタノールの 50:50(v/v)混液中に一滴ずつ添加した。反応液を、室温における窒素ガス下で一夜攪拌した。反応の進行状態はTLCにより確認された(1:1 酢酸エチル/ ヘキサン。エステルのRf値は0.45であり、酸のRf 値は0.0である。呈色反応はp-アニスアルデヒドにより行った)。30時間後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。粗生成物に25 mlのエーテルを加え、5 mlの飽和重炭酸塩溶液で洗浄後、更に5 mlの飽和塩水で洗浄した。この有機溶媒による抽出物を、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、真空下において濃縮した。得られた生産物は、透明な油状物質であった。各種の物理化学的測定の結果は、以下のとおりであった:1H NMR (DMSO、298K、500MHz) δ 5.60 (d、1H、J = 5.58 Hz)、4.12 (m、1H)、4.07 (q、2H、J = 7.1)、2.66 (m、2H)、2.47 (m、2H)、1.87 (t、3H、J = 7.0). 13C NMR (DMSO、298K、125 MHz) δ 170.21、118.60、63.40、59.98、41.10、25.14、14.02。C7H11NO3の分子量の計算値、157.1であり、実測値は、158.2 [M+H+]であった。
配列番号 385及び386 に示される酵素は反応成分に対して安定であることが示され、その半減期は8時間であった。この酵素は、2-クロロベンズアルデヒド、及びシアノヒドリン基質中の夾雑物である2-クロロ安息香酸により阻害された。この酵素反応は、45 mM 2-クロロマンデロニトリルの基質濃度まで拡大して行った。この反応により90 %以上の変換率が得られ、そのeeは、97 % であった。基質中に存在する夾雑物によるピークを除くために、キラルHPLC法を改良した。この方法を利用することで鏡像選択性の決定における精度が改良された。
酵素反応を、pH 5からpH 9の範囲の様々なpHにおいて行った。全ての酵素においてpHの上昇に伴う酵素活性、及び鏡像選択性の増加が認められた。配列番号385、386を除く酵素において、酵素活性及び鏡像選択性に対する最適pH(0.1 M トリス- 塩酸緩衝液)は9であると決定された。配列番号385、386の酵素の最適pH(0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液)は8 であった。
これらの酵素は、温度に対して類似の挙動を示し、37℃及び45℃において最高の活性が測定された。後者の温度において高い変換が観察されたが、殆どの酵素の鏡像選択性は、低い温度において良好であり、37℃より上の温度においてそのee値は、10〜20 % 減少した。配列番号385、386 の酵素の場合、鏡像選択性に関するわずかな最適性は約37℃で明らかであった。よって、この温度をこれらの酵素による2-クロロマンデロニトリルの加水分解における最適温度と決定した。
並行して行われたフェニルアセトアルデヒドのL-フェニル乳酸への鏡像選択的加水分解の検討を通じて、反応液中の酵素濃度は反応の鏡像選択性に対して重要な影響を与えることがわかった。これは、この反応において酵素的加水分解速度が残存シアノヒドリンのラセミ化速度より速いことを示している。これに基づき、(R)-2-クロロマンデロニトリルに対する酵素の立体選択性における酵素濃度の影響を調べた。酵素反応を標準濃度(0.6 mg タンパク質/ml)、その半分及びその1/10の濃度の酵素を用いて行った。
以下の表に、その反応における最高の変換率がその際に与えられる ee 値と共に示されている。配列番号385、386の酵素を除き、たとえあったとしても非常に少ない鏡像選択性の増加しか観察されなかった。よって、残存クロロマンデロニトリルのラセミ化速度は、高い鏡像選択性を得る上での制限因子であるとは認められなかった。
上記の表に示された酵素に加え、他の複数のニトリラーゼをその酵素の2-クロロマンデロニトリルに対する鏡像選択性に関してスクリーニングした。これらの酵素のうちの幾つかは新規に発見された酵素である。幾つかの酵素を、以前にその酵素において最適であると分かっている条件下(pH 8、37℃)において再検討した。このスクリーニングの結果は、以下の表に示されている。
メタノールの反応溶液中への添加によりeeの上昇した酵素反応を確認した。反応液中に添加するメタノール量を最小限にするために、0〜20 %(v/v)の間で異なる濃度のメタノールを添加して酵素反応を行った。様々なメタノール濃度間において鏡像選択性における顕著な差異は認められなかった。しかし、これらの反応におけるeeは、97〜98 %であり、メタノールを添加しない対照反応でのeeは、95〜96 %であった。このee値における差異は、少ないものではあるが、一回以上の一連の実験においてメタノールの効果が繰り返し観察されたため、この差異は有意であると考えられた。
酵素反応の最適化の検討における非常に重要な一部として、酵素反応液中に存在する各々の化合物の効果を決定することが含まれる。開始物質及びシアノヒドリンの平衡生産物である2-クロロベンズアルデヒド、生産物2-クロロマンデル酸及び基質中に含まれる夾雑物、2-クロロ安息香酸の配列番号385、386に対する効果を確認した。シアニドの反応液中への添加は酵素反応に対して何の影響も与えないことが確認された。痕跡量のトリエチルアミンの存在はこの酵素に許容されることが確認された。
配列番号385、386の酵素による(R)-2-クロロマンデロニトリルの変換率、及び立体選択性を確認するために、スケールを大きくした反応を行い、その水溶性反応液中より生産物を単離した。反応は20 mlの反応液に45 mMのクロロマンデロニトリルを基質として加えて行った。シアノヒドリンへの完全な変換が行われ、30 mMの生産物が得られた。この生産物のeeは97 %であり、酵素の特異的活性は、0.13 mmol 生産物/mgニトリラーゼ/hであった。
二相系反応の利用は、酵素反応後の生産物の回収を促進する。この系は、また、酵素を阻害する生産物や副産物の除去にも利用される。ニトリラーゼは、様々な溶媒を用いた二相系条件下においてもその酵素活性を保持できることが示された。上記のような高い基質濃度において見られる低い変換率を改善するために、ヒット酵素を用いた二相系の更なる検討を行った。二相系の利用により、どのような阻害性因子を溶媒層に除くことが出来るか、及び、どのような利点が得られるのかを確認することは非常に重要である。
有機溶媒層にヘキサンを用いることにより有望な結果が得られた。よって、その後の実験では二種類の異なる量のヘキサン(水層の容量の100 %、及び70 %)を用い、基質濃度を最高90 mMまで増加させた。基質は有機層に溶解した。ヘキサンの量は、特に、2-クロロマンデロニトリル濃度が高い場合、生産物の形成に影響を与えないものと思われた。
より高い基質濃度において、非常に低い変換が観察され、90mMの2-クロロマンデロニトリルから7mMの2-クロロマンデル酸が生産された。この変換率は低いが、同じ基質濃度を用いた一相系反応による変換率よりは高かった。これらの結果は、阻害性の2-クロロベンズアルデヒド又は2-クロロ安息香酸の一部が非極性溶媒中に保持されていることを示唆している。
以下の溶液を調製した:
- 基質保存溶液: 50 mMシアノヒドリン基質の 0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)溶液。
- 酵素保存溶液: 20 mgの凍結乾燥した細胞溶解物を含む各々のバイアルに3.33 mlの0.1 Mリン酸緩衝液(pH 8)を加えたもの(最終濃度は6 mg タンパク質/ml)。
非キラルHPLC法は、Synergi-RPTMカラム(4 μm; 50 x 2 mm)を使用し、移動相には10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.5)を利用して行った。メタノール勾配を3.5分後に開始させ、1.5 分で50 %のメタノール濃度まで増加させ、その後0 %まで減少させた。2-クロロマンデル酸及び2-クロロマンデロニトリルの溶出時間は、各々2.5 分及び6.1分であり、もう一本のピークがニトリルと共に5.9分に溶出された。
上述のように、この実験の過程において、2-クロロ安息香酸と(S)-2-クロロマンデル酸との分離を改良するためにキラルHPLC 分析法を最適化した。この最適化された方法を後半の実験において使用し、カラムとしてChirobiotic-RTMを使用した。移動相は、80 %アセトニトリル: 20 %の0.5 % (v/v)酢酸を使用した。(S)-2-クロロマンデル酸及び(R)-2-クロロマンデル酸の溶出時間は、各々2.4分及び3.5分であった。2-クロロ安息香酸のピークが1.9分に溶出された。各々の実験において、生産物の標準曲線の作製がHPLC分析に含まれている。試料中の生産物濃度はこれらの曲線の傾斜より計算した。
酵素活性及び鏡像選択性に対する pH の影響を、様々な異なる緩衝液を用いた標準的アッセイにより検討した: 0.1 M クエン酸リン酸 pH 5; 0.1 M クエン酸リン酸 pH 6; 0.1 M リン酸ナトリウム pH 6; 0.1 M リン酸ナトリウム pH 7; 0.1 M リン酸ナトリウム pH 8; 0.1 M トリス-塩酸 pH 8; 0.1 M トリス-塩酸 pH 9。全ての酵素に関して標準的な酵素濃度を使用したが、配列番号385、386 の酵素に関しては標準的な酵素濃度の半分量を使用した(酵素保存溶液の5 % v/v)。
酵素活性、及び鏡像選択性に対する温度の影響を、様々な異なる温度における標準的アッセイにより検討した: 室温、37℃ 、45℃ 、50℃ 及び60℃。全ての酵素において、標準的な酵素濃度を使用したが、配列番号385、386の酵素においては標準的な酵素濃度の半分量を使用した(酵素保存溶液の5 % v/v)。
酵素濃度の影響
標準的条件下での反応を異なる濃度の酵素を用いて行った: 1 % 、5 % 及び10 % (v/v)の酵素保存溶液。反応液容量は、適当な緩衝液により標準化した。
溶媒の添加
メタノール存在下での酵素反応を行った。メタノールは、標準的反応液中に以下の濃度で添加した: 0 、5 、10 、15 及び20 %(v/v)。
ヘキサンを利用した二相系反応も検討した。水相には、10 % (v/v)となるように溶解した酵素保存溶液を含む0.1 M リン酸緩衝液(pH 8)を使用した。シアノヒドリンは、反応液へ添加する直前にヘキサンに溶解した。二種類の有機溶媒層を以下のように使用した: 水層の容量と等量、若しくは0.7容量。更に、以下のニトリル濃度を検討した: 25、45及び90 mM。これらの反応は、室温で行った。
(i)活性: 酵素活性に対する操作中の成分の影響を反応液中への個々の成分、2-クロロベンズアルデヒド、2-クロロ安息香酸又は2-クロロマンデル酸の添加により確認した。酵素反応は、標準条件下において、二種の推定される阻害物質のうちの一種を以下のように添加して行った: 5、10、20、及び 25 mMの2-クロロベンズアルデヒド; 1.5 及び5 mMの2-クロロ安息香酸; 及び 10、20、40、及び80 mMの2-クロロマンデル酸。対照反応は、標準条件下において何も添加せずに行った。各々のサンプリング時間においてその試料を、10倍に希釈した。反応成分を含み酵素を含まない対照試料を使用し、同様の希釈倍率で希釈した。これらの試料は、非キラルHPLCにより分析した。
酵素反応のスケールアップ
二種類の異なる基質濃度(45 mM 及び90 mM)において酵素反応を行った。反応は、以下に示した標準条件下において行った: 0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8)、37℃及び10 % (v/v)の酵素保存溶液。基質は、緩衝液中への添加直前に10 %(v/v)のメタノールに溶解した。反応液の最終容量は、20 mlとし、電磁攪拌機で攪拌しながら反応を行った。
L-2-アミノ-6,6-ジメトキシヘキサン酸の生産において、最も高い鏡像選択性及び酵素活性の両方を有する一つの酵素をGSSMTM実験に選ぶ。この酵素への変異導入後、生成した変種は、ハイスループットスクリーニング技術を利用して、5,5-ジメトキシペンタナールアミノニトリルに対してスクリーニングされるであろう。HPLCによるポジティブ変種の確認後、これらの変種の特性を更に増強するために、個々のポジティブ変種が組み合わせられるであろう。
この進化法の成功における重要な点は、鏡像選択性に対するハイスループットスクリーニングアッセイの開発である。このようなアッセイは、新規の酵素を基にした鏡像選択性アッセイであり、HPLC法と比べて非常に短期間で三万種を超える変種をスクリーニングできるようなアッセイ法である。
一側面として、本発明は、一群の関連遺伝子のキメラ化、及びそれらがコードする一群の関連生産物を提供している。具体的な一例として、コードされた生産物はニトリラーゼ酵素である。本発明のニトリラーゼをコードする核酸には、ここで記述された方法により変異が導入される。
典型的には、利用可能な境界点は、少なくとも二種の前駆鋳型中の相同的領域(少なくとも一つの同一ヌクレオチド塩基を含む)中に存在するが、境界点は、少なくとも半分の前駆鋳型中の相同的領域、少なくとも2/3の前駆鋳型中の相同的領域、少なくとも3/4の前駆鋳型中の相同的領域、及び好ましくは殆ど全ての前駆鋳型中の相同的領域中に存在し得る。より好ましくは、実用的な境界点が全ての前駆鋳型に共通の相同的領域内に存在する。
他の一側面として、ビルディングブロックが作製される工程における合成的特性は、その後のインビトロでの工程(例えば、変異導入による)又はインビボでの工程(例えば、宿主生物の有するスプライシング能の利用による)で随意的に除かれるヌクレオチド (例えば、コドン、イントロン又は調節配列などの一つ、若しくはそれ以上のヌクレオチド)の設計及び導入を可能にする。利用可能な境界点を作製することの潜在的な利点に加え、多くの例において、これらのヌクレオチドの導入もまた多くの理由から有用であることが認識されている。
ニトリラーゼの発見及び進化の両方におけるスクリーニング処理能を増強するためのハイスループットに向いた自動化アッセイ法を述べる。理想的なアッセイは、形成された生産物および基質の変換の両方を定量でき、且つee 値の定量も可能な方法である。ハイスループットスクリーニングが可能な二種類の非キラル、及び二種類のキラル比色アッセイ法を開発した。
残存基質のOPA アッセイ: OPA アッセイは、α-アミノニトリル又はα-ヒドロキシニトリル基質に対して適用される。全細胞の溶解は不要である。これらの結果は、2-クロロマンデロニトリル及びフェニルアセトアルデヒドシアノヒドリンのHPLC分析により確認した。このアッセイは、芳香族ニトリルに対して最適であった。脂肪族化合物は、直線的な標準曲線を与え、蛍光吸収の低減によりアッセイ感度が低減されている。
生産されたヒドロキシ酸の定量及びee決定のためのLDHアッセイ: LDH アッセイは、フェニル乳酸に対しては適用されるが、2-クロロマンデル酸には利用されない。レサズリン検出系の利用により検出感度が高められ、バックグラウンドが低減される。全細胞によるバックグラウンド蛍光の問題は、アッセイの前の遠心分離又は加熱処理により解決された。
生産されたアミノ酸の定量及び ee 決定のためのAAO アッセイ: AAO アッセイは、フェニルアラニン及び(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸に対して適用される。Amplex Red検出系の利用により検出感度が高められる。細胞の溶解は必要でないことが示された。バックグラウンドの蛍光発色を抑えるために、細胞は合成培地で培養する。
o-フタルアルデヒド (OPA) による蛍光に基づくニトリラーゼアッセイを利用して残存するα-ヒドロキシニトリル基質の量を定量する。OPAは、α-ヒドロキシニトリルの対応するアルデヒド及びシアニドへのpHにより制御される分解により遊離するシアニドと反応し、定量可能な蛍光生産物を生産する。OPAは、α-ヒドロキシニトリルの対応するアルデヒド及びシアニドへのpHにより制御される分解により遊離するシアニドと反応し、蛍光性の1-シアノ-2-R ベンゾイソインドールを生産する。
NDAは脂肪族化合物を検出するための代わりの検出試薬として確立された。しかしアッセイでは、全ての基質に対して同一の検出系を利用することが望ましい。なぜなら、それにより複数のニトリラーゼ基質の評価を自動化により容易になるであろうから。現在のOPA アッセイは、PAC、CMN、CHMN、APA、MN、及びPGN の分析に対して有効である。一方、脂肪族化合物PAH、HPA、及びDMB に対する標準曲線が作成されている。
未処理又は過熱処理された凍結乾燥ニトリラーゼ溶解物のアッセイ成分への添加の影響を評価した。何れの場合においても、バックグラウンド蛍光発色に対する干渉は認められなかった。次にOPAアッセイを評価し、全細胞系でのニトリラーゼ活性を検出するために最適化した。ニトリラーゼを発現している全細胞及びインサイツ(in-situ)で溶解した細胞の両方を評価した。凍結乾燥された細胞溶解物を評価し、対照として、それら各々の全細胞のクローンを並行して評価した。この最適化実験にはマンデロニトリル(MN)をモデル基質に選択した。
シアノヒドリンのニトリラーゼによる触媒的加水分解により生産されるキラルα-ヒドロキシ酸の分析のため、乳酸デヒドロゲナーゼ(L-LDH)に基づく分光測定系を開発した。ヒドロキシニトリル基質は、第二の酵素及び検出酵素により代謝されないため、開始物質は妨害を与えない。加熱処理されていない細胞溶解物は、LDH 系においてバックグラウンド活性を示す。しかし、このバックグラウンド活性は、細胞溶解物の加熱処理又は遠心分離によるペレット形成により防ぐことができる(図4参照)。
本明細書に記述されているニトリラーゼに対する商業的に利用可能なD- 、及びL-乳酸デヒドロゲナーゼの活性、及び鏡像選択性を評価した。あるLDHがD- 及びL-フェニル乳酸の両方の分析に適していることが確認された。2-クロロマンデル酸に適している酵素は見られなかった。選択されたLDH酵素は、事実上完全な立体選択性を示した。凍結乾燥した細胞溶解物を利用した、PACからのD-及びL-LDHの生産を検出するアッセイの実行可能性が確認された。
ニトリラーゼが触媒するアミノニトリルの加水分解により生産されるキラルα-アミノ酸の分析のために、アミノ酸オキシダーゼ(AAO)に基づく分光光学系を開発した。
アッセイの開発とその評価
最初のアッセイ評価では、上述のように2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)による検出系を使用した。しかし発色が安定しなかったため、その後の試験にはλ max 510 nmで分析されるフェノールアミノアンチピリン(PAAP)による検出系を使用した。4-メチル-ロイシン、フェニルアラニン、(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸、及びtert-ロイシンの各々のエナンチオマーに対して適した活性を有する酵素が確認された。このアッセイは、メチルフェニルグリシンに対しては適用できず、フェニルグリシンに対しては効果が十分ではなかった。
全細胞を用いたAAOアッセイにおいて、TB及びLB生育培地中に存在するL-アミノ酸による高いバックグラウンドが観察された。M9培地中の細胞を洗浄し懸濁させることにより、バックグラウンドは除去可能であった。全ての実験において、細胞は、0.2 %のグルコースを含むM9培地で培養した。溶解した細胞は、溶解していない細胞と比べ、ほんの僅かに良好な応答性を示した。よって、細胞の溶解は必ずしも必要ではない。配列番号187、188は、HPLC分析による一次スクリーニングにおいてHPAに対する活性を示した。
蛍光細胞分析分離装置(FACS)によるアッセイの自動化において、ニトリラーゼを発現する細胞をM9培地、0.2 %グルコース及び0.25 mM IPTGを含むマイクロタイタープレートに添加した。以下の三種類のニトリラーゼを発現するクローン及び対照となる挿入を含まない空のベクターを試験した: 配列番号101、102、配列番号187、188、配列番号29、30、及び空のベクター。分注後の細胞の生育が不均一であったため、マイクロタイタープレートに細胞を分注するための他の方法として、コロニーピッキング法を現在検討している。ロボットインキュベーター中において、蓋をしていない1536-ウェルマイクロタイタープレートからの溶液の蒸発率は一日当たり約30 %である[インキュベーターの条件: 37℃で相対湿度 (RH) 85 %]。RHが85 %のインキュベーター中でのインキュベーションにより、蒸発率が一日当たり1 %まで低減された。
HPLC によるAAO アッセイで得られた結果を評価するため、40 mMまでの高濃度のHPA[(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸のHPLC による検出が困難なため]および凍結乾燥された配列番号187、188の細胞溶解物を用いた反応を行った。
AAO アッセイは、M9培地、0.2 %グルコース及び0.25 mM IPTGを含む384-又は1536-ウェルプレートに細胞を添加した形式で行うことができる。細胞は、ニトリルの存在下(この場合はHPA)で生育させるか、あるいは細胞を一定の密度まで生育させた後、ニトリルを添加する。HPAを試験する場合、細胞溶解用試薬はこのアッセイ系を妨害しないが、細胞溶解用試薬は必要ないことが確認された。この親プレートを、ニトリルの添加前又は添加後に娘プレートへと分割し、L-及びD-エナンチオマーの各々に対してアッセイする。AAOとAmplex Red 試薬とのインキュベーション時間は、D-及びL-プレートを別々の時間に測定できるように調節する。
本発明は、L-2-アミノ-6,6-ジメトキシヘキサン酸の生産工程において、多大な技術的及び商業的利点を提供する指向性進化を利用した、ニトリラーゼの開発法を提供する。
L-2-アミノ-6,6-ジメトキシヘキサン酸の生産における酵素の鏡像選択性及び酵素活性を改良するために、選択したニトリラーゼに対するGSSMTM、及び GeneReassemblyTM を行った。2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサンニトリルを鏡像選択的に加水分解してL-(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸を生産するニトリラーゼが同定された。しかし、新規の標的分子であるL-2-アミノ-6,6-ジメトキシヘキサン酸には僅かな構造的差異が存在する。この構造的差異が酵素の活性や鏡像選択性に影響を与えるかどうかを決定するため、新規の標的に対するニトリラーゼの完全な基質スペクトルをスクリーニングした。
2-アミノ-6,6-ジメトキシヘキサン酸に対して最も高い酵素活性と鏡像選択性の両方を有する酵素をGSSMのために選択する。この標的酵素への変異導入に続き、これらの変種を、ハイスループットスクリーニング技術を利用して、5,5-ジメトキシペンタナールアミノニトリルに対してスクリーニングする。HPLC 分析によるポジティブ変種の確認後、その標的に対するGSSMの結果を評価する決定段階へと到達する。
標的とされるα-アミノ酸生産物を以下に示す:
(i)D-4-フルオロフェニルグリシン
α-アミノニトリルのα-アミノ酸への加水分解において、複数の鏡像選択的ニトリラーゼが同定された。これらの酵素は、特定のアミノニトリルにおける目的のエナンチオマーに対する選択性を有するが、候補となるニトリラーゼの更なるスクリーニング、開発及び比較において制限となる要因は、反応条件におけるアミノニトリル基質のラセミ化速度である。
第一段階は、モデル基質であるフェニルグリシンを用いた芳香族ニトリルのラセミ化反応条件の確立である。ラセミ化の方法には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。これらの商業的な応用性に応じておおよその優先順位が決定される。
(1)反応pH の操作。ラセミ化は高いpHにおいて迅速に行われることが示されているため、このアプローチではpH>10において活性及び選択性を示すニトリラーゼの発見及び最適化が要求される。
(2)低いpHでラセミ化を促進し得るアルデヒド、ケトン、弱塩基、樹脂、金属イオン、ルイス酸等の既知の化学的ラセミ化試薬の添加。
(3)容易にラセミ化され得るN-アセチルフェニルグリシノニトリルのようなN-アシル化アミノニトリル誘導体の合成。N-アセチルフェニルグリシノニトリルの場合、アセチル基を除去する選択的D-アシラーゼは、ニトリラーゼ生産物の光学純度を増加させるであろう。
(4)疎水性有機溶媒相において塩基により触媒されるラセミ化が生じ、水相において酵素的加水分解が行われる二相系の使用。
(5)ニトリラーゼ及びアミノニトリルラセマーゼの二種の酵素を含む二酵素系の使用。現在、一種類のアミノ酸ラセマーゼが商業的に利用可能であり、この酵素がフェニル-及びフルオロフェニルグリシノニトリルに対する活性の試験に利用されるであろう。既知のアミノ酸ラセマーゼ、ヒダントインラセマーゼ、若しくは同定されているその他のラセマーゼと相同性を有する遺伝子が遺伝子ライブラリー中より検索されるであろう。
遂行された試験により、フェニルグリシノニトリルはpH 10.8において容易にラセミ化されることが立証された。しかし、このような厳しいpH 条件下で活性を示す既存の酵素は同定されていない。このような条件下においても活性を示すニトリラーゼをスクリーニングするために、高アルカリ環境に由来する試料が利用される。このような酵素が発見されると、この酵素の配列が決定され、クローニングされ、この酵素のスクリーニングが行えるような凍結乾燥細胞溶解物が調製される。
モデル脂肪族アミノニトリル化合物であるペンタナールアミノニトリルをラセミ体として合成する。光学的に濃縮された試料を以下に示した方法のうちの一つを利用して調製する: (i) 調製的キラルHPLC; (ii) ジアステレオマー塩分離; (iii) ジアステレオマー誘導体化、又はカラムクロマトグラフィー; (iv) L-N-BOCノルロイシンからの合成。これらの化合物の検出にはHPLCアッセイが利用される。
(S)-2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサン酸の検出にはHPLCアッセイを利用する。プレカラムを用いる誘導体化を含むアッセイ法が利用される。
スクリーニング/ 特性決定
ニトリラーゼを2-アミノ-6-ヒドロキシヘキサンニトリルに対してスクリーニングする。25 mMより高濃度の基質に対して良好に作用する酵素に対して、スケールアップした反応を行う。その他の酵素の基質/生産物に対する寛容性及び安定性を試験する。
ニトリラーゼをスクリーニングし、ヒット酵素の最適pH及び温度、反応条件下で鏡像選択性、及び安定性を分析する。
目的の特性を示す標的酵素をGSSMTMのために選択する。標的酵素への変異導入後、生成した変種を、ハイスループットスクリーニング技術を利用して、その基質に対してスクリーニングする。HPLCによるポジティブ変種の確認後、変種の特性を更に増強するために、個々のポジティブ変種を組み合わせ、可能な添加物又はそれらの協調効果を評価する。
これに加え、その反応系における活性、鏡像選択性、及び安定性を含む目的の特性により選択されたリード酵素の組み合わせによりGeneReassemblyTMが行われるであろう。
5種類の異なるニトリラーゼ基質の鏡像選択的加水分解についてニトリラーゼを同定した。これらのニトリラーゼを単離し、選択された基質に対して最適化した。この最適化には、反応工程の最適化及び指向性進化が含まれている。具体的には、(S)-フェニル乳酸の生産を特異的に触媒する酵素の特性を分析し、最適化した。これは、主として、高い鏡像選択性を維持したままその酵素活性を改良することを目的として行った。これらの酵素に対する反応条件の検討も行った。
(S)-フェニル乳酸の生産において高い鏡像選択性を示すニトリラーゼとして配列番号103、104が同定された。配列番号103、104の特性決定により、この酵素はpH 8、37℃で最適な反応性を示すことが確認された: 反応開始物質であるフェニルアセトアルデヒド及びその生産物であるフェニル乳酸は、各々5 mM及び30 mMまで酵素活性に影響を与えなかった。拡大された規模での酵素反応におけるee値は95 %であった。
酵素全体をカバーする単一アミノ酸置換のライブラリーを作製するため、nitB 遺伝子(GenBank Accession No. AX025996、from Alcaligenes faecalis)に対して遺伝子部位飽和変異法(GSSMTM)を行った。指向性進化に利用した「親」nitB 遺伝子の配列は、配列番号 103、104に示されている。nitB 変種のライブラリーは、GSSMTMにより作製した。このnitB 変種のライブラリーを、全細胞による増加したヒドロキシメチルチオブチロニトリル(HMTBN、ニトリラーゼ基質)活性を指標にしてスクリーニングした。この基質を用いたニトリラーゼ反応における生産物は、ヒドロキシメチルチオ酪酸(HMTBA)である。
アッセイは、37℃において、100 mM HMTBN及び100 mMリン酸カリウム (pH 7)の存在下で行い、その変換率は、約30-40 %であった。HMTBN の変換の定量には二種類の方法を使用した。一つは生産されたHMTBSをHPLC分析により直接測定する方法、もう一つは、前述された蛍光性シアニドアッセイを利用した残存HMTBNの非直接的検出法である。
これらの変種は親遺伝子よりも発現レベルが高く、QM2及びTM3は、また、SDS-PAGE 分析によると、野生型に比べ可溶性酵素の比率が高かった。安定性に関しては、25℃及び37℃の両条件において、全ての酵素が本質的に同じ安定性を示した。
最後に、これらの変種に対するコドンの最適化を行った。このアプローチは、コドンを最適化し、それによって特定の宿主細胞内での発現レベルを増加させるためであった。これは言い換えると、細胞当たりの酵素活性の増加である。これにより、コドンが最適化された変種における全細胞での酵素活性が対照に比べ増加した。活性の増加率は、約2倍であった。E. coliによる発現系を使用した。
図15A-Pに列挙されている化合物は、本発明の酵素及び/又は方法を利用して、ニトリラーゼの触媒反応により生産し得る、選択された化合物である。
更に、以下の化合物はニトリラーゼのStrecker 形式の反応により生産され得る化合物である。本発明のニトリラーゼを利用することにより、各々のアルデヒド又はケトンから、100種以上のアミノ酸や多数の新規薬剤が生産される。例えば、本発明のニトリラーゼを利用して合成され、多量に市販されている薬物にはホモフェニルアラニン、VasotecTM、VasotericTM、TeczemTM、PrinivilTM、PrinzideTM、ZestrilTM、ZestoreticTM、RamaceTM、TarkaTM、MavikTM、TrandoaprilTM、TrandolaprilatTM、ALTACETM、ODRIKTM、UNIRETICTM、LOTENSINTM、LOTRELTM、CAPOTENTM、MONOPRILTM、TANATRILTM、ACECOLTM、LONGESTM、SPIRAPRILTM、QUINAPRILTM、及び CILAZAPRILTMが含まれる。その他のキラル薬物には、DemserTM (α-メチル-L-チロシン)、AldochlorTM、LevothroidTM、SynthroidTM、CytomelTM、ThyolarTM、HycodanTM、CuprimineTM、DepenTM、PrimaxinTM、MIGRANOLTM、D.H.E.-45、DIOVANTM、CEFOBIDTM、L-DOPA、D-DOPA、D-αメチル-DOPA、L-αメチル-DOPA、L-γ
-ヒドロキシグルタミン酸、D-γ-ヒドロキシグルタミン酸、3-(2-ナフチル)-L-アラニン、D-ホモセリン、及び L-ホモセリンが含まれる。
図16A-G に示されている化合物は基質及び本発明のニトリラーゼ酵素及び/又は方法を利用して生産される生産物の例である。基質と生産物の化学構造が示されている。ここに示されている化学反応は、本発明のニトリラーゼにより触媒される反応例であるが、これらに限定されない。
ニトリラーゼ変種1506-83-H7Aの配列は、残基190のアラニンがヒスチジンで置換された配列番号 210である。コドンレベルでは、生じている変異はGCTのCATへの変異である。この変種は、3-ヒドロキシグルタリルニトリル(HGN)の(R)-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸への変換において、改良された鏡像選択性を示した。
この変種は、室温における100 mM リン酸ナトリウム緩衝液中で上記の変換を行うことが立証されている。この変種は、その他の温度及び緩衝液系において付加的な改良された特性を示す能力を有し得る。この特性の例として、これに限定されないが、改良された反応速度、 % ee値及び安定性が含まれている。具体的には、この改良された特性は速い反応速度、高い % ee値及び高い安定性であり得る。改良された特性は野生型酵素に比べ少なくとも25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、又は95 % 増加、若しくは減少し得る。
本発明において、配列番号 として示された配列の変種は、発現ベクター中にクローン化される。例えば、核酸配列配列番号195、205、207、209、OR 237 の変種及びアミノ酸配列配列番号210 の変種をコードするヌクレオチドが、例えば、これに限定されないが、pSE420(E. coli 発現ベクター)やpMYC(シュードモナス発現ベクター)などの典型的なベクターに挿入され、クローン化される。
室温 (〜22℃) において、攪拌されているニトリラーゼ細胞溶解物(150 mg タンパク質となるように標準化)を含む 2.12 mlの100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7)に、3-ヒドロキシグルタリルニトリル(1 g、9 mmol)を一滴ずつ添加する。この3 M反応物を、室温にて24時間、電磁攪拌機で攪拌する。TLC(薄相クロマトグラフィー)及びGC(ガスクロマトグラフィー)を使用して反応の進行状態を確認する。この反応は24時間以内に完了するはずである。
本明細書で考慮されるその他の変種には、以下の変種が含まれているが、これらには限定されない: N111S; A190H、S、Y又はT; F191L、V、M、D、G、E、Y 若しくは T; M199E、又はL; D222L; A55K、G、又はQ; I60E、又はこれらの組み合わせ。
鏡像選択的変換スクリーニングするための新規な方法、例えば、反応により得られる生産物のee値(%)を測定できるような、プロキラル基質のキラル化合物への鏡像選択的変換をスクリーニングするための新たな方法を開示する。この方法は、ジアステレオマー過剰量 (diastereomeric excess、 % de)を決定するためにも適用できる。
例えば、ある分子中の2つのプロキラル又は鏡像異性化部分のうちの一つを、例えば、酵素などの選択的な触媒により、例えば、重同位体又は軽同位体などを利用した修飾によりラベル化し、選択的触媒による前記2つの部分のうちの一つの部分の修飾を質量分析(MS)により確認する。
15N-(R)-HGN (R)(図17に示されているように)または15N-(S)-HGNに対して例示的なニトリラーゼ反応を行い、可能な二種のラベル化酸生成物と非ラベル化酸生成物の各々の量を分析することにより、その酵素の鏡像選択性が決定できる。
% ee = {[130]-[129]}/{[130]+[129]}。
ここで軽い酸 (129)及び重い酸 (130)の各々の濃度は、質量分析で得られる標準曲線とピーク面積との相関により決定されるか、又は129及び130の各々の質量分析で得られるピーク面積値の直接的な比較により決定される。二種のエナンチオマー(ラベル化及び非ラベル化物質)の相対量を決定するために利用される実際の質量単位は、どのように質量分析機が調整されたかに依存する。
ある場合において、質量分析により得られた % ee値は、液体クロマトグラフィーなどの他の分析方法により観察された値と異なっていることがあり、これは、試料中の天然同位体に由来するバックグラウンド又は夾雑物質によるピークに起因している。しかし、これは、スクリーニングで得られる最終的な結果には影響しない。軽い酸及び重い酸の定量により得られた例示的な標準曲線を図14A及びBに示す。
以下の反応は、例えば、15N-(R)-HGNを調製するための合成経路であり、商業的に利用可能な開始物質を用い、この分野で公知の化学技術を利用する。
酵素の安定性
野生型酵素(配列番号209 及び 210)と配列番号209及び210の変種A190H との比較を行った。この実験において、各々の酵素を、10 mg/mlとなる水溶液中で二種類の異なる基質、アジポニトリル又はヒドロキシグルタリルニトリルの存在下、4℃又は21℃で1、25、50、75、及び150 時間インキュベートした。全ての条件下において、両方の酵素は、150 時間その活性を保持していた。ニトロプルシッドBertholet アッセイ[例えばFawcett、J. K. & Scott、J. (1960); J. Clin. Path.; Vol. 13、pg 156を参照]によれば、野生型酵素は、アジポニトリルに対して強い活性を示し、変種酵素(A190H)は、ヒドロキシグルタリルニトリルに対して強い活性を示すことが確認された。
100mM HGNによるニトリラーゼ活性アッセイ
ニトリラーゼのポジティブ変種であると推定された変種を三つ組でアッセイした。各々の形質転換体を、5 mlのLB培地(100μg/ml のアンピシリンを含む)中で37℃、220 rpmにおいて18 時間培養した。一夜培養した培養液を、二倍に希釈し、ニトリラーゼの発現を誘導するため0.1 mMのIPTGを加えて37℃ 、220 rpm において6 時間培養した。細胞を遠心分離により回収し、100 mM リン酸ナトリウム(pH 7)で洗浄後、1 mlの100 mM HGNを含む100 mMリン酸ナトリウム(pH 7)に懸濁した。反応は、22℃において少なくとも36 時間、穏やかに攪拌しながら続けた。反応の進行状態は、TLC により確認した (1:1 酢酸エチル/ヘキサン。ニトリルのRf 値は0.5であり、酸のRf 値は0.0 である)。細胞、及びその他の不溶物質を遠心分離により除き、凍結乾燥を行う前に一容量のメタノールで処理した。凍結乾燥物は、メタノールに懸濁後、ガスの発生が終わり、GC 分析のためのメチルエステルが調製されたことを示す黄色が持続するまでTMS-ジアゾメタン(2 M のヘキサン溶液、10 倍量)で処理した。(R)-(-)-3-ヒドロキシ-4-シアノ酪酸を95 % ee又はそれ以上で生産する選択されたニトリラーゼ変種の2.25 M HGNに対する活性を評価した。
3-HGN (0.2 g、1.8 mmol、3M)を、22℃において、0.6 mlの100 mMリン酸ナトリウム(pH 7)に懸濁した。細胞溶解物(6 mg ニトリラーゼとなるように標準化)を酵素濃度11 mg/mlとなるように調製し、22℃、100 rpmにおいて反応を行った。反応の進行状態は TLCにより確認した(1:1 酢酸エチル/ヘキサン。ニトリルのRf値は0.32であり、酸のRf値は0.0である) 。反応混合物を、凍結乾燥を行う前に一容量のメタノールで処理した。凍結乾燥物をメタノールに懸濁後、GC 分析のためのメチルエステルを調製するためにTMS-ジアゾメタン(2 M のヘキサン溶液、10 倍量)で処理した。
GSSMライブラリー中の特定の集団を、自動化コロニー摘み取り機により、40 μlのLB(Luria-Bertani)培地(100μg/ml のアンピシリンを含む)を含む384-ウェルプレート中に整列分注し、37℃、湿度85 %において培養した。ニトリラーゼの発現を誘導するため0.1 mMのIPTGを加え、37℃にて24時間培養した。各々のプレートのレプリカをとり、-80℃での保存用に20 %グリセロール溶液を調製した。各々の384-ウェルプレートに10 mMの15N-(R)-1基質を添加した。このプレートを、37℃、湿度85 %において三日間培養した。細胞及びその他の不溶物質を遠心分離により除き、その上澄みをMS 分析に先立ち17,576 倍に希釈した。
ハイスループット分析には、LC/MS イオンスプレー法を以下の様式で使用した。CTCPAL自動サンプラー(Leap Technologies、Carrboro、NC)を用いて384-ウェルプレートからの液体試料をフローインジェクションすることによってハイスループットスクリーニングを行った。71 %アセトニトリル、及び29 % 水(0.1 %の蟻酸を含む)より成る定組成溶液を、LC-10ADvp ポンプ (島津製作所、京都) により、LC-18 カートリッジ (Supelco、Bellefonte、PA) を通じて流速2.2 ml/分で流した。試料は、API 4000 TurboIonスプレー三重-四重極質量分析計(Applied Biosystems、Foster City、CA) で分析した。分析試料のイオンスプレー及び多重反応測定(MRM、Multiple Reaction Monitoring)は陰性イオンモードにより行い、各々の試料の分析は60秒とした。
Claims (20)
- (a)一以上の変異を有する配列番号195の変種配列と少なくとも90%同一の配列を有する核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号195の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号195の部位178-180がGAA又はGAGで置換されている;
配列番号195の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号195の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG又はACGで置換されている;
配列番号195の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号195の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号195の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
または、
前記変異が前記置換のいずかの組合せである、前記核酸、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号196の変種と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
配列番号196の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号196の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号196の残基111がセリンで置換されている;
配列番号196の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号196の残基191がロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号196の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号196の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記核酸、
または、
(c)(a)または(b)に相補的な核酸、
を含む、単離、合成または組換え核酸。 - 一以上の変異を有する配列番号195の変種と同一の配列を有する核酸を含む、単離、合成または組換え核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号195の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号195の部位178-180がGAA 又はGAGで置換されている;
配列番号195の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号195の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACGで置換されている;
配列番号195の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号195の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号195の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、
前記単離、合成または組換え核酸。 - 請求項1記載の核酸を含む、宿主細胞での複製が可能な核酸ベクター。
- 請求項1記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項3記載の宿主細胞を含む宿主生物。
- 固相支持体に固定化された、請求項1記載の単離、合成又は組換え核酸。
- 固相支持体が、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項5記載の単離、合成又は組換え核酸。
- (a)一以上の変異を有する配列番号196の変種と少なくとも90%同一の配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号196の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号196の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号196の残基111がセリンで置換されている;
配列番号196の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号196の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号196の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号196記載の配列を有するポリペプチドであって、ニトリラーゼ活性を有し、
配列番号196の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号196の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号196の残基111がセリンで置換されている;
配列番号196の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号196の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号196の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(c)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが水素結合性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号196記載の配列を有するポリペプチド、または、
(d)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが疎水性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号196記載の配列を有するポリペプチド、を含む、単離、合成又は組換えポリペプチド。 - 請求項8記載のポリペプチドに特異的に結合する精製抗体。
- (a)請求項8記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む酵素の、液体又は乾燥品である酵素調製物、または、
(b)固相支持体に固定化された、(a)記載の酵素調製物。 - ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体をニトリルと接触させることを含む、ニトリルのカルボン酸への加水分解方法。
- 分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分のカルボン酸への加水分解方法であって、ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体を前記分子と接触させることを含む、分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分の加水分解方法。
- シアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を有する分子と、請求項8記載のアミノ酸配列の少なくとも一つを有するポリペプチド、又は、鏡像選択性ニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と前記分子とを混合することを含む、キラルアルファヒドロキシ酸分子、又はキラルアミノ酸分子の作製方法。
- 組成物又は前記組成物の中間体の製造方法であって、前記組成物または中間体のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を含む前駆体を、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも1つ又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と混合すること、および、前駆体中のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を加水分解することを含む、前記製造方法。
- (R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
選択的に(R)- 光学異性体または(S)-光学異性体を生成して(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸を生成する、請求項1記載の核酸によりコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、または請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つまたはこれらのいずれかの組合せとヒドロキシグルタリルニトリルとを接触させることを含む、
前記方法。 - (R)-マンデル酸または(S)-マンデル酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
マンデルニトリルと請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、これらのいずれかの組合せ、または、ニトリラーゼ活性を有するペプチド疑似体、とを混合することを含む、前記方法。 - (S)-フェニル乳酸誘導体又は(R)-フェニル乳酸誘導体の製造方法であって、フェニルラクトシアノニトリルと請求項8記載のポリペプチド少なくとも1つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つとを混合すること、を含む前記方法。
- 以下を含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドの作製方法:
a) 宿主細胞によりポリペプチドが生合成される条件下で請求項1記載の核酸を宿主細胞へ導入すること;および、
b)生合成されたポリペプチドを回収すること。 - 以下により請求項1記載の核酸を改変することを含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸変種であって、天然に存在するものとは異なる、改変された生物学的な活性を有する前記変種の製造方法:
i.1つ以上のヌクレオチドを、天然又は非天然ヌクレオチドを含む、異なるヌクレオチドで置換する;
ii.1つ以上のヌクレオチドを削除する;
iii.1つ以上のヌクレオチドを挿入する;または、
iv. i〜iiiの組み合わせ。 - 請求項1記載の核酸および緩衝液を含むキット。
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