JP4523165B2 - Transgenic and cloned mammals - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、1998年11月２日出願の仮特許出願第60/106,728号、1999年4月26日出願の仮特許出願第60/131,328号、1999年4月23日出願の米国特許出願第09/298,971号、および1999年4月22日出願の米国特許出願第09/298,508号に基づく優先権の利益を主張しており、それら全てが参照によってここに組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
遺伝子導入技術によって動物ゲノムを改変し得ることは、医学的用途に新たな道を開いた。大型の家畜の乳腺に生物医学的タンパク質を発現させることによって、大量の有用な医療用タンパク質を低コストで作成することが現在可能である(Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35: 609-617; Maga et al. (1995) Bio/Technology, 13: 1452-1457; Echelard (1996) Curr. Op. Biotechnol. 7: 536-540; Young et al. (1977) BioPharm. 10: 34-38)。1996年における生物系薬剤の上位１５の総売上は７５億ドルに達したが、この数字は将来更に伸びるものと予測される（Med. Ad News 16:30）。遺伝子導入技術は、高単位用量の必要性、高い投与頻度、または大きな患者人口のために大量に必要な蛋白質、あるいは伝統的な細胞培養法では商業的に有意義な量産が難しい複雑な蛋白質に応用可能で魅力的である。更にトランスジェニック家畜の乳中におけるヒト用薬剤の生産は、例えば翻訳後修飾の不在、不完全な折りたたみ、高い精製コストのような微生物バイオリアクターに関連する多くの問題、あるいは、例えば高額な初期投資、高価な培養液、および低い収率のような動物細胞バイオリアクターに関連する多くの問題を解決する。
【０００３】
酪農用のヤギは、医薬用組み換えタンパク質の遺伝子導入生産にとって理想的である。その平均の乳産出量は搾乳当たり６００−８００リッターである。扱いやすい群れの規模を用い、種々の動物モデルで反復達成された１−５g／リッターの濃度に基づき、１年に１−３００kgの精製産物を得るためのトランスジェニックタンパク質の生産が可能である(Gordon et al. (1987) Bio/Technology 5:1183-1187; Meade et al. (1990) Bio/Technology 8:443-446; Ebert et al. (1991) Bio/Technology 9:835-838;Simons et al. (1987) Nature 328:530-532; Wright et al. (1991) Bio/Technology 9:801-834; Velander et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:12003-120007; Hansson et al. (1994) J Biol Chem. 269:5358-5363; Hurwitz et al. (1994) Transgenic Res. 3:365-375.)。それは大容量タンパク質のカテゴリーの小から中規模であり、現在開発されつつある生物系薬剤の大部分において必要とされるであろう量を意味する。更にヤギの世代間隔、つまり妊娠から、性的成熟、そして妊娠までは、ウシの３年に対して、１８ケ月である。この期間は、遺伝子導入技術によって生産された医療用タンパク質の規制認可のために必要な期間内において、生産動物群の拡大を可能とする。さらに、同じ繁殖能力を有し、かつ乳産出量の低いヒツジに比べて、遥かにスクレイピーの頻度が低いため（米国において現在まで７例報告されている）、ヤギは医療用タンパク質生産のより良い系となっている。現時点では、トランスジェニックヤギを作る信頼できる手法が非常に少ない。そのような方法の１つが、前核マイクロインジェクション(pronuclear microinjection)である。前核マイクロインジェクションを使用した場合、導入遺伝子の遺伝子構造への組込みは、マイクロインジェクションされた胚全体の１−３％に達する（Ebert et al. (1993) Theriogenology, 39:121-135）。
【０００４】
マウスの胚性幹細胞を分離し、in vivoで増殖させ、遺伝子組み換えして、最終的にレシピエント胚の生殖細胞系に寄与させ得ることが1981に発表された（Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Martin (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:7634-7638; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-256）。それ以来、マウス胚性幹細胞は、発生学および遺伝学の研究において、単一の標的遺伝子の改変、すなわち、欠失、置換、変異等に広く利用されてきた（Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352; McMahon et al. (1990) Cell 62:1073-1085; recently reviewed in: Bronson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:27155-27158; Rossant, et al. (1995) Nat. Med. 6:592-594）。マウスにおける広範囲の研究はこの強力かつ見事な技術の有用性を明らかに示したが、胚性幹細胞技術の成功した応用は、結果的にマウスにおいてのみ報告がなされている。しかしながら、クローンおよびトランスジェニック動物（例えばヤギ）を得る方法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞に導入し、同時に活性化させることによって、クローンおよびトランスジェニック動物（例えばクローンおよびトランスジェニックヤギ）を得ることができるという発見に基づく。機能的除核卵母細胞は活性化されても活性化されなくても差し支えない。１つの実施形態において、非活性化状態の機能的除核卵母細胞（例えば中期IIのヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）と融合させ（例えば電気融合(electrofusion)によって）、かつ融合と同時に活性化する。他の実施形態において、活性化された機能的除核卵母細胞（例えば自然に成熟した終期のヤギ卵母細胞）をドナー体細胞（例えばヤギの体細胞）と融合させ（例えば電気融合によって）、かつ融合と同時に活性化する。
【０００６】
トランスジェニック核の核移植のための体細胞株（例えば組み換え一次線維芽細胞体細胞株）の使用は、トランスジェニック動物を作る効率を劇的に向上させる（例えばここで説明される方法によって動物を作る場合、１００％まで向上する。）また、発生途上の胚の各細胞が導入遺伝子を包含するため、初期のモザイク現象の問題も解決する。更にトランスジェニック細胞株からの核移植によるトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックヤギ）の作出は、特定のトランスジェニック系統の加速された規模の拡大を可能とする。例えば動物群の拡大を１繁殖シ−ズンで達成できる。
【０００７】
体細胞からの核移植によるトランスジェニック動物の作出 （例えばトランスジェニックヤギ）は伝統的なマイクロインジェクション法では不可能な遺伝子操作を可能とする利点を持つ。例えば体細胞からの核移植は特定の変異の導入を可能とし、あるいはゲノムの特定部位に対する外来遺伝子の標的化は、組込み位置効果の問題を解決する。ドナー体細胞における相同組み換えは、内因性タンパク質(例えばヤギの内因性タンパク質)を「ノックアウト」するか、あるいは置換して、乳中に発現された異種タンパク質の精製コストを下げ、さらに動物バイオリアクターの正確な調節に役立つ。
【０００８】
全体的に、本発明は、ヒト以外のクローン哺乳動物（例えばクローンヤギ）を作る方法に関する。以下の方法はヤギを対象として説明されるが、他のいかなるヒト以外の哺乳動物にも適用できる。その方法は：ヤギ体細胞由来のヤギゲノムをヤギ卵母細胞（特に望ましいのは自然に成熟した終期の卵母細胞）に移植して再構築胚を作り；例えばその再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって、再構築胚をヤギに発生させてヤギを提供する。1つの実施形態において、例えば、直接注入または体細胞と卵母細胞との融合（例えば電気融合）によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する：ことを含む。
【０００９】
好ましい実施形態において、再構築胚からヤギが発生する。別の実施形態では、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞はG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞であり、例えば体細胞は胚性線維芽細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞(mammary cell)であって差し支えない。好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；細胞周期の望ましい期（中期、終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００１０】
好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤギとの交配をふくむ。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のヤギを第一のヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のヤギと交配させて差し支えない。
【００１１】
好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態において、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。好ましい実施形態において：産物（例えば、タンパク質、組み換えタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例えばヒトタンパク質）をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、例えばトランスジェニックヤギのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する方法に関する。以下にヤギについての方法を記載するが、本方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用することができる。本方法は：ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、遺伝子組換えヤギ体細胞のゲノムを導入して再構築胚を形成し；さらに、例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって再構築胚をヤギに発生させ、それによってトランスジェニックヤギを提供する：ことを含む。
【００１３】
１つの実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合（例えば電気融合）によって、遺伝子組換えヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する。
【００１４】
好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態において、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【００１５】
好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞は活性化されている）、例えば体細胞はG₁期にある。別の実施形態では、体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞であり、例えば体細胞は胚性線維芽細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞のいずれかであって差し支えない。
【００１６】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；体細胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しかつ導入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【００１７】
好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；遺伝子組換えゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００１８】
好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤギとの交配を含む。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のヤギを第一のヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のヤギと交配させて差し支えない。
【００１９】
好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態において、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。好ましい実施形態において：産物（例えば、タンパク質、組み換えタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例えばタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【００２０】
好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を含む。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックイン(knockin)またはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００２１】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００２２】
好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパク(whey acid protein)プロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、例えばクローンまたはトランスジェニックヤギのようなヒト以外の哺乳動物を作る方法に関する。以下にヤギについての方法を記載するが、本方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用することができる。本方法は：例えば電気融合によって、導入タンパク質を発現し得るヤギ体細胞のような体細胞を除核ヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）と融合させて、再構築胚を得て；その再構築胚を活性化させ；その胚をレシピエントの雌ヤギに移植し；さらにその胚をヤギに発生させる：ことを含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態において、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【００２５】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点(START)前のG₁期のようなG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。
【００２６】
好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにある。あるいは、卵母細胞は終期にある。いずれかの実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態において：in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００２７】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；体細胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しかつ導入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【００２８】
好ましい実施形態において、本方法は、再構築胚から発生したヤギと第二のヤギとの交配をふくむ。第二のヤギは：正常なヤギ；再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ；あるいは、第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生したまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である第二のヤギ：であって差し支えない。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００２９】
好ましい実施形態において、ヤギは雄ヤギである。他の好ましい実施形態において、ヤギは雌ヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【００３０】
好ましい実施形態において：産物（例えば、タンパク質、組み換えタンパク質、ヒトタンパク質）をヤギから回収でき；産物（例えばヒトタンパク質）をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【００３１】
好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を含む。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００３３】
好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００３４】
また、本発明は、この中に記載の任意の方法によって作られたヒト以外の動物を包含する。ヤギのために記載された方法を任意のヒト以外の哺乳動物に応用できる。従って、別の態様において、本発明は、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した後期卵母細胞に、ヤギ体細胞のゲノムを導入し、再構築胚を得て、さらにその再構築胚をヤギに発生させることによって得られるクローンヤギまたはそれらの子孫に関する。
【００３５】
好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支えない。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。
【００３６】
好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。
【００３７】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００３８】
好ましい実施形態において、例えば電気融合によって、体細胞と機能的除核卵母細胞を融合させることによってヤギゲノムを導入することができる。
【００３９】
別の態様において、本発明は、例えば1匹以上の雄および１匹の雌から成る集団のような、クローンヤギに関するものであり、その各細胞がヤギ体細胞に由来する染色体ゲノムを有しており、そのヤギ体細胞はクローンヤギ以外のヤギに由来する。
【００４０】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支えない。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞、または乳腺細胞であって差し支えない。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞はG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。
【００４１】
別の態様において、本発明は、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、遺伝子組換えヤギ体細胞のゲノムを導入して再構築胚を形成し、さらに、再構築胚をヤギに発生させることによって得られたトランスジェニックヤギまたはその子孫に関する。
【００４２】
好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支えない。別の好ましい実施形態において、ヤギゲノムは胚性線維芽細胞のようなヤギ線維芽細胞であって差し支えない。
【００４３】
好ましい実施形態において、ヤギ卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。
【００４４】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；細胞周期の望ましい期（中期、終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態において、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００４５】
好ましい実施形態において、例えば電気融合によって体細胞と機能的除核卵母細胞を融合させることによってヤギゲノムを導入することができる。
【００４６】
好ましい実施形態において、体細胞のヤギゲノムは導入遺伝子配列を含む。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、酵素の何れかであるタンパク質、およびおよびペプチドをコードしていて差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質として、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００４７】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００４８】
好ましい実施形態において、ヤギゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００４９】
別の態様において、本発明はトランスジェニックヤギに関するものであり、その各細胞は遺伝子組換えヤギ体細胞由来の染色体ゲノムを有し、ヤギ体細胞はそのトランスジェニックヤギ以外に由来する。
【００５０】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは胚性体細胞に由来していて差し支えない。別の好ましい実施形態において、染色体ゲノムは例えば胚性線維芽細胞のようなヤギ線維芽細胞に由来していて差し支えない。
【００５１】
好ましい実施形態において、体細胞の染色体ゲノムは導入遺伝子配列を含む。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、酵素、およびペプチドの何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００５２】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００５３】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００５４】
別の形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギ（この中に記載のように作る）を第二のヤギと交配させることによって作ったヤギに関する。
【００５５】
好ましい実施形態において：第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である。好ましい実施形態において、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００５６】
別の形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤギと交配させることによって得られた複数のトランスジェニックヤギに関する。
【００５７】
好ましい実施形態において：第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である。好ましい実施形態において、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【００５８】
さらに別の態様において、本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合型のトランスジェニックヤギを提供する方法に関する。本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合型である体細胞を提供し；導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞を作るために体細胞組換えを生じさせ；導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞に由来するゲノムをヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して再構築胚を形成し；さらに例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって再構築胚をヤギに発生させ、それによって導入遺伝子配列とホモ接合型のトランスジェニックヤギを提供することを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明は、導入遺伝子配列とホモ接合型のトランスジェニックヤギに関する。
【００６０】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列とホモ接合型の体細胞に由来するゲノムをヤギ卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して再構築胚を形成し；さらにその再構築胚をヤギに発生させることによってトランスジェニックヤギを作った。
【００６１】
別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のクローン哺乳動物を作る方法に関する。本方法は、例えば、終期の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞のような活性化された卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞に導入して再構築胚を得て；さらに例えば再構築胚をレシピエントの雌に移植することによって再構築胚を発生させ、それによってクローン哺乳動物を作ることを含む。
【００６２】
好ましい実施形態において、例えばヤギのような哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、例えばヤギのような哺乳動物は、再構築胚から発生した例えばヤギのような哺乳動物の子孫である。
【００６３】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。
【００６４】
好ましい実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態においてin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００６５】
好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００６６】
別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞のような活性化された卵母細胞を機能的に除核し、体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）に導入して再構築胚を形成し；さらに例えば再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植することによって再構築胚を発生させることによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のクローン哺乳動物に関する。
【００６７】
好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。
【００６８】
別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作る方法に関する。本方法は、例えば、終期の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞のような活性化された卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞に導入して再構築胚を得て；さらに例えば再構築胚をレシピエントの雌に移植することによって再構築胚を発生させ、それによってトランスジェニック哺乳動物を得ることを含む。
【００６９】
好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、哺乳動物動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００７０】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。
【００７１】
好ましい実施形態において、ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態においてin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００７２】
好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００７３】
好ましい実施形態において、体細胞の核は導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００７４】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００７５】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーター等の哺乳動物特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクタンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００７６】
別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）のような活性化された卵母細胞を機能的に除核し、遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入して再構築胚を形成し；さらに例えば再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植して再構築胚を発生させることによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。
【００７７】
好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るためにin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。
【００７８】
別の態様において、本発明は、例えば終期の卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）のような活性化された卵母細胞を機能的に除核し、遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入することによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダの胚のようなヒト以外の哺乳動物の再構築胚に関する。好ましい実施形態において、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て、例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を得るためにin vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る。
【００７９】
さらに別の態様において、本発明は、例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のクローン哺乳動物を作る方法に関する。本方法は、卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞（ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる）に導入して再構築胚を得て；再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植し；再構築胚を発生させ、それによってクローン哺乳動物を作ることを含む。
【００８０】
好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００８１】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性細胞である。別の好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。別の好ましい実施形態において、卵母細胞は除核卵母細胞である。
【００８２】
好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る（例えば細胞周期の望ましい期（例えば終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得る）。別の実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００８３】
好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００８４】
別の態様において、本発明は例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作る方法に関する。本方法は、卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を提供し；卵母細胞を機能的に除核し；遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを機能的除核卵母細胞（ゲノム導入前またはゲノム導入と同時に卵母細胞を活性化させる）に導入して再構築胚を得て；再構築胚をレシピエントの哺乳動物に移植することによって再構築胚を発生させ、それによってトランスジェニック哺乳動物を作ることを含む。
【００８５】
好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【００８６】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。別の好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。好ましい実施形態において、体細胞は非休止細胞であり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は、臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休止細胞であり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。別の好ましい実施形態において、卵母細胞は除核卵母細胞である。
【００８７】
好ましい実施形態において、卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；例えば細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態において、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【００８８】
好ましい実施形態において、例えば電気融合のような融合によって、あるいは例えばマイクロインジェクションのような卵母細胞への核の直接注入によって、体細胞の染色体ゲノムを卵母細胞に導入する。
【００８９】
好ましい実施形態において、体細胞の核は導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えば組織特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニック哺乳動物における発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【００９０】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【００９１】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、例えばヤギプロモーター等の哺乳動物特異的プロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【００９２】
別の態様において、本発明は、哺乳動物の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を機能的に除核し、さらに遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入する前または導入と同時に卵母細胞を活性化させることによって作られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダのようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関する。
【００９３】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を機能的に除核し、さらに遺伝子組換え体細胞の染色体ゲノムを除核卵母細胞に導入する前または導入と同時に卵母細胞を活性化させることによって得られた例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダの胚のようなヒト以外の哺乳動物の再構築胚に関する。
【００９４】
また、本発明は例えばクローンまたはトランスジェニック哺乳動物（例えばこの中に記載のクローンまたはトランスジェニックヤギ）のようなヒト以外の哺乳動物から得られたタンパク質（例えばこの中に記載の異種タンパク質）のような産物を含む。
【００９５】
好ましい実施形態において、産物は乳または乳中に分泌されたタンパク質である。
【００９６】
別の態様において、本発明は例えばヒトタンパク質のようなタンパク質を提供する方法に関する。本方法は：例えばトランスジェニック哺乳動物（例えばこの中に記載のトランスジェニックヤギ）のようなヒト以外の哺乳動物を提供し；さらにその哺乳動物から、または例えば乳のようなその哺乳動物の産物から、産物を回収する：ことを含む。
【００９７】
別の態様において、本発明は異種ポリペプチドを提供する方法に関する。本方法は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入することによって、ヤギの卵母細胞（好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞）にヤギゲノムを導入して再構築胚を形成し；例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植することによって再構築胚をヤギに発生させ；さらにそのヤギまたはそのヤギの子孫からポリペプチドを回収する：ことを含む。
【００９８】
好ましい実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合（例えば電気融合）によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する。
【００９９】
好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞は臨界点前のG₁期のようなG₁期にある。別の好ましい実施形態では、体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞であり、例えば胚性線維芽細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（例えばミオサイト）、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差し支えない。
【０１００】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列が体細胞に導入されており；その体細胞は例えば一次細胞株のような細胞株に由来し；体細胞は細胞株に由来しかつ導入遺伝子配列がその体細胞に導入されている。
【０１０１】
好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。
【０１０２】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１０３】
好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１０４】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１０５】
好ましい実施形態において、染色体ゲノムは、哺乳動物特異的プロモーター（例えばヤギプロモーター）のようなプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を包含する。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクタンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１０６】
好ましい実施形態において、例えば直接核注入または体細胞と卵母細胞の融合（例えば電気融合）によって、ヤギ体細胞の核をヤギ卵母細胞に導入する。
【０１０７】
好ましい実施形態において、体細胞は胚性体細胞である。別の好ましい実施形態において、体細胞は例えば胚性線維芽細胞のような線維芽細胞である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、卵母細胞は機能的除核卵母細胞、つまり除核卵母細胞である。
【０１０９】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期IIまたは終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；ゲノムの導入前または導入と同時に卵母細胞を活性化させる。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１１０】
好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１１２】
好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギの乳から異種ポリペプチドを精製する。
【０１１３】
好ましい実施形態において、本方法は、トランスジェニックヤギから搾乳することも含む。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、異種ポリペプチドを提供する方法に関する。本方法は：ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した後期卵母細胞に、遺伝子組換えヤギ体細胞のゲノムを導入し、再構築胚を得て、例えば再構築胚をレシピエントの雌ヤギに移植して再構築胚をヤギに発生させることによってヤギを作り；さらに、そのヤギ（例えばそのヤギまたはそのヤギの子孫の乳から）ポリペプチドを回収する：ことを含む。
【０１１５】
好ましい実施形態において、ヤギ体細胞のゲノムは導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。タンパク質は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、トランスジェニックヤギにおける発現が望まれる任意のタンパク質をコードしていて差し支えなく、限定はされないが、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンが挙げられる。
【０１１６】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１１７】
好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギの乳から異種ポリペプチドを精製する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、ヤギの再構築胚を作る方法に関する。本方法は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入し、それによって再構築胚を形成することを含む。
【０１１９】
好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞はG₁期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような胚性体細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差し支えない。
【０１２０】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期または終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；卵母細胞を除核する。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１２１】
別の態様において、本発明は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞にヤギ体細胞からのゲノムを導入することによって得られたヤギの再構築胚に関する。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、ヤギの再構築されたトランスジェニック胚を作る方法に関する。本方法は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入することによって、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞にヤギゲノムを導入し、それによって再構築されたトランスジェニック胚を形成しることを含む。
【０１２３】
好ましい実施形態において、体細胞は非休止期にあり（例えば細胞が活性化されている）、例えば体細胞はG₁期にある。別の好ましい実施形態では体細胞は休止期にあり（例えば細胞は停止している）、例えば体細胞はG₀期にある。好ましい実施形態において、体細胞は、例えば胚性線維芽細胞のような胚性体細胞である。体細胞は、線維芽細胞（例えば一次線維芽細胞）、筋肉細胞（ミオサイト）、神経細胞、卵丘細胞または乳腺細胞であって差し支えない。
【０１２４】
好ましい実施形態において：卵母細胞は中期IIにあり；卵母細胞は終期にあり；in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；細胞周期の望ましい期（例えば中期または終期）の卵母細胞を取り出すために、in vivoプロトコルを用いて卵母細胞を得て；卵母細胞を除核する。好ましい実施形態では、卵母細胞と体細胞を同調する（例えば卵母細胞と体細胞を共に活性化させるか、卵母細胞と体細胞を共に停止させる）。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、例えば遺伝子組換えヤギ体細胞の核を導入することによって、ヤギの卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞にヤギゲノムを導入することによって得られたヤギの再構築されたトランスジェニック胚に関する。
【０１２６】
別の態様において、本発明は、ヤギの群れを提供する方法に関する。本方法は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第一のヤギに発生させることによって第一のヤギを作り；ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第二のヤギに発生させることによって第二のヤギを作り；その際に第一および第二のヤギのゲノムが同じ動物、同じ遺伝子型または同じ細胞株に由来し、従ってヤギの群れを提供することを含む。
【０１２７】
好ましい実施形態において、第一のヤギまたはその子孫を第二のヤギまたはその子孫と交配させる。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第一のヤギに発生させることによって第一のヤギを作り；ヤギ卵母細胞、好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞に、ヤギ体細胞からのヤギゲノムを導入して（例えば核を導入することによって）再構築胚を形成し、さらにその再構築胚を第二のヤギに発生させることによって第二のヤギを作り；その際に第一および第二のヤギのゲノムが同じ動物、同じ遺伝子型または同じ細胞株に由来することによって得られたヤギの群れに関する。
【０１２９】
好ましい実施形態において、ヤギの群れは、この中に記載の任意の方法によって得られる。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、胚性または胎仔性の体細胞に関する。
【０１３１】
好ましい実施形態において、その細胞は精製された胚性または胎仔性の体細胞である。
【０１３２】
好ましい実施形態において、その細胞は胚性または胎仔性の体細胞の調製物中にある。
【０１３３】
好ましい実施形態において、胚性または胎仔性の体細胞株を作るのにその細胞を用いて差し支えない。
【０１３４】
好ましい実施形態において、その細胞は、導入遺伝子（例えばポリペプチドをコードする導入遺伝子）を包含する。導入遺伝子配列は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子のような異種の導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンをコードする。
【０１３５】
好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えば異種のまたはヤギのプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１３６】
好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線維芽細胞または一次派生線維芽細胞(primary derived fibroblast)であって差し支えない。
【０１３７】
好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物から得られた生殖細胞に由来するヤギ（例えば胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトランスジェニックヤギからの***であって差し支えない。
【０１３８】
好ましい実施形態において、その細胞は、例えば精製された胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体細胞のような、胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体細胞である。
【０１３９】
好ましい実施形態において、細胞は、胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体細胞の調製物の一部である。別の好ましい実施形態において、胚性または胎仔性の遺伝子組換えヤギ体細胞株を作るためにその細胞を用いる。
【０１４０】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例えばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１４１】
好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１４２】
好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１４３】
好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギから得られた生殖細胞に由来するヤギ（例えば胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトランスジェニックヤギからの***または卵母細胞であって差し支えない。
【０１４４】
好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細胞を用いる。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、容器（例えば気体または液体密閉容器）中に入れられた、例えばこの中に記載のような、胚性または胎仔性のヤギ体細胞、細胞の調製物、胚性または胎仔性のヤギ体細胞株に関する。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、凍結された（例えば低温保存された）、例えばこの中に記載のような、胚性または胎仔性のヤギ体細胞、細胞の調製物、胚性または胎仔性のヤギ体細胞株に関する。
【０１４７】
別の態様において、本発明はキットに関する。そのキットは、この中に記載されているような細胞容器を含む。好ましい実施形態において、そのキットは、トランスジェニック動物を調製するのに必要な使用説明書をさらに含む。
【０１４８】
好ましい実施形態において、そのキットは、レシピエントの卵母細胞（例えば除核卵母細胞）をさらに含む。
【０１４９】
別の態様において、本発明はクローンまたはトランスジェニックヤギを作るための構成要素を提供するための方法に関する。本方法は、例えばこの中に記載のような細胞の凍結試料を得て、さらにその試料を解凍することを含む。
【０１５０】
別の態様において、本発明は胚性または胎仔性のヤギ体細胞株を調製する方法に関する。本方法は、胚性または胎仔性のヤギから体細胞を得て；さらに体細胞株が得られるように、例えば適切な培地中において細胞を培養することを含む。
【０１５１】
好ましい実施形態において、細胞株は、遺伝子組換え細胞株であり、例えばその細胞は導入遺伝子を包含する。導入遺伝子は：体細胞ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子を含む異種導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１５２】
好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンをコードする。
【０１５３】
好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１５４】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例えばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１５５】
好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１５６】
好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１５７】
好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１５８】
好ましい実施形態において、トランスジェニックヤギから得られた生殖細胞に由来するヤギ（例えば胚のまたは胎仔のヤギ）から細胞を得る。生殖細胞はトランスジェニックヤギからの***または卵母細胞であって差し支えない。
【０１５９】
好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細胞を用いる。
【０１６０】
別の態様において、本発明は、胚性または胎仔性のヤギ体細胞株を調製する方法に関する。本方法は、ヤギの***で雌のレシピエントを受精させ；そのレシピエントからトランスジェニック胚を得て；その胚から体細胞を得て；さらに体細胞株が得られるように例えば適切な培地中においてその細胞を培養することを含む。
【０１６１】
好ましい実施形態において、***はトランスジェニックヤギに由来する。
【０１６２】
好ましい実施形態において、その細胞株は遺伝子組換え細胞株であり、例えばその細胞は導入遺伝子を包含する。導入遺伝子は：体細胞ゲノム中に一体化され；例えばヒト導入遺伝子を含む異種導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１６３】
好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンをコードする。
【０１６４】
好ましい実施形態において、導入遺伝子は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１６５】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え細胞は、その細胞に導入された例えばポリペプチドをコードする核酸のような核酸を包含する。核酸は：ゲノム中に一体化され；例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、ノックインまたはヤギ遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１６６】
好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１６７】
好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１６８】
好ましい実施形態において、体細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は一次線維芽細胞または一次派生線維芽細胞であって差し支えない。
【０１６９】
好ましい実施形態において、核移植のための遺伝子物質の供給源としてその細胞を用いる。
【０１７０】
また、本発明は、胚形成の２から４細胞期においてレシピエントの哺乳動物に移植された再構築胚がクローン哺乳動物に発生し得ることの発見に一部分基づく。哺乳動物は、胚、胎仔または出生後の哺乳動物（例えば成体の哺乳動物）であって差し支えない。
【０１７１】
従って、ある態様において、本発明は、例えばクローン哺乳動物（例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダ）のようなヒト以外の哺乳動物を提供する方法に関する。本方法は、例えばそのゲノムが体細胞に由来する再構築胚のような哺乳動物の再構築胚を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントの哺乳動物に移植し、さらにその再構築胚を哺乳動物に発生させて哺乳動物を作ることを含む。
【０１７２】
好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【０１７３】
好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１７４】
好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上皮細胞のような体細胞；例えば導入遺伝子配列を包含する体細胞のような遺伝子組換え体細胞：に由来する。
【０１７５】
好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生した哺乳動物を第二の哺乳動物（第二の哺乳動物は再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトランスジェニック哺乳動物を第一のトランスジェニック哺乳動物とは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニック哺乳動物と交配させて差し支えない。
【０１７６】
好ましい実施形態において、哺乳動物は雄の哺乳動物である。他の好ましい実施形態において、哺乳動物は雌の哺乳動物である。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０１７７】
好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のような組換えタンパク質）のような産物を哺乳動物から回収し；例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質）のような産物を哺乳動物の乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【０１７８】
好ましい実施形態において、哺乳動物は胚、胎仔または出生後（例えば成体）である。
【０１７９】
好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは、例えばトランスジェニック細胞または核酸が導入された細胞のような遺伝子組換え体細胞に由来する。
【０１８０】
別の態様において、本発明は、本発明は、例えばトランスジェニック哺乳動物（例えばヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマ、ラクダ）のようなヒト以外の哺乳動物を提供する方法に関する。本方法は、哺乳動物の再構築胚（例えばそのゲノムが遺伝子組換え体細胞に由来する再構築胚）を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントの哺乳動物に移植し、さらにその再構築胚を哺乳動物に発生させて哺乳動物を作ることを含む。
【０１８１】
好ましい実施形態において、哺乳動物が再構築胚から発生する。別の実施形態において、哺乳動物は再構築胚から発生した哺乳動物の子孫である。
【０１８２】
好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１８３】
好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生した哺乳動物を第二の哺乳動物（第二の哺乳動物は再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトランスジェニック哺乳動物を第一のトランスジェニック哺乳動物とは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニック哺乳動物と交配させて差し支えない。
【０１８４】
好ましい実施形態において、哺乳動物は雄の哺乳動物である。他の好ましい実施形態において、哺乳動物は雌の哺乳動物である。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０１８５】
好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のような組換えタンパク質）のような産物を哺乳動物から回収し；例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質）のような産物を哺乳動物の乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【０１８６】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞は導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１８７】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、トランスジェニック動物における発現が望まれる任意のタンパク質、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１８８】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１８９】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１９０】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞のゲノム中に核酸が導入されていて差し支えない。核酸は：例えばヒト配列を含む異種核酸のような異種核酸；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギのまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。核酸配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０１９１】
好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０１９２】
好ましい実施形態において、核酸配列はヒトタンパク質をコードする。
【０１９３】
好ましい実施形態において、核酸は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０１９４】
別の態様において、本発明はクローンヤギを作る方法に関する。本方法はヤギの再構築胚（例えばそのゲノムがヤギ体細胞に由来する再構築胚）を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントのヤギに移植し、さらにその再構築胚をヤギに発生させてヤギを作ることを含む。
【０１９５】
好ましい実施形態において、ヤギは、胚、胎仔または出生後（例えば成体）である。
【０１９６】
好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態において、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【０１９７】
好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０１９８】
好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上皮細胞のようなヤギの体細胞；遺伝子組換えヤギ体細胞：に由来し、ヤギ体細胞のゲノムは、その体細胞のゲノムに導入された導入遺伝子配列または核酸を包含する。
【０１９９】
好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤギ（第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【０２００】
好ましい実施形態において、ヤギは雄のヤギである。他の好ましい実施形態において、ヤギは雌のヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０２０１】
好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のような組換えタンパク質）のような産物をヤギから回収し；例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質）のような産物をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【０２０２】
別の態様において、本発明はトランスジェニックヤギを作る方法に関する。本方法はヤギの再構築胚（例えばそのゲノムが遺伝子組換えヤギ体細胞に由来する再構築胚）を２から８細胞期になるまで培養し続けて、２から８細胞期の胚をレシピエントのヤギに移植し、さらにその再構築胚をヤギに発生させてトランスジェニックヤギを作ることを含む。
【０２０３】
好ましい実施形態において、ヤギは、胚、胎仔または出生後（例えば成体）である。
【０２０４】
好ましい実施形態において、ヤギが再構築胚から発生する。別の実施形態において、ヤギは再構築胚から発生したヤギの子孫である。
【０２０５】
好ましい実施形態において、胚が胚形成の２から８、２から６、２から４細胞期になるまで再構築胚を培養し続ける。
【０２０６】
好ましい実施形態において、再構築胚のゲノムは：例えば線維芽細胞または上皮細胞のような体細胞に由来する。
【０２０７】
好ましい実施形態において、本発明は、再構築胚から発生したヤギを第二のヤギ（第二のヤギは再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫であり；あるいは第二のヤギは第一のヤギの遺伝子物質を供給したのと同じ動物、同じ遺伝子型の動物、または同じ細胞株に由来する遺伝子物質から形成された再構築胚から発生しまたは再構築胚から発生したヤギの子孫である）と交配させることをさらに含む。好ましい実施形態では、再構築胚から発生した第一のトランスジェニックヤギを第一のトランスジェニックヤギとは異なる導入遺伝子を有する再構築胚から発生した第二のトランスジェニックヤギと交配させて差し支えない。
【０２０８】
好ましい実施形態において、ヤギは雄のヤギである。他の好ましい実施形態において、ヤギは雌のヤギである。乳分泌するように雌ヤギを誘導し、さらにその雌ヤギから乳を得ることができる。
【０２０９】
好ましい実施形態において、例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質のような組換えタンパク質）のような産物をヤギから回収し；例えばタンパク質（例えばヒトタンパク質）のような産物をヤギの乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収できる。
【０２１０】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞は導入遺伝子配列を包含する。導入遺伝子配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０２１１】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。導入遺伝子は、トランスジェニック動物における発現が望まれる任意のタンパク質、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れをコードしても差し支えない。
【０２１２】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列はヒトタンパク質をコードする。
【０２１３】
好ましい実施形態において、導入遺伝子配列は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０２１４】
好ましい実施形態において、遺伝子組換え体細胞のゲノム中に核酸が導入されていて差し支えない。核酸配列は：例えばヒト導入遺伝子のような異種導入遺伝子；ノックアウト、ノックインまたは哺乳動物の遺伝子の発現を破壊させる他の事象；例えばヒトタンパク質のようなタンパク質をコードする配列；異種プロモーター；例えばヤギのまたは異種のプロモーターのようなプロモーターの制御下にある異種配列：のいずれであっても差し支えない。導入遺伝子配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような任意の関心産物をコードしていて差し支えない。
【０２１５】
好ましい実施形態において、核酸は、ホルモン、免疫グロブリン、血清タンパク質、および酵素の何れかをコードする。核酸は、例えば、α-１プロテイナーゼ阻害剤、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、可溶性ＣＤ４、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長因子、アンチトロンビンIII、インシュリン、プロラクチン、およびα-抗トリプシンの何れかをコードする。
【０２１６】
好ましい実施形態において、核酸配列はヒトタンパク質をコードする。
【０２１７】
好ましい実施形態において、核酸配列は、プロモーター（例えばヤギのまたは異種のプロモーター）の制御下にある。プロモーターは組織特異的プロモーターであって差し支えない。組織特異的プロモーターは：乳特異的プロモーター；血液特異的プロモーター；筋肉特異的プロモーター；神経特異的プロモーター；皮膚特異的プロモーター；毛特異的プロモーター；および尿特異的プロモーター：のいずれであっても差し支えない。乳特異的プロモーターは：カゼインプロモーター；β-ラクトグロブリンプロモーター；乳漿酸タンパクプロモーター；およびラクトアルブミンプロモーター：のいずれかであって差し支えない。
【０２１８】
別の態様において、本発明はキットに関する。キットは、２から８細胞期にある再構築胚を含む。好ましい実施形態において、キットは、例えば胚、胎仔または出生後の哺乳動物のような哺乳動物を作るための使用説明書をさらに含む。
【０２１９】
別の態様において、本発明は、例えばこの中に記載の方法によって得られた例えば８細胞期より後の胚または胎仔のような後期の胚を含むキットに関する。
【０２２０】
この中で用いられている「機能的除核」の用語は、例えば卵母細胞のような細胞の内因性ゲノムを機能できなくする（例えば複製および／またはＤＮＡ合成できなくする）工程を称する。そのような卵母細胞をこの中で「機能的除核卵母細胞」と称する。
【０２２１】
タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの用語は、この中で互換的に用いられている。
【０２２２】
この中で用いられている「導入遺伝子配列」の用語は、技術によって細胞に導入された核酸配列（例えば１つ以上のヒトタンパク質をコードする）を称する。また、導入遺伝子配列は、この中で導入遺伝子としても称されているが、その細胞から全部または一部が発生する動物のゲノムの一部となる。本発明の実施形態において、導入遺伝子配列は染色体ゲノム中に一体化されている。導入遺伝子配列がゲノム中に一体化されている場合、単にその挿入の効果によって、結果としてその配列が挿入されているゲノムの核酸配列に変化をもたらす。導入遺伝子配列は、部分的にまたは完全に、種が異なっていて差し支えなく、すなわち、導入遺伝子配列またはその一部は、それが導入される細胞と異なる種に由来していて差し支えない。導入遺伝子配列が、それが導入される細胞の内因性遺伝子と同種（配列の意味においてまたは種が同じであるという意味において）である場合、好ましくは、導入遺伝子配列は１つ以上の以下の特徴を有する：それが挿入される細胞ゲノムの配列を変化させるように（例えば内因性遺伝子の位置と異なる位置に挿入され、またはその挿入が結果として内因性遺伝子の配列に変化をもたらすように）、細胞ゲノム中への挿入用に設計され、または細胞ゲノム中に挿入され；例えば導入遺伝子配列の異常発現(misexpression)をもたらす変異のような変異を含み；その挿入の効果として、それが挿入されている遺伝子の異常発現をもたらすことができ、例えば、その挿入が結果として、それが挿入されている遺伝子のノックアウトをもたらす。導入遺伝子配列は、1つ以上の転写調節配列、および例えばイントロンのような、選択された核酸の所望のレベルまたはパターンの発現のために必要でありかつその選択された核酸に作動可能に連結された任意の他の核酸配列を含む。導入遺伝子配列は、エンハンサー配列および／または分泌を可能とする配列を含んでいて差し支えない。
【０２２３】
「再構築胚」、「再構成胚」「核移植単位」および「核移植胚」の用語はこの中で互換的に用いられている。
【０２２４】
この中で用いられている「正常のヤギ」の用語は、再構築胚から発生したものでないヤギを称する。
【０２２５】
「自然に派生した卵母細胞」は、例えばin vivoのような自然条件下で培養することによって、選択された細胞期（例えば中期IIまたはより好ましくは終期）に達することができる卵母細胞を称する。
【０２２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の説明および請求項から明らかであろう。
【０２２７】
発明の詳細な説明
体細胞ゲノムの供給源
体細胞
体細胞は、この中に記載の方法において、再構築胚を作るためのゲノムを供給し得る。この中で用いられている「体細胞」の用語は、分化細胞を称する。その細胞は、体細胞または体細胞系統に関連する細胞であって差し支えない。あるいは、この中に記載の任意の方法および動物は、再構築胚を作るためのゲノムを供給する目的で、生殖細胞のもとである二倍体幹細胞を利用して差し支えない。
【０２２８】
体細胞は、動物または培養細胞に由来して差し支えない。体細胞を動物から得た場合は、その動物は、任意の発生期（例えば胚、胎仔または成体）であって差し支えない。胚性細胞が好ましい。胚性細胞は、胚性幹細胞ならびに体細胞系統に関連する胚性細胞であって差し支えない。そのような細胞は、胚の内胚葉、中胚葉または外胚葉から得られる。好ましくは、胚性細胞は体細胞系統に関連する。体細胞系統に関連する胚性細胞は、胚形成の１０日目以降に単離された細胞を称する。しかしながら、胚形成の１０日目より前に細胞を得ても差し支えない。染色体ゲノムの供給源として細胞株を用いる場合、一次細胞が好ましい。この中で用いられている「一次細胞株」の用語は、一次細胞株ならびに一次派生細胞株を含む。
【０２２９】
適切な体細胞として、線維芽細胞（例えば胚性一次線維芽細胞）、筋肉細胞（例えばミオサイト）、卵丘細胞、神経細胞および乳腺細胞が挙げられる。他の適切な細胞として、肝細胞および膵臓ランゲルハンス島が挙げられる。好ましくは、体細胞は、例えば胚形成の１０日目以降に単離された胚性体細胞である。例えばクローン哺乳動物を作るために、体細胞のゲノムは天然のゲノムであって差し支えなく、あるいは、例えばトランスジェニッククローン哺乳動物を作るために、ゲノムは導入遺伝子配列を含むように遺伝子操作されていて差し支えない。
【０２３０】
例えば機械的（例えば切断、細断）または酵素的手段（例えばトリプシン処理）によって組織を分離して細胞懸濁液を得て、さらにコンフルエントな単層になるまでその細胞を培養することによって、体細胞を得ることができる。その後、低温保存のために体細胞を回収および調製し、あるいはストック培養として体細胞を維持して差し支えない。ヤギ体細胞（例えば線維芽細胞）の単離についてこの中に記載する。
【０２３１】
体細胞は休止体細胞であっても非休止体細胞であっても差し支えない。この中に記載の「非休止」は、細胞が細胞***周期にあることを称する。細胞***周期は４つの異なる期G₁、Ｓ、G₂およびＭを有する。臨界点と呼ばれる細胞周期における最初の事象はG₁期の間に生じる。この中で用いられている「臨界点」は、細胞周期を細胞が進むことを確実にする前の細胞周期の初期のG₁期を称する。例えば、細胞がG₁期に入った後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１時間まで、細胞は臨界点前であると考えられる。細胞が次の細胞周期に入るか否かの決定が臨界点でなされる。細胞が臨界点を過ぎると、細胞はG₁期の残り（すなわちＤＮＡ合成期前）を通過する。S期はＤＮＡ合成期であり、その後ＤＮＡ合成と***の間の期であるG₂期が続く。***はＭ期の間に生じる。臨界点で細胞が次の細胞周期に入らない場合は、細胞は休止期になる。さらに、細胞は細胞周期から出て休止期になる。「休止」細胞は、G₀期の細胞としても称され、細胞周期の４つの期の何れにも属さない細胞を称する。好ましくは、体細胞はG₀期にあり、または細胞***周期のG₁期にある。
【０２３２】
細胞周期の特定の期（例えばG₀またはG₁期）にあるドナー体細胞は、卵母細胞と体細胞ゲノムとの同調を可能とする。G₀またはG₁期にある体細胞の核の導入による（例えば、同時の活性化および融合による）中期IIにある卵母細胞の再構築は、受精の間に生じる事象を模倣し得る。別の例示として、例えば同時の活性化および融合によって、臨界点前のG₁期にある体細胞のゲノムと融合させた終期IIにある卵母細胞は、卵母細胞とドナーの核との間の細胞周期の同調をもたらす。
【０２３３】
細胞が細胞周期のどの期にあるかを決定する方法は公知である。例えば、以下の実施例において記載のように、細胞周期の異なる期における種々のマーカーが存在する。そのようなマーカーとして、G₁期のためにシクリンＤ1、2、3および増殖細胞核抗原(ＰＣＮＡ)、ならびにＤＮＡ合成活性を検出するためのＢｒＤｕが挙げられる。さらには、低血清培地(serum-deprived medium)中で細胞を培養することによって、G₀期に入るように細胞を誘導できる。あるいは、血清活性化によって、G₀期にある細胞を細胞周期（すなわちG₁期）に入るように誘導できる。
【０２３４】
例えば胚、胎仔または成体の哺乳動物から、あるいは例えば同調培養系のような培養系から、ドナー細胞を得ることができる。例えば、細胞***周期の特定の期にある少なくとも過半数の（例えば５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上）ドナー細胞を含む培養系からドナー細胞を選択して差し支えない。
【０２３５】
遺伝子組換え体細胞の供給源：
トランスジェニック哺乳動物
本発明において体細胞の供給源として用い得るヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作る方法は当業界で公知である。そのような方法は、哺乳動物の生殖細胞系にＤＮＡ構成物を導入してトランスジェニック動物を作ることを含む。例えば、標準的なトランスジェニック技術によって、ＤＮＡ構成物の1以上のコピーを哺乳動物の胚のゲノムに組み込んで差し支えない。
【０２３６】
ヤギは遺伝子組換え体細胞の好ましい供給源であるが、他のヒト以外の哺乳動物を用いても差し支えない。好ましいヒト以外の哺乳動物は、例えばウシ、ヒツジ、ラクダまたはヤギのような反芻動物である。例えば、アルプス、ザーネンおよびトゥゲンブルグ(Toggenburg)系統のヤギのようなスイス起源のヤギがこの中で記載の方法において有用である。好ましいヒト以外の動物の別の例示として、雄ウシ、ウマ、ラマおよびブタが挙げられる。遺伝子組換え細胞の供給源として用いられる哺乳動物は、本発明の方法（例えば、ヤギゲノムをヤギの機能的除核卵母細胞に導入するような）によって得られるべきトランスジェニック哺乳動物に依存するであろう。
【０２３７】
好ましくは、本発明において用いられる体細胞は、トランスジェニックヤギから得られる。トランスジェニックヤギを作る方法は当業界で公知である。例えば、マイクロインジェクションによってヤギの生殖細胞に導入遺伝子を導入して差し支えない（例えば、参照によってこの中に組み込まれるEbert et al. (1994) Bio/Technology 12: 699を参照）。
【０２３８】
導入遺伝子をヒト以外の動物の生殖細胞に導入することによって、遺伝子組換え体細胞の供給源として用い得る他のヒト以外のトランスジェニック動物を作って差し支えない。導入遺伝子を導入するために、種々の発生期にある標的の胚細胞を用いて差し支えない。標的の胚細胞の発生期に依存して異なる方法を用いる。本発明を実施するために用いられる任意の動物の特定の系統は、全身的な健康状態が良いこと、胚の収率が良いこと、胚における前核の視認性が良いこと、および生殖適応性がよいことに基づいて選択される。さらには、ハプロタイプが重要な因子である。
【０２３９】
核酸導入された細胞株
例えばあるタンパク質をコードする核酸のような関心のある核酸が導入された細胞株から、本発明において用いるための遺伝子組換え体細胞を得て差し支えない。
【０２４０】
従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって細胞に核酸構成物を導入して差し支えない、この中で用いられている「トランスフェクション」および「形質転換」の用語は、宿主細胞に導入遺伝子配列を導入するための種々の技術を含み、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーション等が挙げられる。さらには、以下に記載のように、例えばウィルスベクターのような生物ベクターを用いて差し支えない。宿主を形質転換しまたはトランスフェクションするための適切な方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、および他の適切な実験マニュアルに記載されている。
【０２４１】
２つの有用な方法は、エレクトロポレーションとリポフェクションである。各方法の簡単な例示を以下に記載する。
【０２４２】
以下のプロトコルを用いて、エレクトロポレーションによってドナー体細胞株に、ＤＮＡ構成物を安定に導入することができる：例えば線維芽細胞（例えば胚性線維芽細胞）のような体細胞を約4x10⁶細胞／mlの濃度でＰＢＳ中に再懸濁液させる；線状ＤＮＡ(５０μg)を細胞懸濁液(０．５ml)に添加し、その懸濁液を０．４cmの電極間隙キュベット(Biorad)に設置する；Biorad Gene Pulserエレクトロポレーター(２５mA、１０００マイクロファラッドおよび無限抵抗で３３０ボルトパルス)を用いてエレクトロポレーションを実施する；選択のためにＤＮＡ構成物がネオマイシン耐性遺伝子を包含する場合は、３５０μg／mlのＧ４１８(GibcoBRL)と共に１５日間インキュベートした後、ネオマイシン耐性クローンを選択する。
【０２４３】
以下のようなプロトコルを用いて、リポフェクションによってドナー体細胞にＤＮＡ構成物を安定に導入することができる：約2ｘ10⁵の細胞を3.5シミアメーター(cmiameter)に設置し、さらにLipfectAMINE^TM(GibcoBRL)を用いて線状ＤＮＡ(2μg)をトランスフェクションする；トランスフェクションの４８時間後、細胞を1：1000および1：5000に希釈し、選択のためにＤＮＡ構成物がネオマイシン耐性遺伝子を包含する場合は、Ｇ４１８を最終濃度０．３５mg/mlとなるように添加する；ネオマイシン耐性クローンを単離し、さらに低温保存ならびに核移植のために増殖させる。
【０２４４】
タンパク質の組織特異的発現
例えば異種タンパク質のようなタンパク質をトランスジェニック哺乳動物の特定組織または体液（例えば乳）中に発現させることが望ましい場合が多い。異種タンパク質が発現されている組織または体液からそれらタンパク質を回収することができる。例えば、乳中に異種タンパク質を発現させるのが望ましい場合が多い。乳特異的プロモーターの制御下において、異種タンパク質を産生させる方法が以下に記載されている。さらには、他の組織特異的プロモーターならびに他の制御要素（例えばシグナル配列および非分泌タンパク質の分泌を高める配列）を以下に記載する。
【０２４５】
乳特異的プロモーター
有用な転写プロモーターは、好ましくは哺乳類の上皮細胞において活性化されるプロモーターであり、カゼイン、βラクトグロブリン(Clark et al., (1989) Bio/Technology 7: 487-492)、乳漿酸タンパク質(Gordonet al. (1987) Bio/Technology 5: 1183-1187)およびラクトアルブミン(Soulier et al., (1992) FEBS Letts. 297: 13) のような乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するようなプロモーターが挙げられる。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類のα、β、γまたはκカゼイン遺伝子に由来していて差し支えなく；好ましいプロモーターはヤギβカゼイン遺伝子に由来する(DiTullio, (1992) Bio/Technology 10: 74-77)。乳特異的タンパク質プロモーターまたは乳腺組織において特異的に活性化されるプロモーターは、ｃＤＮＡに由来していてもまたはゲノム配列に由来していても差し支えない。好ましくは、ゲノムに由来する。
【０２４６】
1つ以上、およびしばしばいくつかの生物における上に挙げた乳腺特異的遺伝子のＤＮＡ配列情報を利用できる。例えば、Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981)(ラットα-ラクトアルブミン)；Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984)（ラットWAP）；Junes et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985)（ラットβ-カゼイン）；Yu-Lee ＆ Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983)（ラットγ-カゼイン）；Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987)（ヒトα-ラクトアルブミン）；Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984)（ウシαs1およびκカゼインｃＤＮＡ）；Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988)（ウシβカゼイン）；Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988)（ウシκカゼイン）；Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977)（ウシαS2カゼイン）；Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989)（ウシβラクトグロブリン）；Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987)（ウシαラクトアルブミン）を参照。種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能がMercier ＆ Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993)（全ての目的のために参照によってその全てが組み込まれる）。追加のフランキング配列が異種タンパク質の発現を最適化するのに有用である場合、既存の配列をプローブとして用いて、そのような配列をクローン化することができる。プローブとして公知の同起源のヌクレオチド配列または同起源のタンパク質に対する抗体を用いてそのような生物からのライブラリーをスクリーニングすることによって、異なる生物由来の乳腺特異的制御配列を得ることができる。
【０２４７】
シグナル配列
有用なシグナル配列は乳特異的シグナル配列、あるいは真核生物または原核生物のタンパク質の分泌をもたらすような他のシグナル配列である。好ましくは、シグナル配列は、乳特異的シグナル配列から選択され、すなわち、乳中に分泌される産物をコードする遺伝子に由来する。最も好ましくは、乳特異的シグナル配列はそのＤＮＡ構成物において用いられている乳特異的プロモーター（以下に記載されている）に関連する。シグナル配列のサイズは重要でない。要求されることは、その配列が、例えば乳腺組織に所望の組換えタンパク質の分泌をもたらすのに充分なサイズであることでのみである。例えば、例えばα、β、γまたはκカゼインのようなカゼイン、βラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質およびラクトアルブミンをコードする遺伝子からのシグナル配列を用いて差し支えない。好ましいシグナル配列は、ヤギのβ―カゼインシグナル配列である。
【０２４８】
例えば腎細胞、膵細胞または肝細胞によって分泌されるタンパク質のような他の分泌タンパク質からのシグナル配列を用いても差し支えない。好ましくは、シグナル配列は、例えば尿または血液中にタンパク質の分泌をもたらす。
【０２４９】
分泌タンパク質のアミノ末端領域
非分泌タンパク質が分泌されるようなやり方で（例えば、分泌されるべきタンパク質中に、通常分泌されるタンパク質のコード配列の全てまたは一部を挿入することによって）、非分泌タンパク質を改変させて差し支えない。好ましくは、通常分泌されるタンパク質の全配列がそのタンパク質の配列中に含まれるのではなく、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端のタンパク質の分泌をもたらすのに充分な部分のみが含まれる。例えば、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端部分に、通常分泌されないタンパク質を融合させる（通常そのアミノ末端において）。
【０２５０】
１つの態様において、通常分泌されるタンパク質は、通常乳中に分泌されるタンパク質である。そのようなタンパク質として、乳腺上皮細胞によって分泌されるタンパク質、カゼイン、ラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質、およびラクトアルブミンのような乳タンパク質が挙げられる。カゼインタンパク質は、任意の哺乳類のα、β、γまたはκカゼイン遺伝子を含む。好ましいタンパク質は例えばヤギβカゼインのようなβカゼインである。分泌タンパク質をコードする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノム配列の何れに由来しても差し支えない。好ましくは、その配列はゲノムに由来し、1つ以上のイントロンを包含する。
【０２５１】
他の組織特異的プロモーター
特定組織における発現をもたらす他の組織特異的プロモーターを用いても差し支えない。組織特異的プロモーターは、他の組織におけるよりも特定組織においてより強く発現されるプロモーターである。組織特異的プロモーターは実質的に特定組織においてのみ発現されることが多い。
【０２５２】
用い得る組織特異的プロモーターとして：神経特異的プロモーター（例えばネスティン、Wnt-1、Pax-1、Engrailed-1、Engrailed-2、Sonic hedgehog）；肝特異的プロモーター（例えばアルブミン、α-1抗トリプシン）；筋肉特異的プロモーター（例えばミオゲニン、アクチン、MyoD、ミオシン）；卵母細胞特異的プロモーター（例えばZP1、ZP2、ZP3）；精巣特異的プロモーター（例えばプロタミン、ファーチリン、対合複合体タンパク質-1）血液特異的プロモーター（例えばグロブリン、GATA-1、ポルホビリノゲンデアミナーゼ）；肺特異的プロモーター（例えば界面活性剤プロテインC）；皮膚または毛特異的プロモーター（例えばケラチン、エラスチン）；内皮特異的プロモーター（例えばTie-1、Tie-2）；および骨特異的プロモーター（例えばBMP）が挙げられる。
【０２５３】
さらには、いくつかの組織における発現のために一般的プロモーターを用いても差し支えない。一般的プロモーターとして、β-アクチン、ROSA-21、PGK、FOS、c-myc、Jun-A、およびJun-Bが挙げられる。
【０２５４】
ＤＮＡ構成物
例えば乳腺上皮細胞のような特定組織のためのプロモーター（例えばカゼインプロモーター、例えばヤギβカゼインプロモーター）、乳特異的シグナル配列（例えばカゼインシグナル配列、例えばβカゼインシグナル配列）、および異種タンパク質をコードするＤＮＡを包含する構成物として、異種タンパク質をコードするカセットを組み立てることができる。
【０２５５】
また、その構成物は非分泌タンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流にある３’非翻訳領域を含んでいて差し支えない。そのような領域は、発現系のRNA転写を安定化させ、従ってその発現系からの所望のタンパク質の収率を高める。本発明で用いるための構成物において有用な３’非翻訳領域はポリＡシグナルをもたらす配列である。そのような配列は、例えばSV40スモールｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域または当業界で周知の他の非翻訳領域に由来していて差し支えない。１つの態様において、３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質に由来する。３’非翻訳領域の長さは重要ではないが、そのポリＡ転写の安定化効果は発現配列のRNAを安定化させるのに重要であろう。
【０２５６】
必要に応じて、構成物は、プロモーターとシグナル配列をコードするＤＮＡ配列との間に５’非翻訳領域を包含する。そのような非翻訳領域は、プロモーターと同じ制御領域に由来して差し支えなく、あるいは例えば他の合成の、半合成のまたは天然の供給源に由来する等、異なる遺伝子に由来していて差し支えない。この場合も、その特定の長さは重要でないが、それら非翻訳領域は発現のレベルを改善するのに重要であろう。
【０２５７】
また、構成物は、好ましくは乳腺上皮細胞において発現される遺伝子のＮ末端コード領域の約１０％、２０％、３０％またはそれ以上を包含する。例えば、Ｎ末端コード領域は、用いられるプロモーターに対応させることができ、例えばヤギβカゼインＮ末端コード領域である。
【０２５８】
当業界で公知の方法を用いて構成物を調製できる。大きなプラスミドの一部として構成物を調製できる。そのような調製物は、効率的な方法で正確な構成物のクローニングおよび選択を可能とする。所望の哺乳動物に組み込むために残りのプラスミド配列から容易に単離できるように、プラスミド上の都合のよい制限酵素部位の間に構成物を位置させて差し支えない。
【０２５９】
異種タンパク質
異種タンパク質をコードする導入遺伝子配列をヒト以外の哺乳動物の生殖細胞に導入し、あるいは細胞株にトランスフェクションして、上記のような遺伝子組換え体細胞の供給源を提供することができる。
【０２６０】
タンパク質は、複合または多重結合タンパク質（例えば、ホモ-またはヘテロ-多重結合体、例えばホモ-またはヘテロ-多重結合体として自然に生じたタンパク質、例えばホモ-またはヘテロ-ニ量体、三量体または四量体）であって差し支えない。タンパク質は、例えばＮ末端、Ｃ末端または内部断片の切断等の除去によって処理されたタンパク質であって差し支えない。複合タンパク質でも活性形態で発現され得る。例えばヤギのような哺乳動物のゲノムに導入され得る配列によってコードされるタンパク質として、糖タンパク質、神経ペプチド、イムノグロブリン、酵素、ペプチドおよびホルモンが挙げられる。タンパク質は、天然のタンパク質であっても組換えタンパク質（例えば断片、例えばイムノグロブリン融合タンパク質のような融合タンパク質、または変異体）であっても差し支えない。タンパク質はヒトに由来していてもヒト以外に由来していても差し支えない。異種タンパク質は、限定はされないが、以下のような可能性のある治療薬または診断薬であって差し支えない：α-１プロテイナーゼ阻害剤、α-1抗トリプシン、アルカリホスファターゼ、アンギオジェニン、アンチトロンビンIII、任意の血液凝固因子（VIII因子、IX因子およびX因子等）、キチナーゼ、エリスロポイエチン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブロゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長因子、ヒト血清アルブミン、イムノグロブリン、インスリン、ミエリン塩基性タンパク質、プロインスリン、プロラクチン、可溶性ＣＤ４またはその成分又は複合体、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、あるいはそれらの変異体。
【０２６１】
イムノグロブリンは特に好ましい異種タンパク質である。イムノグロブリンの例示として、IgA、IgG、IgE、IgM、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、単鎖抗体および抗体-タンパク質融合体が挙げられる。
【０２６２】
1つ以上、およびしばしばいくつかの生物における上に挙げた異種タンパク質をコードする遺伝子のいくつかの配列情報を利用できる。例えば、Long et al. (1984) Biochem. 23(21): 4828-4837（α-1抗トリプシン）；Mitchell et al. (1986) Prot. Natl. Acad. Sci USA 83: 7182-7186（アルカリホスファターゼ）；Schneider et al. (1988) EMBO J. 7(13): 4151-4156（アンギオジェニン）；Bock et al. (1988) Biochem. 27(16): 6171-6178（アンチトロンビンIII）；Olds et al. (1991) Br. J. Haematol. 78(3): 408-413（アンチトロンビンIII）；Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(22): 7580-7584（エリスロポイエチン）；米国特許第5,614,184号（エリスロポイエチン）；Horowitz et al. (1989) Genomics 4(1): 87-96（グルコセレブロシダーゼ）；Kelly et al. (1992) Ann. Hum. Genet. 56(3): 255-265（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）；米国特許第5,707,828号（ヒト血清アルブミン）；米国特許第5,652,352号（ヒト血清アルブミン）；Lawn et al. (1981) Nucleic Acid Res. 9(22): 6103-6114（ヒト血清アルブミン）；Kamholz et al. (1986) Prot. Natl. Acad. Sci. USA 83(13): 4962-4966（ミエリン塩基性タンパク質）；Hiraoka et al. (1991) Mol. Cell Endocrinol. 75(1): 71-80（プロラクチン）；米国特許第5,571,896号（ラクトフェリン）；Pennica et al. (1983) Nature 301 (5897): 214-221（組織プラスミノーゲンアクチベーター）；Sarafanov et al. (1995) Mol. Biol. 29: 161-165を参照（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）。
【０２６３】
卵母細胞
本発明において用いるための卵母細胞として、減数細胞***の中期IIにある卵母細胞（例えば中期IIにおいて停止している卵母細胞）、および減数***の終期（例えば終期Iまたは終期II）にある卵母細胞が挙げられる。中期IIにある卵母細胞は１つの極体を有するが、一方終期にある卵母細胞は、第二極体の形成までの、第二極体の細胞膜の突出が存在することに基づいて同定される。さらには、生化学的および／または発生の特徴に基づいて、中期IIにある卵母細胞は、終期IIにある卵母細胞から区別され得る。例えば、中期IIの卵母細胞は停止状態にあるが、一方、終期の卵母細胞は活性化状態にある。好ましくは、卵母細胞はヤギ卵母細胞である。
【０２６４】
ヤギの生殖周期の種々の時期において卵母細胞を得ることができる。例えば、生殖周期の所定の時期に、卵母細胞の多くの割合（例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上）が終期にある。それら卵母細胞は自然に成熟した卵母細胞である。さらには、細胞周期の種々の期の卵母細胞を得て、さらに減数***の特定期に入るようにin vitroで誘導することができる。例えば、低血清培地中で培養した卵母細胞は、中期において停止するようになる。さらには、血清活性化によって、停止卵母細胞を終期に入るように誘導できる。従って、本発明で用いるために終期の卵母細胞を容易に得ることができる。
【０２６５】
再構築胚を形成するために用いる前に、in vitroで卵母細胞を成熟化させることができる。その工程は、通常、哺乳動物の卵母細胞（例えばヤギの卵母細胞）から得た未成熟卵母細胞を採取し、さらにその卵母細胞が所望の減数***期（例えば中期または終期）に達するまで、除核前に培地中において卵母細胞を成熟化させることを必要とする。さらには、再構築胚を形成するために、in vivoで成熟化させた卵母細胞を用いても差し支えない。
【０２６６】
過剰***の間に雌の哺乳動物から卵母細胞を採取する。簡単に説明すると、雌のドナーの卵管から卵母細胞をフラッシングすることによって卵母細胞（例えばヤギ卵母細胞）を外科的に回収することができる。ヤギにおいて過剰***を誘発する方法およびヤギ卵母細胞を採取する方法はこの中に記載されている。
【０２６７】
好ましくは、卵母細胞の減数***期（例えば中期IIまたは終期II）はドナー体細胞の細胞周期の期と互いに関連する。卵母細胞の***期とドナー体細胞の細胞周期の***期の間の相関は、この中で「同調」と称されている。G₀またはG₁期にある体細胞の核の導入による（例えば、同時の活性化および融合による）中期IIの卵母細胞の再構築は、受精の間に生じる事象を模倣する。別の例示として、同時の活性化および融合によって臨界点前のG₁期にある体細胞のゲノムと融合させた終期の卵母細胞は、卵母細胞とドナー核との間の同調をもたらす。
【０２６８】
機能的除核
卵母細胞の内因性ゲノムが機能（例えば複製またはＤＮＡ合成）できなくなるように、例えばヤギ卵母細胞のようなドナー卵母細胞を機能的に除核する。卵母細胞を機能的に除核する方法として：例えば卵母細胞が核ゲノムを欠くように、卵母細胞からゲノムを除去する（すなわち除核する）こと；例えば照射によって（例えばX線照射またはレーザー照射によって）、卵母細胞内のＤＮＡを不活性化すること；化学的に不活性化すること等が挙げられる。
【０２６９】
除核
卵母細胞のゲノムを機能できなくする１つの方法は、卵母細胞からゲノムを除去することである（すなわち除核）。卵母細胞から核物質を除去するために、マイクロピペットまたは針を透明帯に挿入して差し支えない。例えば、第一極体およびその極体の周りの隣接細胞質（例えば、細胞質の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％であり、おそらく中期プレートを包含する）を吸引することによって、マイクロピペットを用いて１つの極体を有する中期IIの卵母細胞を除核することができる。マイクロピペットまたは針を用いて第二極体および周りの細胞質（例えば細胞質の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％）を除去することによって、２つの極体を有する終期の卵母細胞を除核することができる。特に、第二極体からの細胞膜に突出が存在する時期から第二極体の形成までの任意の時点で、終期の卵母細胞を除核することができる。従って、この中で用いられるように、第二極体を放出するまでの、細胞膜における突出と通常それに隣接する紡錐体とを共に示す卵母細胞は終期の卵母細胞と考えられる。あるいは、突出の証拠無しに明白なおよび区別可能な１つの極体を有する卵母細胞は中期の卵母細胞と考えられる。卵母細胞（例えばヤギ卵母細胞）の除核の方法は、実施例にさらに詳細に記載されている。
【０２７０】
照射
照射を用いて卵母細胞の内因性ＤＮＡを不活性化することによって卵母細胞を機能的に除核することができる。照射を用いる方法は当業界で公知であり、例えばBradshaw et al. (1995) Molecul. Reprod. Dev. 41: 503-512（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）に記載されている。
【０２７１】
化学的不活性化
卵母細胞の内因性ＤＮＡを化学的に不活性化することによって卵母細胞を機能的に除核することができる。化学的にＤＮＡを不活性化する方法は当業界で公知である。例えば、Fulkaj and Moore (1993) Molecul. Reprod. Dev. 34: 427-430（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）に記載のようなエトプソイド-シクロヘキシミド法を用いて化学的不活性化を実施できる。
【０２７２】
機能的染色体ゲノムの卵母細胞への導入
この中に記載の方法は、機能的染色体ゲノムを卵母細胞（例えば除核細胞のような機能的除核卵母細胞）に導入して再構築胚を形成することを含む。機能的染色体ゲノムは、再構築胚から生じるクローンまたはトランスジェニック動物の発生を導く。実質的に無傷の染色体ゲノムの卵母細胞への移植をもたらす方法を用いることができる。例示として、機能的染色体ゲノムを包含する細胞を卵母細胞と融合させる方法、および核注入、すなわち卵母細胞に核を直接移植する方法が挙げられる。
【０２７３】
融合
例えば電気融合、ウィルス融合、生化学試薬融合（例えばHAタンパク質）、または化学融合（例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはエタノール）によって、体細胞と卵母細胞との融合を実施できる。
【０２７４】
体細胞と卵母細胞との融合および活性化を同時に実施して差し支えない。例えば、卵母細胞の透明帯内に体細胞の核を挿入して差し支えない。例えば電界を与えることによって、その核を卵母細胞と融合させる工程を同時に実施して差し支えない。体細胞と卵母細胞の同時の融合および活性化はこの中に記載されている。
【０２７５】
再構築胚の活性化
活性化とは、例えば複製およびＤＮＡ合成のような胚の発生の開始を称する。例えば電気ショック（例えば電気融合において）、イオノフォアの使用、エタノール活性化によって活性化を誘導することができ、あるいは、自然に活性化されている期の間に卵母細胞（例えば終期の卵母細胞）を得て差し支えない。
【０２７６】
電気融合
電気ショック（すなわち電気融合）を用いて再構築胚を活性化させることができる。電気融合の使用は、体細胞と卵母細胞の融合および同時に成されるべき活性化を可能とする。
【０２７７】
電気融合を実施するためのBTX200 Embryomanipulation Systemのようなチャンバーは、例えばBTX San Diegoから市販されている。体細胞（例えばヤギ体細胞）と卵母細胞（例えば除核ヤギ卵母細胞のような除核卵母細胞）とを融合させるために電気融合を実施する方法はこの中に記載されている。
【０２７８】
イオノフォア
さらには、イオノフォア活性化によって再構築胚を活性化させることができる。例えばカルシウムイオノフォアのようなイオノフォアを用いて、再構築胚の膜を越えてカルシウム濃度を変化させる。細胞内のフリーカルシウムの濃度が上昇すると、細胞内タンパク質のリン酸化が減少して卵母細胞が活性化される。そのような活性化方法は例えば米国特許第5,496,720号（参照によってその内容がこの中に組み込まれる）に記載されている。
【０２７９】
エタノール活性化
Presicce and Yang(1994) Mol. Reprod. Dev. 37: 61-68およびBordignon and Smith (1998) Mol. Reprod Dev. 49: 29-36(参照によってこの中に組み込まれる)に記載のエタノール活性化処理に基づいて、除核前に、エタノールで卵母細胞（例えば中期IIの卵母細胞）を活性化させることができる。
【０２８０】
終期の卵母細胞
終期の卵母細胞は、通常、すでに活性化されている。従って、それら細胞は受精を妨げ胚の発生を可能とするカルシウム濃度の低下を自然に示すことが多い。
【０２８１】
再構築胚の移植
本発明の再構築胚をレシピエントの雌に移植して、例えばクローンまたはトランスジェニックヤギのようなクローンまたはトランスジェニック哺乳動物に発生させることができる。例えば、以下の実施例に記載のように、線毛を介して、各レシピエントの雌の卵管に再構築胚を移植することができる。さらには、レシピエント哺乳動物に胚を移植する方法は当業界で公知であり、かつ例えばEbert et al. (1994) Bio/Technology 12: 699に記載されている。
【０２８２】
胚盤胞期までの少なくとも最初の***（２細胞期）まで再構築胚を培養し続けて差し支えなく、好ましくは２細胞または４細胞期の胚を移植する。胚発生のための種々の培地が当業界で公知である。例えば、本発明によって提供されるべき哺乳動物のタイプに由来する卵管上皮細胞の単層と共に、再構築胚を共存培養して差し支えない。ヤギ卵管上皮細胞(ＧＯＥＣ)を得る方法、およびその細胞を共存培養する方法は以下の実施例に記載されている。
【０２８３】
乳からのタンパク質の精製
比較的高濃度で、かつ大容量で、乳中にトランスジェニックタンパク質を産生させることができ、再生され得る資源から容易に採取される正常に加工されたペプチドの連続的かつ高レベルの産出をもたらす。乳からタンパク質を単離するためのいくつかの異なる方法が当業界で公知である。
【０２８４】
乳タンパク質は、通常、工程の組合せによって単離される。例えばスキミング、遠心、沈殿(H.E.Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982)、酸沈殿（米国特許第4,644,056号）、またはレニンまたはキモトリプシンを用いた酵素的凝集(Swaisgood, idid)によって、まず脂肪を除去するために生乳を分画する。次に、主な乳タンパク質を透明な溶液または大量の沈殿物に分画し、沈殿物から関心の特定タンパク質を容易に精製できる。
【０２８５】
フランス特許第2487642号は、膜限外濾過と排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせて、スキムミルクまたは乳漿から乳タンパク質を単離することについて記載している。乳漿はレンネット(rennet)または乳酸で凝集させてカゼインを除去することによって最初に得られる。米国特許第4,485,040号は、２つの連続した限外濾過工程によって、αラクトグロブリンを豊富に含む産物を乳漿から単離することについて記載している。米国特許第4,644,056号は、ｐＨ４．０−５．５での酸沈殿乳、および連続したクロスフロー濾過（最初は０．１−１．２５マイクロメーター孔径の膜によって産物プールを浄化し、さらに５−８０kdの分離限界を有する膜によって濃縮する）によって乳または初乳からイムノグロブリンを精製する方法を提供する。
【０２８６】
同様に、米国特許第4,897,465号は、ｐＨシフトを有する酸化金属膜(metallic oxide membrane)上での連続した限外濾過によって、血清、卵黄または乳漿からイムノグロブリンのようなタンパク質を濃縮することを教示する。タンパク質から大量の混在物を除去するためにまず選択されたタンパク質の等電点(ｐＩ)より低いｐＨで濾過を実施し、次に選択されたタンパク質のｐＩより高いｐＨで濾過を実施して、不純物を保持しかつ選択されたタンパク質を透過液中に通過させる。異なる濾過濃縮法が欧州特許第EP467 482 B1に教示されており、その中で、脱脂されたスキムミルクを乳タンパク質のｐＨをｐＩより低いｐＨ３−４まで下げて、カゼインおよび乳漿タンパク質の両方を可溶化させる。３連続の限外濾過またはダイアフィルトレーション(diafiltration)によってタンパク質を濃縮して、その９０％がタンパク質である１５-２０％の固形物を含む残物を形成する。あるいは、英国特許出願第2179947号は、限外濾過して試料を濃縮し、さらに適切な中性ｐＨにおける弱陽イオン交換クロマトグラフィーを行って乳漿からラクトフェリンを単離することについて開示している。純度測定については報告されていない。国際特許公開第WO95/22258号において、濃縮塩の添加によって乳を高いイオン強度に調整し、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーを実施して、乳からラクトフェリンのようなタンパク質を回収している。
【０２８７】
それら方法の全てにおいて、最初に、脂肪、脂質、および濾過膜またはクロマトグラフィー媒体を汚す他の特定の物質を除去するために乳またはその画分を処理する。その様にして作成した最初の画分は、カゼイン、乳漿、または全乳タンパク質（それから関心タンパク質が単離される）から成るであろう。
【０２８８】
国際特許公開第WO94/19935号は、アルギニン、イミダゾールまたはBis-Trisのような正電荷を持つ物質で全乳タンパク質の溶解性を安定化させることによって全乳から生物活性タンパク質を単離する方法について開示している。その処置によって浄化された溶液が形成され、その溶液から例えば膜を介した濾過によってタンパク質を単離でき、その処置がなければ沈殿タンパク質によって膜が詰まってしまうであろう。
【０２８９】
米国特許出願第08/648,235号は、タンジェンシャルフローフィルトレーション(tangential flow filtration)によって全乳または乳画分から、生物活性形態のペプチドのような可溶性乳成分を単離する方法について開示する。以前の単離方法と異なり、その方法は、脂肪およびカゼインミセルを除くために全乳を最初に分画する必要性が無く、従って工程を簡素化しかつ回収率および生物活性の損失を避けることができる。さらに混在物を除去しかつ例えばタンパク質のような関心産物を精製するために、追加の精製工程と組み合わせてその方法を用いても差し支えない。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されているが、それら実施例は本発明を何ら限定するものではない。本出願の全体において挙げられている全ての引例（文献引例、発行済み特許、公開特許出願、および継続中の特許出願を含む）の内容は、参照によって組み込まれる。
【０２９０】
実施例
以下の実施例において用いられるドナーおよびレシピエントは、以下の系統：アルプス、ザーネンおよびトゥゲンブルグ：（混合または単独）の乳ヤギであった。全てのヤギをマサチューセッツ、チャールトンのGenzyme Transgenics農場で飼育した。春および初夏（オフシーズン）に採取および移植を実施した。
【０２９１】
ヤギ体細胞の単離
核質ドナーとして用いられるヤギ胎仔性線維芽細胞は、トランスジェニック抗トロンビンIII(ＡＴIII)初代雄から新鮮に採取した***で、非トランスジェニック雌を人工受精させることによって作った６匹の３５-４０日の胎仔に由来した。ＡＴIII細胞株は、特徴付けがよく成されている遺伝子マーカーを体細胞株に提供し、さらに乳分泌する雌の乳中への複合グリコシル化タンパク質(ＡＴIII)の高レベル発現を可能とするため、ＡＴIII細胞株が選択された。***の４０日後、トランスジェニックＡＴIII雄の***に由来する３匹の胎仔を外科的に取り出し、平衡Ca²⁺/Mg²⁺リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に置いた。0.025％トリプシン／0.5mM ＥＤＴＡ中、３７℃で１０分間、胎仔組織を細かく切断しかつ消化することによって、細胞懸濁液を調製した。ヌクレオシド、0.１mM ２-メルカプトエタノール、２mM L-グルタミン、1％ペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10,000 I.U./ml)を補充した１０％胎仔牛血清(ＦＢＳ)含有平衡１９９^TM培地(Ｍ１９９)(Gibco) (胎仔性細胞培地)で細胞を洗浄し、さらに２５cm²フラスコ中で培養した。２４時間後、培養細胞に平衡胎仔性細胞培地を再供給した。４日目に、Ca²⁺/Mg²⁺を含まないＰＢＳで2回細胞の単層を洗浄し、続いて0.025％トリプシン／0.5mM ＥＤＴＡと共に３８℃で７分間インキュベートしてトリプシン処理することによって、一次胎仔性細胞のコンフルエントな単層を採取した。
【０２９２】
ＡＴIIIを発現する可能性のある細胞を低温保存用に調製し、またはストック培養として維持した。
【０２９３】
ドナー細胞株の性別判断および遺伝子型の特定
プロテイナーゼKでの消化、続いてイソプロパノールでの沈降（Laird et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4293に記載）によって、ＡＴIIIドナー核質用に胎仔頭組織からゲノムＤＮＡを単離し、さらにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒトアンチトロンビンIII（ＡＴIII）配列の存在ならびに性別判断について分析を行った。ＡＴIII配列は、ＡＴIIIトランスジェニック系統を作るのに用いられたＢＣ６構成物(ヤギβカゼイン−ヒトＡＴIII ｃＤＮＡ)(Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571に記載)の一部である。オリゴヌクレオチドＧＴＣ１１およびＧＴＣ１２を用いて３６７bp配列を増幅させることによって、ヒトＡＴIII配列を検出した（以下を参照）。性別決定のために、４４５bp(ｚｆＸ)/４４７bp(ｚｆＹ)ダブレットを生じさせるｚｆＸ/ｚｆＹプライマー対を用いた（以下を参照）。制限酵素SacI(New England Biolabs)を用いた消化によって、ｚｆＸバンドを２つの小さな断片（２７２および１７３bp）に切断した。切断されない４４７bpｚｆＹバンドの存在によって雄を同定した。
【０２９４】
ＰＣＲ反応のために、Taqポリメラーゼ(２．５ units)含有ＰＣＲバッファー(２０mM Tris、ｐＨ８．３、５０mM KCl、１．５mM MgCl₂、０．２５mM デオキシヌクレオチド３リン酸、および６００mMの各プライマー)(５０ml)でゲノムＤＮＡ(約２５０ng)を希釈し、以下の温度プログラムを用いて反応を進めた：

ヒトＡＴIII配列を検出するために以下のプライマーセットを用いた：
ＧＴＣ１１: CTCCATCAGTTGCTGGAGGGTGTCATTA（配列番号１）
ＧＴＣ１２: GAAGGTTTATCTTTTGTCCTTGCTGCTCA（配列番号２）
性別判断のために以下のプライマーを用いた：
ｚｆＸ: ATAATCACATGGAGAGCCACAAGC（配列番号３）
ｚｆＹ: GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAG（配列番号４）
２匹の胎仔は雄であることが同定され、２匹ともＡＴIII配列陰性であった。別の胎仔はメスであることが同定され、かつＡＴIII配列陽性であることが確かめられた。
【０２９５】
胚再構築のためのＡＴ III 発現ドナー細胞の調製
４０日目の胎仔に由来するトランスジェニックメス系統(CFF155-92-6)を上記のようにＰＣＲ分析によって同定し、さらに全ての核移植操作に用いた。トランスジェニック胎仔性線維芽細胞を胎仔性細胞培地と共に２５cm²フラスコ中において維持し、各継代の４日目に培地交換し、7日目にトリプシン処理して細胞を採取した。ストック培養を維持するために、各継代から別の２５cm²フラスコに細胞を移した。簡単に説明すると、胎仔性細胞培地を入れた４穴プレートに胎仔性細胞を蒔き、培養した(５％ＣＯ₂中、３９℃)。
【０２９６】
４８時間後、新鮮な０．５％ＦＢＳ含有胎仔性細胞培地で培地交換した。その後７日間、４８-７２時間ごとに新鮮な0.5％ＦＢＳ含有胎仔性細胞培地で培地交換した。最初に胎仔性細胞培地(０．５％ＦＢＳ)を添加した後７日目に、以前記載したようにトリプシン処理によって、核質ドナーとして用いられる体細胞を採取した。除核卵母細胞と融合させる１から３時間前に、2mM L-グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10,000 I.U.／ml)を補充した１０％ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中に細胞を再懸濁させた。
【０２９７】
細胞株の核型分析
細胞株における総染色体異常を特定するために、核型分析によってクローン細胞株をさらに評価した。デメコルシン(Demecolcine, Sigma)(０．０２μg/ml)と共に１２時間インキュベートすることによって、中期で停止するように細胞を誘導した。トリプシン処置後、得られたペレットを75mM KCl水溶液の低張液中に懸濁させ、３７℃で２０分間インキュベートした。予め洗浄した顕微鏡スライドに少量の細胞懸濁液をのせる前に、氷酢酸−メタノール(１：３)溶液の３回の交換ごとに５分間細胞を固定した。風乾後、ＰＢＳ中の３％ギムザ染色(Sigma)で、染色体調製物を１０分間染色した。油浸の下、1000ｘの倍率で各細胞株について、染色体の広がりを計測した。
【０２９８】
免疫組織学的分析
ビメンチン(Sigma)および汎サイトケラチン(pan-cytokeratin)(Sigma)に特異的な抗体を用いて、細胞株の形態を特徴付けしかつ確認した。７５％コンフルエントになるように滅菌ゼラチンコートカバースリップに細胞をのせ、さらに0.05％サポニン含有２％パラホルムアルデヒド中において1時間固定した。1次抗体を含むＰＢＳ中の0.5％ＰＶＰ(ＰＢＳ/ＰＶＰ)中において細胞を３７℃で２時間インキュベートし、１０分間隔で３回、ＰＢＳ/ＰＶＰで洗浄し、さらに、それぞれＣｙｓ３およびＦＩＴＣと結合させた第２抗体中、１時間インキュベートした。細胞のアルカリホスファターゼ(Sigma)活性を測定し、未分化細胞の存在または不在を特定した。カバースリップを洗浄し、続いて１０μg/mlビスベンジミド(H-33342, Sigma)含有ＰＢＳ/ＰＶＰ中の５０％グリセロールと共にガラススライド上にのせ、蛍光顕微鏡下において観察した。
【０２９９】
汎サイトケラチン陽性でアルカリホスファターゼ活性陰性の上皮細胞株およびビメンチン陽性でアルカリホスファターセ陰性の線維芽細胞株がＡＴIII初代培養から作られた。細胞培養において、形態学的に区別可能な２つの細胞型が観察された。大きな「線維芽細胞様」細胞はビメンチン陽性に染まり、小さな「上皮様」細胞は汎サイトケラチン陽性に染まり、それらは初代細胞培養において共存した。ＡＴIIIから単離された繊維芽細胞株は、コンフルエントになった後３日間培養すると上皮様細胞に分化する傾向を示した。続いて継代すると、ビメンチン陽性染色の欠損によって確認されるように、線維芽細胞以外の選択をもたらし、純粋な上皮細胞を生じさせた。老化または潜在的な細胞周期の停止は、２８継代で最初に観察された。それら細胞は正常に成長している細胞(１５−２５μm)に比べてサイズが大きく見え(＞３０μm)、生存能を失うこと無く、数ヶ月間、明らかな***活性の無い状態で培養し続けることができる。停止細胞からの核を用いた胚再構築は双実胚を作り、***活性の再取得を暗示する。
【０３００】
ドナー核質細胞周期の同調および特徴付け
選択された二倍体トランスジェニック雌細胞株を増殖させ、連続的に継代し、さらに将来の核質ストックとして低温保存した。核移植のためのドナー核質を４穴プレートに蒔き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、４８時間まで、または細胞が７０−８０％コンフルエントになるまで培養した。続いて、0.5％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを用いて7日間血清欠乏状態にすることによって、成長期を出て休止期(G₀)に入るように細胞を誘導し、細胞を同調した。G₀期に同調した後、10％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中に細胞を再懸濁させることによって、核質-サイトプラスト融合の３時間前までに再度細胞周期に細胞群を入れて臨界点前の初期のG₁期に同調した。また、第２群の細胞を休止期から開放して、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中で１２または３６時間培養し、細胞をS期に同調した。標準のトリプシン処理によって細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中に再懸濁させ、さらに核質ドナーとして１時間内に電気融合させた。
【０３０１】
５継代のＡＴIII構成を運ぶトランスジェニック細胞株由来の中期核は、８１％二倍体であり、その割合は１５継代で有意には変わらず、７８％の核が二倍体であった。
【０３０２】
シクリンＤ1、2、3およびＰＣＮＡ(Oncogene Research Products)に対する抗体を用いた免疫組織学的分析によって、細胞周期同調を特定した（そのタンパク質複合体が不在であればG₀期を示唆し、またそのタンパク質複合体が存在すればG₁期に入ったことを示唆する）。チミジンアナログ５-ブロモ２’-デオキシウリジン-５’-３リン酸(ＢｒＤｕ, Sigma)およびストレプトアビジン-ビオチンＢｒＤｕ染色キット(Oncogene Research Products)を用いて、ＤＮＡ合成活性の存在によって細胞周期の推定のS期にある細胞を同定した。
【０３０３】
同調を受けた細胞の免疫蛍光分析は、血清欠乏の７日後、９０％の細胞がG₁期マーカーのシクリンＤ1、2、3、およびPNCA陰性であり、従って、G₀停止期にあった。その細胞株において血清含有量を１０％に回復させると、細胞周期への再突入を誘導し、シクリンＤ1、2、3およびＰＣＮＡ陽性染色によると、血清添加後３時間以内に約７４％の細胞が早期のG₁期に達した。１２から３６時間の血清回復によって、８９％の細胞がBrDu陽性となり、ＤＮＡ合成活性を示唆した。本研究において、クローン細胞株は、通常、血清による同調に対してそれぞれ異なった応答を示した。継代数が増えると共に細胞同調の割合が低下するという間接的な関連性が観察された。さらには、継代数が増えると倍増期間が短くなり、各クローン細胞株は細胞周期の血清による同調に対する感度の低下を示した。
【０３０４】
ドナーヤギの過剰***および卵母細胞の採取
皮下用のノルゲストメット耳埋込み物(Norgestomet ear implant)(６mg)(Synchro-mate B)によって０日目に発情を合わせた。７日目に、プロスタグランジン(ＰＧＦ２α)(Upjohn US)を単回注射した。１２日目から、FSH(Folltropin-V, Vetrepharm, St Laurent, Quebec, Canada)を4日連続で、1日２回投与した。１４日目に耳埋め込み物を除去した。埋め込み物を除去した２４時間後、４８時間間隔で、精管切除した雄とドナー動物を数回***させた。最後のFSH注射後、GnRH(Rhone-Merieux US)を単回筋肉内に注射した。最後の***の約１８および２４時間後、予め３７℃に暖めたCa²⁺/Mg²⁺を含まないＰＢＳで卵管をフラッシングし、中腹部の開腹によって動物から卵母細胞を外科的に回収した。次に卵母細胞を回収し、２mM L-グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(それぞれ10,000 I.U./ml)を補充した１０％ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中において培養した。
【０３０５】
卵母細胞除核
ドナーヤギからin vivoで成熟した卵母細胞を採取した。卵丘細胞を含む卵母細胞または極体を欠く卵母細胞を除去した。卵丘細胞を含まない卵母細胞を２つの群に分けた：１つの極体のみを有する卵母細胞(中期II)プロトコル、および活性化終期IIプロトコル(１つの極体を有し、かつ第二極体を排除した証拠を有する卵母細胞)。１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中において、２から４時間、終期IIにある卵母細胞を培養した。その間に活性化された卵母細胞（第一極体および部分的に排除された第二極体によって証明される）を培養によって誘導されたカルシウム活性化終期II卵母細胞（終期II-Ca²⁺）として分類し、さらに除核した。活性化されなかった卵母細胞を、７％エタノール含有ＰＢＳ中において、除核前に5分間インキュベートした。２５−３０μmのガラスピペットを用いて、第一極体およびおそらく中期プレートを含むその極体の周りの隣接細胞質（細胞質の約３０％）を吸引することによって、終期IIの卵母細胞（１つの極体）を除核した。
【０３０６】
上記のように、２つの方法によって終期卵母細胞を調製した。まず、５％ＦＢＳを補充したリン酸緩衝生理食塩水(Ca²⁺/Mg²⁺を含まないＰＢＳ)中において卵母細胞を１５分間インキュベートし、さらに終期紡錐体構成または第二極体の排除が達成されるまで、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中、３８℃で、約３時間卵母細胞を培養した。異なる細胞外カルシウム濃度における処理下での連続培養に応答した全ての卵母細胞を分離し、終期II-Ca²⁺細胞として分類した。応答しなかった他の卵母細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中の７％エタノール中において５−７分間さらにインキュベートし(終期II−ETOH)、終期II紡錐体構成が達成されるまで、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中において、３８℃でさらに３時間培養した。その後、サイトカラシン-B(５μg/ml)を含む１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地(３０−５０μl)中において、３８℃で１０−１５分間卵母細胞を培養した。３０μm(ＯＤ)のガラスピペットを用いて、第一極体、および中期プレートまたは中期II紡錐体を含む細胞質の約１０％を含むその極体の周りの隣接細胞質の約３０％を吸引することによって、卵母細胞を除核した。除核後、卵母細胞をすぐに再構築させた。
【０３０７】
胚再構築
7日目に、7分間のトリプシン処理(０．０２５％トリプシン／０．５mM ＥＤＴＡ)(Sigma)によって、核質ドナーとして用いる体細胞CFF155-92-6を採取した。L−グルタミン(２mM)およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した１０％ＦＢＳ含有平衡Ｍ１９９培地中に単細胞を再懸濁させた。除核用と同じ培地中において、ドナー細胞の注入を実施した。除核サイトプラストへの注入用に選択する前に、ドナー細胞を小、中、大に分類した。２０−３０μm径のガラスピペットを用いて、小単細胞(１０−１５μm)を選択した。除核の間に作られた透明帯の同じ細孔を介してピペットを導入し、透明帯と卵細胞質膜との間にドナー細胞を注入した。融合および活性化させる３０-６０分前に、Ｍ１９９培地中において再構築胚をインキュベートした。
【０３０８】
融合および活性化
電気融合の前、全ての再構築胚（エタノール前処理したまたはしていない）を融合バッファー(蒸留水中、０．３Mマンニトール、０．０５mM CaCl₂、０．１mM MgSO₄、１mM K₂HPO₄、０．１mMグルタチオン、０．１mg/ml ＢＳＡ)中において２分間洗浄した。融合バッファーで満たした、２００μm離間した２つのステンレス鋼電極を有するチャンバー(BTX 200 Embryomanipulation System, BTX-Genetronics, San Diego, CA)中において、室温で融合および活性化を実施した。ピペットを用いて３-４群に再構築胚を置き、レシピエントの卵母細胞およびドナーのCFF155-92-6細胞の細胞膜が電極に対して平行になるように手動で整列させた。Electrocell Manipulator and Enhancer 400 (BTX-Genetronics)を用いて、まず整列／保持パルス5-10V ACで7秒間、続いて融合パルス1.4-1.8KV/cm DCで70マイクロ秒処理することによって、GnRH注入後３２-４２時間の間に細胞融合および活性化を同時に誘導した。融合培地で３分間胚を洗浄し、次にサイトカラシン-B(Sigma)(５μg/ml)および１０％ＦＣＳ含有Ｍ１９９培地に細胞を移し、1時間インキュベートした。Ｍ１９９／サイトカラシン-Ｂ培地から胚を取り出し、パラフィン油を用いて重積したヤギ卵管上皮細胞と共に、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地５０μl中において培養した。５％ＣＯ_２、３９℃の加湿インキュベーター中において、レシピエントの雌に移植する前４８時間、胚を培養し続けた。
【０３０９】
G₀、G₁、およびＳ期の核質を用いた同時活性化および融合の1時間後の再構築胚全てが、サイトプラストが停止した中期IIになった時に、核膜破壊(ＭＥＢＤ)および未成熟染色体凝縮(ＰＣＣ)を示した。続いて核膜形成が観察され、活性化の４時間後には約３５％に達した。終期IIで再構築された卵母細胞では、G₀、G₁およびＳ期の核質と融合させた１時間後に観察される平均２２％の卵母細胞がＭＥＢＤおよびＰＣＣを受けるが、残りの卵母細胞は非凝縮核の周りの無傷の核ラミナを有することが示された。ＭＥＢＤおよびＰＣＣが生じないことを除いて、用いられた中期および２つの終期再構築プロトコルとの間で一致した核の形態は観察されなかった。３６から４８時間in vitroで培養した後のG₀またはG₁期の核質を用いた場合(２から８割球)と比べて、Ｓ期のドナー核を用いて胚を再構築した場合にクローン胚が進んだ***期(８から３２割球)の高い発生を有することが観察された点において違いが明白となった。蛍光顕微鏡分析は、迅速に***する胚が断片化されるのを示した。他の胚は、卵割発生が阻止される前の培養の3日以内に３２から６４細胞期に発生する。それら胚の割球および核数の分析は、細胞質***および核***の同調の失敗を示し、割球が対応する核を欠きまたは複数の核を包含していた。一方、形態学的に正常に見える胚は、同調した細胞質***および核***を示した。
【０３１０】
ヤギ卵管上皮細胞 ( ＧＯＥＣ )/ 再構築胚の共存培養
ＧＯＥＣは、同調および過剰***させた雌に基づいて実施された外科的卵管フラッシングの間に採取された卵管組織に由来する。１０％ＦＢＳ、L-グルタミン(２mM)、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する平衡Ｍ１９９培地(５ml)を有する１５mlの滅菌ポリプロピレン培養チューブに、単一の雌由来の卵管組織を移した。1分間ボルテックスで攪拌し、続いて、５％ＣＯ₂、３８℃の加湿インキュベーター中において最大1時間まで培養することによって単細胞懸濁液を調製した。再度1分間チューブをボルテックスで攪拌し、その後さらに5分間培養して破片を沈殿させた。単細胞と思われる部分を含む上層部の４μlを新しい１５mlチューブに移し、室温で7分間600ｘgで遠心した。上清を除去し、平衡ＧＯＥＣ培地(８ml)中に細胞ペレットを再懸濁液させた。２５cm²フラスコ中においてＧＯＥＣを培養し、3日目に培地交換し、６日目に上記のようにトリプシン処理によって細胞を採取した。核実験のために、初代ＧＯＥＣ培養から単層を毎週調製した。ＧＯＥＣ培地中に細胞を5x10⁵/mlで再懸濁液させ、５０μ/wellずつ４穴プレートに蒔いた。培地に軽パラフィン油(light paraffin oil)(０．５ml)を重ね、５％ＣＯ₂、３８℃の加湿インキュベーター中においてプレートを培養した。２日目に８０％の新鮮な平衡培地で培地交換した。ＧＴＣ農場でレシピエントに移植する前に、ＧＯＥＣ単層と共に、５％ＣＯ₂、３８℃の加湿インキュベーター中においてin vitroで全ての再構築胚を培養した。
【０３１１】
ＡＴIIIのための全ての実験の反復において、同調したレシピエントに移植可能な卵割期の胚が２日目にもたらされた。ドナー核質として線維芽細胞および上皮細胞の表現形質を用いた胚は、培養中に卵割および発生を示した。ＡＴIII核質と共に用いる場合に、停止した中期IIにおいて用いられたサイトプラスト（３５％）と比較して、予め活性化された終期IIのサイトプラスト（４５％）および終期II-エタノール活性化サイトプラスト（５６％）を用いた再構築胚において、卵割発生の割合（％）が高かった。ドナー核質がＳ期にある場合と比較してG₀またはG₁期にある場合に胚の形態学的特性が良好であるが、細胞周期のG₀、G₁またはＳ期にあるドナー核質を用いて再構築された胚の卵割の割合に違いは観察されなかった。移植の時に胚は通常２から８細胞期にあり、大部分の胚が３-４割球を有する。正常な卵割発生は、時期的に、融合および活性化の約３６から４８時間後に相当する。in vitroで３６から４８時間発生させた後、２から８細胞期において、形態学的に正常に見える胚を選択した。
【０３１２】
レシピエントの雌の発情期の同調
レシピエントにおいて、（ドナーと比較して）１日遅れでホルモン処置してドナー／レシピエント同調を確実にした。皮下用ノルゲストメット耳埋め込み物(６mg)によって、１日目に発情期を同調した。８日目にプロスタグランジンを単回注射した。１４日目に、ＰＭＳＧ(CalBiochem US)の単回の筋肉内投与を開始した。１５日目に耳埋め込み物を除去した。埋め込み物を除去した２４時間後、３日連続で、精管切除した雄とドナー動物を数回***させた。
【０３１３】
レシピエントの雌への胚移植
同調したレシピエントに移植する約４８時間前に、再構築胚をＧＯＥＣ単層と共に共存培養した。移植直前に、１０％ＦＢＳ含有平衡Ham’s F-12培地中に再構築胚を入れた。線毛を介して各レシピエントの卵管ルーメン(oviductal lumen)に２から４の再構築胚を移植した。火造りの(fire-polished) 滅菌ガラスマイクロピペットを用いて、最少容量の１０％ＦＢＳ含有Ham’s F-12培地中で移植を実施した。
【０３１４】
トランスジェニックヤギ胎仔性線維芽細胞およびin vivoで誘導した卵母細胞を用いた核移植によって再構築された胚の発生を表１に要約した。採取のために準備された４匹のドナーと４８時間後の移植のために準備された５-６匹のレシピエントの雌を用いて、全部で１４ラウンドの採取および移植を行った。３つの異なる除核／活性化プロトコル：中期II、終期、およびエタノールで前処置された中期II：を用いた。融合-活性化に続いて、少なくとも卵割(２細胞期)まで、長くても早期１６細胞期まで、ヤギ一次上皮細胞と共に再構築胚を共存培養し；時期的に正確な２−４細胞期にほとんどの胚を移植した。ホルモン的に同調した（時期的に）レシピエントにおいて、全ての移植を外科的に卵管に実施した。中期IIプロトコルと比較して、終期プロトコルおよびエタノールプロトコルを用いた場合に発生の割合がわずかに良好であった。これは、部分的には第二極体の除核が卵母細胞にとってほとんど外傷性でないと思われるため、および部分的にはエタノールで全処置された卵母細胞の活性化の割合が高いと思われるためである。
【０３１５】
【表１】

胚移植に続いて、２５日目に超音波でレシピエントの雌を調べた。ＡＴIIIレシピエントの雌において５５-７８％の範囲の高い妊娠率が診断された。３つの除核／活性化プロトコルの全てにおいて、高い割合の雌（６５％）が３０日目に陽性を示すことが観察された。しかしながら、ほとんどの場合、そのような早期に、胎仔の心拍が検出されないことに注目しなければならない。さらには、３０日目に検出された陽性の超音波シグナルは、正常な胚の発生の特徴ではなく、正常な胚の形成とは関連しない小嚢発生(vesicular development)により近いように思われた。その種の胚の発生は、他のヤギ胚移植プログラム（例えば、マイクロインジェクションした胚）においては通常観察されない。２５日目から４０日目の間における隔週でのそれら小嚢発生の検査は、それら妊娠が異常であり、４０日目にはほとんどの胎仔が再吸収されて正常な超音波画像が見られなかった。
【０３１６】
しかしながら、２件の妊娠において、４０日目までに心拍が検出された。それら２件の場合、２５日目から４０日目の間での超音波検査は心拍を検出したのみでなく、認識可能な胚構造の発生を示した。それら妊娠の一方は、中期II除核／活性化プロトコルを用いて、６継代培養したCFF155-92-6線維芽細胞株に由来する休止期の核質とその除核サイトプラストとを融合させて確立された。その例示において、４個の４細胞期の再構築胚をレシピエントの雌の卵管に移植した。もう一方の妊娠（双胎）は、事前に活性化した終期Ca²⁺卵母細胞に由来する除核細胞と５継代培養したCFF155-92-6上皮細胞株に由来するG₁核質とを融合させる終期除核／活性化プロトコルに基づいて再構築された胚から得られた。その場合、３個の再構築胚（1個の２細胞期および２個の４細胞期）をレシピエントの雌に移植した。
【０３１７】
エタノール除核／活性化プロトコルによって作られた胚を用いた場合、全く妊娠は観察されなかった。しかしながら、本研究において用いられた３つの除核／活性化プロトコルの相対的効果に基づいて結論付けるには数が充分ではなかった。
【０３１８】
【表２】

レシピエント胚の周産期ケア
妊娠を通じて、健康の表面的な兆候（例えば食欲、敏捷性、外観）について、雌ヤギを毎日観察した。継続した発情期の初日から２５-２８日目の超音波検査によって妊娠を決定した。胎仔の生存をモニターおよび確認するために、約７５日目まで隔週で、およびその後一ヶ月に１回雌ヤギを超音波検査した。さらには、血清妊娠分析のため、連続した発情期の約２１日後に、レシピエントの雌ヤギから血清試料を採取した。これは、機能性の黄体が存在するか否か、およびそれがどのように動物の生殖状態（すなわち妊娠）に対照するかを決定するために行った。約１３０日目に、妊娠したヤギに破傷風毒素およびクロストリジウムＣ＆Ｄをワクチン接種した。セレニウム＆ビタミンＥ（Bo-Se）ならびにビタミンＡ、ＤおよびＢ複合物を筋肉内または皮下に投与し、さらに駆虫剤を投与した。約１４３日目に、雌ヤギを清潔な分娩用の区画に移し、分娩前にその新しい環境に慣れさせた。分娩にはいった兆候をモニターするために、妊娠した雌ヤギの観察を増やした。規則正しい収縮が始まった後、出産まで、雌ヤギを断続的に観察し続けた。約１５分間の強い収縮の後陣痛が進行しなかった場合、膣触診で胎仔の位置を調べた。胎仔の位置が正常である場合は、補助下での膣分娩を開始する前に、（雌ヤギに依存して）さらに５-３０分陣痛を進行させた。望ましい場合には、帝王切開を実施した。望ましい場合には、ＰＧＦ２α(例えばLutalyse)(約５−１０mg)を用いて分娩を誘導した。妊娠の約１４５-１５５日の間に、その誘導が生じ得る。通常、最初の注射から３０から４０時間後に分娩が起きる。モニタリング方法は上記と同じである。
【０３１９】
仔ヤギが生まれると直ぐに、その仔ヤギを急いでタオルで乾かし、さらに全体の異常および正常な呼吸をチェックした。仔ヤギを直ぐに雌ヤギから連れ去った。仔ヤギが健康であることを確認すると直ぐに、７％ヨードチンキ中にその臍を浸した。誕生後最初の1時間内に、仔ヤギは熱処理した初乳の最初の供給を受けた。出生時に、能力および健康を高めるためにセレニウム＆ビタミンＥ(Bo-Se)ならびにビタミンＡ、ＤおよびＢ複合物を仔ヤギに注射した。
【０３２０】
核移植によって作られた最初のトランスジェニック雌ヤギの子孫は、分娩および帝王切開出産の誘導後、妊娠期間の１５４日後に生まれた。その子孫の出生時体重は２．３５kgであり、アルプス系統の中間的体重の範囲内であった。雌の双仔は、１ヶ月後、妊娠期間１５１日で、最小限の補助で自然に生まれた。その双仔の出生時体重は共に３．５kgであり、その系統の双仔の中間的体重の範囲内であった。３匹全ての仔ヤギは正常でかつ健康に見え、さらに、毛色およびアルプス系統に典型的なシンボルマークを発現する点において表現形質が類似していた。
【０３２１】
さらには、3匹の子孫は、初代のトランスジェニック雄ヤギに外観において類似していた。ドナー卵母細胞の系統または胎仔性遺伝子型の異種発現からの区別できる表現形質の影響は全く観察されなかった。
【０３２２】
トランスジェニッククローンヤギ
3匹の仔ヤギがヤギβカゼインプロモーターおよびヒトＡＴIII遺伝子配列を包含するＢＣ６構成物の遺伝子移植を受けていることを確認するため、導入遺伝子の断片のＰＣＲ増幅およびサザン分析を実施した。
【０３２３】
出生後すぐに、クローンメスヤギおよび代理母ヤギから血液試料および耳皮膚組織を得た。その試料においてゲノムＤＮＡの単離を実施した(Laird et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293)。各試料について、まずＡＴIII特異的プライマーを用いてＰＣＲによる分析を行い、次に、ＡＴIII ｃＤＮＡを用いてサザンブロット分析を実施した(Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571)。各試料について、ゲノムＤＮＡ(５μg)をEcoRIで消化し(New England Biolabs, Beverly, MA)、０．７％アガロースゲル(Seakem○^R, ME)中において電気泳動を実施し、さらに標準的方法に続いてキャピラリートランスファーによってナイロン膜(MagnaGraph, MSI, Westboro, MA)上に固定化した(Laird et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293)。Prime-It○^Rキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いてα-³²PdCTPで標識した１．５kbのXho I-Sal I ＡＴIII ｃＤＮＡ断片を用いて膜を分析した。６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した(Church et al. (1984) Prot. Natl Acad. Sci. USA 81: 1991-1995)。0.2xSSC(0.1% SDS)でブロットを洗浄し、X-OMAT^TM ARフィルムを４８時間感光させた。
【０３２４】
ＰＣＲ分析は、全ての仔ヤギがヤギβカゼインプロモーターおよびヒトＡＴIII遺伝子配列を包含するＢＣ６構成物の遺伝子移植を受けていることを支持した。サザンブロット分析は、完全なＢＣ６導入遺伝子を示した。３匹全てのクローン動物、細胞株およびトランスジェニック陽性対照において、診断用の４．１kb EcoRI断片に対するハイブリダイゼーションが検出されたが、2匹のレシピエントの雌では検出されなかった。内因性ヤギＡＴ遺伝子座に対するＡＴIII ｃＤＮＡプローブの交差ハイブリダイゼーションのため、１４kbのバンドが全ての試料において予測通り検出された。
【０３２５】
さらには、ＢＣ６構成物の一体化部位を特定するためにin situハイブリダイゼーションでの蛍光分析(ＦＩＳＨ)を実施した。クローンヤギのタイピングのために、リンパ球採取用に全血を培養した(Ponce de Leon et al. (1992) J. Hered. 83: 36-42)。線維芽細胞およびリンパ球を調製し、さらに以前記載のようにハイブリダイズさせた(van de Corput et al. (1998) Histochem Cell Biol. 110: 431-437, and Klinger et al. (1992) Am. J. Human. Genet. 51: 55-65)。完全な１４．７kb ＢＣ６導入遺伝子を包含するジゴキシゲン標識プローブを本方法において用いた。シグナルを増幅させるために、TSA^TM-Directシステム(NENTM Life Science Products, Boston, MA)を用いた。ＤＡＰＩ対比染色を用いてＲ-バンドを可視化しかつ同定した(Di Berardino et al. (1987) J. Hered. 78: 225-230)。画像を捕獲および加工するためのImage-Pro○^R Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)と共に、浜松デジタルカメラを搭載したZeiss Axioskop顕微鏡を用いた。ＢＣ６導入遺伝子に対するプローブを用いた、各トランスジェニック仔ヤギからの血液培養のＦＩＳＨ分析は、３匹全てがＣＦＦ６細胞株由来の中期プレートにおいて認められるのと同じ第５染色体への導入遺伝子の一体化を有することを示した。さらには、各クローン仔ヤギにおける７５以上の中期プレートの分析は、第５染色体への導入遺伝子の一体化がモザイクでないことを支持した。
【０３２６】
3匹全ての仔ヤギがトランスジェニックＣＦＦ６細胞株に由来することの最終的な確認として、非常に多型性のＭＨＣクラスII ＤＲＢ遺伝子のためのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を実施した。ＰＣＲ−ＲＦＬＰタイピングを用いて、ヤギＭＨＣクラスII ＤＲＢ遺伝子の第二エキソンのためのタイピングを実施した(Amills et al. (1996) Immunopathol. 55: 255-260)。nested PCRの産物(１５μl)をRsal(New England Biolabs, Beverly, MA)(２０ units)で消化した。消化後、臭化エチジウムの存在下において４-２０％非変性ポリアクリルアミドゲル(MVPTM precast gel, Stratagene, La Jolla, CA)において制限酵素断片を分離した。
【０３２７】
DRB遺伝子第二エキソンのRsal消化によって説明したように、３匹のクローン仔ヤギはお互いに全く同じであり、かつＣＦＦ６ドナー細胞株と同一であるが、レシピエントの雌は異なる対立遺伝子を有する。
【０３２８】
乳分泌および乳中への導入遺伝子のタンパク質発現の誘導
標的とされた乳腺特異的ヒトＡＴIIIタンパク質の発現が乳中に存在するか否かを特定するために、性成熟前のクローントランスジェニックヤギを一時的に乳分泌するように誘導した。生後２ヶ月で、２週間のホルモン投与による乳分泌誘導プロトコルをクローン仔ヤギに与えた。Ryot et al. (1989) Indian J. Anim. Res. 10: 49-51に記載のように、ＣＦＦ６−１雌においてホルモン乳分泌誘導を実施した。１日１回、手でＣＦＦ６−１仔ヤギを搾乳し、ＡＴIII発現分析のための乳試料を採取した。全てのタンパク質分析法は、Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571に記載されている。２１４nmで検出するHewlett Packard 1050 HPLC(Wilmington, DE)を用いた高速逆相ＨＰＬＣ法によって、乳中の組換えＡＴIIIの濃度を特定した。二段階比色端点測定法(two-stage colorimetric endpoint assay)を用いて、トロンビン阻害を測定することによってＡＴIII活性を評価した。アフィニティー精製したヒツジ抗ＡＴIII−ＨＲＰ結合ポリクロナール抗体(SeroTec, Oxford, UK)を用いて、ウェスタンブロット分析を実施した。１０-２０％グラジエントゲル(Owl Scientific)上に試料をのせる前に、還元試料バッファー中において試料を３０秒間煮沸した。色素の先端がゲルから流れ出るまで１６４ボルトで(一定)電気泳動を操作した。
【０３２９】
２０日間毎日、処置の終わりに、少量の乳試料(０．５−１０ml)を採取した。少量の最初の乳(０．５から１ml)は、ホルモンによって乳分泌を誘導された性成熟前の雌ヤギにおいて見られる一般的な量である。その量は、開始後２５日目に雌ヤギが出し切るまでに、1日当たり１０mlに増加した。いくつかの試料中のＡＴIIIの濃度および活性を評価した。特異的ＢＣ６トランスジェニック細胞株由来の雌を用いて以前言及したように、高レベルの組換えＡＴIIIがウェスタンブロット分析によって検出された(Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571)。クローン仔ヤギの乳中の組換えＡＴIIIの濃度は、5日目に５．８g/l(２０．５U/ml)であり、9日目には３．７g/l(１４．６ U/ml)であった。それらは、そのＢＣ６細胞株からの雌の最初の自然の乳分泌の初期の間に記録されたレベル(３．７から４．０g/l)に一致した。
【０３３０】
結論：
停止した中期IIまたは活性化された終期IIのいずれかにおいて除核された卵母細胞に対して体細胞の核を移植することによって、健康なトランスジェニックヤギを得た。それら研究は、妊娠をもたらすのに用いられた血清欠乏細胞が、おそらく１０％血清回復に続くG₀/ G₁過渡期にあることを示す。
【０３３１】
免疫蛍光スクリーニングは、7日間の血清欠乏の後、胎仔性体細胞はG₁期のサイクリンＤ1、Ｄ2、Ｄ3およびＰＣＮＡ陰性であるが；１０％ＦＢＳ血清活性化の３時間以内に、大部分（例えば約７０％）がそれらマーカーを発現することを示した。
【０３３２】
同時融合および活性化に続いて細胞周期のG₀またはG₁期において同調したドナー核質由来の核の移植による除核中期II停止卵母細胞の再構築は、受精の間に生じる時間的事象を模倣する。同時融合および活性化プロトコルに続く出産直前までの成功した発生および正常かつ健康なトランスジェニック仔ヤギの誕生は、染色質のリモデリングおよびリプログラミングを支持するために上昇した細胞質ＭＰＦ活性にドナー核を長期間暴露することを必要とすることを報告している他の研究において用いられている方法と著しく異なっている(Campbell et al. (1996) Nature 380: 64-66; Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813; Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133; Cibelli et al. (1998) Science 280: 1256-1258を参照)。われわれの結果は、活性化前における上昇したＭＰＦ活性の条件下での体細胞核の長期のリモデリングが胚および胎仔の発生に重要であるとする論点に挑戦する。また、その結果は、再構築胚がＭＰＦに対するドナー核の長期の暴露を必要とせず、また、ＭＥＢＤおよびＰＣＣが完全な必須事象でもないことを示す。ＭＥＢＤおよびＰＣＣに関する染色質レモデリング事象はむしろＭＰＦ活性の随意的効果と思われ、従って、発生の能力または全能性の獲得には必要ないであろう。その代わりに、それら事象はサイトプラストと核質との間の同調の獲得を容易にする役割を果たすであろう。ドナー核がＰＣＣを受け、その結果、ＭＰＦ活性による異常な紡錐体機構のせいで染色体分散を受けるように誘導された時に正常な二倍体が維持されない場合は、それら事象はむしろ有害と成り得る。従って、細胞周期における核質およびサイトプラストの同調が、第一に正常な倍数性の維持のため、第二にゲノムの再活性化およびそれに続く再構築胚の発生能力の獲得の適切な誘導のため重要である。
【０３３３】
染色質が無傷である中期IIの停止卵母細胞を活性化させてＭＰＦ活性を低下させかつM期から出て最初の減数***に入るように卵母細胞を誘導する第２の方法において、さらに支持が得られた。活性化の約３時間後、G₁期の開始前の終期において卵母細胞を除核し、さらに細胞周期の臨界点前のG₁期にあるドナー核質を用いて融合および同時の活性化を行った。さらには、同時活性化および融合は、成熟していない(non-aged)卵母細胞が停止期に戻る傾向を回避するのを確実にした。その実例を用いて、正常かつ健康な双仔のクローントランスジェニック仔ヤギを作った。その方法は、本質的に、サイトプラストを臨界点前のG₁期にあるドナー核に合わせる同質同調方式を提供する。さらに卵母細胞の事前の活性化は、細胞質のＭＰＦ活性の低下を誘導し、従ってＭＥＢＤおよびＰＣＣの発生を阻害する。それら結果は、ＭＥＢＤおよびＰＣＣがサイトプラストおよび核質の同調の誘導のために単に任意的であり、適切なゲノムの再活性化およびそれに続く体細胞核を用いた核移植胚の発生の獲得のために必要ではないことを示唆する。
【０３３４】
それら観察はさらに、G₀またはG₁期での分化細胞が、停止または活性化レシピエントサイトプラストと組み合わせて用いた場合に、全能性を獲得する能力に関して、胚の卵割に類似した機能を有することを示唆する。中期II停止サイトプラストおよび終期IIサイトプラストの両方の使用によって、サイトプラストを調製するためのより長期間の機会を提供することに加えて、サイトプラスト調製のために二重の選択肢を提供する。終期IIサイトプラストの使用は、いくつかの実用的および生物学的利点を有するであろう。終期アプローチは、染色質染色および紫外線局部限定(ultraviolet localization)の必要性無しに、効率的な除核を容易にする。さらには、終期における除核は、最少の細胞質物質の除去および活性化ドナーサイトプラストの同調群の選択を可能とする。また、本方法は、サイトプラストの細胞周期と同調すべきドナー核の同質性の高い群の調製を可能とする。胚再構築に用いられる場合、それら集団は、in vitroでの高い胚発生率を示した。従って、同期的に活性化されたサイトプラストおよび核質から成る再構築胚は発生的に有能である。
【０３３５】
トランスジェニック初代を作ることの成功に加えて、体細胞の核移植は、クローントランスジェニック胚を作る前に適切なトランスジェニック細胞株を選択することを可能とする。このことは、トランスジェニック乳腺によっていくつかのタンパク質を同時発現させるべき場合に特に重要である。例えば、乳中での組換えモノクロナール抗体のトランスジェニック産生において、重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、理想的には、完全抗体の効率的な産生のために、同じレベルで乳腺上皮の同じ分泌細胞において発現される必要がある。さらには、同等の発現を助けかつ群れの繁殖の間に重鎖と軽鎖の導入遺伝子が分離するのを避けるために、各タンパク質を発現させる導入遺伝子が同じ遺伝子座に共に一体化される必要がある。
【０３３６】
また、完全に同じ遺伝子的背景を有するトランスジェニック動物の産生は、乳腺による組換えタンパク質の発現および分泌特性を研究する可能性を高める。例えば、組換えヒトＡＴIIIを産生する何匹かの完全に同じトランスジェニック雌を利用できることは、乳腺によって産生されたそのタンパク質の糖鎖構造における変化の程度を特定するのを助けるであろう。従って、環境因子（例えば食物）を代えることによってトランスジェニック動物系において産生される組換えタンパク質の特性を改善し、あるいは前臨床または臨床プログラムのために適切な量の組換えタンパク質を得るのに必要な時間をさらに減らすために乳産生量を増やすことが適切であろう。
【０３３７】
ＣＦＦ６−１クローンヤギの乳中に検出された組換えヒトＡＴIIIの高レベルでの発現は、本技術の最も重要な態様の１つを例示する。核移植と性成熟前のヤギにおける乳分泌誘導を組み合わせることによって、トランスジェニック動物および乳発現用の細胞株のトランスフェクション時から８から９ヶ月中にそれが分泌するタンパク質を特徴付けすることができる。乳分泌誘導において採取された乳の量は、組換えタンパク質収率を評価するのに充分であるのみならず、mg/mlの発現レベルが得られた場合には、より定性的な分析(グリコシル化、予備的薬物動力学、生物学的および薬理学的活性)に充分である。また、核酸導入されたドナー細胞株を継続的に利用できることは、臨床試験用に治療的タンパク質（予測できる特性と共に）を迅速に供給するために遺伝子的に同じ動物を迅速に作り得ることを確実にする。
【０３３８】
この中で挙げられている全ての特許および他の引例は参照によって組み込まれる。
【０３３９】
他の実施形態も請求の範囲内に含まれる。
【０３４０】
１）外国語書面の明細書第６頁第１行から第９０頁最終行までの各部分の翻訳が欠落していたので、補充して誤訳訂正する。
【０３４１】
２）外国語書面の請求の範囲第９２頁第１行から第１０３頁最終行までの部分の翻訳が欠落していたので、補充して誤訳訂正する。
【０３４２】
３）併せて、既に翻訳済みの明細書および請求の範囲の一部について、些細な表現の訂正を加えた（この部分は内容の変更はないので、詳細な訂正理由は省略する）。[0001]
This application is a provisional patent application No. 60 / 106,728 filed on November 2, 1998, a provisional patent application No. 60 / 131,328 filed on April 26, 1999, or a US patent application filed on April 23, 1999. Claims priority benefit under 09 / 298,971 and US application Ser. No. 09 / 298,508 filed Apr. 22, 1999, all of which are hereby incorporated by reference.
[0002]
Background of the Invention
The ability to modify animal genomes by gene transfer technology has opened up new avenues for medical applications. Large quantities of useful medical proteins can now be produced at low cost by expressing biomedical proteins in large livestock mammary glands (Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35: 609- 617; Maga et al. (1995) Bio / Technology, 13: 1452-1457; Echelard (1996) Curr. Op. Biotechnol. 7: 536-540; Young et al. (1977) BioPharm. 10: 34-38) . In 1996, the top 15 total sales of biopharmaceuticals reached $ 7.5 billion, which is expected to grow further in the future (Med. Ad News 16:30). Gene transfer technology is applied to proteins that are needed in large quantities due to the need for high unit doses, high dosing frequency, or large patient populations, or complex proteins that are difficult to produce commercially meaningfully by traditional cell culture methods Possible and attractive. In addition, the production of human drugs in the milk of transgenic livestock can lead to many problems associated with microbial bioreactors such as the absence of post-translational modifications, incomplete folding, high purification costs, or high initial investment, for example. It solves many problems associated with animal cell bioreactors, such as expensive cultures, and low yields.
[0003]
Dairy goats are ideal for transgenic production of recombinant pharmaceutical proteins. Its average milk output is 600-800 liters per milking. Using a manageable herd scale, it is possible to produce transgenic proteins to obtain 1-300 kg of purified product per year based on concentrations of 1-5 g / liter repeatedly achieved in various animal models ( Gordon et al. (1987) Bio / Technology 5: 1183-1187; Meade et al. (1990) Bio / Technology 8: 443-446; Ebert et al. (1991) Bio / Technology 9: 835-838; Simons et al. (1987) Nature 328: 530-532; Wright et al. (1991) Bio / Technology 9: 801-834; Velander et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 12003-120007; Hansson et al. (1994) J Biol Chem. 269: 5358-5363; Hurwitz et al. (1994) Transgenic Res. 3: 365-375.). It is small to medium in the large protein category and means the amount that would be required in the majority of biological drugs currently being developed. Furthermore, the interval between generations of goats, that is, from pregnancy to sexual maturity and pregnancy is 18 months for 3 years of cattle. This period enables the production animal group to be expanded within the period necessary for regulatory approval of the medical protein produced by the gene transfer technique. In addition, goats are better at producing protein for medical use because they have the same reproductive capacity and are far less scrappy (7 cases reported in the United States to date) than sheep with low milk yield. It is a system. At present, there are very few reliable methods for making transgenic goats. One such method is pronuclear microinjection. When pronuclear microinjection is used, the integration of the transgene into the gene structure reaches 1-3% of the total microinjected embryo (Ebert et al. (1993) Theriogenology, 39: 121-135).
[0004]
It was published in 1981 that mouse embryonic stem cells can be isolated, grown in vivo, genetically modified, and ultimately contributed to the germline of the recipient embryo (Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Martin (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-256). Since then, mouse embryonic stem cells have been widely used for development of single target genes, ie, deletions, substitutions, mutations, etc. in developmental and genetic studies (Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352; McMahon et al. (1990) Cell 62: 1073-1085; recently reviewed in: Bronson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 27155-27158; Rossant, et al. (1995 Nat. Med. 6: 592-594). Although extensive research in mice has clearly shown the usefulness of this powerful and stunning technique, the successful application of embryonic stem cell technology has been reported only in mice as a result. However, there is a need for methods of obtaining clones and transgenic animals (eg goats).
[0005]
Summary of the Invention
The present invention can obtain clones and transgenic animals (eg, clones and transgenic goats) by, at least in part, introducing a chromosomal genome of a somatic cell into a functional enucleated oocyte and simultaneously activating it. Based on the discovery that it can. Functional enucleated oocytes can be activated or not activated. In one embodiment, an inactivated functional enucleated oocyte (eg, metaphase II goat oocyte) is fused with a donor somatic cell (eg, goat somatic cell) (eg, by electrofusion). ) And activated simultaneously with fusion. In other embodiments, activated functional enucleated oocytes (eg, naturally mature terminal goat oocytes) are fused (eg, by electrofusion) with donor somatic cells (eg, goat somatic cells). And activated simultaneously with fusion.
[0006]
The use of somatic cell lines (eg, recombinant primary fibroblast somatic cell lines) for nuclear transfer of transgenic nuclei dramatically improves the efficiency of producing transgenic animals (eg, In the case of making, it is improved to 100%.) Also, since each cell of the developing embryo contains the transgene, the problem of the initial mosaic phenomenon is solved. Furthermore, the generation of transgenic animals (eg, transgenic goats) by nuclear transfer from transgenic cell lines allows for the accelerated scale expansion of specific transgenic lines. For example, the expansion of the group of animals can be achieved with one breeding season.
[0007]
Generating transgenic animals by nuclear transfer from somatic cells (for example, transgenic goats) has the advantage of enabling genetic manipulation that is not possible with traditional microinjection methods. For example, nuclear transfer from somatic cells allows the introduction of specific mutations, or targeting foreign genes to specific sites in the genome solves the problem of integration position effects. Homologous recombination in donor somatic cells "knocks out" or replaces endogenous proteins (e.g., goat endogenous proteins), lowering the cost of purification of heterologous proteins expressed in milk, and in animal bioreactors Useful for precise adjustment.
[0008]
In general, the present invention relates to a method of making a non-human cloned mammal (eg, a cloned goat). The following method is described for a goat, but is applicable to any other non-human mammal. The method is: transplanting a goat genome derived from a goat somatic cell into a goat oocyte (especially desirably a naturally mature terminal oocyte) to produce a reconstructed embryo; By transferring to a goat, a reconstructed embryo is generated in the goat to provide the goat. In one embodiment, the method includes introducing a goat somatic cell nucleus into the goat oocyte, eg, by direct injection or fusion of somatic cells and oocytes (eg, electrofusion).
[0009]
In a preferred embodiment, goats are generated from reconstructed embryos. In another embodiment, the goat is a goat offspring developed from a reconstructed embryo. In preferred embodiments, the somatic cell is in a non-resting state (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is G₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is in a resting state (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell, eg, the somatic cell is an embryonic fibroblast. Somatic cells can be fibroblasts (eg, primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), cumulus cells, nerve cells, or mammary cells. In a preferred embodiment, the oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte. In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is at the end; the oocyte is removed using an in vivo protocol to remove the oocyte at the desired phase of the cell cycle (medium, end) Activate the oocyte before or simultaneously with the genome transfer. In another embodiment, the oocyte and the somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and the somatic cell are activated together or the oocyte and the somatic cell are stopped together).
[0010]
In a preferred embodiment, the method includes crossing a goat generated from a reconstructed embryo with a second goat. The second goat is: a normal goat; a second goat that is generated from or is a descendant of a goat generated from a reconstructed embryo; or the same animal that was supplied with the genetic material of the first goat, A second goat that is generated from a reconstructed embryo formed from genetic material derived from an animal of the same genotype or from the same cell line, or is a goat progeny generated from a reconstructed embryo: In a preferred embodiment, a first goat generated from a reconstructed embryo may be crossed with a second goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first goat.
[0011]
In a preferred embodiment, the goat is a male goat. In other preferred embodiments, the goat is a female goat. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat. In preferred embodiments: the product (eg, protein, recombinant protein, human protein) can be recovered from the goat; the product (eg, human protein) can be recovered from the goat's milk, urine, hair, blood, skin, or meat.
[0012]
In another aspect, the present invention relates to a method of providing a non-human transgenic mammal such as a transgenic goat. A method for a goat is described below, but the method can be applied to any non-human mammal. The method comprises: introducing a genome of a recombinant goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte to form a reconstructed embryo; Generating reconstructed embryos in the goat by transplanting into the female goat of the ent, thereby providing a transgenic goat.
[0013]
In one embodiment, the nucleus of the transgenic goat somatic cell is introduced into the goat oocyte, eg, by direct nuclear injection or fusion of somatic cells and oocytes (eg, electrofusion).
[0014]
In a preferred embodiment, the goat is generated from a reconstructed embryo. In another embodiment, the goat is a goat offspring developed from a reconstructed embryo.
[0015]
In preferred embodiments, the somatic cell is in a non-resting state (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is G₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is in a resting state (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell, eg, the somatic cell is an embryonic fibroblast. Somatic cells can be either fibroblasts (eg, primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), cumulus cells, nerve cells, or mammary cells.
[0016]
In a preferred embodiment, the transgene sequence is introduced into a somatic cell; the somatic cell is derived from a cell line such as a primary cell line; the somatic cell is derived from a cell line and the transgene sequence is introduced into the somatic cell. Has been introduced.
[0017]
In a preferred embodiment, the oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte. In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in metaphase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or phase) To remove the cells, an oocyte is obtained using an in vivo protocol; the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the recombinant genome. In another embodiment, the oocyte and the somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and the somatic cell are activated together or the oocyte and the somatic cell are stopped together).
[0018]
In a preferred embodiment, the method comprises crossing a goat generated from a reconstructed embryo with a second goat. The second goat is: a normal goat; a second goat that is generated from or is a descendant of a goat generated from a reconstructed embryo; or the same animal that was supplied with the genetic material of the first goat, A second goat that is generated from a reconstructed embryo formed from genetic material derived from an animal of the same genotype or from the same cell line, or is a goat progeny generated from a reconstructed embryo: In a preferred embodiment, a first goat generated from a reconstructed embryo may be crossed with a second goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first goat.
[0019]
In a preferred embodiment, the goat is a male goat. In other preferred embodiments, the goat is a female goat. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat. In preferred embodiments: the product (eg, protein, recombinant protein, human protein) can be recovered from the goat; the product (eg, protein, human protein) can be recovered from the goat's milk, urine, hair, blood, skin, or meat.
[0020]
In a preferred embodiment, the goat somatic genome comprises a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knockin or other events that disrupt expression of goat genes; eg proteins such as human proteins Any of the coding sequences; heterologous promoters; heterologous sequences under the control of a promoter such as a goat promoter can be used. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0021]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0022]
In a preferred embodiment, the goat genome includes a heterologous transgene sequence, for example under the control of a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0023]
In another aspect, the present invention relates to a method of making a non-human mammal such as a clone or a transgenic goat. A method for a goat is described below, but the method can be applied to any non-human mammal. The method includes: reconstitution by fusion of a somatic cell, such as a goat somatic cell capable of expressing the introduced protein, with an enucleated goat oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte), eg, by electrofusion. Obtaining an embryo; activating the reconstructed embryo; transferring the embryo to a recipient female goat; and further developing the embryo into a goat.
[0024]
In a preferred embodiment, the goat is generated from a reconstructed embryo. In another embodiment, the goat is a goat offspring developed from a reconstructed embryo.
[0025]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell. Somatic cells can be fibroblasts (eg, primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), cumulus cells, neurons, or mammary cells. In a preferred embodiment, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G before the critical point (START).₁G like the period₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period.
[0026]
In a preferred embodiment, the oocyte is in metaphase II. Alternatively, the oocyte is in the terminal stage. In any embodiment, the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment: obtaining an oocyte using an in vivo protocol; obtaining an oocyte using an in vivo protocol to remove an oocyte at the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or end) . In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0027]
In a preferred embodiment, the transgene sequence is introduced into a somatic cell; the somatic cell is derived from a cell line such as a primary cell line; the somatic cell is derived from a cell line and the transgene sequence is introduced into the somatic cell. Has been introduced.
[0028]
In a preferred embodiment, the method includes crossing a goat generated from a reconstructed embryo with a second goat. The second goat is: a normal goat; a second goat that is generated from or is a descendant of a goat generated from a reconstructed embryo; or the same animal that was supplied with the genetic material of the first goat, A second goat that is generated from a reconstructed embryo formed from genetic material derived from an animal of the same genotype or from the same cell line, or is a goat progeny generated from a reconstructed embryo: In a preferred embodiment, a first transgenic goat generated from a reconstructed embryo can be crossed with a second transgenic goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic goat.
[0029]
In a preferred embodiment, the goat is a male goat. In other preferred embodiments, the goat is a female goat. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat.
[0030]
In preferred embodiments: the product (eg, protein, recombinant protein, human protein) can be recovered from the goat; the product (eg, human protein) can be recovered from the goat's milk, urine, hair, blood, skin, or meat.
[0031]
In a preferred embodiment, the goat somatic genome comprises a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0032]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0033]
In a preferred embodiment, the goat genome includes a heterologous transgene sequence, for example under the control of a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0034]
The invention also encompasses non-human animals made by any of the methods described herein. The methods described for goats can be applied to any non-human mammal. Accordingly, in another aspect, the present invention provides a goat somatic genome introduced into a goat oocyte, preferably a naturally matured late oocyte, to obtain a reconstructed embryo, and the reconstructed embryo. The present invention relates to cloned goats or their offspring obtained by causing a goat to develop.
[0035]
In a preferred embodiment, the goat genome can be derived from embryonic somatic cells. Somatic cells can be fibroblasts (eg, primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), cumulus cells, neurons, or mammary cells. In preferred embodiments, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G₁G like the period₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period.
[0036]
In a preferred embodiment, the oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte.
[0037]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in metaphase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or phase) To remove the cells, an oocyte is obtained using an in vivo protocol; the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0038]
In a preferred embodiment, the goat genome can be introduced by fusing somatic cells and functional enucleated oocytes, for example by electrofusion.
[0039]
In another embodiment, the invention relates to a cloned goat, such as a population of one or more males and one female, each cell having a chromosomal genome derived from a goat somatic cell. The goat somatic cell is derived from a goat other than a cloned goat.
[0040]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome can be derived from embryonic somatic cells. Somatic cells can be fibroblasts (eg, primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), cumulus cells, neurons, or mammary cells. In a preferred embodiment, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is G₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period.
[0041]
In another embodiment, the present invention introduces the genome of a recombinant goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, to form a reconstructed embryo, The present invention relates to a transgenic goat or a progeny thereof obtained by causing a goat to develop a constructed embryo.
[0042]
In a preferred embodiment, the goat genome can be derived from embryonic somatic cells. In another preferred embodiment, the goat genome can be a goat fibroblast, such as an embryonic fibroblast.
[0043]
In a preferred embodiment, the goat oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte.
[0044]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is at the end; the oocyte is removed using an in vivo protocol to remove the oocyte at the desired phase of the cell cycle (medium, end) Activate the oocyte before or simultaneously with the genome transfer. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0045]
In a preferred embodiment, the goat genome can be introduced by fusing somatic cells and functional enucleated oocytes, for example by electrofusion.
[0046]
In a preferred embodiment, the somatic goat genome comprises a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode hormones, immunoglobulins, serum proteins, proteins that are any of enzymes, and peptides. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. Any protein desired to be expressed in the transgenic goat includes, but is not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin , Myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin It is done.
[0047]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0048]
In a preferred embodiment, the goat genome includes a heterologous transgene sequence, for example under the control of a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0049]
In another aspect, the present invention relates to a transgenic goat, each cell having a chromosomal genome derived from a transgenic goat somatic cell, the goat somatic cell being derived from other than the transgenic goat.
[0050]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome can be derived from embryonic somatic cells. In another preferred embodiment, the chromosomal genome can be derived from goat fibroblasts, such as embryonic fibroblasts.
[0051]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome of the somatic cell comprises a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, enzymes, and peptides. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0052]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0053]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome includes a heterologous transgene sequence, for example under the control of a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0054]
In another form, the present invention relates to a goat made by crossing a goat generated from a reconstructed embryo (made as described herein) with a second goat.
[0055]
In a preferred embodiment: the second goat is generated from a reconstructed embryo or is a goat offspring generated from a reconstructed embryo; the second goat is the same animal that has been supplied with the first goat genetic material, the same A goat offspring developed from or generated from a reconstructed embryo formed from a genotyped animal or genetic material derived from the same cell line. In a preferred embodiment, a first transgenic goat generated from a reconstructed embryo can be crossed with a second transgenic goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic goat.
[0056]
In another aspect, the present invention relates to a plurality of transgenic goats obtained by crossing a goat generated from a reconstructed embryo with a second goat.
[0057]
In a preferred embodiment: the second goat is generated from a reconstructed embryo or is a goat offspring generated from a reconstructed embryo; the second goat is the same animal that has been supplied with the first goat genetic material, the same A goat offspring developed from or generated from a reconstructed embryo formed from a genotyped animal or genetic material derived from the same cell line. In a preferred embodiment, a first transgenic goat generated from a reconstructed embryo can be crossed with a second transgenic goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic goat.
[0058]
In yet another aspect, the present invention relates to a method of providing a transgenic goat that is homozygous for a transgene sequence. The present invention provides somatic cells that are homozygous with the transgene sequence; causing somatic recombination to produce somatic cells that are homozygous with the transgene sequence; Introduction of the cell-derived genome into a goat oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte) to form a reconstructed embryo; further by, for example, transplanting the reconstructed embryo into a recipient female goat Generating a reconstructed embryo in a goat, thereby providing a transgenic goat that is homozygous for the transgene sequence.
[0059]
In another aspect, the invention relates to a transgenic goat that is homozygous for the transgene sequence.
[0060]
In a preferred embodiment, a genome derived from a somatic cell homozygous with the transgene sequence is introduced into a goat oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte) to form a reconstructed embryo; Transgenic goats were created by generating reconstructed embryos in goats.
[0061]
In another aspect, the invention relates to a method of making a non-human cloned mammal such as a goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel. The method provides, for example, an activated oocyte such as a terminal oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte; functionally enucleating the oocyte; To obtain a reconstructed embryo by transferring the reconstructed embryo into a recipient female, for example by transplanting the reconstructed embryo into a recipient female, thereby producing a cloned mammal Including making.
[0062]
In a preferred embodiment, a mammal such as a goat develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammal, such as a goat, is a progeny of a mammal, such as a goat, developed from a reconstructed embryo.
[0063]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell. In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast, such as an embryonic fibroblast. In preferred embodiments, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G₁G like the period₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period.
[0064]
In a preferred embodiment, the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, an oocyte is obtained using an in vivo protocol, eg, an oocyte is obtained using an in vivo protocol to remove an oocyte at a desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or end). . In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0065]
In a preferred embodiment, the somatic chromosomal genome is introduced into the oocyte by fusion, such as electrofusion, or by direct injection of the nucleus into the oocyte, eg, microinjection.
[0066]
In another embodiment, the present invention functionally enucleates activated oocytes, such as terminal oocytes, and somatic chromosome genomes are enucleated (preferably naturally matured). A reconstructed embryo; for example obtained by generating a reconstructed embryo by transplanting the reconstructed embryo into a recipient mammal, eg goat, cow, It relates to cloned mammals other than humans such as pigs, horses, sheep, llamas and camels.
[0067]
In a preferred embodiment, an oocyte is obtained using an in vivo protocol, eg, to obtain an oocyte, eg, to obtain an oocyte at a desired phase (eg, end) of the cell cycle.
[0068]
In another aspect, the invention relates to a method of making a non-human transgenic mammal such as a goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel. The method provides, for example, an activated oocyte such as a terminal oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte; functionally enucleating the oocyte; The chromosome genome of the recombinant somatic cell is introduced into a functional enucleated oocyte to obtain a reconstructed embryo; further, for example, a reconstructed embryo is generated by transplanting the reconstructed embryo into a recipient female, thereby transducing Obtaining a transgenic mammal.
[0069]
In a preferred embodiment, the mammal develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammalian animal is a mammalian offspring developed from a reconstructed embryo.
[0070]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell. In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast, such as an embryonic fibroblast. In preferred embodiments, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G₁G like the period₁It is in the period. In another embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period.
[0071]
In a preferred embodiment, the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, an in vivo protocol is used to obtain an oocyte, for example, to obtain an oocyte at a desired phase (eg, end) of the cell cycle, and the oocyte is obtained using an in vivo protocol. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0072]
In a preferred embodiment, the somatic chromosomal genome is introduced into the oocyte by fusion, such as electrofusion, or by direct injection of the nucleus into the oocyte, eg, microinjection.
[0073]
In a preferred embodiment, the somatic cell nucleus includes a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0074]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0075]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome includes a heterologous transgene sequence that is under the control of a promoter, such as a mammal-specific promoter such as a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0076]
In another aspect, the invention functionally enucleates an activated oocyte such as, for example, a terminal oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte) Introducing the chromosomal genome of the cell into an enucleated oocyte to form a reconstructed embryo; further eg, a goat obtained by transplanting the reconstructed embryo into a recipient mammal to generate a reconstructed embryo, The present invention relates to transgenic mammals other than humans such as cows, pigs, horses, sheep, llamas and camels.
[0077]
In a preferred embodiment, an oocyte is obtained using an in vivo protocol, eg, an oocyte is obtained using an in vivo protocol to obtain an oocyte at a desired phase (eg, end) of the cell cycle.
[0078]
In another aspect, the invention functionally enucleates an activated oocyte such as, for example, a terminal oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte) It relates to reconstructed embryos of non-human mammals such as goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel embryos obtained by introducing the chromosomal genome of the cells into enucleated oocytes. In a preferred embodiment, an oocyte is obtained using an in vivo protocol, eg, an oocyte is obtained using an in vivo protocol to obtain an oocyte at a desired phase (eg, end) of the cell cycle.
[0079]
In yet another aspect, the invention relates to a method of making a non-human cloned mammal such as a goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel. The method provides an oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte; functionally enucleates the oocyte; chromosomal genome of the somatic cell functionally enucleated oocyte (genome transfer) To activate the oocyte prior to or simultaneously with the genome transfer) to obtain a reconstructed embryo; transplant the reconstructed embryo into a recipient mammal; generate a reconstructed embryo, and thereby a cloned mammal Including making.
[0080]
In a preferred embodiment, the mammal develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammal is a mammalian offspring developed from a reconstructed embryo.
[0081]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic cell. In another preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast, such as an embryonic fibroblast. In preferred embodiments, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G₁G like the period₁It is in the period. In another preferred embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In another preferred embodiment, the oocyte is an enucleated oocyte.
[0082]
In a preferred embodiment, the oocyte is at metaphase II; the oocyte is at the end; obtaining the oocyte using an in vivo protocol (eg, removing the oocyte at the desired phase (eg, end) of the cell cycle) In order to obtain an oocyte using an in vivo protocol). In another embodiment, the oocyte and the somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and the somatic cell are activated together or the oocyte and the somatic cell are stopped together).
[0083]
In a preferred embodiment, the somatic chromosomal genome is introduced into the oocyte by fusion, such as electrofusion, or by direct injection of the nucleus into the oocyte, eg, microinjection.
[0084]
In another aspect, the invention relates to a method of making a non-human transgenic mammal such as a goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel. The method provides an oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte; functionally enucleating the oocyte; functionally enucleating the chromosomal genome of the recombinant cell Introduced into (activates the oocyte before or simultaneously with the genome introduction) to obtain a reconstructed embryo; generating a reconstructed embryo by transplanting the reconstructed embryo into a recipient mammal; Producing a transgenic mammal.
[0085]
In a preferred embodiment, the mammal develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammal is a mammalian offspring developed from a reconstructed embryo.
[0086]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell. In another preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast, such as an embryonic fibroblast. In preferred embodiments, the somatic cell is a non-resting cell (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell has a G₁G like the period₁It is in the period. In another preferred embodiment, the somatic cell is a resting cell (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In another preferred embodiment, the oocyte is an enucleated oocyte.
[0087]
In a preferred embodiment, the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in metaphase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; eg, an egg in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or end) To remove the mother cell, the oocyte is obtained using an in vivo protocol; the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0088]
In a preferred embodiment, the somatic chromosomal genome is introduced into the oocyte by fusion, such as electrofusion, or by direct injection of the nucleus into the oocyte, eg, microinjection.
[0089]
In a preferred embodiment, the somatic cell nucleus includes a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; any heterologous sequence under the control of a promoter such as a tissue-specific promoter can be used. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic mammal, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen , Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III , Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0090]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0091]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome includes a heterologous transgene sequence that is under the control of a promoter, such as a mammal-specific promoter such as a goat promoter. The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0092]
In another aspect, the present invention functionally enucleates a mammalian oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, and further chromosomal genomes of the transgenic cell are enucleated. The present invention relates to transgenic mammals other than humans, such as goats, cows, pigs, horses, sheep, llamas, and camels, which are produced by activating an oocyte before or simultaneously with introduction into the animal.
[0093]
In yet another aspect, the present invention functionally enucleates a mammalian oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, and further chromosomal genome of the genetically engineered cell. Reconstructed embryos of non-human mammals such as goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel embryos obtained by activating oocytes before or simultaneously with introduction into cells .
[0094]
Also, the present invention may be applied to proteins obtained from non-human mammals (eg, heterologous proteins described herein), such as clones or transgenic mammals (eg, clones or transgenic goats described herein). Including various products.
[0095]
In a preferred embodiment, the product is milk or a protein secreted into milk.
[0096]
In another aspect, the invention relates to a method of providing a protein, such as a human protein. The method provides: a non-human mammal, such as, for example, a transgenic mammal (eg, a transgenic goat described herein); further from that mammal, or from the product of that mammal, such as, for example, milk. Recovering the product: including.
[0097]
In another aspect, the present invention relates to a method for providing a heterologous polypeptide. The method introduces a goat genome into a goat oocyte (preferably a naturally mature terminal oocyte), eg, by introducing the nucleus of a transgenic goat somatic cell, to form a reconstructed embryo; Generating the reconstructed embryo in a goat, for example by transplanting the reconstructed embryo into a recipient goat; and recovering the polypeptide from the goat or the goat offspring.
[0098]
In a preferred embodiment, the goat somatic nucleus is introduced into the goat oocyte, eg, by direct nuclear injection or fusion of somatic cells and oocytes (eg, electrofusion).
[0099]
In a preferred embodiment, the somatic cell is in a non-resting state (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is a pre-critical point G₁G like the period₁It is in the period. In another preferred embodiment, the somatic cell is in a resting state (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell, such as an embryonic fibroblast. Somatic cells can be fibroblasts (eg primary fibroblasts), muscle cells (eg myocytes), neurons, cumulus cells or mammary cells.
[0100]
In a preferred embodiment, the transgene sequence is introduced into a somatic cell; the somatic cell is derived from a cell line such as a primary cell line; the somatic cell is derived from a cell line and the transgene sequence is derived from the somatic cell. Has been introduced.
[0101]
In a preferred embodiment, the oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte.
[0102]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in metaphase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or phase) To remove the cells, an oocyte is obtained using an in vivo protocol; the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0103]
In a preferred embodiment, the goat somatic genome includes a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0104]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0105]
In a preferred embodiment, the chromosomal genome includes a heterologous transgene sequence that is under the control of a promoter, such as a mammal-specific promoter (eg, a goat promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0106]
In a preferred embodiment, the goat somatic nucleus is introduced into the goat oocyte, eg, by direct nuclear injection or fusion of somatic cells and oocytes (eg, electrofusion).
[0107]
In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell. In another preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast, such as an embryonic fibroblast.
[0108]
In a preferred embodiment, the oocyte is a functional enucleated oocyte, ie an enucleated oocyte.
[0109]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in metaphase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase II or phase) To remove the cells, an oocyte is obtained using an in vivo protocol; the oocyte is activated before or simultaneously with the introduction of the genome. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0110]
In a preferred embodiment, the goat somatic genome includes a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0111]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0112]
In a preferred embodiment, the heterologous polypeptide is purified from transgenic goat milk.
[0113]
In a preferred embodiment, the method also includes milking the transgenic goat.
[0114]
In another aspect, the present invention relates to a method for providing a heterologous polypeptide. The method comprises: introducing the genome of a genetically modified goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally matured late oocyte, to obtain a reconstructed embryo, eg, reconstructing an embryo into a recipient female Making a goat by transplanting it into a goat and generating a reconstructed embryo in the goat; and recovering the polypeptide (eg, from the milk of the goat or the goat's progeny).
[0115]
In a preferred embodiment, the goat somatic genome includes a transgene sequence. Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. The protein can be any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene sequence may encode any protein desired to be expressed in the transgenic goat, including but not limited to, alpha-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, Glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, Insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0116]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0117]
In a preferred embodiment, the heterologous polypeptide is purified from transgenic goat milk.
[0118]
In another aspect, the invention relates to a method of making a goat reconstructed embryo. The method includes introducing a goat genome from a goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, thereby forming a reconstructed embryo.
[0119]
In preferred embodiments, the somatic cell is in a non-resting state (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is G₁It is in the period. In another preferred embodiment, the somatic cell is in a resting state (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell such as an embryonic fibroblast. Somatic cells can be fibroblasts (eg primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), neurons, cumulus cells or mammary cells.
[0120]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in terminal phase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase or end) To remove oocytes using in vivo protocols; enucleate the oocytes. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0121]
In another aspect, the invention relates to a goat reconstructed embryo obtained by introducing a genome from a goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte.
[0122]
In another aspect, the present invention relates to a method of making a reconstructed transgenic embryo of a goat. The method comprises introducing a goat genome into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, for example by introducing the nucleus of a genetically modified goat somatic cell, and thereby reconstructed transgenic Forming an embryo.
[0123]
In preferred embodiments, the somatic cell is in a non-resting state (eg, the cell is activated), eg, the somatic cell is G₁It is in the period. In another preferred embodiment, the somatic cell is in a resting state (eg, the cell is arrested), eg, the somatic cell is G₀It is in the period. In a preferred embodiment, the somatic cell is an embryonic somatic cell such as an embryonic fibroblast. Somatic cells can be fibroblasts (eg primary fibroblasts), muscle cells (myocytes), neurons, cumulus cells or mammary cells.
[0124]
In a preferred embodiment: the oocyte is in metaphase II; the oocyte is in terminal phase; the oocyte is obtained using an in vivo protocol; and the oocyte in the desired phase of the cell cycle (eg, metaphase or end) To remove oocytes using in vivo protocols; enucleate the oocytes. In a preferred embodiment, the oocyte and somatic cell are synchronized (eg, the oocyte and somatic cell are activated together or the oocyte and somatic cell are stopped together).
[0125]
In another embodiment, the present invention is obtained by introducing a goat genome into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte, for example by introducing the nucleus of a transgenic goat somatic cell. Reconstructed transgenic embryo of a goat.
[0126]
In another aspect, the invention relates to a method for providing a herd of goats. The method comprises introducing a goat genome from a goat somatic cell into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte (eg, by introducing a nucleus) to form a reconstructed embryo, A first goat is created by generating a reconstructed embryo in the first goat; a goat genome from a goat somatic cell is introduced into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte (eg, A second goat is created by forming a reconstructed embryo (by introducing the nucleus) and then generating the reconstructed embryo in a second goat; the genomes of the first and second goats are the same Including providing a herd of goats, derived from an animal, the same genotype or the same cell line.
[0127]
In a preferred embodiment, a first goat or its offspring is bred with a second goat or its offspring.
[0128]
In another embodiment, the present invention provides for reconstructed embryos by introducing a goat genome from a goat somatic cell (eg, by introducing a nucleus) into a goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte. The first goat is made by forming and developing the reconstructed embryo in the first goat; the goat genome from the goat somatic cell is introduced into the goat oocyte, preferably a naturally mature terminal oocyte Introducing (eg, by introducing a nucleus) to form a reconstructed embryo, and generating the reconstructed embryo in a second goat to create a second goat; It relates to a group of goats obtained by having the goat genome derived from the same animal, the same genotype or the same cell line.
[0129]
In a preferred embodiment, the goat herd is obtained by any of the methods described herein.
[0130]
In another aspect, the present invention relates to embryonic or fetal somatic cells.
[0131]
In a preferred embodiment, the cell is a purified embryonic or fetal somatic cell.
[0132]
In preferred embodiments, the cells are in a preparation of embryonic or fetal somatic cells.
[0133]
In preferred embodiments, the cells can be used to create embryonic or fetal somatic cell lines.
[0134]
In a preferred embodiment, the cell includes a transgene (eg, a transgene encoding a polypeptide). Transgene sequences are: integrated into the genome; heterologous transgenes such as human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; sequences encoding proteins such as human proteins A heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. In preferred embodiments, the transgene encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Transgenes include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, It encodes lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0135]
In a preferred embodiment, the transgene is under the control of a promoter (eg, a heterologous or goat promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0136]
In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast. Fibroblasts can be primary fibroblasts or primary derived fibroblasts.
[0137]
In a preferred embodiment, cells are obtained from goats (eg, fetal goats) derived from germ cells obtained from a transgenic mammal. Germ cells can be sperm from transgenic goats.
[0138]
In a preferred embodiment, the cell is an embryonic or fetal genetically modified goat somatic cell, such as a purified embryonic or fetal genetically modified goat somatic cell.
[0139]
In a preferred embodiment, the cells are part of a preparation of embryonic or fetal genetically modified goat somatic cells. In another preferred embodiment, the cells are used to create an embryonic or fetal genetically modified goat somatic cell line.
[0140]
In a preferred embodiment, a genetically modified cell includes a nucleic acid such as a nucleic acid encoding a polypeptide introduced into the cell. Nucleic acids are: integrated into the genome; heterologous nucleic acids such as heterologous nucleic acids including, for example, human sequences; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of the goat gene; sequences encoding proteins such as human proteins; It can be any heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The nucleic acid sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide. In preferred embodiments, the nucleic acid encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Nucleic acids include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin , Lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin may be encoded.
[0141]
In preferred embodiments, the nucleic acid is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0142]
In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast. Fibroblasts can be primary fibroblasts or primary derived fibroblasts.
[0143]
In a preferred embodiment, cells are obtained from goats derived from germ cells obtained from transgenic goats (eg, fetal goats). Germ cells can be sperm or oocytes from a transgenic goat.
[0144]
In a preferred embodiment, the cells are used as a source of genetic material for nuclear transfer.
[0145]
In another aspect, the present invention provides embryonic or fetal goat somatic cells, cell preparations, embryonic, for example as described therein, placed in a container (eg, a gas or liquid sealed container). Or relates to a fetal goat somatic cell line.
[0146]
In another aspect, the present invention relates to frozen (eg, cryopreserved), eg, embryonic or fetal goat somatic cells, cell preparations, embryonic or fetal, as described herein Relates to goat somatic cell lines.
[0147]
In another aspect, the present invention relates to a kit. The kit includes a cell container as described therein. In a preferred embodiment, the kit further comprises instructions for use to prepare the transgenic animal.
[0148]
In a preferred embodiment, the kit further comprises a recipient oocyte (eg, an enucleated oocyte).
[0149]
In another aspect, the invention relates to a method for providing a component for making a clone or transgenic goat. The method includes obtaining a frozen sample of cells, eg, as described herein, and further thawing the sample.
[0150]
In another aspect, the invention relates to a method of preparing an embryonic or fetal goat somatic cell line. The method includes obtaining somatic cells from embryonic or fetal goats; further culturing the cells, eg, in a suitable medium, to obtain a somatic cell line.
[0151]
In a preferred embodiment, the cell line is a genetically modified cell line, eg, the cell includes a transgene. Transgenes are: integrated into the somatic cell genome; heterologous transgenes such as heterologous transgenes including human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; such as human proteins It can be any of: a protein coding sequence; a heterologous promoter; a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0152]
In preferred embodiments, the transgene encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Transgenes include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, It encodes lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0153]
In a preferred embodiment, the transgene is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0154]
In a preferred embodiment, a genetically modified cell includes a nucleic acid such as a nucleic acid encoding a polypeptide introduced into the cell. Nucleic acids are: integrated into the genome; heterologous nucleic acids such as heterologous nucleic acids including, for example, human sequences; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of the goat gene; sequences encoding proteins such as human proteins; It can be any heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The nucleic acid sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0155]
In preferred embodiments, the nucleic acid encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Nucleic acids include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin , Lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin may be encoded.
[0156]
In preferred embodiments, the nucleic acid is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0157]
In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast. Fibroblasts can be primary fibroblasts or primary derived fibroblasts.
[0158]
In a preferred embodiment, cells are obtained from goats derived from germ cells obtained from transgenic goats (eg, embryonic or fetal goats). Germ cells can be sperm or oocytes from a transgenic goat.
[0159]
In a preferred embodiment, the cells are used as a source of genetic material for nuclear transfer.
[0160]
In another aspect, the present invention relates to a method for preparing an embryonic or fetal goat somatic cell line. The method involves fertilizing a female recipient with goat semen; obtaining a transgenic embryo from the recipient; obtaining a somatic cell from the embryo; and obtaining a somatic cell line, eg, in a suitable medium. Culturing the cell.
[0161]
In a preferred embodiment, the semen is derived from a transgenic goat.
[0162]
In a preferred embodiment, the cell line is a genetically modified cell line, eg, the cell includes a transgene. Transgenes are: integrated into the somatic cell genome; heterologous transgenes such as heterologous transgenes including human transgenes; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of goat genes; such as human proteins It can be any of: a protein coding sequence; a heterologous promoter; a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0163]
In preferred embodiments, the transgene encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Transgenes include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, It encodes lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0164]
In a preferred embodiment, the transgene is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0165]
In a preferred embodiment, a genetically modified cell includes a nucleic acid such as a nucleic acid encoding a polypeptide introduced into the cell. Nucleic acids are: integrated into the genome; heterologous nucleic acids such as heterologous nucleic acids including, for example, human sequences; knockout, knock-in or other events that disrupt expression of the goat gene; sequences encoding proteins such as human proteins; It can be any heterologous promoter; for example, a heterologous sequence under the control of a promoter such as a goat promoter. The nucleic acid sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0166]
In preferred embodiments, the nucleic acid encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Nucleic acids include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin , Lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin may be encoded.
[0167]
In preferred embodiments, the nucleic acid is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0168]
In a preferred embodiment, the somatic cell is a fibroblast. Fibroblasts can be primary fibroblasts or primary derived fibroblasts.
[0169]
In a preferred embodiment, the cells are used as a source of genetic material for nuclear transfer.
[0170]
The present invention is also based in part on the discovery that reconstructed embryos transplanted into a recipient mammal at the 2-4 cell stage of embryogenesis can develop in a cloned mammal. The mammal can be an embryo, fetus or postnatal mammal (eg, an adult mammal).
[0171]
Accordingly, in certain embodiments, the invention relates to a method of providing a non-human mammal, such as a cloned mammal (eg, goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel). The method involves culturing a mammalian reconstructed embryo, such as a reconstructed embryo whose genome is derived from a somatic cell, until it reaches the 2-8 cell stage, and the 2-8 cell stage embryo is Transplanting to a mammal, and further generating the reconstructed embryo in the mammal to produce the mammal.
[0172]
In a preferred embodiment, the mammal develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammal is a mammalian offspring developed from a reconstructed embryo.
[0173]
In a preferred embodiment, the reconstructed embryo continues to be cultured until the embryo is in the 2-8, 2-6, 2-4 cell stage of embryogenesis.
[0174]
In a preferred embodiment, the genome of the reconstructed embryo is derived from: a somatic cell such as, for example, a fibroblast or an epithelial cell; a genetically modified somatic cell such as, for example, a somatic cell comprising a transgene sequence.
[0175]
In a preferred embodiment, the invention provides that the mammal developed from the reconstructed embryo is a second mammal (the second mammal is developing from the reconstructed embryo or a goat offspring developed from the reconstructed embryo; or The second goat develops from a reconstructed embryo formed from genetic material derived from the same animal, animal of the same genotype or from the same cell line that supplied the first goat's genetic material, or develops from a reconstructed embryo And mating with a goat descendant). In a preferred embodiment, a first transgenic mammal developed from a reconstructed embryo is crossed with a second transgenic mammal developed from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic mammal. There is no problem.
[0176]
In preferred embodiments, the mammal is a male mammal. In other preferred embodiments, the mammal is a female mammal. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat.
[0177]
In a preferred embodiment, a product such as a protein (eg a recombinant protein such as a human protein) is recovered from the mammal; a product such as a protein (eg a human protein) is collected from the mammal's milk, urine, hair, It can be recovered from blood, skin, or meat.
[0178]
In preferred embodiments, the mammal is embryo, fetus or post-natal (eg, adult).
[0179]
In a preferred embodiment, the genome of the reconstructed embryo is derived from a genetically modified cell, such as a transgenic cell or a cell into which a nucleic acid has been introduced.
[0180]
In another aspect, the present invention relates to a method of providing a non-human mammal such as a transgenic mammal (eg, goat, cow, pig, horse, sheep, llama, camel). The method involves culturing a mammalian reconstructed embryo (eg, a reconstructed embryo whose genome is derived from a recombinant cell) until it reaches the 2-8 cell stage, and the 2-8 cell stage embryo is reciped. Transplanting to the mammal of the ent, and further generating the reconstructed embryo in the mammal to produce the mammal.
[0181]
In a preferred embodiment, the mammal develops from a reconstructed embryo. In another embodiment, the mammal is a mammalian offspring developed from a reconstructed embryo.
[0182]
In a preferred embodiment, the reconstructed embryo continues to be cultured until the embryo is in the 2-8, 2-6, 2-4 cell stage of embryogenesis.
[0183]
In a preferred embodiment, the invention provides that the mammal developed from the reconstructed embryo is a second mammal (the second mammal is developing from the reconstructed embryo or a goat offspring developed from the reconstructed embryo; or The second goat develops from a reconstructed embryo formed from genetic material derived from the same animal, the same genotype animal, or the same cell line that supplied the first goat's genetic material. And mating with a descendant of the goat that has occurred. In a preferred embodiment, a first transgenic mammal developed from a reconstructed embryo is crossed with a second transgenic mammal developed from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic mammal. There is no problem.
[0184]
In preferred embodiments, the mammal is a male mammal. In other preferred embodiments, the mammal is a female mammal. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat.
[0185]
In a preferred embodiment, a product such as a protein (eg a recombinant protein such as a human protein) is recovered from the mammal; a product such as a protein (eg a human protein) is collected from the mammal's milk, urine, hair, It can be recovered from blood, skin, or meat.
[0186]
In a preferred embodiment, the transgenic cell includes a transgene sequence. Transgene sequences include: heterologous transgenes such as human transgenes; knockouts, knock-ins or other events that disrupt the expression of mammalian genes; sequences encoding proteins such as human proteins; heterologous promoters; It can be any heterologous sequence under the control of a promoter, such as a promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0187]
In preferred embodiments, the transgene sequence encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene can be any protein that is desired to be expressed in the transgenic animal, such as α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin , Myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin Can be coded.
[0188]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0189]
In preferred embodiments, the transgene sequence is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0190]
In a preferred embodiment, the nucleic acid can be introduced into the genome of the genetically modified cell. Nucleic acids include: heterologous nucleic acids such as heterologous nucleic acids including human sequences; knockouts, knock-ins or other events that disrupt the expression of mammalian genes; sequences encoding proteins such as human proteins; heterologous promoters; Any heterologous sequence under the control of a promoter, such as a heterologous or heterologous promoter. The nucleic acid sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0191]
In preferred embodiments, the nucleic acid encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Nucleic acids include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin , Lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin may be encoded.
[0192]
In a preferred embodiment, the nucleic acid sequence encodes a human protein.
[0193]
In preferred embodiments, the nucleic acid is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0194]
In another aspect, the invention relates to a method of making a cloned goat. The method continues to cultivate goat reconstructed embryos (eg, reconstructed embryos whose genome is derived from goat somatic cells) until they reach the 2-8 cell stage, and the 2-8 cell stage embryos become recipient goats. Transplanting and further developing the reconstructed embryo into a goat to make a goat.
[0195]
In preferred embodiments, the goat is embryo, fetus or postnatal (eg, adult).
[0196]
In a preferred embodiment, the goat is generated from a reconstructed embryo. In another embodiment, the goat is a goat offspring developed from a reconstructed embryo.
[0197]
In a preferred embodiment, the reconstructed embryo continues to be cultured until the embryo is in the 2-8, 2-6, 2-4 cell stage of embryogenesis.
[0198]
In a preferred embodiment, the genome of the reconstructed embryo is derived from: goat somatic cells such as fibroblasts or epithelial cells; genetically modified goat somatic cells, wherein the goat somatic genome is the somatic genome. A transgene sequence or nucleic acid introduced in
[0199]
In a preferred embodiment, the present invention relates to a goat developed from a reconstructed embryo as a second goat (the second goat is a progeny of a goat that has developed from or is regenerated from a reconstructed embryo; or A goat develops from or is generated from a reconstructed embryo formed from the same animal, animal of the same genotype, or genetic material derived from the same cell line as the genetic material of the first goat Further mating). In a preferred embodiment, a first transgenic goat generated from a reconstructed embryo can be crossed with a second transgenic goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic goat.
[0200]
In a preferred embodiment, the goat is a male goat. In another preferred embodiment, the goat is a female goat. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat.
[0201]
In a preferred embodiment, a product such as a protein (eg a recombinant protein such as a human protein) is recovered from a goat; for example a product such as a protein (eg a human protein) is recovered from goat milk, urine, hair, blood, It can be recovered from skin or meat.
[0202]
In another aspect, the present invention relates to a method of making a transgenic goat. The method continues to culture a goat reconstructed embryo (eg, a reconstructed embryo whose genome is derived from a recombinant goat somatic cell) until the 2-8 cell stage, and the 2-8 cell stage embryo Transplanting to a goat, and further developing the reconstructed embryo into a goat to produce a transgenic goat.
[0203]
In preferred embodiments, the goat is embryo, fetus or postnatal (eg, adult).
[0204]
In a preferred embodiment, the goat is generated from a reconstructed embryo. In another embodiment, the goat is a goat offspring developed from a reconstructed embryo.
[0205]
In a preferred embodiment, the reconstructed embryo continues to be cultured until the embryo is in the 2-8, 2-6, 2-4 cell stage of embryogenesis.
[0206]
In a preferred embodiment, the genome of the reconstructed embryo is derived from: a somatic cell such as a fibroblast or an epithelial cell.
[0207]
In a preferred embodiment, the present invention relates to a goat developed from a reconstructed embryo as a second goat (the second goat is a progeny of a goat that has developed from or is regenerated from a reconstructed embryo; or A goat develops from or is generated from a reconstructed embryo formed from the same animal, animal of the same genotype, or genetic material derived from the same cell line as the genetic material of the first goat Further mating). In a preferred embodiment, a first transgenic goat generated from a reconstructed embryo can be crossed with a second transgenic goat generated from a reconstructed embryo having a transgene different from the first transgenic goat.
[0208]
In a preferred embodiment, the goat is a male goat. In another preferred embodiment, the goat is a female goat. A female goat can be induced to lactate and milk can be obtained from the female goat.
[0209]
In a preferred embodiment, a product such as a protein (eg a recombinant protein such as a human protein) is recovered from a goat; for example a product such as a protein (eg a human protein) is recovered from goat milk, urine, hair, blood, It can be recovered from skin or meat.
[0210]
In a preferred embodiment, the transgenic cell includes a transgene sequence. Transgene sequences include: heterologous transgenes such as human transgenes; knockouts, knock-ins or other events that disrupt the expression of mammalian genes; sequences encoding proteins such as human proteins; heterologous promoters; Or any heterologous sequence under the control of a promoter, such as a heterologous promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0211]
In preferred embodiments, the transgene sequence encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. The transgene can be any protein that is desired to be expressed in the transgenic animal, such as α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin , Myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin Can be coded.
[0212]
In a preferred embodiment, the transgene sequence encodes a human protein.
[0213]
In preferred embodiments, the transgene sequence is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0214]
In a preferred embodiment, the nucleic acid can be introduced into the genome of the genetically modified cell. Nucleic acid sequences include: heterologous transgenes such as human transgenes; knockouts, knock-ins or other events that disrupt the expression of mammalian genes; sequences encoding proteins such as human proteins; heterologous promoters; Or any heterologous sequence under the control of a promoter, such as a heterologous promoter. The transgene sequence can encode any product of interest, such as a protein, polypeptide or peptide.
[0215]
In preferred embodiments, the nucleic acid encodes any of hormones, immunoglobulins, serum proteins, and enzymes. Nucleic acids include, for example, α-1 proteinase inhibitor, alkaline phosphatase, angiogenin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human serum albumin, myelin basic protein, proinsulin, soluble CD4, lactoferrin , Lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, erythropoietin, tissue plasminogen activator, human growth factor, antithrombin III, insulin, prolactin, and α-antitrypsin.
[0216]
In a preferred embodiment, the nucleic acid sequence encodes a human protein.
[0217]
In preferred embodiments, the nucleic acid sequence is under the control of a promoter (eg, a goat or heterologous promoter). The promoter can be a tissue specific promoter. Tissue-specific promoters can be: milk specific promoters; blood specific promoters; muscle specific promoters; nerve specific promoters; skin specific promoters; hair specific promoters; and urine specific promoters. . The milk-specific promoter can be any of: a casein promoter; a β-lactoglobulin promoter; a whey acid protein promoter; and a lactalbumin promoter.
[0218]
In another aspect, the present invention relates to a kit. The kit includes reconstructed embryos that are in the 2 to 8 cell stage. In a preferred embodiment, the kit further comprises instructions for making a mammal such as an embryo, fetus or post-natal mammal.
[0219]
In another aspect, the invention relates to a kit comprising a late embryo such as, for example, a post-8 cell stage embryo or a fetus obtained, for example, by the methods described herein.
[0220]
As used herein, the term “functional enucleation” refers to a process that renders the endogenous genome of a cell, such as an oocyte, incapable of functioning (eg, incapable of replication and / or DNA synthesis). Such an oocyte is referred to herein as a “functional enucleated oocyte”.
[0221]
The terms protein, polypeptide and peptide are used interchangeably herein.
[0222]
As used herein, the term “transgene sequence” refers to a nucleic acid sequence (eg, encoding one or more human proteins) that has been introduced into a cell by technology. The transgene sequence, also referred to herein as a transgene, is part of the genome of an animal that develops in whole or in part from its cells. In an embodiment of the invention, the transgene sequence is integrated into the chromosomal genome. If the transgene sequence is integrated into the genome, the effect of the insertion simply results in a change in the nucleic acid sequence of the genome into which the sequence is inserted. The transgene sequence can be partially or completely different in species, i.e., the transgene sequence or part thereof can be from a different species than the cell into which it is introduced. Where the transgene sequence is homologous (in the sense of the sequence or in the sense that the species are the same) as the endogenous gene of the cell into which it is introduced, preferably the transgene sequence has one or more of the following characteristics: To change the sequence of the cell genome in which it is inserted (eg, inserted at a position different from the position of the endogenous gene, or the insertion results in a change in the sequence of the endogenous gene) Designed for insertion into the cell genome, or inserted into the cell genome; including mutations such as mutations resulting in misexpression of the transgene sequence; as an effect of the insertion, it is inserted For example, the insertion results in a knockout of the gene into which it is inserted. The transgene sequence is required for expression of one or more transcriptional regulatory sequences and the desired level or pattern of the selected nucleic acid, such as an intron, and is operably linked to the selected nucleic acid. And any other nucleic acid sequence. The transgene sequence can include enhancer sequences and / or sequences that allow secretion.
[0223]
The terms “reconstructed embryo”, “reconstructed embryo”, “nuclear transfer unit” and “nuclear transfer embryo” are used interchangeably herein.
[0224]
As used herein, the term “normal goat” refers to a goat that has not developed from a reconstructed embryo.
[0225]
A “naturally derived oocyte” is an oocyte that can reach a selected cell stage (eg, metaphase II or more preferably end stage) by culturing under natural conditions such as in vivo. Called.
[0226]
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following description and from the claims.
[0227]
Detailed Description of the Invention
Source of somatic cell genome
Somatic cell
Somatic cells can provide the genome for making reconstructed embryos in the methods described herein. As used herein, the term “somatic cell” refers to a differentiated cell. The cell can be a somatic cell or a cell associated with a somatic cell lineage. Alternatively, any of the methods and animals described herein may utilize diploid stem cells that are the source of germ cells for the purpose of providing a genome for generating reconstructed embryos.
[0228]
Somatic cells can be derived from animals or cultured cells. If somatic cells are obtained from an animal, the animal can be at any stage of development (eg, embryo, fetus or adult). Embryonic cells are preferred. Embryonic cells can be embryonic stem cells as well as embryonic cells associated with somatic cell lineages. Such cells are obtained from embryonic endoderm, mesoderm or ectoderm. Preferably, the embryonic cell is associated with a somatic cell lineage. Embryonic cells associated with somatic cell lines refer to cells isolated after day 10 of embryogenesis. However, cells can be obtained prior to day 10 of embryogenesis. When cell lines are used as the source of chromosomal genomes, primary cells are preferred. As used herein, the term “primary cell line” includes primary cell lines as well as primary derived cell lines.
[0229]
Suitable somatic cells include fibroblasts (eg embryonic primary fibroblasts), muscle cells (eg myocytes), cumulus cells, nerve cells and mammary cells. Other suitable cells include hepatocytes and pancreatic islets of Langerhans. Preferably, the somatic cell is an embryonic somatic cell isolated, for example, after day 10 of embryogenesis. For example, to make a cloned mammal, the somatic genome can be a natural genome, or, for example, to create a transgenic cloned mammal, the genome has been genetically engineered to include a transgene sequence. There is no problem.
[0230]
For example, by separating the tissue by mechanical (eg cutting, shredding) or enzymatic means (eg trypsinization) to obtain a cell suspension and further culturing the cells until a confluent monolayer is obtained. Cells can be obtained. Thereafter, somatic cells may be collected and prepared for cryopreservation or maintained as a stock culture. The isolation of goat somatic cells (eg fibroblasts) is described herein.
[0231]
Somatic cells can be resting or non-resting somatic cells. “Non-resting” as described herein refers to the cell being in the cell division cycle. The cell division cycle has four different phases G₁, S, G₂And M. The first event in the cell cycle called the critical point is G₁Occurs during the period. The “critical point” used here is the initial G of the cell cycle before it ensures that the cell goes through the cell cycle.₁Refers to the period. For example, if the cell is G₁The cells are considered to be before the critical point until 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 hours after entering the phase. A determination is made at the critical point whether the cell enters the next cell cycle. When the cell passes the critical point, the cell₁Pass the rest of the phase (ie before the DNA synthesis phase). S phase is the DNA synthesis phase, then G is the phase between DNA synthesis and division₂The period continues. Fission occurs during the M phase. If the cell does not enter the next cell cycle at the critical point, the cell enters a resting state. In addition, the cells exit the cell cycle and become quiescent. "Resting" cells are G₀Also referred to as a phase cell, it refers to a cell that does not belong to any of the four phases of the cell cycle. Preferably, the somatic cell is G₀G in the phase or in the cell division cycle₁It is in the period.
[0232]
A specific phase of the cell cycle (eg G₀Or G₁Donor somatic cells in the (phase) allow synchronization of the oocyte and the somatic cell genome. G₀Or G₁Reconstruction of oocytes in metaphase II by introduction of somatic cell nuclei in phase (eg, by simultaneous activation and fusion) can mimic events that occur during fertilization. As another illustration, pre-critical point G, e.g., by simultaneous activation and fusion₁An oocyte in terminal II fused with the genome of a somatic cell in phase provides synchronization of the cell cycle between the oocyte and the donor nucleus.
[0233]
Methods for determining in which phase of a cell cycle a cell is known. For example, there are various markers at different phases of the cell cycle, as described in the examples below. G as such a marker₁Cyclin D1, 2, 3 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) for phase, and BrDu for detecting DNA synthesis activity. Furthermore, by culturing the cells in a serum-deprived medium,₀Cells can be induced to enter phase. Alternatively, by serum activation, G₀Cells in phase are called cell cycle (ie G₁Can be guided to enter.
[0234]
For example, donor cells can be obtained from an embryo, fetus or adult mammal, or from a culture system such as a synchronized culture system. For example, donor cells from a culture system comprising at least a majority (eg 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% or more) of donor cells in a particular phase of the cell division cycle. You can select it.
[0235]
Sources of transgenic cells:
Transgenic mammal
Methods for making non-human transgenic mammals that can be used as a source of somatic cells in the present invention are known in the art. Such methods include introducing a DNA construct into a mammalian germline to create a transgenic animal. For example, one or more copies of the DNA construct can be integrated into the genome of a mammalian embryo by standard transgenic techniques.
[0236]
Goats are a preferred source of genetically modified cells, but other non-human mammals can be used. Preferred non-human mammals are ruminants such as cows, sheep, camels or goats. For example, goats of Swiss origin such as goats of the Alps, Saanen and Toggenburg strains are useful in the methods described herein. Other examples of preferred non-human animals include bulls, horses, llamas and pigs. Mammals used as a source of genetically modified cells will depend on the transgenic mammal to be obtained by the methods of the invention (eg, introducing a goat genome into a functional enucleated oocyte of a goat). I will.
[0237]
Preferably, the somatic cells used in the present invention are obtained from a transgenic goat. Methods for making transgenic goats are known in the art. For example, transgenes can be introduced into goat germ cells by microinjection (see, eg, Ebert et al. (1994) Bio / Technology 12: 699 incorporated herein by reference).
[0238]
By introducing the transgene into the germ cells of non-human animals, other non-human transgenic animals can be made that can be used as a source of genetically modified cells. To introduce the transgene, target embryo cells at various developmental stages can be used. Different methods are used depending on the stage of development of the target embryo cell. The particular strain of any animal used to practice the invention has good general health, good embryo yield, good pronuclear visibility in the embryo, and reproductive fitness Is selected based on what is good. Furthermore, the haplotype is an important factor.
[0239]
Nucleic acid introduced cell lines
For example, a recombinant cell for use in the present invention may be obtained from a cell line into which a nucleic acid of interest such as a nucleic acid encoding a protein has been introduced.
[0240]
The term “transfection” and “transformation” used herein may introduce a nucleic acid construct into a cell by conventional transformation or transfection techniques, and introduce a transgene sequence into a host cell. And various techniques for the preparation, and include calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation method, DEAE-dextran method, lipofection, electroporation and the like. Furthermore, as described below, a biological vector such as a virus vector may be used. Suitable methods for transforming or transfecting hosts can be found in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), and other appropriate laboratory manuals.
[0241]
Two useful methods are electroporation and lipofection. A simple illustration of each method is given below.
[0242]
The following protocol can be used to stably introduce a DNA construct into a donor somatic cell line by electroporation: about 4 × 10 somatic cells such as fibroblasts (eg embryonic fibroblasts).⁶Resuspension in PBS at a concentration of cells / ml; linear DNA (50 μg) is added to the cell suspension (0.5 ml) and the suspension is added to a 0.4 cm electrode gap cuvette (Biorad). Perform electroporation using a Biorad Gene Pulser electroporator (330 mA pulse with 25 mA, 1000 microfarads and infinite resistance); if the DNA construct includes a neomycin resistance gene for selection, After incubation with 350 μg / ml G418 (GibcoBRL) for 15 days, neomycin resistant clones are selected.
[0243]
A DNA construct can be stably introduced into donor somatic cells by lipofection using the following protocol: about 2 × 10^FiveCells in a 3.5 cmiameter and then LipfectAMINE^TM(GibcoBRL) is used to transfect linear DNA (2 μg); 48 hours after transfection, cells are diluted 1: 1000 and 1: 5000 and the DNA construct includes a neomycin resistance gene for selection. If so, G418 is added to a final concentration of 0.35 mg / ml; neomycin resistant clones are isolated and further propagated for cryopreservation and nuclear transfer.
[0244]
Tissue-specific expression of proteins
It is often desirable to express a protein, such as a heterologous protein, in a particular tissue or body fluid (eg, milk) of a transgenic mammal. These proteins can be recovered from tissues or body fluids in which the heterologous proteins are expressed. For example, it is often desirable to express a heterologous protein in milk. A method for producing a heterologous protein under the control of a milk-specific promoter is described below. In addition, other tissue specific promoters and other regulatory elements (eg, signal sequences and sequences that enhance secretion of non-secreted proteins) are described below.
[0245]
Milk specific promoter
Useful transcriptional promoters are those that are preferably activated in mammalian epithelial cells and include casein, β-lactoglobulin (Clark et al., (1989) Bio / Technology 7: 487-492), whey acid protein ( Gordonet al. (1987) Bio / Technology 5: 1183-1187) and lactalbumin (Soulier et al., (1992) FEBS Letts. 297: 13) have promoters that control genes encoding milk proteins. Can be mentioned. The casein promoter can be derived from any mammalian alpha, beta, gamma or kappa casein gene; the preferred promoter is derived from the goat beta casein gene (DiTullio, (1992) Bio / Technology 10: 74-77) . Milk specific protein promoters or promoters that are specifically activated in mammary gland tissue can be derived from cDNA or genomic sequences. Preferably, it is derived from the genome.
[0246]
DNA sequence information of the mammary gland specific genes listed above in one or more and often in some organisms is available. For example, Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (rat α-lactalbumin); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (rat WAP) Junes et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (rat β-casein); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (rat γ -Casein); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (human α-lactalbumin); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (bovine αs1 and κ casein cDNA); Gorodetsky et al ., Gene 66, 87-96 (1988) (bovine beta casein); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (bovine kappa casein); Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (bovine αS2 casein); Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (bovine β-lactoglobulin); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) See shi-lactalbumin). The structure and function of various milk protein genes are described in Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993), all of which are incorporated by reference for all purposes. If additional flanking sequences are useful for optimizing the expression of heterologous proteins, such sequences can be cloned using existing sequences as probes. By screening libraries from such organisms using cognate nucleotide sequences known as probes or antibodies to cognate proteins, mammary gland specific control sequences from different organisms can be obtained.
[0247]
Signal sequence
Useful signal sequences are milk-specific signal sequences or other signal sequences that result in secretion of eukaryotic or prokaryotic proteins. Preferably, the signal sequence is selected from milk specific signal sequences, ie derived from a gene encoding a product that is secreted into milk. Most preferably, the milk-specific signal sequence is associated with the milk-specific promoter (described below) used in the DNA construct. The size of the signal sequence is not critical. All that is required is that the sequence be of sufficient size to provide for secretion of the desired recombinant protein, eg, in mammary tissue. For example, signal sequences from genes encoding casein such as α, β, γ or κ casein, β lactoglobulin, whey acid protein and lactalbumin may be used. A preferred signal sequence is the goat β-casein signal sequence.
[0248]
For example, signal sequences from other secreted proteins such as proteins secreted by kidney cells, pancreatic cells or hepatocytes may be used. Preferably, the signal sequence results in the secretion of the protein, for example in urine or blood.
[0249]
Amino terminal region of secreted protein
The non-secreted protein can be modified in such a way that the non-secreted protein is secreted (eg, by inserting all or part of the coding sequence of the normally secreted protein into the protein to be secreted). Absent. Preferably, the entire sequence of a normally secreted protein is not included in the protein sequence, but only a portion sufficient to effect secretion of the protein at the amino terminus of the normally secreted protein. For example, a normally secreted protein is fused (usually at its amino terminus) to the amino terminal portion of a normally secreted protein.
[0250]
In one embodiment, the normally secreted protein is a protein that is normally secreted into milk. Such proteins include proteins secreted by mammary epithelial cells, milk proteins such as casein, lactoglobulin, whey acid protein, and lactalbumin. Casein proteins include any mammalian alpha, beta, gamma or kappa casein gene. A preferred protein is β-casein, such as goat β-casein. The sequence encoding the secreted protein can be derived from either cDNA or genomic sequences. Preferably, the sequence is derived from the genome and includes one or more introns.
[0251]
Other tissue specific promoters
Other tissue specific promoters that provide expression in specific tissues may be used. A tissue-specific promoter is a promoter that is more strongly expressed in a particular tissue than in other tissues. Tissue specific promoters are often expressed substantially only in specific tissues.
[0252]
Tissue specific promoters that can be used: nerve specific promoters (eg, nestin, Wnt-1, Pax-1, Engrailed-1, Engrailed-2, Sonic hedgehog); liver specific promoters (eg, albumin, alpha-1 antitrypsin) Muscle specific promoters (eg myogenin, actin, MyoD, myosin); oocyte specific promoters (eg ZP1, ZP2, ZP3); testis specific promoters (eg protamine, fertilin, paired complex protein-1) blood Specific promoters (eg globulin, GATA-1, porphobilinogen deaminase); lung specific promoters (eg surfactant protein C); skin or hair specific promoters (eg keratin, elastin); endothelium specific promoters (eg Tie-1, Tie-2); and bone specific promoters (eg BMP).
[0253]
Furthermore, a general promoter may be used for expression in some tissues. Common promoters include β-actin, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A, and Jun-B.
[0254]
DNA construct
Promoters for specific tissues such as mammary epithelial cells (eg casein promoter, eg goat β casein promoter), milk specific signal sequences (eg casein signal sequence, eg β casein signal sequence), and DNA encoding heterologous proteins A cassette encoding a heterologous protein can be assembled.
[0255]
The construct may also include a 3 'untranslated region downstream of the DNA sequence encoding the non-secreted protein. Such a region stabilizes the RNA transcription of the expression system and thus increases the yield of the desired protein from the expression system. A 3 'untranslated region useful in constructs for use in the present invention is a sequence that provides a poly A signal. Such sequences can be derived from, for example, the SV40 small t antigen, the casein 3 'untranslated region or other untranslated regions well known in the art. In one embodiment, the 3 'untranslated region is derived from a milk specific protein. The length of the 3 'untranslated region is not critical, but its stabilizing effect on poly A transcription may be important for stabilizing the RNA of the expressed sequence.
[0256]
Optionally, the construct includes a 5 'untranslated region between the promoter and the DNA sequence encoding the signal sequence. Such untranslated regions can be derived from the same control region as the promoter, or can be derived from different genes, eg, from other synthetic, semi-synthetic or natural sources. Again, the specific length is not important, but the untranslated regions will be important to improve the level of expression.
[0257]
The construct also preferably includes about 10%, 20%, 30% or more of the N-terminal coding region of a gene expressed in mammary epithelial cells. For example, the N-terminal coding region can correspond to the promoter used, for example, goat β casein N-terminal coding region.
[0258]
The composition can be prepared using methods known in the art. The construct can be prepared as part of a larger plasmid. Such a preparation allows the cloning and selection of the correct construct in an efficient manner. The construct can be located between convenient restriction enzyme sites on the plasmid so that it can be easily isolated from the remaining plasmid sequences for incorporation into the desired mammal.
[0259]
Heterologous protein
Transgene sequences encoding heterologous proteins can be introduced into germ cells of non-human mammals or transfected into cell lines to provide a source of genetically modified cells as described above.
[0260]
Proteins are complex or multiple binding proteins (eg, homo- or hetero-multiple conjugates, eg, proteins that naturally occur as homo- or hetero-multiple conjugates, eg, homo- or hetero-dimers, trimers or Tetramer). The protein can be a protein that has been processed by removal, for example, cleavage of the N-terminus, C-terminus or internal fragment. Complex proteins can also be expressed in active form. Proteins encoded by sequences that can be introduced into the genome of a mammal such as a goat include glycoproteins, neuropeptides, immunoglobulins, enzymes, peptides and hormones. The protein can be a natural protein or a recombinant protein (eg, a fragment, eg, a fusion protein such as an immunoglobulin fusion protein, or a variant). The protein may be derived from human or non-human. The heterologous protein can be, but is not limited to, a potential therapeutic or diagnostic agent such as: α-1 proteinase inhibitor, α-1 antitrypsin, alkaline phosphatase, angiogenin, antithrombin III , Any blood coagulation factor (factor VIII, factor IX and factor X, etc.), chitinase, erythropoietin, extracellular superoxide dismutase, fibrogen, glucocerebrosidase, glutamate decarboxylase, human growth factor, human serum albumin, immunoglobulin , Insulin, myelin basic protein, proinsulin, prolactin, soluble CD4 or a component or complex thereof, lactoferrin, lactoglobulin, lysozyme, lactalbumin, tissue plasminogen activator, or the like Mutant.
[0261]
Immunoglobulin is a particularly preferred heterologous protein. Examples of immunoglobulins include IgA, IgG, IgE, IgM, chimeric antibodies, humanized antibodies, recombinant antibodies, single chain antibodies and antibody-protein fusions.
[0262]
Some sequence information is available for genes encoding the heterologous proteins listed above in one or more and often in some organisms. For example, Long et al. (1984) Biochem. 23 (21): 4828-4837 (α-1 antitrypsin); Mitchell et al. (1986) Prot. Natl. Acad. Sci USA 83: 7182-7186 (alkaline phosphatase) Schneider et al. (1988) EMBO J. 7 (13): 4151-4156 (angiogenin); Bock et al. (1988) Biochem. 27 (16): 6171-6178 (antithrombin III); Olds et al. (1991) Br. J. Haematol. 78 (3): 408-413 (antithrombin III); Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (22): 7580-7584 ( Erythropoietin); US Pat. No. 5,614,184 (erythropoietin); Horowitz et al. (1989) Genomics 4 (1): 87-96 (glucocerebrosidase); Kelly et al. (1992) Ann. Hum. Genet 56 (3): 255-265 (glutamate decarboxylase); US Pat. No. 5,707,828 (human serum albumin); US Pat. No. 5,652,352 (human serum albumin); Lawn et al. (1981) Nucleic Acid Res. 9 ( 22): 6103-6114 (human serum albumin Kamholz et al. (1986) Prot. Natl. Acad. Sci. USA 83 (13): 4962-4966 (myelin basic protein); Hiraoka et al. (1991) Mol. Cell Endocrinol. 75 (1): 71-80 (prolactin); US Pat. No. 5,571,896 (lactoferrin); Pennica et al. (1983) Nature 301 (5897): 214-221 (tissue plasminogen activator); Sarafanov et al. (1995) Mol. See Biol. 29: 161-165, the contents of which are incorporated herein by reference.
[0263]
Oocyte
Oocytes for use in the present invention include oocytes that are in metaphase II metaphase (eg, oocytes that are arrested in metaphase II) and at the end of meiosis (eg, end I or end II). One oocyte is mentioned. Oocytes in metaphase II have one polar body, while oocytes in terminal phase are identified based on the presence of a second polar body membrane protrusion until the formation of the second polar body Is done. Furthermore, based on biochemical and / or developmental characteristics, oocytes in metaphase II can be distinguished from oocytes in metaphase II. For example, metaphase II oocytes are in a quiescent state, while terminal oocytes are in an activated state. Preferably, the oocyte is a goat oocyte.
[0264]
Oocytes can be obtained at various times during the reproductive cycle of goats. For example, at a given time in the reproductive cycle, a large percentage of oocytes (eg, about 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% or more) are at the end. These oocytes are naturally matured oocytes. Furthermore, oocytes at various phases of the cell cycle can be obtained and induced in vitro to enter a specific phase of meiosis. For example, oocytes cultured in a low serum medium will stop in the middle phase. Furthermore, serum activation can induce arrested oocytes to enter terminal phase. Thus, terminal oocytes can be easily obtained for use in the present invention.
[0265]
Oocytes can be matured in vitro before being used to form reconstructed embryos. The process typically involves harvesting immature oocytes obtained from a mammalian oocyte (eg, goat oocyte) and the oocyte is in a desired meiotic phase (eg, metaphase or terminal). Until reached, it is necessary to mature the oocytes in the medium prior to enucleation. Furthermore, oocytes matured in vivo can be used to form reconstructed embryos.
[0266]
Oocytes are collected from female mammals during superovulation. Briefly, oocytes (eg, goat oocytes) can be surgically recovered by flushing the oocytes from a female donor's oviduct. Methods for inducing superovulation in goats and collecting goat oocytes are described therein.
[0267]
Preferably, the meiotic phase of the oocyte (eg, metaphase II or terminal phase II) correlates with the phase of the donor somatic cell cycle. The correlation between the division phase of the oocyte and the division phase of the donor somatic cell cycle is referred to herein as “tuning”. G₀Or G₁Reconstruction of metaphase II oocytes by introduction of somatic cell nuclei (eg, by simultaneous activation and fusion) mimics the events that occur during fertilization. As another illustration, G before the critical point by simultaneous activation and fusion₁The terminal oocyte, fused with the genome of the somatic cell in phase, provides synchronization between the oocyte and the donor nucleus.
[0268]
Functional enucleation
A donor oocyte, such as a goat oocyte, is functionally enucleated so that the endogenous genome of the oocyte becomes incapable of functioning (eg, replication or DNA synthesis). As a method of functionally enucleating an oocyte: removing the genome from the oocyte (ie enucleate), eg so that the oocyte lacks the nuclear genome; eg by irradiation (eg X-ray irradiation or Inactivation of DNA in oocytes; chemical inactivation, etc.).
[0269]
Enucleation
One way to render the oocyte's genome inoperable is to remove it from the oocyte (ie, enucleation). A micropipette or needle can be inserted into the zona pellucida to remove nuclear material from the oocyte. For example, by aspirating the first polar body and adjacent cytoplasm around that polar body (eg, about 20%, 30%, 40%, 50%, 60% of the cytoplasm, possibly including metaphase plates) A micropipette can be used to enucleate metaphase II oocytes with one polar body. By removing the second polar body and surrounding cytoplasm (eg, about 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% of the cytoplasm) using a micropipette or needle, the two poles Terminal oocytes with body can be enucleated. In particular, the terminal oocyte can be enucleated at any time from the time when a protrusion exists in the cell membrane from the second polar body to the formation of the second polar body. Thus, as used herein, an oocyte that exhibits both a protrusion in the cell membrane and usually a spindle adjacent to it until the second polar body is released is considered a terminal oocyte. Alternatively, an oocyte with one polar body that is obvious and distinguishable without evidence of overhang is considered a metaphase oocyte. Methods for enucleation of oocytes (eg goat oocytes) are described in more detail in the examples.
[0270]
Irradiation
The oocyte can be functionally enucleated by inactivating the endogenous DNA of the oocyte using irradiation. Methods using irradiation are known in the art and are described, for example, in Bradshaw et al. (1995) Molecul. Reprod. Dev. 41: 503-512, the contents of which are incorporated herein by reference.
[0271]
Chemical inactivation
The oocyte can be functionally enucleated by chemically inactivating the endogenous DNA of the oocyte. Methods for chemically inactivating DNA are known in the art. For example, chemical inactivation is performed using the etopoid-cycloheximide method as described in Fulkaj and Moore (1993) Molecul. Reprod. Dev. 34: 427-430, the contents of which are incorporated herein by reference. it can.
[0272]
Introduction of functional chromosomal genome into oocytes
The methods described therein include introducing a functional chromosomal genome into an oocyte (eg, a functional enucleated oocyte such as an enucleated cell) to form a reconstructed embryo. A functional chromosomal genome leads to the development of clones or transgenic animals that arise from reconstructed embryos. Any method that results in the transfer of a substantially intact chromosomal genome into an oocyte can be used. Examples include methods of fusing cells containing a functional chromosomal genome with an oocyte, and nuclear injection, i.e., direct transplantation of the nucleus into the oocyte.
[0273]
fusion
For example, fusion of somatic cells and oocytes can be performed by electrofusion, virus fusion, biochemical reagent fusion (eg, HA protein), or chemical fusion (eg, polyethylene glycol (PEG) or ethanol).
[0274]
Fusion and activation of somatic cells and oocytes can be performed simultaneously. For example, a somatic cell nucleus may be inserted into the zona pellucida of an oocyte. For example, by applying an electric field, the step of fusing the nucleus with the oocyte may be performed simultaneously. Simultaneous fusion and activation of somatic cells and oocytes is described therein.
[0275]
Activation of reconstructed embryos
Activation refers to the onset of embryonic development such as replication and DNA synthesis. Activation can be induced, for example, by electroshock (eg in electrofusion), use of ionophores, ethanol activation, or during a naturally activated phase (eg terminal oocytes) ).
[0276]
Electrofusion
Electric shock (ie, electrofusion) can be used to activate the reconstructed embryo. The use of electrofusion allows somatic and oocyte fusion and activation to be performed simultaneously.
[0277]
Chambers such as the BTX200 Embryomanipulation System for performing electrofusion are commercially available from, for example, BTX San Diego. Methods for performing electrofusion to fuse somatic cells (eg, goat somatic cells) and oocytes (eg, enucleated oocytes such as enucleated goat oocytes) are described therein.
[0278]
Ionophore
Furthermore, reconstructed embryos can be activated by ionophore activation. An ionophore, such as a calcium ionophore, is used to change the calcium concentration across the membrane of the reconstructed embryo. When the concentration of intracellular free calcium increases, phosphorylation of intracellular proteins decreases and the oocyte is activated. Such activation methods are described, for example, in US Pat. No. 5,496,720, the contents of which are incorporated herein by reference.
[0279]
Ethanol activation
Presicce and Yang (1994) Mol. Reprod. Dev. 37: 61-68 and Bordignon and Smith (1998) Mol. Reprod Dev. 49: 29-36 (incorporated therein by reference) Based on the above, oocytes (eg, metaphase II oocytes) can be activated with ethanol prior to enucleation.
[0280]
Terminal oocyte
Terminal oocytes are usually already activated. Therefore, these cells often naturally exhibit a reduced calcium concentration that prevents fertilization and allows embryo development.
[0281]
Reconstructed embryo transfer
The reconstructed embryo of the present invention can be transplanted into a recipient female and developed into a clone or transgenic mammal such as a clone or transgenic goat. For example, as described in the Examples below, the reconstructed embryo can be implanted into the female oviduct of each recipient via the pilus. Furthermore, methods for transplanting embryos into recipient mammals are known in the art and are described, for example, in Ebert et al. (1994) Bio / Technology 12: 699.
[0282]
The reconstructed embryo may continue to be cultured until at least the first division (2 cell stage) up to the blastocyst stage, preferably a 2 cell or 4 cell stage embryo is transplanted. Various media for embryo development are known in the art. For example, reconstructed embryos can be co-cultured with a monolayer of fallopian tube epithelial cells derived from the type of mammal to be provided by the present invention. Methods for obtaining goat oviduct epithelial cells (GOEC) and methods for co-culturing the cells are described in the examples below.
[0283]
Protein purification from milk
Transgenic proteins can be produced in milk at relatively high concentrations and in large volumes, resulting in continuous and high levels of production of normally processed peptides that are easily harvested from resources that can be regenerated . Several different methods for isolating proteins from milk are known in the art.
[0284]
Milk proteins are usually isolated by a combination of processes. For example, skimming, centrifugation, precipitation (HESwaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982), acid precipitation (US Pat. No. 4,644,056), or enzymatic using renin or chymotrypsin Raw milk is first fractionated to remove fat by agglomeration (Swaisgood, idid). The main milk protein can then be fractionated into a clear solution or bulk precipitate and the specific protein of interest can be readily purified from the precipitate.
[0285]
French Patent No. 2487642 describes the isolation of milk protein from skim milk or whey using a combination of membrane ultrafiltration and exclusion or ion exchange chromatography. Whey is first obtained by agglomeration with rennet or lactic acid to remove casein. US Pat. No. 4,485,040 describes the isolation of α-lactoglobulin-rich product from whey by two successive ultrafiltration steps. U.S. Pat. No. 4,644,056 describes acid precipitation milk at pH 4.0-5.5 and continuous cross-flow filtration (initially purifying the product pool with a 0.1-1.25 micrometer pore size membrane, A method for purifying immunoglobulins from milk or colostrum by concentrating with a membrane having a separation limit of −80 kd.
[0286]
Similarly, U.S. Pat.No. 4,897,465 describes concentrating proteins such as immunoglobulins from serum, egg yolk or whey by continuous ultrafiltration over a metallic oxide membrane with a pH shift. Teach. In order to remove a large amount of contaminants from the protein, the filtration is first performed at a pH lower than the isoelectric point (pI) of the selected protein, and then the filtration is performed at a pH higher than the pI of the selected protein; Retain impurities and pass selected proteins through the permeate. A different filtration and concentration method is taught in European Patent No. EP467 482 B1, in which defatted skim milk is reduced to a pH 3-4 below the pI to allow both casein and whey protein. Solubilize. Concentrate the protein by three consecutive ultrafiltrations or diafiltration to form a residue containing 15-20% solids, 90% of which is protein. Alternatively, British Patent Application No. 2179947 discloses ultrafiltration to concentrate a sample and further perform weak cation exchange chromatography at an appropriate neutral pH to isolate lactoferrin from whey. . No purity measurement has been reported. In International Patent Publication No. WO 95/22258, milk is adjusted to high ionic strength by the addition of concentrated salt, followed by cation exchange chromatography to recover proteins such as lactoferrin from milk.
[0287]
In all of these methods, milk or a fraction thereof is first treated to remove fats, lipids, and other specific materials that contaminate filtration membranes or chromatographic media. The first fraction so produced will consist of casein, whey, or whole milk protein from which the protein of interest is isolated.
[0288]
International Patent Publication No. WO94 / 19935 describes a method for isolating bioactive protein from whole milk by stabilizing the solubility of whole milk protein with a positively charged substance such as arginine, imidazole or Bis-Tris. Disclosure. The procedure forms a clarified solution from which proteins can be isolated, for example by filtration through a membrane, otherwise the membrane will be clogged with precipitated protein.
[0289]
US patent application Ser. No. 08 / 648,235 discloses a method for isolating soluble milk components, such as bioactive forms of peptides, from whole milk or milk fractions by tangential flow filtration. Unlike previous isolation methods, the method eliminates the need to first fractionate whole milk to remove fat and casein micelles, thus simplifying the process and avoiding loss of recovery and biological activity. it can. In addition, the method can be used in combination with additional purification steps to remove contaminants and purify the product of interest, such as protein. The present invention is further illustrated by the following examples, which are not intended to limit the invention in any way. The contents of all references cited throughout this application, including literature references, issued patents, published patent applications, and pending patent applications, are incorporated by reference.
[0290]
Example
The donors and recipients used in the following examples were milk goats of the following strains: Alps, Saanen and Tugenburg: (mixed or alone). All goats were bred at the Genzyme Transgenics farm in Charlton, Massachusetts. Harvesting and transplantation were performed in spring and early summer (off season).
[0291]
Isolation of goat somatic cells
Goat fetal fibroblasts used as nucleophilic donors are 6 35-40 cells made by artificial insemination of non-transgenic females with freshly collected semen from transgenic antithrombin III (ATIII) primary males. Derived from day fetus. The ATIII cell line provides well-characterized genetic markers to somatic cell lines and allows for high-level expression of complex glycosylated protein (ATIII) in lactating female milk, The ATIII cell line was selected. Forty days after sexual intercourse, 3 fetuses derived from the semen of transgenic ATIII males were surgically removed and equilibrated Ca²⁺/ Mg²⁺Placed in phosphate buffered saline (PBS). Cell suspensions were prepared by mincing and digesting fetal tissue in 0.025% trypsin / 0.5 mM EDTA for 10 minutes at 37 ° C. Equilibrium 199 containing 10% fetal bovine serum (FBS) supplemented with nucleosides, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1% penicillin / streptomycin (10,000 I.U./ml each)^TMWash the cells with medium (M199) (Gibco) (fetal cell medium) and add 25cm²Incubated in flasks. After 24 hours, the cultured cells were re-fed with balanced fetal cell culture medium. On the fourth day, Ca²⁺/ Mg²⁺The confluent monolayer of primary fetal cells is harvested by washing the cell monolayer twice with PBS, followed by trypsinization by incubating with 0.025% trypsin / 0.5 mM EDTA at 38 ° C. for 7 min. did.
[0292]
Cells that could express ATIII were prepared for cryopreservation or maintained as stock cultures.
[0293]
Gender determination and genotyping of donor cell lines
Genomic DNA is isolated from fetal head tissue for ATIII donor nucleoplasm by digestion with proteinase K, followed by precipitation with isopropanol (described in Laird et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4293), and polymerase The presence of human antithrombin III (ATIII) sequence and gender determination were analyzed by chain reaction (PCR). The ATIII sequence is part of the BC6 construct (goat β casein-human ATIII cDNA) (described in Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571) used to create ATIII transgenic lines. The human ATIII sequence was detected by amplifying a 367 bp sequence using oligonucleotides GTC11 and GTC12 (see below). For gender determination, a zfX / zfY primer pair that gave rise to a 445 bp (zfX) / 447 bp (zfY) doublet was used (see below). The zfX band was cut into two small fragments (272 and 173 bp) by digestion with the restriction enzyme SacI (New England Biolabs). Males were identified by the presence of an uncut 447 bpzfY band.
[0294]
For PCR reaction, Taq polymerase (2.5 units) -containing PCR buffer (20 mM Tris, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl)₂, 0.25 mM deoxynucleotide triphosphate, and 600 mM of each primer) (50 ml) diluted genomic DNA (approximately 250 ng) and the reaction proceeded using the following temperature program:

The following primer sets were used to detect human ATIII sequences:
GTC11: CTCCATCAGTTGCTGGAGGGTGTCATTA (SEQ ID NO: 1)
GTC12: GAAGGTTTATCTTTTGTCCTTGCTGCTCA (SEQ ID NO: 2)
The following primers were used for gender determination:
zfX: ATAATCACATGGAGAGCCACAAGC (SEQ ID NO: 3)
zfY: GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAG (SEQ ID NO: 4)
Two fetuses were identified as male and both were ATIII sequence negative. Another fetus was identified as female and confirmed to be ATIII sequence positive.
[0295]
AT for embryo reconstruction III Preparation of expression donor cells
A transgenic female line (CFF155-92-6) derived from the 40th day fetus was identified by PCR analysis as described above and further used for all nuclear transfer operations. Transgenic fetal fibroblasts with fetal cell medium 25 cm²Maintained in the flask, the medium was changed on the 4th day of each passage, and the cells were collected by trypsinization on the 7th day. Another 25cm from each passage to maintain stock culture²Cells were transferred to a flask. Briefly, fetal cells were seeded and cultured in a 4-well plate containing fetal cell culture medium (5% CO 2.₂Medium, 39 ° C).
[0296]
After 48 hours, the medium was replaced with fresh 0.5% FBS-containing fetal cell medium. Thereafter, the medium was replaced with fresh 0.5% FBS-containing fetal cell medium every 48-72 hours for 7 days. Seven days after the first addition of fetal cell culture medium (0.5% FBS), somatic cells used as nucleophilic donors were harvested by trypsinization as previously described. 1-3 hours prior to fusion with enucleated oocytes, cells were resuspended in balanced M199 medium containing 10% FBS supplemented with 2 mM L-glutamine, 1% penicillin / streptomycin (10,000 IU / ml each). It was.
[0297]
Karyotype analysis of cell lines
Clonal cell lines were further evaluated by karyotype analysis to identify total chromosomal abnormalities in the cell lines. Cells were induced to arrest in metaphase by incubating with Demecolcine, Sigma (0.02 μg / ml) for 12 hours. After trypsin treatment, the resulting pellet was suspended in a hypotonic solution of 75 mM aqueous KCl and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Cells were fixed for 5 minutes after every 3 changes of glacial acetic acid-methanol (1: 3) solution before placing a small amount of cell suspension on a pre-washed microscope slide. After air drying, chromosome preparations were stained for 10 minutes with 3% Giemsa staining (Sigma) in PBS. Chromosome spread was measured for each cell line at 1000 × magnification under oil immersion.
[0298]
Immunohistochemical analysis
Antibodies specific for vimentin (Sigma) and pan-cytokeratin (Sigma) were used to characterize and confirm cell line morphology. Cells were placed on a sterile gelatin-coated coverslip to 75% confluence and further fixed in 2% paraformaldehyde containing 0.05% saponin for 1 hour. Cells were incubated for 2 hours at 37 ° C. in 0.5% PVP in PBS with primary antibody (PBS / PVP), washed 3 times at 10 minute intervals with PBS / PVP, and bound to Cys3 and FITC, respectively Incubated in the second antibody for 1 hour. Cellular alkaline phosphatase (Sigma) activity was measured to identify the presence or absence of undifferentiated cells. Cover slips were washed and subsequently placed on glass slides with 50% glycerol in PBS / PVP containing 10 μg / ml bisbenzimide (H-33342, Sigma) and observed under a fluorescence microscope.
[0299]
Pancytokeratin positive and alkaline phosphatase activity negative epithelial cell lines and vimentin positive and alkaline phosphatase negative fibroblast cell lines were generated from ATIII primary cultures. In cell culture, two morphologically distinguishable cell types were observed. Large “fibroblast-like” cells stained positive for vimentin, small “epithelial-like” cells stained positive for pancytokeratin, and they coexisted in primary cell culture. The fibroblast cell line isolated from ATIII showed a tendency to differentiate into epithelial cells when cultured for 3 days after becoming confluent. Subsequent passage resulted in selections other than fibroblasts, as confirmed by the lack of vimentin positive staining, resulting in pure epithelial cells. Senescence or potential cell cycle arrest was first observed at passage 28. These cells appear larger in size (> 30 μm) than normally growing cells (15-25 μm), and continue to be cultured for several months without apparent mitotic activity without losing viability. Can do. Embryo reconstruction using nuclei from arrested cells creates twin embryos and implies reacquisition of division activity.
[0300]
Synchronization and characterization of donor nucleocytocycle
Selected diploid transgenic female cell lines were expanded, serially passaged, and cryopreserved as future nucleoplasmic stocks. Donor nucleoplasm for nuclear transfer was plated in 4-well plates and cultured in DMEM with 10% FBS for up to 48 hours or until cells were 70-80% confluent. Subsequently, the serum is rendered deficient for 7 days using DMEM supplemented with 0.5% FBS to leave the growth phase and enter the resting phase (G₀The cells were induced to enter and the cells were synchronized. G₀After synchronization with the cell phase, cells were re-suspended in M199 medium containing 10% FBS to repopulate the cell cycle 3 hours prior to the nucleocytocytoplast fusion and the initial phase before the critical point. G₁Synchronized with the period. In addition, the cells of the second group were released from the resting phase and cultured in M199 medium containing 10% FBS for 12 or 36 hours to synchronize the cells with S phase. Cells were harvested by standard trypsinization, resuspended in M199 medium containing 10% FBS, and electrofused within 1 hour as a nucleophilic donor.
[0301]
Metaphase nuclei from transgenic cell lines carrying the passage 5 ATIII construct were 81% diploid, the proportion did not change significantly at passage 15, and 78% nuclei were diploid. .
[0302]
Cell cycle synchronization was identified by immunohistological analysis using antibodies against cyclin D1,2,3 and PCNA (Oncogene Research Products) (G protein in the absence of the protein complex).₀G indicates the stage and if the protein complex is present₁Suggests that the season has started). Using the thymidine analog 5-bromo 2'-deoxyuridine-5'-3-phosphate (BrDu, Sigma) and streptavidin-biotin BrDu staining kit (Oncogene Research Products), the estimation of the cell cycle by the presence of DNA synthesis activity Cells in S phase were identified.
[0303]
Immunofluorescence analysis of synchronized cells shows that 90% of G₁Phase marker cyclin D1, 2, 3, and PNCA negative, therefore G₀It was in a stop period. Restoring the serum content to 10% in that cell line induces re-entry into the cell cycle, and according to cyclin D1, 2, 3 and PCNA positive staining, about 74% of the cells within 3 hours after addition of serum. Early G₁The period has been reached. Serum recovery from 12 to 36 hours resulted in 89% of the cells becoming BrDu positive, suggesting DNA synthesis activity. In this study, clonal cell lines usually showed different responses to serum synchronization. An indirect association was observed where the rate of cell synchronization decreased with increasing passage number. Furthermore, the doubling period shortened as the number of passages increased, and each clonal cell line showed reduced sensitivity to synchronization with cell cycle serum.
[0304]
Donor goat superovulation and oocyte collection
Estrus was adjusted on day 0 with a Norgesmet met ear implant (6 mg) (Synchro-mate B) for subcutaneous use. On day 7, a single injection of prostaglandin (PGF2α) (Upjohn US) was made. From day 12, FSH (Folltropin-V, Vetrepharm, St Laurent, Quebec, Canada) was administered twice a day for 4 consecutive days. On day 14, the ear implants were removed. 24 hours after removal of the implant, the vasectomized male and donor animals were sexually intercourse several times at 48 hour intervals. After the last FSH injection, GnRH (Rhone-Merieux US) was injected once intramuscularly. Approximately 18 and 24 hours after the last sexual intercourse, Ca pre-warmed to 37 ° C²⁺/ Mg²⁺The oviduct was flushed with PBS containing no and oocytes were surgically recovered from the animals by mid-abdominal laparotomy. The oocytes were then collected and cultured in a balanced M199 medium containing 10% FBS supplemented with 2 mM L-glutamine, 1% penicillin / streptomycin (10,000 I.U./ml each).
[0305]
Oocyte enucleation
In vivo matured oocytes were collected from donor goats. Oocytes containing cumulus cells or oocytes lacking polar bodies were removed. Oocytes without cumulus cells were divided into two groups: oocyte with only one polar body (medium II) protocol and end-of-activation II protocol (having one polar body and Oocytes with evidence of elimination of bipolar bodies). Oocytes in terminal stage II were cultured in M199 medium containing 10% FBS for 2 to 4 hours. Calcium-activated terminal II oocytes (terminal II-Ca) induced by culture of oocytes activated during that time (proven by the first polar body and partially excluded second polar body)²⁺) And further enucleated. Unactivated oocytes were incubated in PBS containing 7% ethanol for 5 minutes prior to enucleation. Using a 25-30 μm glass pipette, a terminal polar oocyte (one single polar body and possibly about 30% of the cytoplasm) around that polar body, including the metaphase plate, is aspirated. The polar body was enucleated.
[0306]
Terminal oocytes were prepared by two methods as described above. First, phosphate buffered saline supplemented with 5% FBS (Ca²⁺/ Mg²⁺Oocytes in PBS without PBS) for about 3 hours at 38 ° C. in M199 medium with 10% FBS until a further end spindle configuration or elimination of the second polar body is achieved. Oocytes were cultured. Isolate all oocytes in response to continuous culture under treatment at different extracellular calcium concentrations, and end-stage II-Ca²⁺Classified as cells. Other oocytes that did not respond were further incubated for 5-7 minutes in 7% ethanol in M199 medium containing 10% FBS (Terminal II-ETOH) until 10% F spindle configuration was achieved. The cells were further cultured at 38 ° C. for 3 hours in M199 medium containing% FBS. Thereafter, the oocytes were cultured for 10-15 minutes at 38 ° C. in M199 medium (30-50 μl) containing 10% FBS containing cytochalasin-B (5 μg / ml). Using a 30 μm (OD) glass pipette, aspirate about 30% of the first polar body and adjacent cytoplasm around that polar body, including about 10% of the cytoplasm containing the metaphase plate or metaphase II spindle. The oocytes were enucleated by After enucleation, the oocytes were immediately reconstituted.
[0307]
Embryo reconstruction
On day 7, somatic cells CFF155-92-6 used as nucleoplasmic donors were harvested by trypsinization for 7 minutes (0.025% trypsin / 0.5 mM EDTA) (Sigma). Single cells were resuspended in equilibrated M199 medium containing 10% FBS supplemented with L-glutamine (2 mM) and penicillin / streptomycin. Donor cell injections were performed in the same medium as for enucleation. Prior to selection for injection into enucleated cytoplasts, donor cells were classified as small, medium and large. Small single cells (10-15 μm) were selected using a 20-30 μm diameter glass pipette. Pipettes were introduced through the same pores of the zona pellucida created during enucleation, and donor cells were injected between the zona pellucida and the egg cytoplasmic membrane. Reconstructed embryos were incubated in M199 medium 30-60 minutes prior to fusion and activation.
[0308]
Fusion and activation
Prior to electrofusion, all reconstructed embryos (ethanol pretreated or not) were fused with buffer (0.3 M mannitol, 0.05 mM CaCl in distilled water).₂0.1 mM MgSO_Four1mM K₂HPO_Four, 0.1 mM glutathione, 0.1 mg / ml BSA) for 2 minutes. Fusion and activation were performed at room temperature in a chamber with two stainless steel electrodes spaced 200 μm apart (BTX 200 Embryomanipulation System, BTX-Genetronics, San Diego, Calif.) Filled with fusion buffer. Reconstructed embryos were placed in groups 3-4 using pipettes and manually aligned so that the recipient oocytes and donor CFF155-92-6 cell membranes were parallel to the electrodes. After injection of GnRH using an Electrocell Manipulator and Enhancer 400 (BTX-Genetronics) by first treating with alignment / holding pulse 5-10V AC for 7 seconds, followed by fusion pulse 1.4-1.8KV / cm DC for 70 microseconds Cell fusion and activation between 32-42 hoursInduced at the same time. The embryos were washed for 3 minutes in fusion medium, then cells were transferred to M199 medium containing cytochalasin-B (Sigma) (5 μg / ml) and 10% FCS and incubated for 1 hour. Embryos were removed from M199 / cytochalasin-B medium and cultured in 50 μl of M199 medium containing 10% FBS with goat oviduct epithelial cells stacked using paraffin oil. 5% CO₂The embryos continued to be cultured in a humidified incubator at 39 ° C. for 48 hours prior to transfer to the recipient female.
[0309]
G₀, G₁And all reconstructed embryos 1 hour after co-activation and fusion with S-phase nucleoplasm became metaphase II with cytoplast arrest and nuclear membrane disruption (MEBD) and immature chromosome condensation ( PCC). Subsequent nuclear film formation was observed, reaching about 35% after 4 hours of activation. In oocytes reconstructed at end stage II, G₀, G₁And an average of 22% of the oocytes observed 1 hour after fusion with the S-phase nucleoplasm undergo MEBD and PCC, while the remaining oocytes have intact nuclear lamina around the uncondensed nuclei It has been shown. Except for the absence of MEBD and PCC, no consistent nuclear morphology was observed between the metaphase used and the two end-stage reconstruction protocols. G after 36-48 hours in vitro culture₀Or G₁Higher mitotic stage (8-32 blastomeres) when cloned embryos advanced when embryos were reconstructed using S-phase donor nuclei compared to those using nucleoplasm at stage (2-80 spheroids) The difference became apparent in that it was observed to have an occurrence. Fluorescence microscopy analysis showed that rapidly dividing embryos were fragmented. Other embryos develop at the 32- to 64-cell stage within 3 days of culture before cleavage is prevented. Analysis of their embryonic blastomeres and nuclei number showed a failure of cytokinesis and synchronization of fission, where the blastomer lacked the corresponding nucleus or included multiple nuclei. On the other hand, embryos that appeared morphologically normal showed synchronized cytokinesis and nuclear division.
[0310]
Goat oviduct epithelial cells ( GOEC ) / Coculture of reconstructed embryo
GOEC originate from fallopian tube tissue collected during surgical fallopian tube flushing performed on synchronized and superovulated females. The oviduct tissue from a single female was transferred to a 15 ml sterile polypropylene culture tube with equilibrated M199 medium (5 ml) containing 10% FBS, L-glutamine (2 mM), penicillin / streptomycin. Vortex for 1 minute followed by 5% CO₂Single cell suspensions were prepared by culturing in a humidified incubator at 38 ° C. for up to 1 hour. The tube was vortexed again for 1 minute and then incubated for an additional 5 minutes to precipitate the debris. 4 μl of the upper layer containing the portion considered to be a single cell was transferred to a new 15 ml tube and centrifuged at 600 × g for 7 minutes at room temperature. The supernatant was removed and the cell pellet was resuspended in balanced GOEC medium (8 ml). 25cm²GOEC were cultured in a flask, the medium was changed on the third day, and the cells were collected by trypsinization as described above on the sixth day. Monolayers were prepared weekly from primary GOEC cultures for nuclear experiments. 5x10 cells in GOEC medium^FiveThe suspension was resuspended at a rate of 50 ml / well and plated on 4-well plates. Overlay the medium with light paraffin oil (0.5 ml), 5% CO₂The plates were cultured in a humidified incubator at 38 ° C. On the second day, the medium was replaced with 80% fresh equilibration medium. 5% CO with GOEC monolayer before transplanting to recipient at GTC farm₂All reconstructed embryos were cultured in vitro in a humidified incubator at 38 ° C.
[0311]
In all experimental repeats for ATIII, embryos at the cleavage stage that could be transferred to synchronized recipients were brought on day 2. Embryos using fibroblast and epithelial cell phenotypes as donor nucleoplasm showed cleavage and development during culture. When used with ATIII nucleoplasm, preactivated terminal II cytoplasts (45%) and terminal II-ethanol activated cytoplasts compared to the cytoplasts used in arrested metaphase II (35%) In reconstructed embryos using (56%), the rate of cleavage generation (%) was high. G compared to the donor nucleus in S phase₀Or G₁Embryo has good morphological characteristics when in phase, but G in cell cycle₀, G₁Alternatively, no difference was observed in the percentage of embryos reconstructed using donor nucleoplasm in S phase. At the time of transfer, embryos are usually in the 2-8 cell stage, with most embryos having 3-4 blastomeres. Normal cleavage development chronologically corresponds to about 36 to 48 hours after fusion and activation. After development in vitro for 36 to 48 hours, embryos that appeared morphologically normal at the 2 to 8 cell stage were selected.
[0312]
Synchronizing the estrus of recipient females
In the recipient, hormonal treatment was delayed one day (compared to the donor) to ensure donor / recipient synchronization. The estrous phase was synchronized on day 1 with subcutaneous Norgestmet ear implants (6 mg). On day 8, a single injection of prostaglandin was made. On day 14, a single intramuscular administration of PMSG (CalBiochem US) was started. On day 15, the ear implants were removed. 24 hours after removal of the implant, the vasectomized male and donor animals were sexually intercourse several times for 3 consecutive days.
[0313]
Embryo transfer to recipient females
Approximately 48 hours prior to transfer to synchronized recipients, reconstructed embryos were co-cultured with GOEC monolayers. Immediately before transplantation, reconstructed embryos were placed in balanced Ham's F-12 medium containing 10% FBS. Two to four reconstructed embryos were implanted into each recipient's oviductal lumen via the cilia. Transplantation was performed in a minimal volume of Ham's F-12 medium containing 10% FBS using a fire-polished sterile glass micropipette.
[0314]
The development of embryos reconstructed by nuclear transfer using transgenic goat fetal fibroblasts and oocytes induced in vivo is summarized in Table 1. A total of 14 rounds of harvesting and transplantation were performed using 4 donors prepared for harvesting and 5-6 recipient females prepared for transplanting 48 hours later. Three different enucleation / activation protocols were used: metaphase II, metaphase, and metaphase II pretreated with ethanol. Following fusion-activation, co-cultured reconstructed embryos with goat primary epithelial cells at least until cleavage (2 cell stage), at the most early 16 cell stage; timely accurate 2-4 cell stage Most embryos were transplanted into. All transplants were surgically performed on the fallopian tubes in hormonally synchronized recipients. The incidence was slightly better when using the terminal and ethanol protocols compared to the mid-phase II protocol. This is because, in part, the enucleation of the second polar body appears to be almost traumatic to the oocyte, and in part, the activation rate of the oocyte fully treated with ethanol is high. Because it seems.
[0315]
[Table 1]

Following embryo transfer, recipient females were examined by ultrasound on day 25. High pregnancy rates in the range of 55-78% were diagnosed in ATIII recipient females. In all three enucleation / activation protocols, a high proportion of females (65%) were observed to be positive on day 30. However, it should be noted that in most cases fetal heartbeats are not detected at such an early stage. Furthermore, the positive ultrasound signal detected on day 30 appeared to be closer to vesicular development not associated with normal embryo development, but to normal embryo development characteristics. . The development of such embryos is not usually observed in other goat embryo transfer programs (eg, microinjected embryos). Examination of the development of these vesicles every other week between the 25th and the 40th days revealed that the pregnancy was abnormal and on the 40th day most fetuses were reabsorbed and normal ultrasound images were not seen It was.
[0316]
However, heartbeats were detected by day 40 in two pregnancies. In those two cases, ultrasonography between day 25 and 40 not only detected the heartbeat, but also showed the development of a recognizable embryonic structure. One of these pregnancies fused the quiescent nucleoplasm derived from the 6th passage CFF155-92-6 fibroblast cell line with its enucleated cytoplast using the mid-phase II enucleation / activation protocol. Established. In that illustration, four 4-cell stage reconstructed embryos were transplanted into a recipient female oviduct. The other pregnancy (twin) is pre-activated terminal Ca²⁺G derived from enucleated cells derived from oocytes and CFF155-92-6 epithelial cell line cultured for 5 passages₁Obtained from embryos reconstructed based on a terminal enucleation / activation protocol that fuses with the nucleoplasm. In that case, 3 reconstructed embryos (1 2-cell stage and 2 4-cell stage) were transplanted into the recipient female.
[0317]
No pregnancy was observed when using embryos produced by the ethanol enucleation / activation protocol. However, the numbers were not sufficient to conclude based on the relative effects of the three enucleation / activation protocols used in this study.
[0318]
[Table 2]

Perinatal care of recipient embryos
During pregnancy, female goats were observed daily for superficial signs of health (eg appetite, agility, appearance). Pregnancy was determined by ultrasonography on days 25-28 from the first day of the continuous estrus. To monitor and confirm fetal survival, female goats were ultrasonated biweekly until about day 75 and once a month thereafter. In addition, serum samples were collected from recipient female goats approximately 21 days after successive estrus for serum pregnancy analysis. This was done to determine whether a functional corpus luteum is present and how it contrasts to the reproductive state of the animal (ie pregnancy). On about day 130, pregnant goats were vaccinated with tetanus toxin and Clostridium C & D. Selenium & vitamin E (Bo-Se) and vitamins A, D and B complex were administered intramuscularly or subcutaneously, and an anthelmintic was administered. On about day 143, the female goat was transferred to a clean delivery compartment and habituated to its new environment before delivery. Increased observation of pregnant female goats to monitor signs of labor. After regular contraction began, the female goat continued to be observed until delivery. If labor pain did not progress after about 15 minutes of strong contraction, the fetal position was examined by vaginal palpation. If the fetus was in normal position, labor pains were advanced for another 5-30 minutes (depending on the female goat) before starting assisted vaginal delivery. A cesarean section was performed if desired. If desired, parturition was induced with PGF2α (eg Lutalyse) (approximately 5-10 mg). The induction can occur during about 145-155 days of pregnancy. Usually, labor occurs 30 to 40 hours after the first injection. The monitoring method is the same as above.
[0319]
As soon as the pups were born, the pups were rushed to dry with a towel and checked for overall abnormalities and normal breathing. The kid was immediately taken away from the female goat. Immediately after confirming that the goat was healthy, the navel was immersed in 7% iodine tincture. Within the first hour after birth, the goats received the first supply of heat-treated colostrum. At birth, larvae were injected with selenium & vitamin E (Bo-Se) and vitamins A, D and B complex to enhance performance and health.
[0320]
The first transgenic female goat offspring produced by nuclear transfer was born 154 days after gestation, after induction of labor and cesarean delivery. The offspring's birth weight was 2.35 kg, which was within the intermediate weight range of the Alps strain. Female twins were born one month later, with a gestation period of 151 days, with minimal assistance. The birth weight of both twins was 3.5 kg, which was within the range of the intermediate weight of twins of the line. All three pups looked normal and healthy, and were similar in phenotype in that they developed a symbolic mark typical of coat and alpine lines.
[0321]
Furthermore, the three offspring were similar in appearance to the first transgenic male goat. No distinct phenotypic effects were observed from the heterologous expression of the donor oocyte lineage or fetal genotype.
[0322]
Transgenic clone goat
In order to confirm that the three pups had undergone gene transfer of the BC6 construct including the goat β casein promoter and the human ATIII gene sequence, PCR amplification and Southern analysis of the transgene fragment was performed.
[0323]
Immediately after birth, blood samples and ear skin tissue were obtained from cloned female goats and surrogate mother goats. Isolation of genomic DNA was performed on the sample (Laird et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293). Each sample was first analyzed by PCR using ATIII-specific primers, and then Southern blot analysis was performed using ATIII cDNA (Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571). For each sample, genomic DNA (5 μg) was digested with EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) and 0.7% agarose gel (Seakem®).^R, ME) and further immobilized on a nylon membrane (MagnaGraph, MSI, Westboro, MA) by standard methods followed by capillary transfer (Laird et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19). : 4293). Prime-It ○^RUsing the kit (Stratagene, La Jolla, CA)³²Membranes were analyzed using a 1.5 kb Xho I-Sal I ATIII cDNA fragment labeled with PdCTP. Hybridization was performed overnight at 65 ° C (Church et al. (1984) Prot. Natl Acad. Sci. USA 81: 1991-1995). Wash the blot with 0.2xSSC (0.1% SDS) and X-OMAT^TM The AR film was exposed for 48 hours.
[0324]
PCR analysis supported that all goats had undergone BC6 construct gene transfer including the goat β casein promoter and the human ATIII gene sequence. Southern blot analysis showed a complete BC6 transgene. Hybridization to a diagnostic 4.1 kb EcoRI fragment was detected in all three cloned animals, cell lines and transgenic positive controls, but not in the two recipient females. Due to the cross-hybridization of the ATIII cDNA probe to the endogenous goat AT locus, a 14 kb band was detected in all samples as expected.
[0325]
Furthermore, fluorescence analysis (FISH) with in situ hybridization was performed to identify the integration site of the BC6 construct. Whole blood was cultured for lymphocyte collection for clonal goat typing (Ponce de Leon et al. (1992) J. Hered. 83: 36-42). Fibroblasts and lymphocytes were prepared and further hybridized as previously described (van de Corput et al. (1998) Histochem Cell Biol. 110: 431-437, and Klinger et al. (1992) Am. J. Human. Genet. 51: 55-65). A digoxigen labeled probe encompassing the complete 14.7 kb BC6 transgene was used in the method. TSA to amplify the signal^TM-Direct system (NENTM Life Science Products, Boston, MA) was used. RAPI bands were visualized and identified using DAPI counterstaining (Di Berardino et al. (1987) J. Hered. 78: 225-230). Image-Pro for capturing and processing images^R A Zeiss Axioskop microscope equipped with a Hamamatsu digital camera was used with Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). FISH analysis of blood cultures from each transgenic goat using a probe for the BC6 transgene showed that all three animals were integrated into the same chromosome 5 as found in the metaphase plate from the CFF6 cell line. It was shown to have. Furthermore, analysis of more than 75 metaphase plates in each cloned goat supported that the integration of the transgene into chromosome 5 was not mosaic.
[0326]
PCR-RFLP analysis for the highly polymorphic MHC class II DRB gene was performed as a final confirmation that all three pups were derived from the transgenic CFF6 cell line. PCR-RFLP typing was used to type for the second exon of the goat MHC class II DRB gene (Amills et al. (1996) Immunopathol. 55: 255-260). The nested PCR product (15 μl) was digested with Rsal (New England Biolabs, Beverly, MA) (20 units). After digestion, restriction enzyme fragments were separated on a 4-20% non-denaturing polyacrylamide gel (MVP ™ precast gel, Stratagene, La Jolla, Calif.) In the presence of ethidium bromide.
[0327]
As explained by Rsal digestion of the DRB gene second exon, the three cloned goats are identical to each other and are identical to the CFF6 donor cell line, but the recipient female has a different allele.
[0328]
Lactation and induction of transgene protein expression into milk
In order to determine whether expression of the targeted mammary gland specific human ATIII protein is present in milk, pre-sexual maturity cloned transgenic goats were induced to transiently lactate. At 2 months of age, clones were given a lactation induction protocol by hormone administration for 2 weeks. Hormone lactation induction was performed in CFF6-1 females as described by Ryot et al. (1989) Indian J. Anim. Res. 10: 49-51. Once daily, CFF6-1 goats were milked by hand and milk samples for ATIII expression analysis were collected. All protein analysis methods are described in Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571. The concentration of recombinant ATIII in milk was determined by a fast reverse phase HPLC method using a Hewlett Packard 1050 HPLC (Wilmington, DE) detecting at 214 nm. ATIII activity was assessed by measuring thrombin inhibition using a two-stage colorimetric endpoint assay. Western blot analysis was performed using affinity purified sheep anti-ATIII-HRP conjugated polyclonal antibody (SeroTec, Oxford, UK). Samples were boiled for 30 seconds in reducing sample buffer before placing the samples on a 10-20% gradient gel (Owl Scientific). The (constant) electrophoresis was run at 164 volts until the dye tip flowed out of the gel.
[0329]
A small milk sample (0.5-10 ml) was taken daily at the end of the treatment for 20 days. A small amount of initial milk (0.5 to 1 ml) is a common amount found in pre-sexually mature female goats that have been induced lactation by hormones. The amount increased to 10 ml per day by the end of the female goat on day 25 after the start. The concentration and activity of ATIII in several samples was evaluated. As previously mentioned using females from specific BC6 transgenic cell lines, high levels of recombinant ATIII were detected by Western blot analysis (Edmunds et al. (1998) Blood 91: 4561-4571). The concentration of recombinant ATIII in the milk of cloned goats is 5.8 g / l (20.5 U / ml) on day 5 and 3.7 g / l (14.6 U / ml) on day 9. )Met. They corresponded to the levels recorded during the early period of female first natural lactation from the BC6 cell line (3.7 to 4.0 g / l).
[0330]
Conclusion:
Healthy transgenic goats were obtained by transplanting somatic nuclei into oocytes that had been enucleated in either arrested metaphase II or activated terminal II. These studies show that the serum-deficient cells used to bring about pregnancy are probably followed by 10% serum recovery.₀/ G₁Indicates that it is in a transition period.
[0331]
Immunofluorescence screening shows that after 7 days of serum deprivation, fetal somatic cells₁Phase cyclins D1, D2, D3 and PCNA are negative; within 3 hours of 10% FBS serum activation, the majority (eg about 70%) have been shown to express these markers.
[0332]
Cell cycle G following simultaneous fusion and activation₀Or G₁Reconstruction of metanuclear stage II arrested oocytes by transplantation of donor-nucleus-derived nuclei synchronized in phase mimics the temporal events that occur during fertilization. Successful development just before birth following the simultaneous fusion and activation protocol and the birth of a normal and healthy transgenic goat bring donor nuclei to elevated cytoplasmic MPF activity in support of chromatin remodeling and reprogramming. Significantly different from the methods used in other studies reporting that they require long-term exposure (Campbell et al. (1996) Nature 380: 64-66; Wilmut et al. (1997 ) Nature 385: 810-813; Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133; Cibelli et al. (1998) Science 280: 1256-1258). Our results challenge the argument that long-term remodeling of somatic nuclei under conditions of elevated MPF activity prior to activation is important for embryonic and fetal development. The results also show that reconstructed embryos do not require long-term exposure of donor nuclei to MPF, and that MEBD and PCC are not completely essential events. Chromatin remodeling events for MEBD and PCC appear to be rather an optional effect of MPF activity, and therefore may not be necessary for acquisition of developmental or totipotency. Instead, they will play a role in facilitating the acquisition of synchrony between the cytoplast and the nucleus. If the normal diploid is not maintained when the donor nucleus undergoes PCC and as a result is induced to undergo chromosomal dispersal due to an abnormal spindle mechanism due to MPF activity, these events are rather detrimental. obtain. Thus, synchronization of the nucleoplasm and cytoplast in the cell cycle is primarily responsible for maintaining normal ploidy, secondly for proper induction of genome reactivation and subsequent acquisition of reconstructed embryo developmental potential. Because it is important.
[0333]
In a second method of activating intermediate II arrested oocytes with intact chromatin to reduce MPF activity and inducing the oocytes to exit M phase and enter the first meiosis, further comprising: Support was obtained. About 3 hours after activation, G₁Enucleate the oocyte at the end of the phase before the start of the phase, and before the critical point of the cell cycle₁Fusion and simultaneous activation were performed with donor nucleoplasm in phase. Furthermore, simultaneous activation and fusion ensured that non-aged oocytes avoided the tendency to return to the arrest phase. The example was used to create a normal and healthy twin clonal transgenic goat. In essence, the cytoplast is moved to G before the critical point.₁A homogenous tuning system that matches the donor nuclei at the stage is provided. Furthermore, preactivation of the oocytes induces a decrease in cytoplasmic MPF activity and thus inhibits the development of MEBD and PCC. The results indicate that MEBD and PCC are merely optional for the induction of cytoplast and nucleoplasmic synchrony, and for proper genomic reactivation and subsequent acquisition of nuclear transfer embryo development using somatic nuclei. Suggest that it is not necessary.
[0334]
These observations are further₀Or G₁This suggests that differentiated cells at the stage have a function similar to embryo cleavage in terms of the ability to acquire totipotency when used in combination with arrested or activated recipient cytoplasts. In addition to providing a longer-term opportunity to prepare cytoplasts, the use of both metaphase II arrested and terminal II cytoplasts provides a dual option for cytoplast preparation. The use of terminal II cytoplasts will have several practical and biological advantages. The end-of-life approach facilitates efficient enucleation without the need for chromatin staining and ultraviolet localization. Furthermore, enucleation at the end phase allows for the removal of minimal cytoplasmic material and selection of a synchronized group of activated donor cytoplasts. The method also allows the preparation of highly homogenous groups of donor nuclei to be synchronized with the cytoplast cell cycle. When used for embryo reconstruction, these populations showed high embryo development rates in vitro. Thus, reconstructed embryos consisting of synchronously activated cytoplasts and nucleoplasm are developmentally competent.
[0335]
In addition to the success of creating a transgenic primary, somatic cell nuclear transfer allows the selection of an appropriate transgenic cell line prior to creating a clonal transgenic embryo. This is particularly important when several proteins are to be co-expressed by the transgenic mammary gland. For example, in the transgenic production of recombinant monoclonal antibodies in milk, the heavy and light chain transgenes are ideally the same in the mammary epithelium at the same level for efficient production of complete antibodies. It needs to be expressed in secretory cells. In addition, the transgenes that express each protein need to be integrated together at the same locus to help equal expression and avoid segregation of heavy and light chain transgenes during herd breeding There is.
[0336]
Also, the production of transgenic animals with the exact same genetic background increases the possibility of studying the expression and secretion properties of recombinant proteins by the mammary gland. For example, the availability of several completely identical transgenic females producing recombinant human ATIII will help identify the extent of changes in the carbohydrate structure of the protein produced by the mammary gland. Therefore, it is necessary to improve the properties of recombinant proteins produced in transgenic animal systems by substituting environmental factors (eg food), or to obtain appropriate quantities of recombinant proteins for preclinical or clinical programs It may be appropriate to increase milk production to further reduce the amount of time.
[0337]
The high level expression of recombinant human ATIII detected in the milk of CFF6-1 cloned goats exemplifies one of the most important aspects of the technology. By combining nuclear transfer and induction of lactation in pre-sexual maturity goats, it is possible to characterize the protein that it secretes within 8 to 9 months from the transfection of transgenic animals and cell lines for milk expression. . The amount of milk collected in lactation induction is not only sufficient to assess the recombinant protein yield, but also a more qualitative analysis (glycosylation when an expression level of mg / ml is obtained. , Preliminary pharmacokinetics, biological and pharmacological activity). In addition, the continued availability of nucleic acid-introduced donor cell lines ensures that genetically identical animals can be rapidly made to rapidly deliver therapeutic proteins (with predictable properties) for clinical trials. To.
[0338]
All patents and other references cited therein are incorporated by reference.
[0339]
Other embodiments are within the scope of the claims.
[0340]
1) Since the translation of each part from the 6th page, the 1st line to the 90th page, the last line of the specification in the foreign language document is missing, it is supplemented to correct the mistranslation.
[0341]
2) Since the translation of the portion from the first line of page 92 to the last line of page 103 is missing in the foreign language written claim, it is supplemented and mistranslated and corrected.
[0342]
3) At the same time, minor corrections were made to a part of the specification and claims that have already been translated (the details of this part are not changed, so detailed reasons for correction are omitted).

Claims (34)

非ヒトクローン哺乳動物を作る方法であって：
減数***の終期にある自然に成熟した除核卵母細胞に、非ヒト哺乳動物の体細胞に由来するゲノムを導入して再構築胚を形成し；
前記再構築胚を、胚形成の２から４細胞期になるまで培養維持し；
前記再構築胚を雌の非ヒト哺乳動物レシピエントに移植し；
該再構築胚を哺乳動物に発生させ、それによって非ヒト哺乳動物を提供する：
各工程を含むことを特徴とする方法。A method for making a non-human cloned mammal comprising:
Introducing a genome derived from a somatic cell of a non-human mammal into a naturally mature enucleated oocyte at the end of meiosis to form a reconstructed embryo;
Maintaining the reconstructed embryo in culture until the 2-4 cell stage of embryogenesis ;
Transplanting the reconstructed embryo into a female non-human mammal recipient ;
The reconstructed embryo is generated in a mammal, thereby providing a non-human mammal:
A method comprising each step. 前記体細胞の核を前記除核卵母細胞に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the somatic cell nucleus is introduced into the enucleated oocyte. 非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作る方法であって：
減数***の終期にある自然に成熟した除核卵母細胞に、哺乳動物の体細胞の遺伝子組換えゲノムを導入して再構築胚を形成し；さらに
前記再構築胚を、胚形成の２から４細胞期になるまで培養維持し；
前記再構築胚を雌の非ヒト哺乳動物レシピエントに移植し；
該再構築胚を哺乳動物に発生させ、それによってトランスジェニック哺乳動物を提供する：
各工程を含むことを特徴とする方法。A method of making a non-human transgenic mammal comprising:
Introducing a genetically modified mammalian somatic cell into a naturally mature enucleated oocyte at the end of meiosis to form a reconstructed embryo;
Maintaining the reconstructed embryo in culture until the 2-4 cell stage of embryogenesis ;
Transplanting the reconstructed embryo into a female non-human mammal recipient ;
The reconstructed embryo is generated in a mammal, thereby providing a transgenic mammal:
A method comprising each step. 遺伝子組換え体細胞の核を前記除核卵母細胞に導入することを特徴とする請求項３記載の方法。The method according to claim 3, wherein the nucleus of the gene recombinant cell is introduced into the enucleated oocyte. 前記哺乳動物がヤギであることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。  5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the mammal is a goat. 前記哺乳動物が反芻動物であることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。  5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the mammal is a ruminant. 前記哺乳動物がウシであることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the mammal is a cow. 前記哺乳動物が、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマまたはラクダであることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。  5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the mammal is a pig, horse, sheep, llama or camel. 前記体細胞が線維芽細胞であることを特徴とする請求項１から８いずれか１項記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the somatic cells are fibroblasts. 前記線維芽細胞が胚性線維芽細胞であることを特徴とする請求項９記載の方法。  The method according to claim 9, wherein the fibroblast is an embryonic fibroblast. 前記体細胞がG₁期にあることを特徴とする請求項１から１０いずれか１項記載の方法The method of claim 1 according 10 any one of the somatic cell is characterized in that in the G ₁ phase 前記体細胞がG₀期にあることを特徴とする請求項１から１０いずれか１項記載の方法。The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the body cells are in ₀ phase G. 融合によって前記体細胞の核を除核卵母細胞に導入することを特徴とする請求項１から１２いずれか１項記載の方法。  13. The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the somatic cell nucleus is introduced into the enucleated oocyte by fusion. マイクロインジェクションによって前記体細胞の核を除核卵母細胞に導入することを特徴とする請求項１から１２いずれか１項記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the somatic cell nucleus is introduced into the enucleated oocyte by microinjection. 前記再構築胚から発生した哺乳動物を第二の哺乳動物と交配させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１から１４いずれか１項記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 14, further comprising the step of mating a mammal developed from the reconstructed embryo with a second mammal. 前記再構築胚から発生した哺乳動物が雌の哺乳動物であることを特徴とする請求項１から１５いずれか１項記載の方法。  16. The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the mammal generated from the reconstructed embryo is a female mammal. 前記雌の哺乳動物が乳分泌することを特徴とする請求項１６記載の方法。The method of claim 16, wherein the female mammal is characterized by secreting milk. 前記体細胞のゲノムが導入遺伝子配列を包むことを特徴とする請求項１から１７いずれか１項記載の方法。  18. A method according to any one of the preceding claims, wherein the somatic cell genome envelops the transgene sequence. 前記導入遺伝子配列がヒトタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１８記載の方法。  The method of claim 18, wherein the transgene sequence encodes a human protein. 前記体細胞のゲノムがプロモーターの制御下にある異種導入遺伝子配列を含むことを特徴とする請求項１８または１９記載の方法。  20. The method of claim 18 or 19, wherein the somatic cell genome comprises a heterologous transgene sequence under the control of a promoter. 前記プロモーターがヤギプロモーターであることを特徴とする請求項２０記載の方法。  21. The method of claim 20, wherein the promoter is a goat promoter. 前記プロモーターが組織特異的プロモーターであることを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。  The method according to claim 20 or 21, wherein the promoter is a tissue-specific promoter. 前記組織特異的プロモーターが乳特異的プロモーターであることを特徴とする請求項２２記載の方法。  23. The method of claim 22, wherein the tissue specific promoter is a milk specific promoter. 前記導入遺伝子配列によってコードされるポリペプチドが、前記哺乳動物から回収されることを特徴とする請求項１８から２３いずれか１項記載の方法。 24. A method according to any one of claims 18 to 23 , wherein the polypeptide encoded by the transgene sequence is recovered from the mammal . 前記ポリペプチドが、前記哺乳動物の乳、尿、毛、血液、皮膚、または肉から回収されることを特徴とする請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the polypeptide is recovered from milk, urine, hair, blood, skin, or meat of the mammal. 非ヒトクローン哺乳動物を作る方法であって：
減数***の終期にある自然に成熟した除核卵母細胞と哺乳動物の体細胞とを融合させて再構築胚を得て；
前記再構築胚を活性化し；
前記再構築胚を胚形成の２から４細胞期になるまで培養維持し；
前記再構築胚を雌の非ヒト哺乳動物レシピエントに移植し；さらに
前記再構築胚を哺乳動物に発生させる：
各工程を含むことを特徴とする方法。A method for making a non-human cloned mammal comprising:
Fusing naturally mature enucleated oocytes at the end of meiosis with mammalian somatic cells to obtain reconstructed embryos;
Activating the reconstructed embryo;
Maintaining the reconstructed embryo in culture until the 2-4 cell stage of embryogenesis ;
Transferring the reconstructed embryo to a female non-human mammal recipient ; and further generating the reconstructed embryo in a mammal:
A method comprising each step. 非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作る方法であって：
減数***の終期にある自然に成熟した除核卵母細胞とトランスジェニックタンパク質を発現し得る哺乳動物の体細胞とを融合させて再構築胚を得て；
前記再構築胚を活性化し；
前記再構築胚を胚形成の２から４細胞期になるまで培養維持し；
前記再構築胚を雌の非ヒト哺乳動物レシピエントに移植し；さらに
前記再構築胚を哺乳動物に発生させる：
各工程を含むことを特徴とする方法。A method of making a non-human transgenic mammal comprising:
Fusing naturally mature enucleated oocytes at the end of meiosis with mammalian somatic cells capable of expressing the transgenic protein to obtain reconstructed embryos;
Activating the reconstructed embryo;
Maintaining the reconstructed embryo in culture until the 2-4 cell stage of embryogenesis ;
Transferring the reconstructed embryo to a female non-human mammal recipient ; and further generating the reconstructed embryo in a mammal:
A method comprising each step. 前記体細胞の核が導入遺伝子配列を含むことを特徴とする請求項２７記載の方法。  28. The method of claim 27, wherein the somatic cell nucleus comprises a transgene sequence. 前記導入遺伝子配列がヒトタンパク質をコードすることを特徴とする請求項２８記載の方法。  29. The method of claim 28, wherein the transgene sequence encodes a human protein. 前記哺乳動物がヤギであることを特徴とする請求項２６から２９いずれか１項記載の方法。  30. A method according to any one of claims 26 to 29, wherein the mammal is a goat. 前記哺乳動物が反芻動物であることを特徴とする請求項２６から２９いずれか１項記載の方法。  30. A method according to any one of claims 26 to 29, wherein the mammal is a ruminant. 前記哺乳動物がウシであることを特徴とする請求項２６から２９いずれか１項記載の方法。  30. A method according to any one of claims 26 to 29, wherein the mammal is a cow. 前記哺乳動物が、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラマまたはラクダであることを特徴とする請求項２６から２９いずれか１項記載の方法。  30. A method according to any one of claims 26 to 29, wherein the mammal is a pig, horse, sheep, llama or camel. 前記哺乳動物が雌の哺乳動物であることを特徴とする請求項２６から３３いずれか１項記載の方法。  34. A method according to any one of claims 26 to 33, wherein the mammal is a female mammal.