JP4519646B2

JP4519646B2 - Purification method of preproinsulin

Info

Publication number: JP4519646B2
Application number: JP2004525238A
Authority: JP
Inventors: ホルスト・トューロウ; ハンス・ブルーメンシュトック; シャンターレ・ハーヴェニト
Original assignee: サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2002-08-01
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2023-07-18
Also published as: EP1527097A1; CA2493539A1; CY1108046T1; US20060183666A1; DK1527097T3; US7803763B2; JP2006513978A; IL166438A0; ATE384742T1; AU2003254375A1; CA2493539C; MXPA05001042A; PT1527097E; DE10235168A1; ES2297223T3; BR0313131A; US20050080000A1; SI1527097T1; WO2004013176A1; EP1527097B1

Abstract

The invention relates to a method for the chromatographic purification of preproinsulins, in which higher molecular weight substances are removed from an aqueous solution of preproinsulin by a first chromatography on an anion exchanger in flow-through mode and a subsequent second chromatography on a cation exchanger in adsorption mode, and to a method for preparing insulins, which includes the method for preparing preproinsulins.

Description

世界的に約１２００万人の人々が１型糖尿病に罹っており、１型糖尿病は、インスリンホルモンの内因性の産生が不十分なことを特徴とする。このタイプの糖尿病の唯一の可能な療法形態は、内分泌性インスリンの分泌の欠如をインスリン製剤を適用することによって代替することである。 Approximately 12 million people worldwide have type 1 diabetes, which is characterized by insufficient endogenous production of insulin hormone. The only possible form of therapy for this type of diabetes is to replace the lack of secretion of endocrine insulin by applying an insulin formulation.

インスリン製剤は、インスリンホルモンが活性物質である医薬製剤である。この場合、天然に存在するインスリンだけでなく、インスリン類似体およびインスリン誘導体が用いられる。 Insulin preparations are pharmaceutical preparations in which insulin hormone is the active substance. In this case, not only naturally occurring insulin but also insulin analogues and insulin derivatives are used.

ヒトの膵臓で生産されるヒトインスリンは、５１個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、これは、２つのペプチド鎖、すなわち２１個のアミノ酸残基を有するＡ鎖と、３０個のアミノ酸残基を有するＢ鎖とに分けられる。両ペプチド鎖のアミノ酸残基の配列は遺伝学的に決定されており、既知である。両鎖は互いに２個のジスルフィド架橋で連結している。加えて、Ａ鎖はまた、鎖内部のジスルフィド架橋も含む。 Human insulin produced in the human pancreas is a polypeptide containing 51 amino acid residues, which consists of two peptide chains, an A chain having 21 amino acid residues and a 30 amino acid residue. It is divided into a B chain having a group. The sequence of the amino acid residues of both peptide chains has been determined genetically and is known. Both chains are connected to each other by two disulfide bridges. In addition, the A chain also contains disulfide bridges within the chain.

インスリン類似体は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、および／または、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加または除去により、ヒトインスリンと異なっている。インスリン類似体は、ヒト以外の種で天然に生じるものでもよいし、または、人工的に製造されたものでもよい。インスリン誘導体は、例えば追加のエステルまたはアミド基のような化学修飾されたアミノ酸残基を含むが、その他はヒトのアミノ酸配列または類似したアミノ酸配列を示す。 Insulin analogues differ from human insulin by substitution of at least one amino acid residue and / or addition or removal of at least one amino acid residue. Insulin analogs may occur naturally in species other than humans or may be artificially produced. Insulin derivatives contain chemically modified amino acid residues such as, for example, additional ester or amide groups, while others exhibit human amino acid sequences or similar amino acid sequences.

通常、インスリン類似体またはインスリン誘導体は、修飾されていないヒトインスリンと比べて、改変された作用キネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す。 In general, insulin analogues or insulin derivatives exhibit altered action kinetics compared to unmodified human insulin.

ここ数年、ヒトインスリン、および、インスリン類似体もしくはインスリン誘導体が、組み換えＤＮＡ技術で製造されてきた。工業的な方法において、例えば、最初に式１で示される適切な前駆体のプレプロインスリン（ＰＰＩ）が製造され、それからヒトインスリンまたはインスリン類似体が酵素による切断により製造される。例えば、ヒトインスリンを製造するための遺伝学的方法は、以下の方法工程を含む：
ａ）遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
ｂ）前記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
ｃ）未溶解の融合タンパク質を含む封入体を単離する工程、
ｄ）ペプチド鎖が正しくフォールディングされた前記融合タンパク質を溶解させ、同時にジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得る工程、
ｅ）プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
ｆ）ヒトインスリンを精製する工程、
ｇ）ヒトインスリンを結晶化し、得られた生成物を乾燥させる工程。 In recent years, human insulin and insulin analogs or insulin derivatives have been produced by recombinant DNA technology. In industrial methods, for example, the appropriate precursor preproinsulin (PPI) of formula 1 is first prepared, and then human insulin or insulin analog is prepared by enzymatic cleavage. For example, a genetic method for producing human insulin includes the following method steps:
a) fermenting a genetically engineered microorganism;
b) recovering the microorganism and disrupting the cells;
c) isolating inclusion bodies containing undissolved fusion protein,
d) dissolving the fusion protein in which the peptide chain is correctly folded and simultaneously linking disulfide bridges to obtain preproinsulin;
e) cleaving preproinsulin with an enzyme to obtain human insulin;
f) purifying human insulin;
g) Crystallizing human insulin and drying the resulting product.

インスリン類似体を製造する際、プレプロインスリンの適切な領域のアミノ酸配列（Ａ鎖およびＢ鎖の）は、予め決定されている。様々なプレプロインスリンの酵素による切断は、例えば酵素トリプシン、さらに必要に応じて酵素カルボキシペプチダーゼＢのようなプロテアーゼを用いて行われる。 When producing insulin analogues, the amino acid sequence (A chain and B chain) of the appropriate region of preproinsulin is predetermined. The enzymatic cleavage of various preproinsulins is performed using, for example, the enzyme trypsin, and optionally a protease such as the enzyme carboxypeptidase B.

プレプロインスリンは、式１で示されるタンパク質である；

上記式中、
Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ）であり、および、３個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も２個の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ）
であり、
Ｒ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する。 Preproinsulin is a protein of formula 1;

In the above formula,
X is
a) a genetically codeable amino acid residue, or
b) a peptide having 2 to 35 amino acid residues, where the first and last are both basic amino acid residues (especially Arg) and consist of more than 3 amino acid residues Two basic amino acid residues (especially Arg and / or Lys), both first and last
And
R ¹ is
a) hydrogen,
b) a genetically codeable amino acid residue, or
c) a peptide having 2 to 15 amino acid residues,
R ² is a genetically codeable amino acid residue, and
Residues A1-A20 correspond to the amino acid sequence of the A chain of human insulin or insulin analog, and residues B1-B30 correspond to the amino acid sequence of the B chain of human insulin or insulin analog.

好ましくは、プレプロインスリンは、以下のような式１で示されるタンパク質である；
Ｘは、３５個のアミノ酸残基を有し、ヒトインスリンまたはサルのインスリンのＣ鎖配列を含むペプチド、または、２９個のアミノ酸を有するペプチドであり、その配列は以下の通り：
Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１）、
Ｒ¹は、２〜１５個のアミノ酸残基を有し、そのカルボキシル末端アミノ酸残基がＡｒｇであるペプチドであり、
Ｒ²は、アミノ酸残基ＡｓｎまたはＧｌｙであり、および、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、
残基Ｂ１〜Ｂ３０は、Ｂ３位のＡｓｎをＬｙｓで置換し、Ｂ２９位のＬｙｓをＧｌｕで置換しているヒトインスリンのＢ鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応する。 Preferably, the preproinsulin is a protein of formula 1 as follows:
X is a peptide having 35 amino acid residues and comprising the C chain sequence of human insulin or monkey insulin, or a peptide having 29 amino acids, the sequence of which is as follows:
Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser- Leu-Gln-Lys-Arg (SEQ ID NO: 1),
R ¹ is a peptide having 2 to 15 amino acid residues, the carboxyl terminal amino acid residue of which is Arg;
R ² is the amino acid residue Asn or Gly, and
Residues A1-A20 correspond to the amino acid sequence of the A chain of human insulin,
Residues B1-B30 correspond to the amino acid sequence of the human insulin B chain or insulin analog in which Asn at position B3 is replaced with Lys and Lys at position B29 is replaced with Glu.

本プロセスの、ペプチド鎖が正しくフォールディングされた融合タンパク質を溶解させて、同時にジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得る段階では、望ましい単量体プレプロインスリン以外にも、競合反応でポリマー状のプレプロインスリンも生産される。前記ポリマー状のプレプロインスリンは、それらのより高分子量によりＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析または動的光散乱法で検出することができる。この望ましくない競合反応を抑制するために、融合タンパク質の初期濃度は、できるだけ低くする必要がある（ＤｅＢｅｒｎａｄｅｚ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３０９：２１７，１９９９年）。実際には、このプロセスの段階では、約０.５〜１ｇ／Ｌの濃度でプレプロインスリンが生産され、さらに、より高分子量の割合が約４０％であることがわかっている。より高分子量の区分には、ポリマー状のプレプロインスリンが含まれる。 In the process of dissolving the fusion protein in which the peptide chain is correctly folded and simultaneously connecting disulfide bridges to obtain preproinsulin, in addition to the desired monomeric preproinsulin, a polymerized preproinsulin is used in a competitive reaction Is also produced. The polymeric preproinsulin can be detected by HPLC-GPC analysis or dynamic light scattering method based on their higher molecular weight. In order to suppress this undesirable competition reaction, the initial concentration of the fusion protein should be as low as possible (De Bernadez et al., Meth. Enzym. 309: 217, 1999). In practice, it has been found that at this stage of the process, preproinsulin is produced at a concentration of about 0.5-1 g / L, and that the higher molecular weight fraction is about 40%. The higher molecular weight category includes polymeric preproinsulin.

驚くべきことに、本発明の範囲内において、ポリマー状のプレプロインスリンは、それに続くプロセスの段階で未変性インスリンの変性を誘導することによってインスリンの安定性に不利に作用することがわかった。変性反応の連鎖中、第一の可逆性の工程で、溶解した単量体インスリン分子から、物理的な接着力で繰り返し単位が連結された直線状の凝集体が生産されることがわかっている。それに続く不可逆性の反応により、溶解した凝集体から、安定な不溶性の凝集体の束（フィブリル）が生産され、これらは順に、自己触媒プロセスで未変性インスリンの変性を誘導する。これら不溶性のインスリンの繊維は、生物学的に不活性なだけではなく、医薬インスリン製剤を適用する際に注射針を詰まらせる原因となり得る。加えて、これらはまた、インスリン製剤を用いた療法中に場合により起こりうる免疫学的な不適合反応に関与する（Ｊ．Ｂｒａｎｇｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃ．１９９７年，８６，５１７〜５２５；Ｒ．Ｅ．Ｒａｔｎｅｒ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３９，７２８〜７３３，１９９０年）。 Surprisingly, it has been found that within the scope of the present invention, polymeric preproinsulin adversely affects insulin stability by inducing denaturation of native insulin in subsequent process steps. During the chain of denaturation reactions, the first reversible process has been shown to produce linear aggregates in which repeating units are linked by physical adhesive forces from dissolved monomeric insulin molecules. . Subsequent irreversible reactions produce stable insoluble aggregate bundles (fibrils) from the dissolved aggregates, which in turn induce denaturation of native insulin in an autocatalytic process. These insoluble insulin fibers are not only biologically inert, but can cause clogging of the injection needle when applying a pharmaceutical insulin formulation. In addition, they are also involved in an immunological incompatibility that may occur during therapy with insulin preparations (J. Brange et al., J. Pharm. Sc. 1997, 86, 517-525; R E. Ratner et al., Diabetes, 39, 728-733, 1990).

インスリン製造プロセスのそれに続く部分において、プレプロインスリンは、酵素トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによってヒトインスリンに変換される（Ｋｅｍｍｌｅｒ，Ｗ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＳｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６（１９７１年）６７８６〜６７９１を参照）。この場合、Ａ鎖とＢ鎖との間のリンカーペプチド（式１におけるＸ）と、Ｂ鎖のアミノ末端の先の部分（式１におけるＲ¹）が除去される。トリプシンでの酵素反応は、その切断によりヒトインスリンが生産されるペプチド結合を切断するだけでなく、競合反応において、その切断により多数の望ましくない副産物が生産される他のペプチド結合も切断する。式１で示されるアミノ酸残基Ｂ２９とＢ３０との間をさらに切断することによる脱Ｔｈｒインスリンの形成（ＥＰ０２６４２５０（Ｂ１）を参照）が、特に望ましくない。それに続く精製段階でこの副産物を除去すると、生成物が大量に失われる。この望ましくない副作用を抑制するためには、プレプロインスリンの初期濃度をできるだけ高く、すなわち８〜２５ｇ／ｌ（これは１〜３ｍＭに相当する）の範囲にする必要がある（ＥＰ０２６４２５０（Ｂ１）を参照）。この必要性は、２つ前の段落で述べられた必要性と対照的である。 In the subsequent part of the insulin production process, preproinsulin is converted to human insulin by the enzymes trypsin and carboxypeptidase B (Kemmler, W., Peterson, JD and Steiner, DF, J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791). In this case, the linker peptide between the A chain and the B chain (X in Formula 1) and the portion preceding the amino terminus of the B chain (R ¹ in Formula ¹ ) are removed. The enzymatic reaction with trypsin not only cleaves the peptide bond from which the human insulin is produced by its cleavage, but also cleaves other peptide bonds in the competition reaction that produce a number of undesirable byproducts. The formation of de-Thr insulin by further cleavage between amino acid residues B29 and B30 of formula 1 (see EP0 264 250 (B1)) is particularly undesirable. Removal of this byproduct in a subsequent purification step results in a large amount of product loss. In order to suppress this undesirable side effect, the initial concentration of preproinsulin needs to be as high as possible, ie in the range of 8-25 g / l (which corresponds to 1-3 mM) (EP0 264 250 (B1) See). This need is in contrast to the needs stated in the previous paragraph.

上記から明白であるが、プレプロインスリン生産と、プレプロインスリンのインスリンへの切断の間に、ポリマー状のプレプロインスリンをできるだけ徹底的に除去し、同時に、単量体プレプロインスリン濃度をできるだけ多く増加させる追加のプロセス工程を導入することが有利である。このプロセス工程において極めて高い収率を確実にするには、追加の条件が必要である。 As is apparent from the above, during preproinsulin production and cleavage of preproinsulin into insulin, the addition of removing polymeric preproinsulin as thoroughly as possible and at the same time increasing the monomeric preproinsulin concentration as much as possible It is advantageous to introduce the following process steps. Additional conditions are required to ensure a very high yield in this process step.

従って、疎水性の吸着性樹脂でプレプロインスリンを濃縮することが提唱されてきた（ＥＰ０６００３７２（Ｂ１））。本出願人は、高い濃度係数（Ｆ＝１０〜１５）は達成可能であるが、実質的にはポリマー状のプレプロインスリンは除去されていないことを自身の実験で示すことができた。その他の提案（Ｄ．Ｆ．Ｓｔｅｉｎｅｒ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１７（１９６８年），７２５〜７３６）では、イオン交換樹脂を用いたプレプロインスリンのクロマトグラフィーの精製が述べられている。我々の実験において、我々は、陰イオン交換樹脂を用いて、濃度係数Ｆ＝５、および、より高分子量の区分を約５％になるまで除去することしかできなかった。陽イオン交換樹脂を用いてより高分子量の区分を約１％になるまで除去したが、樹脂のプレプロインスリンに対する結合能力が不十分であることがわかった。 Therefore, it has been proposed to concentrate preproinsulin with a hydrophobic adsorbent resin (EP0 600 372 (B1)). Applicants have been able to show in their experiments that a high concentration factor (F = 10-15) is achievable, but substantially no polymeric preproinsulin has been removed. Other proposals (DF Steiner et al., Diabetes, 17 (1968), 725-736) describe chromatographic purification of preproinsulin using ion exchange resins. In our experiments, we could only remove the concentration factor F = 5 and higher molecular weight fractions to about 5% using an anion exchange resin. Although the higher molecular weight fraction was removed to about 1% using a cation exchange resin, it was found that the binding capacity of the resin to preproinsulin was insufficient.

続いて、驚くべきことに、フロースルー式の陰イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーと、その直後の吸着式の陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーの組み合わせが、明らかに優れた結果を提供することがわかった。それゆえに、本発明は、同時に高濃度の単量体プレプロインスリンを含むプレプロインスリン水溶液から、より高分子量の物質を効果的に除去する方法に関する。 Surprisingly, the combination of chromatography on a flow-through anion exchange resin and the chromatography on an adsorbing cation exchange resin immediately afterwards clearly provides excellent results. all right. Therefore, the present invention relates to a method for effectively removing higher molecular weight substances from an aqueous preproinsulin solution containing a high concentration of monomeric preproinsulin at the same time.

本発明によれば、インスリン製造プロセス中に生産されるようなプレプロインスリンの希釈水溶液は、陰イオン交換樹脂が充填されたプレカラム（例えばＳｏｕｒｃｅ３０Ｑ）を、ｐＨ７.０〜９.０、好ましくはｐＨ７.５〜８.５で、伝導率５〜７ｍＳ／ｃｍで通過して送り出される。この場合、単量体プレプロインスリンは、樹脂に結合しないが、透過液と共にカラムを通過する。それに対して、ポリマー状のプレプロインスリンを含むより高い分子量の物質の大部分は樹脂に吸着し、プレプロインスリンから除去される。この対象の物質を含むプレカラムからの透過液は、ライン上で塩酸を用いてｐＨ３.０〜５.５、好ましくはｐＨ４.０〜５.０に調節され、続いて、直接的に、陽イオン交換樹脂が充填された第二のカラム（例えばＳｏｕｒｃｅ３０Ｓ）に送り出される。プレプロインスリンはこの樹脂に吸着され、不純物は、透過液と共にカラムから洗浄される。プレプロインスリンは、濃度を１〜２０ｇ／ｌ、好ましくは２.５〜１５.０ｇ／ｌに直線的に増加させた塩化ナトリウム含有溶出緩衝液で脱離させる。精製したプレプロインスリンは、主画分に回収され、その一方でさらなる不純物は、前の画分と後の画分で除去される。プレプロインスリンの初期量の＞９０％を含む主画分において、測定された濃度は１５〜２０ｇ／Ｌであった（濃度係数Ｆ＝２０〜２５）。より高分子量の物質は、＜０.１％になるまで除去された。この方法で精製したプレプロインスリンは、途中で結晶化させることにより溶液から単離してもよいし、または、溶液を酵素による切断プロセス段階に直接供給してもよい。 According to the present invention, a dilute aqueous solution of preproinsulin as produced during the insulin production process is applied to a precolumn (eg, Source 30Q) packed with an anion exchange resin, pH 7.0-9.0, preferably pH 7. It is sent out with a conductivity of 5-7 mS / cm at 5-8.5. In this case, monomeric preproinsulin does not bind to the resin but passes through the column with the permeate. In contrast, most of the higher molecular weight materials, including polymeric preproinsulin, adsorb to the resin and are removed from the preproinsulin. The permeate from the pre-column containing the substance of interest is adjusted to pH 3.0-5.5, preferably pH 4.0-5.0 using hydrochloric acid on the line, followed by cation directly. It is sent out to a second column (for example, Source 30S) filled with exchange resin. Preproinsulin is adsorbed to the resin and impurities are washed from the column along with the permeate. Preproinsulin is desorbed with an elution buffer containing sodium chloride whose concentration is linearly increased to 1-20 g / l, preferably 2.5-15.0 g / l. Purified preproinsulin is collected in the main fraction while further impurities are removed in the previous and subsequent fractions. In the main fraction containing> 90% of the initial amount of preproinsulin, the measured concentration was 15-20 g / L (concentration factor F = 20-25). Higher molecular weight material was removed to <0.1%. The preproinsulin purified in this way may be isolated from the solution by crystallization in the middle, or the solution may be fed directly to the enzymatic cleavage process step.

従って、本発明は、式１：

で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法に関し、 Thus, the present invention provides the formula 1:

A method for chromatographic purification of preproinsulin represented by:

式中、Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ）であり、および、３個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も２個の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ）
であり、
Ｒ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応し； Where X is
a) a genetically codeable amino acid residue, or
b) a peptide having 2 to 35 amino acid residues, where the first and last are both basic amino acid residues (especially Arg) and consist of more than 3 amino acid residues Two basic amino acid residues (especially Arg and / or Lys), both first and last
And
R ¹ is
a) hydrogen,
b) a genetically codeable amino acid residue, or
c) a peptide having 2 to 15 amino acid residues,
R ² is a genetically codeable amino acid residue, and
Residues A1-A20 correspond to the amino acid sequence of the A chain of human insulin or insulin analog, and residues B1-B30 correspond to the amino acid sequence of the B chain of human insulin or insulin analog;

本方法において、より高分子量の物質が、フロースルー式の陰イオン交換体での第一のクロマトグラフィー、および、それに続く吸着式の陽イオン交換体での第二のクロマトグラフィーによって、前記プレプロインスリンの水溶液から除去される；
ここで、前記プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列を有し得る：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ；（配列番号２）
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；（配列番号３）
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４）。 In this method, the higher molecular weight material is obtained by the first chromatography on a flow-through anion exchanger followed by the second chromatography on an adsorptive cation exchanger. Removed from an aqueous solution of
Here, the preproinsulin may have the following amino acid sequence:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro -Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln -Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn; (SEQ ID NO: 2)
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-S r-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly; (SEQ ID NO: 3)
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys- Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-G n-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 4).

本発明はさらに、インスリンの変性を誘導するプレプロインスリンの溶液から外来物質を分離するための上記方法に関する。 The invention further relates to the above method for separating foreign substances from a solution of preproinsulin that induces the degeneration of insulin.

本発明はさらに、前記第二のクロマトグラフィーは、ｐＨ３.０〜５.５で行われる、上記方法に関する。 The present invention further relates to the above method, wherein the second chromatography is carried out at a pH of 3.0 to 5.5.

本発明はさらに、前記第二のクロマトグラフィーは、圧力１〜３０ｂａｒで行われる、上記方法に関する。 The present invention further relates to the above method, wherein said second chromatography is carried out at a pressure of 1-30 bar.

本発明はさらに、フォールディングされていないプレプロインスリンを発現することによってインスリンを製造する方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）フォールディングされていないプレプロインスリンを発現する遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
ｂ）前記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
ｃ）未溶解のフォールディングされていないプレプロインスリンを含む封入体を単離する工程、
ｄ）ペプチド鎖が正しくフォールディングしたプレプロインスリンを溶解させ、同時にジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得て、それに続いて、上述の式１で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法を行う工程、
ｅ）プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
ｆ）ヒトインスリンを精製する工程、
ｇ）ヒトインスリンを結晶化し、乾燥させる工程。
以下で本発明をより詳細に説明するが、これに限定されない。 The invention further relates to a method of producing insulin by expressing unfolded preproinsulin, which method comprises the following steps:
a) fermenting a genetically engineered microorganism that expresses unfolded preproinsulin;
b) recovering the microorganism and disrupting the cells;
c) isolating inclusion bodies containing undissolved unfolded preproinsulin;
d) dissolving preproinsulin in which the peptide chain is correctly folded, and simultaneously linking disulfide bridges to obtain preproinsulin, followed by the chromatographic purification method of preproinsulin represented by the above formula 1;
e) cleaving preproinsulin with an enzyme to obtain human insulin;
f) purifying human insulin;
g) Crystallizing and drying human insulin.
The present invention is described in more detail below, but is not limited thereto.

以下の実施例１〜３に記載の、式１で示される様々なプレプロインスリンを精製するための出発溶液を、以下のような既知の方法（ＥＰ０４８９７８０、および、ＥＰ０６００３７２）で、上述のプロセスの段階ａ、ｂ、ｃおよびｄに従って製造した：
微生物の発酵（プロセス段階ａ）の間、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、プレプロインスリンのアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む封入体を形成した。発酵終了後、この細胞を遠心分離で単離し、通常の高圧ホモジナイズによって崩壊させた（プロセス段階ｂ）。このプロセスで放出された不溶性の封入体を遠心分離で単離し、遠心分離機中で水で洗浄した（プロセス段階ｃ）。それに続くプロセス段階ｄで、融合タンパク質の封入体を８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ１０.８）に溶解させた。水で希釈し、塩酸システインを加えた後、３個のジスルフィド架橋をｐＨ１０.８、４℃で連結させて融合タンパク質をフォールディングさせ、式１で示されるプレプロインスリンを得た。次に、この溶液を１０％濃度の塩酸を用いてｐＨ５に調整し、その結果として外来タンパク質を沈殿させ、この沈殿を遠心分離で除去した。遠心分離後の上清は、０.６〜０.８ｇ／ｌの単量体プレプロインスリンを含んでいた。プレプロインスリンの純度は、ＨＰＬＣ−ＲＰ分析で測定したところ、面積で約６５％であった。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析により、より高分子量の不純物は、面積で約４５％の割合と測定された。 The starting solutions for purifying the various preproinsulins of formula 1 described in Examples 1 to 3 below are prepared as described above by known methods (EP0 489 780 and EP0 600 372) as described below. Prepared according to process steps a, b, c and d of:
During microbial fermentation (process step a) E. coli cells formed inclusion bodies containing a fusion protein having the amino acid sequence of preproinsulin. After fermentation, the cells were isolated by centrifugation and disrupted by normal high pressure homogenization (process step b). Insoluble inclusion bodies released in this process were isolated by centrifugation and washed with water in a centrifuge (process step c). In the subsequent process step d, the inclusion body of the fusion protein was dissolved in 8M guanidine hydrochloride solution (pH 10.8). After diluting with water and adding cysteine hydrochloride, three disulfide bridges were ligated at pH 10.8 and 4 ° C. to fold the fusion protein to obtain preproinsulin represented by Formula 1. Next, this solution was adjusted to pH 5 using 10% strength hydrochloric acid, and as a result, foreign protein was precipitated, and this precipitate was removed by centrifugation. The supernatant after centrifugation contained 0.6-0.8 g / l monomeric preproinsulin. The purity of preproinsulin was about 65% in area as measured by HPLC-RP analysis. By HPLC-GPC analysis, higher molecular weight impurities were determined to be about 45% area.

ＨＰＬＣ−ＲＰ分析

HPLC-RP analysis

ローディング溶液中のプレプロインスリン含量を決定するため、分析されたサンプル中のプレプロインスリンのピーク面積を、対応する標準物質のピーク面積で割った。純度を決定するために、プレプロインスリンのピーク面積を、分析されたサンプル中の全ての溶出可能な物質のピーク面積の合計で割った。 To determine the preproinsulin content in the loading solution, the peak area of preproinsulin in the analyzed sample was divided by the peak area of the corresponding standard. To determine purity, the peak area of preproinsulin was divided by the sum of the peak areas of all eluting substances in the analyzed sample.

ＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析

HPLC-GPC analysis

より高分子量の物質の区分を測定するために、単量体プレプロインスリンの前に溶出させた全てのより高分子量の物質のピーク面積を、全ての溶出可能な物質のピーク面積の合計で割った。標準物質を用いて単量体プレプロインスリンの保持時間を決定した。 In order to determine the fraction of higher molecular weight substances, the peak areas of all higher molecular weight substances eluted before the monomeric preproinsulin were divided by the sum of the peak areas of all eluting substances. . The retention time of monomeric preproinsulin was determined using a standard substance.

実施例１
上述のプロセスの段階ａ、ｂ、ｃおよびｄが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から得た：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号２）。 Example 1
After completion of steps a, b, c and d of the above-described process, a solution of preproinsulin having the following amino acid sequence was appropriately engineered E. coli. obtained from E. coli cells:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-S r-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 2).

前記プレプロインスリンは、式１に相当し、式中、
Ｘは、サルのＣペプチドの配列を含む３５個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ¹は、配列：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５）の１０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ²は、アミノ酸残基Ａｓｎであり（ヒトインスリンのＡ鎖のＡ２１と同一）、
Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンのＡ鎖の配列を有する（Ａ１〜Ａ２０のみ）ペプチド鎖であり、
Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンのＢ鎖の配列を有するペプチド鎖である。 Said preproinsulin corresponds to formula 1, wherein
X is a peptide chain having 35 amino acid residues including the sequence of the monkey C peptide;
R ¹ is a peptide chain having 10 amino acid residues of the sequence: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 5);
R ² is the amino acid residue Asn (identical to A21 of the A chain of human insulin),
A1 to A20 are peptide chains having the sequence of the A chain of human insulin (only A1 to A20),
B1 to B30 are peptide chains having the sequence of the B chain of human insulin.

主として、連続して配置された２つのクロマトグラフィーカラム、および、その間に配置された撹拌容器を含む装置を用いて、プレプロインスリン溶液を精製した。２つのカラムの間のライン上で溶液のｐＨを変化させるために、撹拌容器を用いた。 The preproinsulin solution was purified primarily using an apparatus comprising two chromatography columns placed in series and a stirred vessel placed between them. A stirred vessel was used to change the pH of the solution on the line between the two columns.

第一のクロマトグラフィーカラムにおいて（製造元：ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），直径：５ｃｍ）、ゲルベッド（ベッド高さ：１４ｃｍ，ベッド体積：２７５ｍｌ）を、陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−セファロース・ファスト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｆａｓｔｆｌｏｗ）（製造元：ファルマシア・バイオテク（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）；製品番号１７−０７０９−０５）を用いて製造した。カラムを上から下へ大気圧１ｂａｒで稼動させた。流速は２０００ｍｌ／ｈとした。多重バルブ、ローディングポンプ（ＩｓｍａｔｅｃＭＶ）、および、バブルトラップをカラムの上流に取り付けた。以下の溶液を連続的にカラムに多重バルブを介して送り出した：
８.１Ｌのローディング溶液、
２.３Ｌの置換用緩衝液、
１.４Ｌの洗浄緩衝液、
１.４Ｌの再生溶液、
２Ｌの平衡緩衝液。 In the first chromatography column (manufacturer: Pharmacia, diameter: 5 cm), the gel bed (bed height: 14 cm, bed volume: 275 ml) was subjected to the anion exchange resin DEAE-Sepharose Fast Flow (Sepharose).
fast flow (manufacturer: Pharmacia Biotech; product no. 17-0709-05). The column was operated from top to bottom at 1 bar atmospheric pressure. The flow rate was 2000 ml / h. Multiple valves, a loading pump (Ismatec MV), and a bubble trap were attached upstream of the column. The following solutions were continuously delivered to the column via multiple valves:
8.1 L loading solution,
2.3 L replacement buffer,
1.4 L wash buffer,
1.4 L regeneration solution,
2 L equilibration buffer.

ＵＶプローブ（２７５ｎｍ，データの記録を伴う）およびその他の多重バルブをカラムの下流に取り付けた。第二の多重バルブを介して、約１０.２Ｌの透過液画分を上述の撹拌容器に導き、続いて、約１Ｌの洗浄画分を回収容器に導いた。残存した透過液を、多重バルブを介して生物学的廃棄物チャンネルに排出した。 A UV probe (275 nm, with data recording) and other multiple valves were mounted downstream of the column. Through the second multiple valve, about 10.2 L of permeate fraction was directed to the stirring vessel described above, followed by about 1 L of the washed fraction to the collection vessel. The remaining permeate was drained into the biological waste channel via multiple valves.

陰イオン交換クロマトグラフィーをフロースルー式で稼動させ、すなわち、価値のある物質のプレプロインスリンがゲルには結合せずに、生成物を適用する間に透過液と共にカラムを通過して洗浄されるような条件を選択した（ｐＨ８.３；伝導率＝６.１ｍＳ／ｃｍ）。それに対して、汚染物質はゲルに吸着し、洗浄緩衝液と再生溶液で除去された。 The anion exchange chromatography is run in a flow-through manner, i.e. the valuable substance preproinsulin does not bind to the gel and is washed through the column with the permeate during application of the product. Conditions were selected (pH 8.3; conductivity = 6.1 mS / cm). In contrast, contaminants adsorbed on the gel and were removed with wash buffer and regeneration solution.

用いられた溶液は、以下の組成を有する： The solution used has the following composition:

カラム１用の出発溶液：

Starting solution for column 1:

カラム１および２のための再生溶液：

Regeneration solution for columns 1 and 2:

カラム１のための平衡緩衝液：

Equilibration buffer for column 1:

価値のある物質のプレプロインスリンを含む透過液分画、および、より高い分子量の不純物の大部分を含む洗浄分画をカラムアウトレットで回収した：
１．約１０.２Ｌ透過液画分
（生成物を置換する間、溶液ローディングの開始時はＵＶ値２０％から始め（上昇）、ＵＶ値３５％にする（下降））
２．約１Ｌ洗浄画分
（洗浄緩衝液のローディングの際はＵＶ値３０％から始め（上昇勾配）、ＵＶ値４０％にする（下降））。 The permeate fraction containing the valuable substance preproinsulin and the wash fraction containing most of the higher molecular weight impurities were collected at the column outlet:
1. About 10.2 L permeate fraction (While replacing the product, at the beginning of solution loading, start with a UV value of 20% (rising) and a UV value of 35% (falling))
2. Approximately 1 L wash fraction (when loading wash buffer, start with UV value of 30% (ascending gradient), UV value 40% (decrease)).

その他全ての透過液を、生物学的廃棄物チャンネルに排出した。 All other permeate was drained to the biological waste channel.

図１は、カラム１のアウトレットで測定されたＵＶ図を示す。 FIG. 1 shows a UV diagram measured at the outlet of column 1.

第一のカラムの透過液画分を、ライン上で中間に存在する容器（基準体積：４Ｌ，撹拌しながら，ｐＨプローブおよびインレットチューブ）中で９０％濃度の乳酸でｐＨ３.５に調節し、次に、第二のクロマトグラフィーカラムに直接送り出した。 The permeate fraction of the first column is adjusted to pH 3.5 with 90% lactic acid in a container (reference volume: 4 L, stirring, pH probe and inlet tube) in the middle of the line, It was then sent directly to the second chromatography column.

第二のクロマトグラフィーカラム（製造元：ファルマシア，直径：５ｃｍ）において、ゲルベッド（ベッド高さ：１０.５ｃｍ，ベッド体積：２０６ｍｌ）を、陽イオン交換樹脂Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｓ（製造元：ファルマシア・バイオテク；製品番号１７−１２７３−０４）を用いて製造した。カラムを上から下へ大気圧１ｂａｒで稼動させた。同様に流速は２０００ｍｌ／ｈであった。多重バルブ、ローディングポンプ、および、バブルトラップをカラムの上流に取り付けた。以下の溶液を連続的にカラムに多重バルブを介して送り出した：
１０.２Ｌローディング溶液（＝カラム１の透過液分画，ｐＨ３.５に調節）
０.５Ｌ置換用緩衝液当量
３.０Ｌ溶出緩衝液Ａ／Ｂ（等量のＡおよびＢ）
２.３Ｌ再生溶液
２Ｌ平衡緩衝液。 In the second chromatography column (manufacturer: Pharmacia, diameter: 5 cm), the gel bed (bed height: 10.5 cm, bed volume: 206 ml) was added to the cation exchange resin Source 30S (manufacturer: Pharmacia Biotech; product number 17- 1273-04). The column was operated from top to bottom at 1 bar atmospheric pressure. Similarly, the flow rate was 2000 ml / h. Multiple valves, loading pumps, and bubble traps were attached upstream of the column. The following solutions were continuously delivered to the column via multiple valves:
10.2 L loading solution (= permeate fraction of column 1 adjusted to pH 3.5)
0.5 L displacement buffer equivalent 3.0 L elution buffer A / B (equal amounts of A and B)
2.3 L regeneration solution 2 L equilibration buffer.

ＵＶプローブ（２７５ｎｍ，データの記録を伴う）およびその他の多重バルブをカラムの下流に取り付けた。約１Ｌの主画分を、第二の多重バルブを介して回収容器に導いた。残存した透過液を多重バルブを介して生物学的廃棄物チャンネルに排出した。 A UV probe (275 nm, with data recording) and other multiple valves were mounted downstream of the column. About 1 L of main fraction was led to the collection vessel via the second multiple valve. The remaining permeate was drained into the biological waste channel via multiple valves.

陽イオン交換体クロマトグラフィーを、吸着式で稼動させ、すなわち生成物を適用する間、価値のある物質のプレプロインスリンをゲルに吸着させ、（ローディング溶液を排出させた後）、溶出緩衝液Ａ／Ｂを用いて再び脱離させた。最適な精製効果を達成するために、直線的に増加する塩化ナトリウム濃度勾配を、溶出緩衝液に適用した。 The cation exchanger chromatography is run in an adsorptive manner, ie, while applying the product, the valuable substance preproinsulin is adsorbed to the gel (after draining the loading solution) and the elution buffer A / Desorption again with B. In order to achieve an optimal purification effect, a linearly increasing sodium chloride concentration gradient was applied to the elution buffer.

カラム２用のローディング溶液：

Loading solution for column 2:

カラム２用の置換用緩衝液：

Replacement buffer for column 2:

カラム２用の溶出緩衝液Ａ：
溶出緩衝液Ａはカラム２用の置換用緩衝液と同一である。 Elution buffer A for column 2:
Elution buffer A is the same as the replacement buffer for column 2.

カラム２用の溶出緩衝液Ｂ：

Elution buffer B for column 2:

カラム１および２用の再生溶液：

Regeneration solution for columns 1 and 2:

カラム２用の平衡緩衝液：

Equilibration buffer for column 2:

価値のある物質のプレプロインスリンを含む主要な画分をカラムアウトレットで回収した：
約１.０Ｌ主画分
（溶出中、ＵＶ値６５％から始め（上昇）、ＵＶ値７６％（下降）にする）。 The main fraction containing the valuable substance preproinsulin was collected at the column outlet:
About 1.0 L main fraction (during elution, starting with a UV value of 65% (rising) and UV value of 76% (falling)).

図２は、カラム２のアウトレットで測定されたＵＶ図を示す。 FIG. 2 shows a UV diagram measured at the outlet of column 2.

精製した溶液（カラム２の主要な画分）において、面積で純度が８９％の１５ｇ／Ｌのプレプロインスリンを測定した（ＨＰＬＣ−ＲＰ分析）。収率は、出発溶液中のプレプロインスリンの量に基づき９１％であった。面積でより高分子量の区分は、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析で０.２％と測定された。 In the purified solution (the main fraction of column 2), 15 g / L preproinsulin having an area purity of 89% was measured (HPLC-RP analysis). The yield was 91% based on the amount of preproinsulin in the starting solution. The higher molecular weight section by area was determined to be 0.2% by HPLC-GPC analysis.

実施例２
上述のプロセスの段階ａ、ｂ、ｃおよびｄが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から得た：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｉａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号３）。 Example 2
After completion of steps a, b, c and d of the above-described process, a solution of preproinsulin having the following amino acid sequence was appropriately engineered E. coli. obtained from E. coli cells:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Aia-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-S r-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly (SEQ ID NO: 3).

前記プレプロインスリンは、式１に相当し、
式中、
Ｘは、サルのＣペプチドの配列を含む３５個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ¹は、配列：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５）の１０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ²は、アミノ酸残基Ｇｌｙであり、
Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンのＡ鎖の配列を有する（Ａ１〜Ａ２０のみ）ペプチド鎖であり、
Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンのＢ鎖の配列を有するペプチド鎖である。 The preproinsulin corresponds to Formula 1,
Where
X is a peptide chain having 35 amino acid residues including the sequence of the monkey C peptide;
R ¹ is a peptide chain having 10 amino acid residues of the sequence: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 5);
R ² is the amino acid residue Gly,
A1 to A20 are peptide chains having the sequence of the A chain of human insulin (only A1 to A20),
B1 to B30 are peptide chains having the sequence of the B chain of human insulin.

プレプロインスリン溶液を、主として、連続して配置された２つのクロマトグラフィーカラム、および、その間に配置された撹拌容器を含む装置を用いて再び精製した。撹拌容器を用いて、２つのカラムの間で溶液のｐＨを変化させた。第二のクロマトグラフィー段階の装置は、圧力の安定性のために設計された。 The preproinsulin solution was purified again mainly using an apparatus comprising two chromatography columns placed in series and a stirring vessel placed between them. A stirred vessel was used to change the pH of the solution between the two columns. The second chromatographic stage apparatus was designed for pressure stability.

実施例１で説明した通りに、カラム１のクロマトグラフィーと、中間に存在する容器でのｐＨ切り替えを行った（従って、ここでの説明および値は省略する）。 As described in Example 1, the chromatography of column 1 and the pH switching in the container existing in the middle were performed (therefore, description and values here are omitted).

第二のクロマトグラフィーカラム（製造元：プロクロム（Ｐｒｏｃｈｒｏｍ），直径：５ｃｍ，材質：ステンレス鋼）において、ゲルベッド（ベッド高さ：１０ｃｍ，ベッド体積：１９６ｍｌ）を、陽イオン交換体Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｓ（製造元：ファルマシア・バイオテク；製品番号：１７−１２７３−０４）を用いて製造した。このカラムを、上から下へ、稼動圧力１０ｂａｒで稼動させた。流速は、３５００ｍｌ／ｈであった。多重バルブ、ローディングポンプ（製造元：ベスタ（Ｂｅｓｔａ）；タイプ：ＨＤ２−３００）をカラムの上流に取り付けた。以下の溶液を連続的にカラムに多重バルブを介して送り出した：
１０.２Ｌローディング溶液（＝カラム１の透過液分画，ｐＨ４.６に調節）
０.５Ｌ置換用緩衝液
３.０Ｌ溶出緩衝液Ａ／Ｂ（等量のＡおよびＢ）
２.３Ｌ再生溶液
２Ｌ平衡緩衝液。 In the second chromatography column (manufacturer: Prochrom, diameter: 5 cm, material: stainless steel), the gel bed (bed height: 10 cm, bed volume: 196 ml) was placed on the cation exchanger Source 30S (manufacturer: Pharmacia Biotech; product number: 17-1273-04). The column was operated from top to bottom at an operating pressure of 10 bar. The flow rate was 3500 ml / h. A multiple valve, loading pump (manufacturer: Besta; type: HD2-300) was mounted upstream of the column. The following solutions were continuously delivered to the column via multiple valves:
10.2 L loading solution (= permeate fraction of column 1 adjusted to pH 4.6)
0.5 L displacement buffer 3.0 L elution buffer A / B (equal amounts of A and B)
2.3 L regeneration solution 2 L equilibration buffer.

ＵＶプローブ（２７５ｎｍ，データの記録を伴う）およびその他の多重バルブをカラムの下流に取り付けた。精製したプレプロインスリンを含む主画分を、第二の多重バルブを介して回収容器に導いた。残存した透過液を多重バルブを介して生物学的廃棄物チャンネルに排出した。 A UV probe (275 nm, with data recording) and other multiple valves were mounted downstream of the column. The main fraction containing purified preproinsulin was led to a collection vessel via a second multiple valve. The remaining permeate was drained into the biological waste channel via multiple valves.

カラム２用のローディング溶液：

Loading solution for column 2:

カラム２用の置換用緩衝液：

Replacement buffer for column 2:

カラム２用の溶出緩衝液Ａ：
溶出緩衝液Ａは、カラム２用の置換用緩衝液と同一である。 Elution buffer A for column 2:
Elution buffer A is the same as the replacement buffer for column 2.

カラム２用の溶出緩衝液Ｂ：

Elution buffer B for column 2:

カラム１および２用の再生溶液：

Regeneration solution for columns 1 and 2:

カラム２用の平衡緩衝液：

Equilibration buffer for column 2:

価値のある物質のプレプロインスリンを含む主画分をカラムアウトレットで回収した：
約０.９Ｌ主画分（溶出中、ＵＶ値６５％から始め（上昇）、ＵＶ値７６％（下降）にする）
その他全ての透過液を、生物学的廃棄物チャンネルに排出した。 The main fraction containing the valuable substance preproinsulin was collected at the column outlet:
About 0.9L main fraction (During elution, start from 65% UV value (rising) and to 76% UV value (falling))
All other permeate was drained to the biological waste channel.

精製した溶液（カラム２の主画分）において、１７ｇ／Ｌのプレプロインスリンは、面積で純度が９３％であると測定した（ＨＰＬＣ−ＲＰ分析）。収率は、出発溶液中のプレプロインスリンの量に基づき９２％であった。より高分子量の区分は、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析で面積で＜０.１％と測定された。 In the purified solution (main fraction of column 2), 17 g / L preproinsulin was measured to be 93% pure in area (HPLC-RP analysis). The yield was 92% based on the amount of preproinsulin in the starting solution. The higher molecular weight category was determined to be <0.1% in area by HPLC-GPC analysis.

実施例３
上述のプロセスの段階ａ、ｂ、ｃおよびｄが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から得た：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４）。 Example 3
After completion of steps a, b, c and d of the above-described process, a solution of preproinsulin having the following amino acid sequence was appropriately engineered E. coli. obtained from E. coli cells:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu
-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu -Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 4).

前記プレプロインスリンは、式１に相当し、
式中、
Ｘは、配列：Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１）の２９個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ¹は、配列：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号５）の１０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
Ｒ²は、アミノ酸残基Ａｓｎ（ヒトインスリンのＡ鎖のＡ２１）であり、
Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンのＡ鎖の配列を有する（Ａ１〜Ａ２０のみ）ペプチド鎖であり、
Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンのＢ鎖と類似した配列を有する、すなわちＢ３位のＶａｌをＬｙｓで置換し、Ｂ２９位のＬｙｓをＧｌｕで置換したペプチド鎖である。 The preproinsulin corresponds to Formula 1,
Where
X is the sequence: Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu -A peptide chain having 29 amino acid residues of Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg (SEQ ID NO: 1),
R ¹ is a peptide chain having 10 amino acid residues of the sequence: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 5);
R ² is the amino acid residue Asn (A21 of the A chain of human insulin)
A1 to A20 are peptide chains having the sequence of the A chain of human insulin (only A1 to A20),
B1 to B30 are peptide chains having a similar sequence to the B chain of human insulin, that is, Val at position B3 is replaced with Lys, and Lys at position B29 is replaced with Glu.

実施例１で用いたのと同じ装置を用いてプレプロインスリン溶液を精製した。 The preproinsulin solution was purified using the same equipment used in Example 1.

この時、カラム１のクロマトグラフィーには、陰イオン交換樹脂Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ（製造元：ファルマシア・バイオテク；製品番号：１７−１２７５−０４）が用いられた。このゲルの再生には、実施例１および２と比べて２倍量の再生溶液が必要であった。第一のクロマトグラフィーの残りのパラメーター、例えば溶液の組成と量は、実施例１および２で説明されたのと同じである。 At this time, an anion exchange resin Source 30Q (manufacturer: Pharmacia Biotech; product number: 17-1275-04) was used for column 1 chromatography. The regeneration of this gel required twice as much regeneration solution as in Examples 1 and 2. The remaining parameters of the first chromatography, such as the composition and amount of the solution, are the same as described in Examples 1 and 2.

同様に、中間に存在する容器でｐＨ切り替えを実施例１で説明された通りに行った。 Similarly, pH switching was performed as described in Example 1 in the intermediate container.

ここで、第二のクロマトグラフィーを稼動圧力１５ｂａｒで行った。第二のクロマトグラフィーのその他全てのパラメーターは、実施例２で説明されたのと同一である。 Here, a second chromatography was carried out at an operating pressure of 15 bar. All other parameters of the second chromatography are the same as described in Example 2.

精製した溶液（カラム２の主画分）において、１７ｇ／Ｌのプレプロインスリンの純度は、面積で９２.５％であると測定された（ＨＰＬＣ−ＲＰ分析）。収率は、出発溶液中のプレプロインスリンの量に基づき９１％であった。より高分子量の区分は、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ分析で面積で＜０.１％と測定された。 In the purified solution (main fraction of column 2), the purity of 17 g / L preproinsulin was measured to be 92.5% by area (HPLC-RP analysis). The yield was 91% based on the amount of preproinsulin in the starting solution. The higher molecular weight category was determined to be <0.1% in area by HPLC-GPC analysis.

変性分析
変性分析（表１）により、フォールディング反応中に生産されたより高分子量のポリマー状のプレプロインスリンが、天然インスリンの変性を誘導できることを示す。 Denaturation analysis Denaturation analysis (Table 1) shows that higher molecular weight polymeric preproinsulin produced during the folding reaction can induce denaturation of natural insulin.

変性分析において、実施例２で説明されたプレプロインスリンを酵素で切断することによって得られる未変性のインスリングラルギン（アベンティス・ドイツ社（ＡｖｅｎｔｉｓＤｅｕｔｓｃｈｌａｎｄＧｍｂＨ）製品）を結晶化した。驚くべきことに、我々は、インスリングラルギンの結晶化条件下（ｐＨ６.１、および、２６℃）で、インスリンの変性を誘導し得る物質を結晶化混合物に加えると未変性インスリンの変性が起こることを、全実験において示すことができた。 In denaturation analysis, native insulin glargine (Aventis Deutschland GmbH product) obtained by enzymatic cleavage of the preproinsulin described in Example 2 was crystallized. Surprisingly, we found that denaturation of native insulin occurs when a substance capable of inducing insulin denaturation is added to the crystallization mixture under the crystallization conditions of insulin glargine (pH 6.1 and 26 ° C.). Could be shown in all experiments.

以下の組成の、結晶化混合物用の標準溶液を製造した：
インスリングラルギン５ｇ／Ｌ
クエン酸５.２ミリモル／Ｌ
塩化亜鉛３ミリモル／Ｌ
塩化ナトリウム０.５ｇ／Ｌ
ｎ−プロパノール７％（ｖ／ｖ）
純水で５００ｍｌにし、
１Ｎ塩酸を用いて、ｐＨ３にした。 A standard solution for the crystallization mixture was prepared with the following composition:
Insulin glargine 5g / L
Citric acid 5.2mmol / L
Zinc chloride 3mmol / L
Sodium chloride 0.5g / L
n-propanol 7% (v / v)
Make 500 ml with pure water,
The pH was adjusted to 3 using 1N hydrochloric acid.

この溶液を孔の幅が０.１μｍのメンブレンフィルターでろ過した。 This solution was filtered through a membrane filter having a pore width of 0.1 μm.

変性分析において、この酸性の標準溶液を様々な分析物質の溶液と混合した：除去されたポリマー状のプレプロインスリンを濃度５ｇ／Ｌで含むカラム１の洗浄画分、または、精製したプレプロインスリンをそれぞれ１５および１７ｇ／Ｌ濃度で含むカラム２の主画分。インスリンの変性により観察された現象が引き起こされるというさらなる証拠のために、０.１％濃度のポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１７１のストック水溶液（１０ｍｌ）を加えた。ポロキサマー１７１は、疎水性界面でインスリンの変性を抑制することがわかっている（Ｈ．ＴｈｕｒｏｗａｎｄＫ．Ｇｅｉｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９８４年）２７，２１２〜２１８、および、ＥＰ００１８６０９）。 In denaturation analysis, this acidic standard solution was mixed with solutions of various analytes: column 1 wash fraction containing removed polymeric preproinsulin at a concentration of 5 g / L, or purified preproinsulin, respectively. Column 2 main fraction containing 15 and 17 g / L concentrations. For further evidence that the phenomenon observed by insulin denaturation was caused, a 0.1% concentration of Poloxamer 171 stock aqueous solution (10 ml) was added. Poloxamer 171 has been shown to inhibit insulin denaturation at the hydrophobic interface (H. Therow and K. Geisen, Diabetologia (1984) 27, 212-218, and EP0 018 609).

次に、この溶液を２６℃に加熱し、１０％濃度の水酸化ナトリウム溶液で撹拌しながらｐＨ６.１に調節し、無晶性インスリンの沈殿を得た。この無晶性の懸濁液を２６℃で５０時間撹拌した。この後、全ての混合物は、インスリン結晶を含んでいた。 Next, this solution was heated to 26 ° C. and adjusted to pH 6.1 while stirring with a 10% strength sodium hydroxide solution to obtain a precipitate of amorphous insulin. This amorphous suspension was stirred at 26 ° C. for 50 hours. After this all the mixtures contained insulin crystals.

この混合物を、バックグラウンドにおける、または、インスリン結晶間の無晶性粒子（膜）の外観を顕微鏡下で観察してサンプルを評価することによって分析した。加えて、それぞれの混合物を、ほぼ同じ量で２つに分けた。沈降の挙動を調べるために、第一の部分を２５０ｍｌの測定シリンダーに導入し、この混合物を室温で６０分間放置した後、沈殿物量と上清の透明度を評価した。第二の部分を１Ｎ塩酸でｐＨ３に調節し、インスリン結晶が溶解した後、生じた溶液の透明度を評価した。 This mixture was analyzed by observing the appearance of amorphous particles (membrane) in the background or between insulin crystals under a microscope to evaluate the sample. In addition, each mixture was divided into two in approximately the same amount. In order to investigate the sedimentation behavior, the first part was introduced into a 250 ml measuring cylinder and the mixture was allowed to stand at room temperature for 60 minutes, after which the amount of sediment and the clarity of the supernatant were evaluated. The second part was adjusted to pH 3 with 1N hydrochloric acid, and after the insulin crystals were dissolved, the transparency of the resulting solution was evaluated.

表１は、変性分析の結果を示す。ポリマー分画を添加しなかったコントロールサンプル１７４Ａ、および、１８８Ａでは、変性は観察されなかった。顕微鏡下で、透明なバックグラウンドに対して結晶を目視できた。６０分後、この結晶を沈殿させ、凝縮された沈殿物と透明な上清が生じた。この結晶をｐＨ３で溶解させた後、透明な溶液が生成した。それに対して、サンプル１７４Ｂ、１８８Ｂ、および、１７４Ｃは、いずれの場合もそれぞれ１ｍｌおよび５ｍｌのポリマー画分が結晶化混合物に添加されており、これらは、インスリングラルギンの明らかな変性を示した。顕微鏡下で、結晶間に無晶性の膜を目視できた。沈降分析において、多量の沈殿物が生成し、それにおいて沈殿物量は、５０〜９０ｍｌ（結晶懸濁液２５０ｍｌより）であった。結晶をｐＨ３で再溶解させた後、程度の差はあるが不透明な無晶性の懸濁液が生成した。２０ｐｐｍのポロキサマー１７１の存在下では、１ｍｌのポリマー溶液（１８８Ｃ）の添加による変性は観察されなかった。同様に、精製したプレプロインスリン（実施例１、２および３のカラム２の主画分）と混合した分析混合物１７４Ｄ、１７４Ｅ、および、１７４Ｆにおいては、インスリンのグラルギンの変性は観察されなかった。 Table 1 shows the results of denaturation analysis. In the control samples 174A and 188A to which no polymer fraction was added, no denaturation was observed. Crystals were visible against a transparent background under a microscope. After 60 minutes, the crystals were precipitated, resulting in a condensed precipitate and a clear supernatant. After dissolving the crystals at pH 3, a clear solution was formed. In contrast, samples 174B, 188B, and 174C, in each case, had 1 ml and 5 ml of polymer fraction added to the crystallization mixture, respectively, which showed obvious denaturation of insulin glargine. Under the microscope, an amorphous film could be visually observed between the crystals. In sedimentation analysis, a large amount of precipitate was produced, in which the amount of precipitate was 50-90 ml (from 250 ml of crystal suspension). After redissolving the crystals at pH 3, a more or less opaque amorphous suspension was formed. In the presence of 20 ppm poloxamer 171, no modification was observed with the addition of 1 ml polymer solution (188C). Similarly, no insulin glargine denaturation was observed in analytical mixtures 174D, 174E, and 174F mixed with purified preproinsulin (the main fraction of column 2, examples 1, 2 and 3).

ヒトインスリンを結晶化した類似の変性分析でも、同様の結果が得られた（ここには示さず）。 Similar denaturation analysis of crystallized human insulin gave similar results (not shown here).

Claims

式１：

（式中、Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれ
の場合もＡｒｇであり、
Ｒ ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、そして、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する）
で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法であって、プレプロインスリンの水溶液から、フロースルー式の陰イオン交換体での第一のクロマトグラフィー、および、それに続く吸着式の陽イオン交換体での第二のクロマトグラフィーによってより高分子量の物質が除去され、ここで、第一のクロマトグラフィーは７.０〜９.０のｐＨ、５〜７ｍＳ／ｃｍの伝導率で行われ、第二のクロマトグラフィーは３.０〜５.５のｐＨで行われる、上記の方法。Formula 1:

(Where X is
a) a genetically codeable amino acid residue, or
b) a peptide having 2 to 35 amino acid residues, where the first and last are both Arg ;
R ¹ is
a) hydrogen,
b) a genetically codeable amino acid residue, or
c) a peptide having 2 to 15 amino acid residues,
R ² is a genetically codeable amino acid residue and
Residues A1-A20 correspond to the amino acid sequence of the A chain of human insulin or insulin analog, and residues B1-B30 correspond to the amino acid sequence of the B chain of human insulin or insulin analog)
The method for chromatographic purification of preproinsulin shown in FIG. 1, wherein the first chromatography on an aqueous solution of preproinsulin with a flow-through type anion exchanger, followed by the first chromatography with an adsorption type cation exchanger is performed. the more material high molecular weight removed by second chromatography, wherein the first chromatography is pH of 7.0 to 9.0, performed by conductivity of 5~7mS / cm, second chromatography the Ru is carried out at a pH of 3.0 to 5.5, the above methods.

プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号２）
を有する、請求項１に記載の方法。Preproinsulin has the following amino acid sequence:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-S r-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 2)
The method of claim 1, comprising:

プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号３）
を有する、請求項１に記載の方法。Preproinsulin has the following amino acid sequence:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg- Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-S r-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly (SEQ ID NO: 3)
The method of claim 1, comprising:

プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ −Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４）
を有する、請求項１に記載の方法。Preproinsulin has the following amino acid sequence:
Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys- Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-G ln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 4)
The method of claim 1, comprising:

インスリンの変性を誘導するプレプロインスリン溶液から外来物質を分離するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4, for separating a foreign substance from a preproinsulin solution that induces degeneration of insulin.

第二のクロマトグラフィーは、ｐＨ３.０〜５.５で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the second chromatography is performed at a pH of 3.0 to 5.5.

第二のクロマトグラフィーは、圧力１〜３０ｂａｒで行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the second chromatography is performed at a pressure of 1 to 30 bar.

フォールディングされていないプレプロインスリンを発現することによってインスリンを製造する方法であって、
ａ）フォールディングされていないプレプロインスリンを発現する遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
ｂ）上記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
ｃ）未溶解のフォールディングされていないプレプロインスリンを含む封入体を単離する工程、
ｄ）ペプチド鎖が正しくフォールディングしたプレプロインスリンを溶解させ、同時に、ジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得て、続いて請求項１〜７に記載の方法を行う工程、
ｅ）プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
ｆ）ヒトインスリンを精製する工程、
ｇ）ヒトインスリンを結晶化し、乾燥させる工程、
を含む、上記の方法。A method of producing insulin by expressing unfolded preproinsulin, comprising:
a) fermenting a genetically engineered microorganism that expresses unfolded preproinsulin;
b) recovering the microorganisms and disrupting the cells;
c) isolating inclusion bodies containing undissolved unfolded preproinsulin;
d) dissolving preproinsulin in which the peptide chain is correctly folded and simultaneously linking disulfide bridges to obtain preproinsulin, followed by carrying out the method according to claims 1-7;
e) cleaving preproinsulin with an enzyme to obtain human insulin;
f) purifying human insulin;
g) crystallizing and drying human insulin;
Including the above method.