JP4517061B2 - ダンベル型ｄｎａの効率的な製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ダンベル型ＤＮＡの製造方法に関する。

ヒト・ゲノムプロジェクトの進歩により数多くの病因遺伝子が同定されるに伴い、「遺伝子」を薬として生体に導入することによって治療効果を期待する、いわゆる「遺伝子治療」が注目されるようになった（非特許文献１）。遺伝子治療を行うために、治療用遺伝子を治療する細胞に入れる仕掛けを「ベクター」と呼び、現在ではウイルスベクターとプラスミドベクターとが主に実際の臨床試験で用いられている。

ウイルスベクターは、通常病原性をなくしたウイルスなどを用いる。
この場合、ウイルスが細胞に感染して自分の遺伝子を細胞に送り込む働きを利用するので、他のベクターに比べてベクターの細胞への遺伝子導入効率が良いことが長所である。しかしながらウイルスベクターはごくまれに、病原性を無くし増殖できなくする前処理（不活化）を免れて、副作用として本来の病原性を表わしたり、勝手に増殖するウイルスが混じることがある。そのほか、予期しない遺伝子組み替えが起こりうること、免疫原性を持つことなども大きな問題となっている。

ウイルスベクターに比べ免疫原性は低く、生産性の高い代替ベクターとしてプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が近年特に注目されてきた。しかしながら最近の研究によると、プラスミドＤＮＡ中にＣｐＧ ｍｏｔｉｆと呼ばれる配列が存在すると、マクロファージや樹状細胞がこれを取り込むと危険信号として認識し、種々の炎症性サイトカイン産生などの免疫活性化反応が起こすことが明らかにされた。炎症性サイトカインは、その細胞毒性作用のため遺伝子発現を低下させてしまうため、遺伝子治療では不適切である。また、プラスミドＤＮＡは通常、抗生物質耐性遺伝子や、微生物などの異種生物由来の余分な遺伝子配列を持ち、これらは遺伝子治療に不要なばかりでなく、それら遺伝子がコードする不要なタンパク質が発現する、正常なゲノムＤＮＡに組み込まれるなどして異常ゲノムＤＮＡができる、などの副作用の危険性がある（非特許文献２）。

米国特許第６４５１５９３号明細書には、最小限の免疫原性に限定した遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ；Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクター、つまりダンベル型ＤＮＡを使った遺伝子導入技術（ＭＩＤＧＥ技術）が開示されている。このベクターは、ＲＮＡ転写のもとになるＤＮＡで、そのＤＮＡは環状鎖ＤＮＡでできており、ダンベル型を形成する。このダンベル型ベクターは、環状鎖が最初の相補配列、最初の相補的でない配列、２番目の相補配列、２番目の相補的でない配列からできており、１番目と２番目の相補的配列のペアは２重鎖を形成し、これら２重鎖は、プロモーター配列、コード配列、ポリＡまたは安定化配列を持ち、最初と２番目の相補的でない配列で１本鎖を形成するループ部分も持つ（特許文献１）。

ウイルスベクターや、プラスミドベクターの欠点を補い長所を生かす、より優れた代替ベクターとしてダンベル型ＤＮＡベクターが作成された（非特許文献３）。ダンベル型ＤＮＡベクターは図１に示したように、プロモーターと転写配列領域しか含まず、余分な配列を持たないため免疫原性を最小限にすることができる。さらに必要な遺伝子配列の両端にそれぞれループ部分を持たせて閉じた環状ＤＮＡとすることで、細胞内に形質転換させた際に、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｅｘｏ型核酸分解酵素）活性を受けることなく、分解を受けにくく比較的血清や細胞内で安定であることが知られている。また、この遺伝子治療などに必要最低限の遺伝子配列しか持たないダンベルＤＮＡを、図６に示したように３分子会合にて作るやりかたが知られている（非特許文献４）。図６に示してある一般的なダンベル型ＤＮＡの作成法では、目的の遺伝子配列を含むｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法にて直鎖状の目的ＤＮＡ断片を増幅したのち（図６の工程１（ＰＣＲ））、直鎖状の目的ＤＮＡ断片の両端を制限酵素にて切断する。このものと、ダンベルのループ部分を持つ合成ＤＮＡ２本とを、ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて結合させ、ダンベル型ＤＮＡとする方法を採るのが一般的である。

しかしながらこの作成法の欠点は、ライゲーション反応（図６の工程４（分子間ｌｉｇａｔｉｏｎ））が３分子会合によるものであり、しかも分子間ライゲーション反応であるので、ライゲーション効率が低い。加えて直鎖状の目的ＤＮＡ断片のモル数に対して、ダンベルのループ部分を持つ合成ＤＮＡ２本各々のモル数が大過剰必要であり、その結果殆ど全てのループ部分を持つ合成ＤＮＡが反応することなく無駄となり、これらは精製の妨げにもなる。結果として、目的ダンベル型ＤＮＡの収量が非常に低くなっている。

試験管内でのダンベル型ＤＮＡベクターを作る別のやり方として、図７に示したように、ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、２つの逆位の（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉニック酵素認識配列を直鎖状の目的ＤＮＡ断片の両端に持たせたものを作成し、大腸菌を用いて増幅可能なプラスミドベクターＤＮＡにサブクローニングを行い、大腸菌に形質転換させ大量増幅させた後、図７の６−９の処理を行い目的配列を含むダンベル型ＤＮＡベクターを作成し、プラスミドベクター由来のダンベル型ＤＮＡを消化および精製するやり方が知られている。しかしながらこの作成法の欠点は、サブクローニングの必要があること、およびプラスミドベクター由来のダンベル型ＤＮＡを消化する必要があるなど、操作が非常に煩雑で時間を要する。

米国特許第６４５１５９３号明細書

Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ １９９７，３８９，２３９−２４２．

Ｌｕｏ，Ｄ．；Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８，３３−３７．Ｆｅｒｂｅｒ，Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，２９４，１６３８−１６４２．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，２，１５−１６．

Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ，Ｆ．；Ｇｏｒｓｃｈｌｕｔｅｒ，Ｍ．；Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｃ．；Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｍ．；Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔ，Ｐ．；Ｚｉｓｋｅ，Ｃ．；Ｓｃｈｏｔｔｋｅｒ，Ｂ．；Ｋｏｎｉｇ−Ｍｅｒｅｄｉｚ，Ｓ．Ａ．；Ｓａｕｅｒｂｒｕｃｈ，Ｔ．；Ｗｉｔｔｉｇ，Ｂ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ，Ｉ．Ｇ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００１，３，７９３−８００．

Ｚａｎｔａ，Ｍ．Ａ．；Ｂｅｌｇｕｉｓｅ−Ｖａｌｌａｄｉｅｒ，Ｐ．；Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，９１−６．

本発明は、ダンベル型ＤＮＡを製造するための簡易な方法を提供することを目的とする。

従来法（３分子会合法、図６）でダンベル型ＤＮＡを作成したのではライゲーション効率が４０％程度と非常に悪い（図３（Ｂ））。しかしながら、今回開発した新規手法（図１）にてダンベル型ＤＮＡを作成した場合、ライゲーションはほぼ定量的に進行した（図３（Ａ））。図２に示したように、ライゲーション反応を行う以前の化合物２ｃは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理（３７度１時間）によってほぼ完全に分解されてしまったが、ダンベル化の後の化合物４ｃはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ耐性を持つに至った（安定性の向上）。

２個のＰＣＲプライマーのうち一方のループ部分にただ１箇所だけ蛍光基（フルオレセイン）で化学修飾を行ったのちＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の直鎖状ＤＮＡに対し、本発明の方法でダンベル化を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析を行った。ループ部分に１箇所だけ蛍光基を持つ修飾ダンベル型ＤＮＡは、図２に示したようにｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ耐性を持ち安定性が向上した。

図４に示したように、２個のＰＣＲプライマーのうち一方のループ部分にただ１箇所だけアミノ基を持つプライマーを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の直鎖状ＤＮＡに対し、本発明の方法でダンベル化を行い、１級アミノ基を１箇所のループ部分のみに持つダンベル型ＤＮＡを作成した。これに対しＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＯＳｕを作用させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析を行った。約５００ｂｐのダンベルＤＮＡのただ１箇所の１級アミノ基のみに部位特異的にフルオレセイン修飾されたことが分かった。ネガティブコントロール実験として、１級アミノ基をループ部分に全く持たない、同じ塩基配列を持つダンベル型ＤＮＡを用いて同一の実験を行ったが、ＤＮＡは蛍光修飾されなかった。

このように、ダンベル化のあとにループ部分特異的に化学修飾を行うことが可能となったが、この部位特異的修飾はニック酵素処理の前でも可能であった（データは示さず）。
例えば、ｓｉＲＮＡを発現させるプロモーターとして利用される天然型のＵ６プロモーターの配列は２４０塩基から４００塩基程度であり、天然のｔＲＮＡプロモーターの配列は１００塩基から１５０塩基程度である。しかしながら、遺伝子導入に用いられるＤＮＡは、細胞への透過性という面において、短いほど適していると考えられる。そこで、Ｕ６プロモーター配列を１５０塩基以下まで短くした場合において、実際に細胞への透過性を調べてみたところ、確かに短いＤＮＡ配列が短い場合には、細胞への透過性も高まった（図９（ｃ））。このように小型化したプロモーター配列を用いることで、細胞内での発現量の増加が期待できる。また、導入するＤＮＡの長さが１５０塩基対以下の場合、導入するＤＮＡを合成化学的に生産することができる。

トランスフェクション試薬を用いずに、哺乳類の細胞内にダンベル型ＤＮＡベクターを導入（デリバリー）する手法として、ペプチドをダンベル型ＤＮＡのループ部分特異的に修飾した。ダンベル型ＤＮＡ−ペプチド共有結合体に対し、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）処理を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析を行った。各々のペプチドの分子量に依存して、別々の位置に分解断片が現れ、ダンベル型ＤＮＡ−ペプチド共有結合体の形成が確認された。

本発明は、これらの知見に基づいて、完成された。

本発明の要旨は以下の通りである。
［１］ 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡの製造方法であって、以下の工程：
１）センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有し、
（ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
２）１）の工程で得られたＤＮＡ増幅産物を（ａ）のニック酵素で処理する工程、
３）２）の工程でニック酵素処理されたＤＮＡ増幅産物を加熱し、その後にアニーリングする工程、及び
４）３）の工程で加熱及びアニーリングされたＤＮＡ増幅産物をＤＮＡリガーゼで処理する工程
を含み、ここで、
１）の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端がリン酸化されているか、あるいは１）の工程が行われた後４）の工程が行われる前にＤＮＡ増幅産物の５’末端がリン酸化される、前記方法。
［２］ ダンベル型ＤＮＡが、ＲＮＡ転写のためのベクターとして用いられるものである［１］記載の方法。
［３］ 目的のＤＮＡ配列が１個以上のプロモーター配列及びｓｉＲＮＡ転写配列を有する［１］または［２］記載の方法。
［４］ ダンベル型ＤＮＡがタンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターあるいはステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクターである［３］記載の方法。
［５］ センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーが、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有し、ここで、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結されている［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、（ａ）の配列がＴＮ^１ＡＧＧ（配列中、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表され、（ｂ）の配列が（Ｔ）_ｎ（配列中、Ｔはチミンであり、ｎは１以上の整数である。）で表され、（ｃ）の配列がＣＣＴＮ^１１ＡＧＣ（配列中、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表される［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ センスプライマー及びアンチセンスプライマーが、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有し、センスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＡＧで表され、第２のスペーサー配列がＴＣで表され、アンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＴＣで表され、第２のスペーサー配列がＡＧで表され、かつ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結されている［６］記載の方法。
［８］ センスプライマーの配列及びアンチセンスプライマーについて、（ｂ）の配列がＴＴＴＴで表される［７］記載の方法。
［９］ センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーが、（ｂ）の配列及び／又はスペーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも１箇所で官能基により修飾されている［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ １）の工程の後に、官能基変換を行う工程をさらに含む［９］記載の方法。
［１１］ センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも一組のプライマーを含む組成物であって、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマーが、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有する、前記組成物。
（ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
［１２］ 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡを製造するために用いられる［１１］記載の組成物。
［１３］ 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡを製造するために用いられるキットであって、センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも一組のプライマーを含み、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマーが、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有する、前記キット。
（ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
［１４］ 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡにデリバリー剤を結合させた核酸ベクターの製造方法であって、以下の工程：
１）センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有し、
（ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
２）１）の工程で得られたＤＮＡ増幅産物を（ａ）のニック酵素で処理する工程、
３）２）の工程でニック酵素処理されたＤＮＡ増幅産物を加熱し、その後にアニーリングする工程、
４）３）の工程で加熱及びアニーリングされたＤＮＡ増幅産物をＤＮＡリガーゼで処理する工程、及び
５）４）の工程でＤＮＡリガーゼ処理されたＤＮＡ増幅産物中の目的のＤＮＡ配列以外の配列にデリバリー剤を結合させる工程
を含み、ここで、
１）の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端がリン酸化されているか、あるいは１）の工程が行われた後４）の工程が行われる前にＤＮＡ増幅産物の５’末端がリン酸化される、前記方法。
［１５］ ［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法で作製されたダンベル型ＤＮＡ。
［１６］ 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡであって、以下の（ａ’）〜（ｄ’）の配列を含む前記ダンベル型ＤＮＡ。
（ａ’）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ’）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ’）（ａ’）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ’）目的のＤＮＡ配列
［１７］ 細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させることができる［１５］または［１６］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［１８］ 発現する機能性核酸がｓｉＲＮＡあるいはヘアピンＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである［１７］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［１９］ 発現する機能性核酸がリボザイムである［１７］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２０］ 発現する機能性核酸がアンチセンスＲＮＡである［１７］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２１］ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含む［１７］〜［２０］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２２］ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの少なくとも１つの配列を含む２５０塩基以下の配列を含む［２１］記載のダンベル型ＤＮＡ。
（ｉ）ＴＡＴＡ
（ｉｉ）ＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ
（ｉｉｉ）ＹＹＴＣＣＣＡＮＮＲＴＮＣＮＮＹＧＣＲＲ
（ｉｖ）ＡＴＧＣＡＡＡＴあるいはこれに相補的な配列
（配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
［２３］ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部が、以下の（ｉ’）〜（ｉｉ’）のうちの少なくとも１つの配列を含む１５０塩基以下の配列を含む［２１］記載のダンベル型ＤＮＡ。
（ｉ’）ＲＲＹＮＮＡＲＹＧＧ
（ｉｉ’）ＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ
（配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
［２４］ 配列番号１、２２、２３または２５のいずれかの配列を含む［２１］〜［２３］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２５］ 発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である［１７］〜［２４］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２６］ ウイルスがＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶからなる群より選択される［２５］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２７］ 細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる［１５］または［１６］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２８］ ＤＮＡザイムである［２７］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［２９］ デコイとして作用する［２７］記載のダンベル型ＤＮＡ。
［３０］ ダンベル型ＤＮＡが光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型ＤＮＡである［１５］〜［２９］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
［３１］ ［１５］〜［３０］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡを含む組成物。
［３２］ ［１５］〜［３０］のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡを含む医薬組成物。

本発明のダンベル型ＤＮＡの製造方法は、以下の利点を有する。
１）図７の従来法における、Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉサイトを４つ持つ、プラスミドベクターＤＮＡ構築の手間が不要である。
２）図７の従来法における、ベクターＤＮＡ由来の不要なダンベルＤＮＡができない。
３）図６の従来法ではＰＣＲプライマー（合成オリゴＤＮＡ）が４本必要なのに対し、図１の本発明の方法では合成オリゴ２本のみしか必要でなく、経済的である。
４）図１の本発明の方法では、環化してダンベル型ＤＮＡになるライゲーション反応が、分子内反応なので効率が非常に良く、図６の従来法と比較して量が取れる。
環化収率について、従来法（２本鎖ＤＮＡを基準として）４０％程度であるが、本発明の方法だと８０％以上となりえる。
つまり、図６の操作４において、ループ部分に官能基もしくは反応点を持つ合成オリゴＤＮＡのわずか４％程度しかダンベルＤＮＡにならず、残りの９６％は無駄に廃棄される。
しかしながら、ＰＣＲに官能基もしくは反応点を持たせることで、原理的にはＰＣＲプライマーの殆ど全てが消費され無駄にならず、ライゲーション反応も分子内反応なので、官能基もしくは反応点を持つ合成オリゴＤＮＡの大部分（８０〜９５％程度）がダンベル型ＤＮＡとなる。このように、上流および下流のＰＣＲのプライマーの１本鎖ループ部分（図１の場合ＴＴＴＴのどこか）のどちらか、または両方に官能基もしくは反応点を持たせる際に有利である。
５）図１の操作２−５までは、全て同じチューブ内でのｏｎｅ−ｐｏｔ反応なので、操作が極めて簡便である。
６）ＰＣＲ法で行う図６の従来法の場合では精製が２段階存在するのに対し、図１の本発明の方法の場合、精製が最後（操作６）だけでよい。精製ステップの省略は、ダンベル型ＤＮＡの全体での回収量低下を防ぐ。

本明細書において、「ダンベル型ＤＮＡ」とは、直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖をループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結したＤＮＡをいう。ダンベル型ＤＮＡを構成するＤＮＡは、塩基部分、リン酸部分、糖部分、５’末端及び／又は３’末端が修飾されていても（修飾型ＤＮＡ）、されていなくてもよい（天然型ＤＮＡ）。

修飾型ＤＮＡの種類及び製法は数々の文献に記載されている。例えば、リン酸部分のリンに結合している水酸基（−ＯＨ）が、ボラノ基（−ＢＨ_３ ⁻）、チオール基（−Ｓ⁻）、アミノ基（−ＮＨ_２）、低級アルキル基（−Ｒ）（Ｒは、例えば、メチル基、エチル基など）およびアルコキシ基（−ＯＲ）（Ｒは、例えば、メチル基、エチル基など）からなる群より選択される基に置換されている修飾型ＤＮＡは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５１３４．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８２）２３，４２８９．に記載されている。リン酸部分のリンに結合しているオキソ基（＝Ｏ）が、チオキソ基（＝Ｓ）に置換されている修飾型ＤＮＡは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８０）２１，１１２１．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）２６，８２３７．に記載されている。リン酸部分のリンと糖の５’位の炭素に結合しているオキシ基（−Ｏ−）が、メチレン基（−ＣＨ_２−）、チオキシ基（−Ｓ−）およびアミノ基（−ＮＨ−）からなる群より選択される基に置換されている修飾型ＤＮＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５，８３０に記載されている。リン酸部分のリンと糖の３’位の炭素に結合しているオキシ基（−Ｏ−）が、メチレン基（−ＣＨ_２−）、チオキシ基（−Ｓ−）およびアミノ基（−ＮＨ−）からなる群より選択される基に置換されている修飾型ＤＮＡは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２，５７９８に記載されている。リン酸部分がホスホロジチオエート化されている修飾型ＤＮＡは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８８）２９，２９１１．；ＪＡＣＳ（１９８９）１１１，２３２１．に記載されている。

修飾塩基の例としては、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリルピレン−ウリジン、２’−アミノウリジン、２’−デオキシウリジン、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、５−フルオロ−ウリジン、５−インド−ウリジン、５−メチル−シチジン、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、７−デアザ−グアニン、８−アミノヘキシル−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、２−チオ−チミン、５−ヨード−ウリジン、５−ヨード−シチジン、８−ブロモ−グアニン、８−ブロモ−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、５−ヒドロキシメチル−ウリジンなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの合成ユニットは市販されており（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入できる）、ＤＮＡへの導入は化学合成により可能である。

糖部分の修飾の例としては、３’−デオキシ化、２’−フルオロ化、アラバノシド化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらについてもＤＮＡへの導入は化学合成により可能である。

５’末端の修飾の例としては、５’−アミノ化、５’−ビオチン化、５’−フルオレセイン化、５’−テトラフルオロ−フルオレセイン化、５’−チオ化、５’−ダブシル化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

３’末端の修飾の例としては、３’−アミノ化、３’−ビオチン化、２，３−ジデオキシ化、３’−チオール化、３’−ダブシル化、３’−カルボキシレート化、３’−コレストリル化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

ＤＮＡの合成反応において、既存のＤＮＡの一次構造が新たに合成されるＤＮＡの一次構造を決定するとき、既存のＤＮＡを「鋳型ＤＮＡ」という。

ニック酵素は、サイト及びストランド特異的な、人工的に工学的手法で作られたエンドヌクレアーゼである。

「ニック」とは、エンドヌクレアーゼの作用により、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のホスホジエステル結合が開裂して５‘にリン酸基、３’にヒドロキシル基を生ずるＤＮＡの損傷のことである。この損傷は、ＤＮＡリガーゼにより修復可能な切断である。

「ニック酵素の切断認識配列」とは、ニック酵素により認識されて、特定位置にニックが入るＤＮＡ配列をいう。

「アニーリング」とは、二本鎖から一本鎖に解離したＤＮＡを再び二本鎖ＤＮＡに会合させることをいう。二本鎖ＤＮＡの会合は、２つの分子間（すなわち、２本のＤＮＡ鎖間）で起こってもよいし、同一分子内（すなわち、１本のＤＮＡ鎖内）で生じてもよい。本発明のダンベル型ＤＮＡの製造方法においては、アニーリングにより、同一分子内で会合が生じて、新たな二本鎖ＤＮＡ部分とループ部分が形成される。

「プロモーター」とは、調節遺伝子の一種でＲＮＡポリメラーゼが結合し、オペロンの転写を開始する部位のことである。

「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉作用を有する（すなわち、標的とするｍＲＮＡを切断する活性を有する）短い二本鎖オリゴヌクレオチドをいう。標的とするｍＲＮＡを認識するＲＮＡ鎖はアンチセンス鎖であり、他方のＲＮＡ鎖がセンス鎖である。一般に、「アンチセンス鎖」とはｍＲＮＡが認識するＲＮＡ鎖である。ｓｉＲＮＡの塩基数は、通常５０個以下であり、好ましくは１０〜４０個であり、より好ましくは１０〜３０個である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分子に限定されるわけではなく、ＲＮＡ分子と他のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡなど）とのキメラ分子であってもよく、また、これらの分子の置換体又は修飾体であってもよい。ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の置換体及び修飾体の例としては、５’末端を５’モノリン酸化したもの、３’末端の２’水酸基を２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、ビオチン、２’，３’−ダイデオキシシトシン、アミノプロピルホスホエステルに変えたものなどを挙げることができる。

「ｓｉＲＮＡ転写配列」とは、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をいう。ｓｉＲＮＡ転写配列には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列の両方が含まれる。ｓｉＲＮＡ転写配列を組み込んだｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいて、２つのプロモーター配列の各々と機能的に連結した、ｓｉＲＮＡのセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが直列に結合しているものを「タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクター」という（図８のａ））。また、ｓｉＲＮＡのセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが随意の介在配列（例えば、一本鎖でループ構造を形成することができる配列など）を挟んで対向しているものがプロモーター配列と機能的に連結しているものを「ステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクター」という（図８のａ））。

「機能的に連結した」とは、プロモーターからの転写を受けて、ｓｉＲＮＡのセンス鎖をコードするＤＮＡ配列及び／又はｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列の転写産物が生成するように、該ＤＮＡ配列とプロモーター配列とが結合していることをいう。従って、該ＤＮＡ配列に対するプロモーター配列の位置は、その上流、下流を問わないが、通常上流に位置する。また、該ＤＮＡ配列とプロモーター配列との間には、該ＤＮＡ配列の転写が起こり得る限り、任意のＤＮＡ配列を有していてもよい。

「スペーサー配列」とは、ループ部分の一本鎖のヌクレオチド配列と、目的のＤＮＡ配列（プロモーター・転写・終結などに関わるヌクレオチド配列）との間にある、生化学的に意味を持たないオリゴヌクレオチド配列をいう。

「対向する」とは、互いに相補的な２つの配列を互いに逆方向となるように配置することを意味する。例えば、第１のスペーサー配列がＡＧで表され、第２のスペーサー配列がＴＣで表され、（ｂ）の配列がＴＴＴＴで表される場合には、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とが（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結させると、ＡＧＴＴＴＴＣＴの配列となる。

「核酸主鎖」とは、‘…−糖−リン酸−糖−リン酸−…’の基本骨格のことをいう。核酸主鎖は修飾がなされていても、なされていなくともよい。

「塩基部分」とは、核酸を構成するプリン又はピリミジン塩基の部分をいう。プリン又はピリミジン塩基は修飾がなされていても、なされていなくともよい。

「デリバリー剤」とは、必要な量の薬を、体内の必要な場所または、必要な時間、およびその両方に正確に配達するための仕掛けを持つ各種分子をいう。

「機能性核酸」とは、細胞、組織、および器官において、特定の働きを持つ核酸をいい、遺伝子発現抑制などの生理活性、ＲＮＡの切断などの酵素活性、タンパク質や、ＲＮＡ、低分子化合物などへの結合能、などを有する核酸が含まれる。

「ヘアピンＲＮＡ」とは、直鎖状２本鎖ＲＮＡの５’末端および３’末端の両末端同士が、１本鎖の構造を持つＲＮＡループでつながったＲＮＡをいい、ステム構造とそれをつなぐループ構造を持つステム、ループＲＮＡが含まれる。ステム構造は、完全にマッチしていなくてもよい。

「リボザイム」とは、ＲＮＡを化学的実体とする生体触媒の総称である。

「アンチセンスＲＮＡ」とは、あるＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡ分子をいい、あるターゲットＲＮＡと相補的に結合し、その発現を抑制するＲＮＡ分子を含む。

「ＤＮＡザイム」とは、ＤＮＡを化学的実体とする生体触媒の総称である。

「光学活性なボラノホスフェート」とは、デオキシヌクレオチドにおいて、ボラノ基が５’のα−リン原子に共有結合しているために生じる不斉中心を有するボラノホスフェートをいう。

なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。

塩基配列の表示において、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｕはウラシル、Ｎはアデニン又はシトシン又はグアニン又はチミン若しくはウラシルのいずれかの塩基を表す。塩基配列は特にことわりがない限り、５’→３’方向に記載するものとする。

本発明により、簡易な方法でダンベル型ＤＮＡを製造することができるようになった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−２０６９０５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明のダンベル型ＤＮＡの作成法の一例を示す。この手法は、特に上流および下流のＰＣＲプライマーのループ部分（この場合ＴＴＴＴ配列の部分）のどちらかに１個、もしくはループ部分の両方に官能基を持たせる場合に有利である。原理的には全てのＰＣＲプライマー（原料）が消費されるまでＰＣＲ反応は続くので、原料がほとんど無駄にならない。操作２）−３）までは全てｏｎｅ−ｐｏｔ反応（１つの試験管のなかへ次々と試薬を混ぜていくだけの反応）なので、操作が簡便なのも特徴である。１）５’末端がリン酸化されている、Ｂｐｕ１０Ｉ制限酵素サイトの一部ＴＮＡＧＧと、１本鎖ループ部分の配列を挟んで第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列が対向するように連結している配列（ＮＮＴＴＴＴＮＮ；この図の場合はＡＧＴＴＴＴＣＴと、ＴＣＴＴＴＴＧＡ）と、Ｂｐｕ１０Ｉ制限酵素サイトのアンチセンス配列ＣＣＴＮＡＧＣを持つ２本の別々のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡ中の目的の塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域；例えばｓｉＲＮＡコード領域））を増幅し、精製する。２）Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉ酵素を用いて、目的の塩基配列部分のみにニック（切れ目）を入れ、加熱し、徐冷して反応溶液を室温に戻し、ループを形成させる。３）ＤＮＡリガーゼを用いて分子内ライゲーション反応を行い、目的の１種類のみのダンベル型ＤＮＡを合成する。分子内ライゲーション反応なので、非常に高収率である。（図３（Ａ））その後、ＤＥＡＥイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびアガロース電気泳動などで、目的のＤＮＡ断片のみを精製する。 エキソヌクレアーゼ消化に対するＤＮＡの安定性を示す。バンドは最初、（ａ）フルオロイメージャー５９５によって可視化した。図１に書いてある、２ｃとか４ｃという化合物番号は、この図にも対応している。約６００ｂｐのバンドは、フルオレセインによって標識されたＤＮＡである。次にゲルはエチジウムブロマイドによって染色され、バンドは、トランスイルミネータによって可視化された。 直鎖状のベクターから、ダンベル型ベクターへの変換効率をあらわした図。ゲルはエチジウムブロマイドによって染色され、バンドは、トランスイルミネータによって可視化された。 フルオレセインのスクシニミドエステルを用いた、ダンベル型ＤＮＡのループ特異的な修飾を示す。バンドは最初、（ａ）フルオロイメージャー５９５によって可視化した。次にゲルはエチジウムブロマイドによって染色され、バンドは、トランスイルミネータによって可視化された。レーン１と２は、ヘアピンループ部分に一級アミノ基を持つダンベル型ＤＮＡを流し、レーン３と４は、ヘアピンループ部分に一級アミノ基を持たないダンベル型ＤＮＡを流した。レーン２と４は、フルオレセインスクシニミドエステルとの反応混合物サンプルを流した。レーン１と３は、その反応前のサンプルを流した。 ＨｅＬａＳ３／ＥＧＦＰ細胞内にトランスフェクションされた各種ベクターによる、ＥＧＦＰ発現抑制の様子を示す。 従来のダンベル型ＤＮＡの作成法の一つを示す。１．それぞれ独立の２個の制限酵素切断サイトを持つプライマーＡおよびＢを用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡ中の目的の塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域；例えばｓｉＲＮＡコード領域））を増幅し、精製する。２．別々の異なる制限酵素ＡおよびＢで処理する。３．ＤＥＡＥイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびアガロース電気泳動などで、目的のＤＮＡ断片のみを精製する。４．目的のＤＮＡ断片に対して１０倍当量過剰の、２種類の合成オリゴＤＮＡ（ループ部分）をまぜ、ＤＮＡリガーゼを用いて３分子会合し、ダンベル型ＤＮＡを合成する。分子間ライゲーション反応なので、低収率である。（図３（Ｂ））５．ＤＥＡＥイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびアガロース電気泳動などで、目的のＤＮＡ断片のみを精製する。 従来のダンベル型ＤＮＡの別の作成法を示す。１．それぞれ独立の２個の制限酵素切断サイトを持ち、同時にＢｐｕ１０Ｉ制限酵素サイトを２つ持つプライマーＡおよびＢを用いたＰＣＲにより、ｃＤＮＡ中の目的の塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域；例えばｓｉＲＮＡコード領域））を増幅し、精製する。２．別々の異なる制限酵素ＡおよびＢで処理する。３．ＤＥＡＥイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびアガロース電気泳動などで、目的のＤＮＡ断片のみを精製する。４．大腸菌を用いて増幅可能なベクターＤＮＡ（ＭＩＤＧＥベクターなど）に、精製した目的ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼなどを用いてクローニングする。５．４を用いて大腸菌の形質転換を行い、目的ＤＮＡ断片を持つプラスミドＤＮＡを増幅する。６．Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉ酵素を用いて、目的の塩基配列部分のみにニック（切れ目）を入れる。７．加熱する。８．徐冷して反応溶液を室温に戻し、ループを形成させる。９．ＤＮＡリガーゼを用いて分子内ライゲーション反応を行い、２種類のダンベル型ＤＮＡを合成する。１０．大腸菌を用いて増幅可能なベクターＤＮＡ（ＭＩＤＧＥベクターなど）由来のダンベル型ＤＮＡを、制限酵素処理する。その際、目的ＤＮＡ断片中にその制限酵素配列を持ってはならない。１１．制限酵素で部分消化したベクターＤＮＡ（ＭＩＤＧＥベクターなど）由来のダンベル型ＤＮＡを、完全消化する。１２．ＤＥＡＥイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびアガロース電気泳動などで、目的のＤＮＡ断片のみを精製する。 タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクター（ａ））とステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｂ））の一例を模式的に表した図である。ａ）のタンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターでは、２つのＵ６プロモーターからセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡが転写される。ｂ）のステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクターでは、ショートヘアピンＲＮＡが転写され、プロセッシングを受けて、ｓｉＲＮＡが産生される。 小型化プロモーターを導入したダンベル型ベクターの効果を示す。小型化プロモーターは天然のＵ６プロモーターとほぼ同程度の発現活性を有し（（ａ））、小型化プロモーターで発現されるｓｉＲＮＡはルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する効果を有しており（（ｂ））、さらに、小型化プロモーターは天然のＵ６プロモーターよりも核透過性が高かった（（ｃ））。

以下、本発明を詳細に説明するが、これは、本発明の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。

１．ダンベル型ＤＮＡの構築
目的のＤＮＡ配列を有する鋳型ＤＮＡの構築
まず、目的のＤＮＡ配列を有する鋳型ＤＮＡを用意する。鋳型ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡの場合も、二本鎖ＤＮＡの場合もある）、ＰＣＲなどの生化学的手法により合成したＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡの場合も、二本鎖ＤＮＡの場合もある）を例示することができる。鋳型ＤＮＡは、環状ＤＮＡであっても、直鎖状ＤＮＡであってもよい。
目的のＤＮＡ配列の長さは、２０〜２０００塩基であるとよく、好ましくは４０〜１０００塩基であり、より好ましくは４０〜５００塩基である。
目的のＤＮＡ配列としては、プロモーター配列、目的とする転写領域の配列（例えば、ｓｉＲＮＡ転写配列、デコイ転写配列、非翻訳ＲＮＡ転写配列（例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）転写配列、ｔＲＮＡ転写配列）、特定のタンパク質の翻訳に必要な配列、デコイ配列などを例示することができる。これらのＤＮＡ配列は、市販のＤＮＡ合成機などを用いて公知の方法で合成することができる。
プロモーターは、転写反応開始反応の効率に影響を与えるものであれば、特に限定されないが、本発明のダンベル型ＤＮＡをｓｉＲＮＡ発現ベクターとして用いる場合には、ｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡの発現に適したｐｏｌ ＩＩＩ系を用いることが好ましい。
ｐｏｌＩＩＩ系のプロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ ＲＮＡプロモーター、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。
利用可能なプロモーターの名前とその配列を以下に記載する。
・Ｕ６プロモーター
５’−ＡＡＧＧＴＣＧ ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴ ＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣ ＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴ ＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡ ＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧ ＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴ ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴ ＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧ ＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡ ＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡ ＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴ ＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡ ＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴ ＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴ ＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴ ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴ ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧ ＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴ ＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ ＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ ＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴ ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡ ＴＡＴＡＴＣＴＴ−３’（配列番号１）
天然のＵ６プロモーターには幾種類かの配列があり、後述の実施例２で用いたプロモーター配列（Ｕ６（２４０））は以下の通りである。
・Ｕ６（２４０）
５’−ＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２５）
・Ｈ１プロモーター
５’−ＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＴＣＧＡＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２）
・ｔＲＮＡプロモーター
５’−ＡＣＣＧＴＴＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＴＣＣＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡ−３’（配列番号３）
発現させるプロモーター領域を小型化した人工プロモーターを用いても良い。このような人工プロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含み、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの少なくとも１つの配列を含むものを挙げることができる。
（ｉ）ＴＡＴＡ
（ｉｉ）ＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ
（ｉｉｉ）ＹＹＴＣＣＣＡＮＮＲＴＮＣＮＮＹＧＣＲＲ
（ｉｖ）ＡＴＧＣＡＡＡＴあるいはこれに相補的な配列
（配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
別の人工プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含み、以下の（ｉ’）〜（ｉｉ’）のうちの少なくとも１つの配列を含むものを挙げることができる。
（ｉ’）ＲＲＹＮＮＡＲＹＧＧ
（ｉｉ’）ＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ
（配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
人工プロモーターの塩基数は、２５０塩基以下であるとよく、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。
人工プロモーターとしては、後述の実施例に記載のＵ６（９０）、Ｕ６（１１０）プロモーターなどを挙げることができる。Ｕ６（９０）、Ｕ６（１１０）プロモーターの配列を以下に記載する。
・Ｕ６（９０）プロモーター
５’−ＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２２）
・Ｕ６（１１０）プロモーター
５’−ＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２３）
また、プロモーターとして、誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイミングでｓｉＲＮＡを発現させることも可能である。このような誘導可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンで誘導可能なＵ６プロモーター（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆ Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｂｙ ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｎＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００））等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいはＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いて、組織特異的にｓｉＲＮＡの発現を誘導してもよい。
プロモーター配列の長さは、１〜１５００塩基であるとよく、好ましくは４０〜５００塩基であり、より好ましくは６０〜２６０塩基である。
ｓｉＲＮＡ転写配列は、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であればよい。標的とする遺伝子（ｍＲＮＡ）は、遺伝病をはじめとする各種疾患の原因遺伝子、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ｐ５３）、白血病遺伝子ｂｃｒ−ａｂｌジャンクション、癌 ｒａｓ，ｍｙｘ，ｍｅｔ，ｍｄｍ２，ａｂｌ，ｅｒｂＢなどの疾患に関連する遺伝子、ＨＩＶ、ＨＣＶなどの病原ウイルスのゲノムなどを例示することができる。
ｓｉＲＮＡ転写配列を開示している文献は以下の通りである。
ｃ−ＪＵＮのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊｕｎ ２７ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃ−ＪＵＮ−ＪＮＫ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃ−ＪＵＮ ｄｅｌｔａ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔｓ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｅｔ ｏｆ ＩＬ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ．Ｈｏｌｚｂｅｒｇ Ｄ，Ｋｎｉｇｈｔ ＣＧ，Ｄｉｔｔｒｉｃｈ−Ｂｒｅｉｈｏｌｚ Ｏ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｈ，Ｄｏｒｒｉｅ Ａ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅ，Ｒｅｓｃｈ Ｋ，Ｋｒａｃｈｔ Ｍ．に記載されている。
Ｃｈｋ１のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｊｕｎ；２（６）：５４３−８．Ｈｕｍａｎ ｃｈｋ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ｇ（２）ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｃｈｅｎ Ｚ，Ｘｉａｏ Ｚ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｎｇ ＳＣ，Ｓｏｗｉｎ Ｔ，Ｓｈａｍ Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ，Ｆｅｓｉｋ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｈ．に記載されている。
ｃａｓｐａｓｅ ８のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｎ １６ Ｃａｓｐａｓｅ ８ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｚｅｎｄｅｒ Ｌ，Ｈｕｔｋｅｒ Ｓ，Ｌｉｅｄｔｋｅ Ｃ，Ｔｉｌｌｍａｎｎ ＨＬ，Ｚｅｎｄｅｒ Ｓ，Ｍｕｎｄｔ Ｂ，Ｗａｌｔｅｍａｔｈｅ Ｍ，Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｔ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ Ｐ，Ｍａｌｅｋ ＮＰ，Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ Ｃ，Ｍａｎｎｓ ＭＰ，Ｋｕｈｎｅｌ Ｆ，Ｋｕｂｉｃｋａ Ｓ．；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｎ １６ Ｃａｓｐａｓｅ ８ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｚｅｎｄｅｒ Ｌ，Ｈｕｔｋｅｒ Ｓ，Ｌｉｅｄｔｋｅ Ｃ，Ｔｉｌｌｍａｎｎ ＨＬ，Ｚｅｎｄｅｒ Ｓ，Ｍｕｎｄｔ Ｂ，Ｗａｌｔｅｍａｔｈｅ Ｍ，Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｔ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ Ｐ，Ｍａｌｅｋ ＮＰ，Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ Ｃ，Ｍａｎｎｓ ＭＰ，Ｋｕｈｎｅｌ Ｆ，Ｋｕｂｉｃｋａ Ｓ．に記載されている。
ＲＥＣＫのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｎ １６ Ｃａｓｐａｓｅ ８ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｚｅｎｄｅｒ Ｌ，Ｈｕｔｋｅｒ Ｓ，Ｌｉｅｄｔｋｅ Ｃ，Ｔｉｌｌｍａｎｎ ＨＬ，Ｚｅｎｄｅｒ Ｓ，Ｍｕｎｄｔ Ｂ，Ｗａｌｔｅｍａｔｈｅ Ｍ，Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｔ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ Ｐ，Ｍａｌｅｋ ＮＰ，Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ Ｃ，Ｍａｎｎｓ ＭＰ，Ｋｕｈｎｅｌ Ｆ，Ｋｕｂｉｃｋａ Ｓ．に記載されている。
ＳＴＲＡＤのｓｉＲＮＡ転写配列は、ＥＭＢＯ Ｊ．２００３ Ｊｕｎ １６；２２（１２）：３０６２−３０７２．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｋｉｎａｓｅ ＬＫＢ１ ｂｙ ｔｈｅ ＳＴＥ２０−ｌｉｋｅ ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ ＳＴＲＡＤ．Ｂａａｓ ＡＦ，Ｂｏｕｄｅａｕ Ｊ，Ｓａｐｋｏｔａ ＧＰ，Ｓｍｉｔ Ｌ，Ｍｅｄｅｍａ Ｒ，Ｍｏｒｒｉｃｅ ＮＡ，Ａｌｅｓｓｉ ＤＲ，Ｃｌｅｖｅｒｓ ＨＣ．に記載されている。
ＰＫＡ ＣαのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊｕｎ １１ ＰＫＡ ｂｌｏｃｋｓ Ｒａｆ−１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ １４−３−３ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒａｆ−１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒａｓ．Ｄｕｍａｚ Ｎ，Ｍａｒａｉｓ Ｒ．に記載されている。
ＰＫＡ ＣβのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊｕｎ １１ ＰＫＡ ｂｌｏｃｋｓ Ｒａｆ−１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ １４−３−３ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒａｆ−１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒａｓ．Ｄｕｍａｚ Ｎ，Ｍａｒａｉｓ Ｒ．に記載されている。
ＥｒｂＢ３のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３ Ｊｕｎ ５；２２（２３）：３５９８−６０７．Ａｔｙｐｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥｒｂＢ３ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ：ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ＥｒｂＢ３ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｗａｌｔｅｒｓ ＤＫ，Ｆｒｅｎｃｈ ＪＤ，Ａｒｅｎｄｔ ＢＫ，Ｊｅｌｉｎｅｋ ＤＦ．に記載されている。
Ａｎｄｒｏｇｅｎ ＲｅｃｅｐｔｏｒのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００３ Ｍａｙ ２９ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｗｒｉｇｈｔ ＭＥ，Ｔｓａｉ ＭＪ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．に記載されている。
ＦＡＤＤのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３ Ｍａｙ １２ ｃＦＬＩＰ−Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐ３８ ＭＡＰＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：Ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｇｒａｍｂｉｈｌｅｒ Ａ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｈ，Ｂｒｏｎｋ ＳＦ，Ｇｏｒｅｓ ＧＪ．に記載されている。
ＨＢ−ＥＧＦのｓｉＲＮＡ転写配列は、ＥＭＢＯ Ｊ ２００３ Ｍａｙ １５；２２（１０）：２４１１−２４２１ ＴＡＣＥ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｒｏａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＧＰＣＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｇｓｃｈｗｉｎｄ Ａ，Ｈａｒｔ Ｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＯＭ，Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ．；ＥＭＢＯ Ｊ ２００３ Ｍａｙ １５；２２（１０）：２４１１−２４２１ ＴＡＣＥ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｒｏａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＧＰＣＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｇｓｃｈｗｉｎｄ Ａ，Ｈａｒｔ Ｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＯＭ，Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ．に記載されている。
ＴＡＣＥのｓｉＲＮＡ転写配列は、ＥＭＢＯ Ｊ ２００３ Ｍａｙ １５；２２（１０）：２４１１−２４２１ ＴＡＣＥ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｒｏａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＧＰＣＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｇｓｃｈｗｉｎｄ Ａ，Ｈａｒｔ Ｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＯＭ，Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ．に記載されている。
ｐ７３のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００３ Ａｐｒ；３（４）：４０３−１０ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｐ７３ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｒｗｉｎ ＭＳ，Ｋｏｎｄｏ Ｋ，Ｍａｒｉｎ ＭＣ，Ｃｈｅｎｇ ＬＳ，Ｈａｈｎ ＷＣ，Ｋａｅｌｉｎ ＷＧ．に記載されている。
β−ｃａｔｅｎｉｎのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３ Ａｐｒ；９（４）：１２９１−３００ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｖｅｒｍａ ＵＮ，Ｓｕｒａｂｈｉ ＲＭ，Ｓｃｈｍａｌｔｉｅｇ Ａ，Ｂｅｃｅｒｒａ Ｃ，Ｇａｙｎｏｒ ＲＢ．に記載されている。
ＡＰＣのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３ Ａｐｒ；９（４）：１２９１−３００ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｖｅｒｍａ ＵＮ，Ｓｕｒａｂｈｉ ＲＭ，Ｓｃｈｍａｌｔｉｅｇ Ａ，Ｂｅｃｅｒｒａ Ｃ，Ｇａｙｎｏｒ ＲＢ．に記載されている。
ＮＦ−κＢのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３ Ａｐｒ；９（４）：１２９１−３００ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｖｅｒｍａ ＵＮ，Ｓｕｒａｂｈｉ ＲＭ，Ｓｃｈｍａｌｔｉｅｇ Ａ，Ｂｅｃｅｒｒａ Ｃ，Ｇａｙｎｏｒ ＲＢ．に記載されている。
ｐ１２０のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００３ Ａｐｒ；１２４（４）：９４９−６０ Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ１２０ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍａｙｅｒｌｅ Ｊ，Ｆｒｉｅｓｓ Ｈ，Ｂｕｃｈｌｅｒ ＭＷ，Ｓｃｈｎｅｋｅｎｂｕｒｇｅｒ Ｊ，Ｗｅｉｓｓ ＦＵ，Ｚｉｍｍｅｒ ＫＰ，Ｄｏｍｓｃｈｋｅ Ｗ，Ｌｅｒｃｈ ＭＭ．に記載されている。
ＡＴＭのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３ Ａｐｒ １；６３（７）：１５５０−４ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｏｌｌｉｓ ＳＪ，Ｓｗａｒｔｚ ＭＪ，Ｎｅｌｓｏｎ ＷＧ，ＤｅＷｅｅｓｅ ＴＬ．に記載されている。
ＡＴＲのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３ Ａｐｒ １；６３（７）：１５５０−４ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｏｌｌｉｓ ＳＪ，Ｓｗａｒｔｚ ＭＪ，Ｎｅｌｓｏｎ ＷＧ，ＤｅＷｅｅｓｅ ＴＬ．に記載されている。
ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００３ Ｍａｒ；２（３）：２０９−１６ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ ＢＡ，Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ Ｋ，Ｔａｂｌｅｒ Ｍ，Ｒｏｗｌｅｙ ＰＴ．；Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００３ Ｍａｒ；２（３）：２０９−１６ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ ＢＡ，Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ Ｋ，Ｔａｂｌｅｒ Ｍ，Ｒｏｗｌｅｙ ＰＴ．に記載されている。
ｃｙｃｌｉｎ ＧのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３ Ｍａｒ ２０；２２（１１）：１６７８−８７ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ ｐ７３ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ｃｙｃｌｉｎ Ｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｏｈｔｓｕｋａ Ｔ，Ｒｙｕ Ｈ，Ｍｉｎａｍｉｓｈｉｍａ ＹＡ，Ｒｙｏ Ａ，Ｌｅｅ ＳＷ．に記載されている。
ＭＤＣ１のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｎａｔｕｒｅ ２００３ Ｆｅｂ ２７；４２１（６９２６）：９６１−６ ＭＤＣ１ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｓｔｅｗａｒｔ ＧＳ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｂｉｇｎｅｌｌ ＣＲ，Ｔａｙｌｏｒ ＡＭ，Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ．；Ｎａｔｕｒｅ ２００３ Ｆｅｂ ２７；４２１（６９２６）：９６１−６ ＭＤＣ１ ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｓｔｅｗａｒｔ ＧＳ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｂｉｇｎｅｌｌ ＣＲ，Ｔａｙｌｏｒ ＡＭ，Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ．に記載されている。
ＦａｓのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３ Ｆｅｂ １０ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆａｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｓｏｎｇ Ｅ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｉｎｃｅ Ｎ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｍｉｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｈａｎｋａｒ Ｐ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｊ．に記載されている。
ＤＮＭＴ１のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００２ Ｄｅｃ ２３ ＤＮＭＴ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｒｏｂｅｒｔ ＭＦ，Ｍｏｒｉｎ Ｓ，Ｂｅａｕｌｉｅｕ Ｎ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ Ｆ，Ｃｈｕｔｅ ＩＣ，Ｂａｒｓａｌｏｕ Ａ，ＭａｃＬｅｏｄ ＡＲ．に記載されている。
ＤＮＡ−ＰＫｃｓのｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２ Ｎｏｖ １５；６２（２２）：６４００−４ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｄａｍａｇｅ，Ｃｅｌｌ Ｋｉｌｌｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｐｅｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｎａｇａｓａｗａ Ｈ，Ｏｋａｙａｓｕ Ｒ，Ｌｉｂｅｒ ＨＬ，Ｂｅｄｆｏｒｄ ＪＳ．に記載されている。
ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００２ Ｎｏｖ １５；１６（２２）：２９２３−３４ Ｃｄｋ４ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｒｅｎｄｅｒｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ａｒｆ／ｐ５３−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｚｏｕ Ｘ，Ｒａｙ Ｄ，Ａｚｉｙｕ Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｏｖ Ｋ，Ｂｏｉｋｏ ＡＤ，Ｇｕｄｋｏｖ ＡＶ，Ｋｉｙｏｋａｗａ Ｈ．に記載されている。
ＥＺＨ２のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｎａｔｕｒｅ ２００２ Ｏｃｔ １０；４１９（６９０７）：６２４−９ Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＺＨ２ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ Ｓ，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ＳＭ，Ｚｈｏｕ Ｍ，Ｂａｒｒｅｔｔｅ ＴＲ，Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａ Ｃ，Ｓａｎｄａ ＭＧ，Ｇｈｏｓｈ Ｄ，Ｐｉｅｎｔａ ＫＪ，Ｓｅｗａｌｔ ＲＧ，Ｏｔｔｅ ＡＰ，Ｒｕｂｉｎ ＭＡ，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ＡＭに記載されている。
ｐ７３のｓｉＲＮＡ転写配列は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２ Ｊｕｌ １８；２１（３１）：４７１５−２７ ｐ５３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐ７３ Ｄｅｌｔａ Ｎ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｌｏｏｐ．Ｋａｒｔａｓｈｅｖａ ＮＮ，Ｃｏｎｔｅｎｔｅ Ａ，Ｌｅｎｚ−Ｓｔｏｐｐｌｅｒ Ｃ，Ｒｏｔｈ Ｊ，Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎに記載されている。
ｍｉＲＮＡは、他の生体分子と相互作用して、発生や分化に影響する小さな非翻訳ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ転写配列は、ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であればよい。ｍｉＲＮＡ転写配列は、Ｋａｗａｓａｋｉ Ｈ，Ｔａｉｒａ Ｋ．、Ｈｅｓ１ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２３ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｔｉｎｏｉｃ−ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＴ２ ｃｅｌｌｓ．、Ｎａｔｕｒｅ．２００３年、４２３、８３８−８４２．などの文献に記載されている。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ転写配列（プロモーター配列や、ループ部分の配列は含まないで、目的ＲＮＡに対する結合領域のみの配列）の長さは、１〜２００塩基であるとよく、好ましくは１５〜４０塩基であり、より好ましくは１８〜２５塩基である。
ｔＲＮＡ転写配列は、ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であればよい。ｔＲＮＡ転写配列は、Ｋｏｓｅｋｉ Ｓ，Ｔａｎａｂｅ Ｔ，Ｔａｎｉ Ｋ，Ａｓａｎｏ Ｓ，Ｓｈｉｏｄａ Ｔ，Ｎａｇａｉ Ｙ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｔ，Ｏｈｋａｗａ Ｊ，Ｔａｉｒａ Ｋ．，Ｆａｃｔｏｒｓ ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；７３（３）：１８６８−７７．；Ｋａｗａｓａｋｉ Ｈ，Ｔａｉｒａ Ｋ．Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｓＲＮＡｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔＲＮＡ（Ｖａｌ）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３年３１、７００−７０７ページなどの文献に記載されている。ｔＲＮＡ転写配列の長さは、１〜２００塩基であるとよく、好ましくは６５〜１１０塩基であり、より好ましくは８０〜９２塩基である。
特定のタンパク質の翻訳に必要な配列を開示している文献は以下の通りである。
Ｂａｘの翻訳に必要な配列は、Ｏｌｔｖａｉ，Ｚ．Ｎ．，Ｍｉｌｌｉｍａｎ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｃｌ−２ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｂａｘ，ｔｈａｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ，Ｃｅｌｌ ７４（４），６０９−６１９（１９９３）．に記載されている。
ｐ５３の翻訳に必要な配列は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｈｅｌｆｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ａｄａｍｓ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐ５３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（７），１６０１−１６１０（１９８５）に記載されている。
特定のタンパク質の翻訳に必要な配列の長さは、１〜２０００塩基であるとよく、好ましくは５０〜１０００塩基であり、より好ましくは６５〜８００塩基である。
デコイ配列は、遺伝子の転写因子結合部位と同一の配列を持ち、これに転写因子が結合し、転写因子が本来のゲノム結合部位に結合することが阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制されるものであれば、いかなるものであってもよい。
デコイ配列の一つを以下に記載する。
Ｅ２Ｆデコイ： ＴＴＴＣＧＣＧＣ
デコイ分子が結合することが知られている、Ｅ２Ｆ以外の転写因子（タンパク質）としては、ＡＰ−１、ＮＦ−ｋＢ、ＳＳＲＥ、ＣＲＥＢ、ＭＥＦ−２、ＣａｒＧ ｂｏｘ、ｔａｘ、ＶＰ１６、ＴＡＲ／ｔａｔ、ＧＲＥ／ＨＲＥ／ＭＲＥ、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ＲＥ、ＳＲＥ、ＡＰ−２、ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＴＧＦ−ｂ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＨＩＦ−１などが知られている。
デコイ転写配列は、デコイ配列をコードする配列である（ＲＮＡデコイの場合）。また、デコイは転写因子のＤＮＡ結合部位の配列を含む、短いＤＮＡ２重鎖核酸（医薬）の場合もある。後者の場合、転写されることなく、ダンベル型ＤＮＡそのものが囮（デコイ）分子として働く。
目的のＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡは、目的のＤＮＡ配列をプラスミド、ウイルス、またはＰＣＲ産物などに組み込むことにより作製することができる。組み込みの方法は、Ｊ．Ｓｍａｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著、’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ’（ｗｗｗ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ）などの文献に記載されている。
目的のＤＮＡ配列を有する鋳型ＤＮＡを化学合成するには、公知の方法に従えばよい。

核酸増幅
センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅する（図１の１））。ここで、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有する。
（ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
（ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
（ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
（ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
（ａ）の配列の長さは、１〜１０塩基であるとよく、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは５塩基である。
（ｂ）の長さは、１〜５０塩基であるとよく、好ましくは１〜１０塩基であり、より好ましくは３〜６塩基である。
（ｃ）の長さは、４〜２０塩基であるとよく、好ましくは５〜１５塩基であり、より好ましくは７〜１０塩基である。
（ｄ）の長さは、５〜５０塩基であるとよく、好ましくは１０〜３０塩基であり、より好ましくは１５〜２５塩基である。
ニック酵素は、二本鎖ＤＮＡの１本のストランドのみに開裂（ニック）を入れるものであるとよい。現在市販されている、二本鎖ＤＮＡの１本のストランドのみに開裂を入れるニック酵素及びその切断認識配列（制限酵素サイト）の例を以下に記載する。なお、下記の配列は、ニック酵素により認識されてニックが入るストランドの配列（この場合、「ニック酵素の切断認識配列のセンス配列」）である。
Ｂｐｕ１０Ｉ制限酵素サイト： ＧＣＴＮＡＧＧ（Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉニック酵素は、ＧＣ’ＴＮＡＧＧの配列を認識して’の位置にニックを入れる；Ｎは、ＡＴＧＣのいずれの配列でも可能。
Ｎ．ＢｐｖＣ ＩＢ認識サイト： ＣＣＴＣＡＧＣ（Ｎ．ＢｐｖＣ ＩＢニック酵素は、ＣＣ’ＴＣＡＧＣの配列を認識して’の位置にニックを入れる）
Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識サイト： ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ（Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉニック酵素は、ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ’Ｎの配列を認識して’の位置にニックを入れる）
Ｎ．Ａｌｗ Ｉ認識サイト：ＧＧＡＴＣＮＮＮＮＮ（Ｎ．Ａｌｗ Ｉニック酵素は、ＧＧＡＴＣＮＮＮＮ’Ｎの配列を認識して’の位置にニックを入れる）
Ｎ．ＢｐｖＣ ＩＡ認識サイト： ＧＣＴＧＡＧＧ（Ｎ．ＢｐｖＣ ＩＡニック酵素は、ＧＣ’ＴＧＡＧＧの配列を認識して’の位置にニックを入れる）
ニック酵素がＮ．Ｂｐｕ１０Ｉである場合、（ａ）の配列としてはＴＮＡＧＧを、（ｃ）の配列としてはＣＣＴＮＡＧＣを挙げることができる。
ニック酵素がＮ．ＢｐｖＣ ＩＢである場合、（ａ）の配列としてはＴＣＡＧＣを、（ｃ）の配列としてはＧＣＴＧＡＧＧを挙げることができる。
ニック酵素がＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉである場合、（ａ）の配列としてはＮを、（ｃ）の配列としてはＮＮＮＮＮＧＡＣＴＣを挙げることができる。
ニック酵素がＮ．Ａｌｗ Ｉである場合、（ａ）の配列としてはＮを、（ｃ）の配列としてはＮＮＮＮＮＧＡＴＣＣを挙げることができる。
ニック酵素がＮ．ＢｐｖＣ ＩＡである場合、（ａ）の配列としてはＴＧＡＧＧを、（ｃ）の配列としてはＣＣＴＣＡＧＣを挙げることができる。
（ｂ）の配列は、一本鎖でループ構造を形成することができるものであればいかなる配列であってもよく、その一例を以下に記載する。
（Ｔ）ｎ （配列中、ｎは１以上、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは３〜６である。）
（ｂ）の配列は、アプタマーＤＮＡの配列であってもよい。アプタマーＤＮＡの配列を以下に記載する。
・トロンビンに対するアプタマー；ＧＧＮＴＧＧＮ_２−５ＧＧＮＴＧＧ（配列番号４〜７）
・色素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９）に結合するＤＮＡアプタマーの配列モチーフ；１本鎖ループを形成する。５’−ｇｇｃｇｔｔｃｇｇｇｇｇｇｔａ−３’（配列番号８）
例えば、センスプライマー及びアンチセンスプライマーのうちの一方の（ｂ）の配列をアプタマーＤＮＡの配列とし、他方の（ｂ）の配列を色素（例えば、Ｅｕ^３＋複合体（ユーロピウムなどの希土類色素と有機化合物との錯形成物）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９など）で修飾してもよい。トロンビンのＤＮＡアプタマー結合モチーフと目的タンパク質との融合タンパク質を細胞内で発現させた時に、Ｅｕ^３＋複合体色素−ダンベルＤＮＡを細胞内に導入することで、結果として目的タンパク質が（希土類系）色素でラベルされる。遅延蛍光を利用した、細胞内で目的タンパク質の高感度測定を行うなどの応用が可能となる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーのうちの一方の（ｂ）の配列をアプタマーＤＮＡの配列とし、他方の（ｂ）の配列を色素で修飾したものから作製したダンベル型ＤＮＡは、アプタマー核酸を特異的に認識するペプチド又はタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで結合させることにより、細胞内への導入が容易となる。
センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーは、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有してもよい。ここで、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結される。
第１のスペーサーの例としてはＡＧを、第２のスペーサーの例としてはＴＣを挙げることができる。
ニック酵素としてＮ．Ｂｐｕ１０Ｉを使用する場合、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、（ａ）の配列がＴＮ^１ＡＧＧ（配列中、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表され、（ｂ）の配列が（Ｔ）_ｎ（配列中、Ｔはチミンであり、ｎは１以上の整数である。）で表され、（ｃ）の配列がＣＣＴＮ^１１ＡＧＣ（配列中、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表されるとよい。（Ｔ）ｎのｎは、１以上の整数であるが、好ましくは１〜１０のいずれかの整数であり、より好ましくは３〜６のいずれかの整数である。センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有し、センスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＡＧで表され、第２のスペーサー配列がＴＣで表され、アンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＴＣで表され、第２のスペーサー配列がＡＧで表され、かつ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結されているとよい。
センスプライマーについて、（ｄ）の配列は、目的のＤＮＡ配列のセンス鎖の５’末端を含む全部又は一部の領域の配列に相補的な配列を有する。
アンチセンスプライマーについて、（ｄ）の配列は、目的のＤＮＡ配列のアンチセンス鎖の５’末端を含む全部又は一部の領域の配列に相補的な配列を有する。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの長さは、１０〜２００塩基であるとよく、好ましくは２０〜１５０塩基であり、より好ましくは３０〜１２０塩基である。
また、センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーは、（ｂ）の配列及び／又はスペーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも１箇所で官能基により修飾されていてもよい。このような修飾がなされていると、これらのプライマーを用いて作製したダンベル型ＤＮＡにデリバリー剤などを結合させる反応点となるので有利である。修飾の例としては、アミノ基、フルオレセインなどの蛍光基、ビオチン基、などの官能基による修飾、タンパク質、ウイルス由来タンパク質、糖結合タンパク質、フェリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、抗体、人工抗体、ペプチド、ペプチド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸および非天然アミノ酸の共重合体、ビオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖、オリゴ糖、コレステロール、エストラジオール、エストロン、コレステロール誘導体、ステロイド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸などのデリバリー剤の結合などを挙げることができる。異なる官能基やデリバリー剤で複数の修飾を行ってもよい。導入された官能基を利用して、別の官能基、ＴＡＴやＮＬＳなどの機能性ペプチド、ガン細胞を特異的に認識する抗体、電子供与能を持つ蛍光又はリン光色素、電子受容能を持つ蛍光又はリン光色素、タンパク質、ウイルス由来タンパク質、糖結合タンパク質、フェリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、抗体、人工抗体、ペプチド、ペプチド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸および非天然アミノ酸の共重合体、ビオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖、オリゴ糖、コレステロール、エストラジオール、エストロン、コレステロール誘導体、ステロイド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸などのデリバリー剤などの付加や置換をすることができる。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、５’末端をリン酸化しておいてもよい。センスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端をリン酸化しておけば、ダンベル型ＤＮＡ構築の最終段階で、ヘアピンループ構造をとっているＤＮＡにＤＮＡリガーゼを作用させた時に、分子内ライゲーション反応によりＤＮＡが環化する。５’末端のリン酸化は、ＤＮＡ自動合成の最後の段階で、リン酸化試薬を結合させたのち、アンモニア処理で脱保護することにより行うことができる。また、化学合成したオリゴＤＮＡ（５‘末端が水酸基）の場合は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、酵素的にリン酸化することができる。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端をリン酸化しない場合には、これらのプライマーを用いた核酸増幅法により生成した増幅産物であるＤＮＡにＤＮＡリガーゼを作用させる前のいずれかの段階（例えば、核酸増幅の後、ニック酵素による処理の後、加熱の後、アニーリングの後など）で増幅産物ＤＮＡの５’末端をリン酸化しておくとよい。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅するには、公知の核酸増幅法によればよい。例えば、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを鋳型となるＤＮＡと混合し、その後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。

直鎖状ＤＮＡからダンベル型ＤＮＡへの変換
直鎖状ＤＮＡ増幅産物をニック酵素と混合（例えば、ＤＮＡ１μｇに対してニック酵素０．５〜２Ｕの混合比で）し、反応混合物をインキュベーションする（例えば、２５〜５０℃で一晩）。この操作により、直鎖状ＤＮＡ増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の１本のストランドのみにニックが入る（図１の２ａ−ｃに付した矢印）。
その後、反応混合物を加熱し（例えば、９０〜１００℃で０．５〜１０分）、室温まで１分〜２時間かけて冷却する（アニーリング）。これらの操作により、直鎖状ＤＮＡ増幅産物の末端部にヘアピンループ構造が形成される（図１の３ａ−ｃ）。
次いで、ＤＮＡリガーゼ（例えば、ＤＮＡ１μｇに対してＤＮＡリガーゼ１７５〜１０００Ｕの混合比で）とライゲーションバッファーを添加して、インキュベーションする（例えば、１４〜３７℃で３分〜６時間）。この操作により、ヘアピンループ構造部分で分子内ライゲーション反応が起こり、ダンベル型の構造が形成される。
以上の変換工程はワンポット反応である。すなわち、この変換工程は一つのマイクロチューブ内で行うことができる。
ダンベル型ＤＮＡの長さは、１２〜２０００塩基（２重鎖相当分）であるとよく、好ましくは５０〜１０００塩基（２重鎖相当分）であり、より好ましくは１５０〜６００塩基（２重鎖相当分）である。
ライゲーションにより生成した産物は公知の方法で精製するとよい。
上記の操作により、ダンベル型ＤＮＡが構築される。このとき、ダンベル型ＤＮＡは光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型ＤＮＡであってもよい。光学活性なボラノホスフェートから修飾型ＤＮＡを製造する方法は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．８，１６１１−１６１７に記載されている。
２．エキソヌクレアーゼによる分解反応に対するダンベル型ＤＮＡの安定性の評価
１で構築したダンベル型ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで、２５〜４２℃の温度）で１０分〜２時間処理する。エキソヌクレアーゼ処理前後のダンベル型ＤＮＡを少量とって、電気泳動にかけ、バンドを可視化する。その結果、ダンベル型ＤＮＡはエキソヌクレアーゼによる分解反応に対して抵抗性を示すことがわかる。
３．ダンベル型ＤＮＡの部位特異的修飾
１で構築したダンベル型ＤＮＡは、公知の方法により、部位特異的修飾を行うことができる。例えば、特定位の塩基（例えば、一本鎖でループ構造を形成している配列中の塩基）にアミノ基を導入しておけば、市販のＡｍｉｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いることにより、アミノ基を導入した部位でダンベル型ＤＮＡをフルオレセインで修飾することができる。また、市販のキット（Ｆａｓｔ Ｔａｇ^（Ｒ），ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、無修飾のプライマーＤＮＡにＳＨ基を付与させておけば、各種マレイミド誘導体と反応させることができる。
４．ダンベル型ＤＮＡへのデリバリー剤の結合
１で構築したダンベル型ＤＮＡは、公知の方法により、デリバリー剤を結合させることができる。
デリバリー剤としては、タンパク質、ウイルス由来タンパク質、糖結合タンパク質、フェリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、抗体、人工抗体、ペプチド、ペプチド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸および非天然アミノ酸の共重合体、ビオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖、オリゴ糖、コレステロール、エストラジオール、エストロン、コレステロール誘導体、ステロイド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸等を例示することができる。
ダンベル型ＤＮＡにデリバリー剤を結合させる方法の例を以下に記載する。第一の例では、まず、ダンベル型ＤＮＡにアミド基（−ＮＨ_２）を導入し（ダンベル型ＤＮＡ−ＮＨ_２）、これをＥＭＣＳ（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）と反応させることにより、ダンベル型ＤＮＡをマレイミド化することができる（ダンベル型ＤＮＡ−ＮＨＣＯ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）。マレイミド化したダンベル型ＤＮＡ（ダンベル型ＤＮＡ−ＮＨＣＯ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）をペプチドなどに含まれるＳＨ基と反応させることにより、ダンベル型ＤＮＡにペプチドを結合させることができる（ダンベル型ＤＮＡ−ＮＨＣＯ−ペプチド）。
第二の例では、ダンベル型ＤＮＡにアミド基（−ＮＨ_２）を導入し（ダンベルＤＮＡ−ＮＨ_２）、これをスクシニミドエステル誘導体と反応させることにより、ダンベル型ＤＮＡを誘導体化することができる（ダンベル型ＤＮＡ−ＮＨＣＯ−誘導体）。
５．ダンベル型ＤＮＡの利用
ダンベル型ＤＮＡは核酸ベクターとして利用することができる。
核酸ベクターの細胞への導入は、公知の方法で行うことができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６（１９７３））、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１３１１（１９８７））、リポフェクション法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７５（１９８９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，ｐ．３４，Ｍａｒｃｈ（１９９４））、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１９，ｐ．７９１（１９８６））、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．３，ｐ．２７１７（１９８４））、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐ．８５０２（１９８８））、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１２，ｐ．８７１１（１９８４））等により行うことができる。
核酸ベクターが導入された細胞を選択する方法としては、導入した核酸ベクターに特異的なＤＮＡ配列をプローブあるいはプライマーとして、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法等の公知の手法により選択することができる。核酸ベクターが選択マーカーを備えている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
ダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡがｓｉＲＮＡ転写配列を有する場合には、そのｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を抑制することができるので、疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、遺伝子の機能を解析するための試薬として利用することができる。例えば、ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子が、遺伝病をはじめとする各種疾患の原因遺伝子、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ｐ５３）、白血病遺伝子ｂｃｒ−ａｂｌジャンクション、癌 ｒａｓ，ｍｙｘ，ｍｅｔ，ｍｄｍ２，ａｂｌ，ｅｒｂＢなどの疾患に関連する遺伝子、ＨＩＶ、ＨＣＶなどの病原ウイルスのゲノムなどである場合には、ダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡは、疾患を予防及び／又は治療するための医薬品として、ヒト、その他の動物に投与することができる。
患者の組織または細胞に、ｓｉＲＮＡ配列を有するダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡを導入することによって、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制することができる。ダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（″Ｌｉｐｉｄｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ″（１９９７）Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌ．Ｈｕａｎｇ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １４，１７３−２０６；中西守ら、蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，１５９０−１５９６（１９９９））、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に導入することもできる。
ダンベル型ＤＮＡ、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型ＤＮＡを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
本発明のダンベル型ＤＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡあるいはヘアピンＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡなどの機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させたり、遺伝子の発現を抑制することができる。機能性核酸の標的は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどのウイルス、癌遺伝子などであるとよい。本発明のダンベル型ＤＮＡを細胞あるいは組織内に導入したときに、遺伝子の発現を抑制することができれば、このダンベル型ＤＮＡはＤＮＡザイムとして利用することができる。
本発明のダンベル型ＤＮＡを含む組成物は、医薬品、化粧品、試薬、食品などの種々の用途に利用することができる。
６．プライマー組成物及びキット
本発明の別の態様として、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも１組のプライマーを含むキットが提供される。このキットは、ダンベル型ＤＮＡを製造するために利用することできる。キットは、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも１組のプライマー以外の要素を含んでもよい。例えば、核酸増幅の鋳型となるＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、各種塩基のｄＮＴＰ、ニック酵素、ＤＮＡリガーゼ、バッファー（例えば、トリスバッファー、リン酸バッファー、カコジル酸バッファーなど）、キットの使用方法を記載した説明書、コバルト塩、マグネシウム塩、マンガン塩、更なる官能基化のできる化合物（マレイミド誘導体、スクシニミドエステル誘導体、機能性ペプチド、反応点を持つタンパク質や抗体）などを含んでもよい。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
実験方法
本実験の全般に渡り、全ての溶媒と試薬は市販の物を使い、特に精製を行っていない。アッセーは最低３回行った。
プラスミド構築．ｐＵ６ｉ−ＥＧＦＰとｐＵ６ｉ−ｌａｍｉｎプラスミドは、Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒと、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）とｌａｍｉｎにそれぞれ対するｈａｉｒｐｉｎ−ｔｙｐｅ ｓｉＲＮＡ発現配列とを持つ。それらは，次のように構築した。最初に本発明者らはｓｉＲＮＡ発現ベクターを、市販のｐＵ６ｉｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒ（ｉＧＥＮＥ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）をもとに構築した。この市販ベクターは、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒと２つのＢｓｐＭＩサイトを持つ。ｓｉＲＮＡ−発現ベクター構築のために，本発明者らはｈａｉｒｐｉｎ配列，ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列，そしてｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ配列を持つオリゴヌクレオチドを（外注で）合成した。そして、それらフラグメントのアニールを行い、先ほどのｐＵ６ｉｃａｓｓｅｔｔｅベクターＢｓｐＭＩサイトに挿入（ライゲーション）を行った。
Ｕ６プロモーター直後の挿入配列は次の通り：ｐＵ６ｉ−ＥＧＦＰでは；５’−ＧＧＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＡＣＣ ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＴＡ ＧＣＣ−３’（配列番号９），ｐＵ６ｉ−ｌａｍｉｎでは；５’−ＧＧＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＴＡＡ ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＴＧＴ ＣＣＣ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＴＧＣ ＣＣ−３’（配列番号１０）
３つの独立したオリゴヌクレオチドを用いて分子間でダンベル型ＤＮＡを作る従来法．
（ａ）Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−によって発生するｓｉＲＮＡをコードする直鎖状ＤＮＡのＰＣＲによる増幅：５００ｐｍｏｌのそれぞれの合成ＤＮＡプライマーをｐＵ６ｉ−ｌａｍｉｎベクターとまぜ、ＰＣＲ反応をＥｘ Ｔａｑ^ＴＭＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）．を使って行った。
ＰＣＲのためのプライマーの、センスおよびアンチセンス鎖の配列は，５’−ｐＧＧＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ Ｇ−３’（配列番号１１）と５’−ｐＧＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＡＧ Ｇ−３’（配列番号１２）である。どちらのプライマーもＢｓｐＭＩ認識配列（下線で示してある），を持ち、５’−末端はリン酸化されている。ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることで精製され、ＢｓｐＭＩを用いて消化された。３７度で７時間反応を行ったのち、消化された生成物はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて単離された。
（ｂ）ｓｉＲＮＡ発現用直鎖状ＤＮＡのダンベル型ＤＮＡへの変換：ダンベル化されていないＰＣＲ産物は、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＴａＫａＲａ）を用いて、１０当量過剰のｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃａｐ分子と反応し、ダンベル化した。ライゲーション反応前に，粘着性５’末端を持つｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃａｐのヘアピン型構造を持つＤＮＡを、９５度で１分処理後、１時間かけて徐々にそれを室温に徐冷することで得た。
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃａｐの配列は，５’−ｐＧＧＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＡＣ Ａ−３’（配列番号１３）と５’−ｐＣＣＴ ＣＧＧ ＣＣＴ ＡＴＡ ＧＴＧ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＧＧ ＣＧＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＣＣ−３’（配列番号１４）である。反応混合物は、１６度，終夜インキュベートを行い，ライゲーション産物はｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出後、エタノール沈殿を行うことで得た。
ＰＣＲ産物の分子内ライゲーションによるダンベルＤＮＡベクターの新規作成法．
（１）Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−によって発生する、ｌａｍｉｎに対するｓｉＲＮＡをコードする直鎖状ＤＮＡのＰＣＲによる増幅：それぞれの合成ＤＮＡプライマーを５００ｐｍｏｌずつ、ｐＵ６ｉ−ｌａｍｉｎベクターと混合し，ＰＣＲ反応をＥｘ Ｔａｑ^ＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）．を使って行った。ＰＣＲのための共通プライマーの、センスおよびアンチセンス鎖の配列は，５’−ｐＴＴＡ ＧＧＡ ＧＴＴ Ｘ^ｎＴＣ ＴＣＣ ＴＡＡ ＧＣＧ ＴＴＴ ＴＣＣ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＧＡ ＣＧＴ ＴＧ−３’（ｎ＝１−３）（配列番号１５〜１７）及び５’−ｐＴＴＡ ＧＧＴ ＣＴＴ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＧＣＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧ−３’（配列番号１８）である．どちらのプライマーもＮ．Ｂｐｕ１０Ｉ認識配列（下線で示してある）を持ち、５’−末端はリン酸化されている。ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることで精製された。センスプライマーは、未修飾の（Ｘ^１；ｄＴ），アミノ基で修飾された（Ｘ^２，ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄＴ），またはフルオレセインで修飾された（Ｘ^３，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄＴ）デオキシチミジンである。それらＨＰＬＣで精製済みの共プライマーはＨｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。
（２）Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−によって発生する、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡをコードする直鎖状ＤＮＡのＰＣＲによる増幅：５００ｐｍｏｌの各々の合成ＤＮＡプライマーとｐＵ６ｉ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡとを混ぜ、最初のＰＣＲ反応をＥｘ Ｔａｑ^ＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）．を使って行った。最初のＰＣＲのためのプライマーの、センスおよびアンチセンス鎖の配列は，５’−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ−３’（配列番号１９）と５’−ＧＡＧ ＣＧＧ ＡＴＡ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＡＣＧ ＴＣＣ ＡＧＧ ＡＧ−３’（配列番号２０）である。そして、最初のＰＣＲ生成物は、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製された。単離したＰＣＲフラグメントを鋳型ＤＮＡとして，２番目のＰＣＲ反応を共通プライマーを用いて同一条件にて行った。２番目のＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることで精製された。
ｓｉＲＮＡをコードする直鎖状ＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
ＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡＧＴＧＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＧＣＴＴＡＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＡＡ（配列番号２１）
（３）ｓｉＲＮＡ−を発現するための直鎖状ＤＮＡの、ダンベル型ＤＮＡへの変換： １８．８マイクログラムの直鎖状ＰＣＲ産物をそれぞれ、１８．８ＵのＮ．Ｂｐｕ１０Ｉ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）と混合し、反応混合物を３７度で終夜インキュベートした。反応混合物は、９５度で１分加熱を行い、９５度から室温まで１時間かけて徐冷した。この段階で、末端ヘアピンループ構造が形成される。ヘアピン末端部分での分子内ライゲーションのために，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１５，７５０Ｕ）とライゲーションバッファー（ＴａＫａＲａ）は反応混合物に直接加えられ、そして１６度で３時間インキュベートを行った。以上の変換過程はワンポット反応である点が特筆される。つまり、それら全ての過程は、たった一つのマイクロチューブ内で行われる。ライゲーション生成物は、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出後、エタノール沈殿を行うことで得た。
試験管内での、エキソヌクレアーゼ消化によるベクターの安定性の評価
直鎖状およびダンベル型ベクターの安定性は、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ（１５００Ｕ／マイクロｇ ｏｆ ＤＮＡ，ＴａＫａＲａ）で３７度、１時間の消化を行うことで評価した。消化反応の前後の各々のフラクションを一定量用いて、それぞれ８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。電気泳動後のゲルは、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分析した。この装置には、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）が励起光源として付属しており、フルオレセイン（λ_ｍａｘ＝４９２ｎｍ）の蛍光を検出するために、発色フィルター（ａｒｏｕｎｄ ５３０ｎｍ）を用いた。次に、先ほどのゲルを用いて、ｅｔｈｙｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅによる染色を行った。ＤＮＡの量と、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが付加しているかどうかは、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｇｒａｍとＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いたゲルのバンド定量することで分析した。各々のバンド強度は、標準サンプルによる標準カーブを用いて定量化され、直鎖状ＤＮＡからダンベル型ＤＮＡへの変換効率を求めた。
ダンベル型ベクターのフルオレセインによる部位特異的な修飾
ダンベル型ベクターを化学修飾するため、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ａｍｉｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添付マニュアル通りに用いた。簡潔に概略を記述すると、６７ｎＭのダンベル型ベクター（３０マイクロリッター、１００ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）溶液、４ｍＭ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを含む）を３７度、１ｈｏｕｒでインキュベーションして、その後，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加えることで反応を終結させた。溶液は更に３０分放置した。ＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることで単離した。
細胞、細胞培養、形質転換、ＧＦＰ蛍光アッセー
ＨｅＬａ Ｓ３／ＥＧＦＰ細胞を次のようにして得た。ＨｅＬａ／Ｓ３細胞は、直鎖状に変換したｐＨｙｇＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ，ＰＡ）を用いて形質転換された。そして、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ−耐性クローンを選び出した。細胞培養は、１０％（ｖ／ｖ）ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（１００マイクロｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を補填したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行った。クローンの一つ、つまり、ＨｅＬａ Ｓ３／ＥＧＦＰクローン番号３を、以下の実験に用いた。細胞は、先ほどの培地内で、３７度，５％ＣＯ_２インキュベーター内で維持された。細胞は、８−ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）内で約４０−５０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになるまで培養し、ＤＮＡで形質転換を行った。形質転換には、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｔｒａｎｓ−Ｉｔ ＬＴ−１試薬（ＰａｎＶｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、同封マニュアル通りに行った。それらは各々１００ｎｇの，ＥＧＦＰ遺伝子をターゲットとしたｓｉＲＮＡを発現させるｄｕｍｂｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅｄベクター，直鎖状ＰＣＲ産物ベクター，またはｐＵ６ｉ−ＥＧＦＰプラスミドベクターを用いて独立にトランスフェクションされた。ＤＮＡを用いずに、トランスフェクション試薬だけを用いたにせのトランスフェクションもコントロール実験としてなされた。トランスフェクション後の細胞のインキュベーションは４８時間なされた。トランスフェクション後２４時間経った時に、培地を新鮮なものに交換した。ガラスカバースリップ上の生細胞は、４８時間後に蛍光顕微鏡（ＬＳＭ−５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を持ちいて観察した。

結果及び考察
合成
ダンベルづくりのキーステップは図１に示した。３段階の反応からなる。
Ｎ．Ｂｐｕ１０Ｉは、サイト＆ストランド特異的な、人工的に工学的な手法で作られたエンドヌクレアーゼである。それは、２本鎖ＤＮＡの１本のストランドのみに開裂（ニック）を入れる。
図１で示したように、ステップ２でのニック酵素はＤＮＡの一つのストランドのみを開裂する。
環化収率は９０％だったことは強調できる。なぜなら環化は分子内ライゲーション反応として進行するからである。
ダンベルＤＮＡに１箇所だけ１級アミノ基がついた化合物は蛍光性のダンベルＤＮＡにスクシニミドエステルを用いて変換することに成功した。対照的に、一級アミノ基を持っていないダンベルは、スクシニミドエステルと全く反応しなかった。
このことは、様々な置換基がダンベルＤＮＡのヘアピンループ領域だけに、部位特異的に導入できることを意味している。
蛍光性のダンベルＤＮＡはまた、蛍光プライマーを用いた合成によっても作ることができた。
ダンベル型ＤＮＡは末端がヘアピンオリゴヌクレオチド構造になっているので、エキソヌクレアーゼによる分解反応に対して抵抗性を示すようになることが知られている。
中間体２ｃと、ダンベル４ｄとを、独立にエキソヌクレアーゼで１時間処理し、８％ＰＡＧＥで分析した。
結果を図２に示したように、末端を持つＤＮＡは１時間のヌクレアーゼ処理で完全に分解してしまったが、ダンベルは明らかに分解に抵抗性を示した。
細胞でのアッセイ
プラスミド、直鎖状ＤＮＡも、ダンベルＤＮＡも、同じ発現カセットを持つ。それは、Ｕ６プロモーターとＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ発現用遺伝子との両方である。
これら異なったｓｉＲＮＡ発現ベクターによる細胞内での目的ｍＲＮＡ遺伝子の阻害効果をテストするため、本発明者らはＨｅｌａ／ＥＧＦＰに形質転換した。
ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡを用いたところ、特異的で効果的なターゲットへのダウンレギュレーションが確認された。
再現性は３回確認した。
本発明者らは、最高のかつ最も再現性のある阻害がダンベルＤＮＡを使った時に確認した。
この条件下で、本発明者らはダンベルｓｉＲＮＡ発現ベクターが、４８時間のインキュベーション後に直鎖状のＰＣＲ産物よりもより効果的であることを見つけた。
つまり、ダンベルＤＮＡによって誘発されたＲＮＡｉ効果が直鎖ＤＮＡのそれよりも高く、効果が長持ちした。
直鎖状ＤＮＡのＲＮＡｉ効果が４８時間後に減少したことを説明するのに、本発明者らはダンベルＤＮＡの細胞内での寿命が、直鎖状ＤＮＡに比べて長いからだと考えている。このことは、前記のｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを用いた試験管内での実験で示されたように、ダンベルＤＮＡが直鎖状ＤＮＡよりも、細胞の中でもｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅに対してより安定に存在するからであろう。
［実施例２］
ダンベル型ＤＮＡによって構成しうる発現型ＤＮＡの最小ユニットは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列（プロモーター）および、発現されるべきＲＮＡをコードする配列である。細胞内に導入されるＤＮＡは、医薬品としてのコストや細胞内への導入効率の面で、より短いものが望ましく、したがって、導入されるＤＮＡを、より短くすることは、遺伝子の機能解析や遺伝子治療の面で非常に有益である。
小型化プロモーターの作製と解析
小型化プロモーターは天然のプロモーターとの比較のためにＵ６（９０）プロモーターおよびＵ６（１１０）プロモーターを作製した。どちらも天然のＵ６プロモーターと比較して半分以下の長さである。このプロモーターの下流にルシフェラーゼを標的としたｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを配置し、ベクターを構築した。
Ｕ６（９０）プロモーター配列、あるいはＵ６（１１０）プロモーター配列を有する化学合成ＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＭＩ処理後、ｐｉＧＥＮＥ−ｈＵ６ベクター（ｉＧＥＮＥ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）にプロモーターＤＮＡを組み込んだ。これらのプロモーター配列を有するプラスミドをＢｓｐＭＩ処理後、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２４）を組み込み、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを構築した。
ベクターＤＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクション後、発現されるＲＮＡの量をノーザンブロッティング法を用いて定量した。また、ｓｉＲＮＡの効果を比較するためにルシフェラーゼの発光値を測定した。
ベクターＤＮＡを、フルオレセイン蛍光色素を含むプライマーを用いてＰＣＲした後に、ジギトニン処理したＨｅＬａ細胞とインキュベーション後、１時間後に蛍光を観察した。
結果および考察
Ｕ６（９０）プロモーター、Ｕ６（１１０）プロモーター、および天然のＵ６プロモーターにおいて発現量を検出したところ、小型化によって得られたプロモーターは、天然のＵ６プロモーターとほぼ同程度で発現活性を有していた（図９（ａ））。また、これらのプロモーターで発現されるｓｉＲＮＡはルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する効果を有していた（図９（ｂ））。さらに、蛍光色素で標識したＤＮＡベクターの細胞核透過性を調べたところ、小型化したベクターでは、従来のベクターよりも核透過性が高いことが明らかとなった（図９（ｃ））。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

本発明のダンベル型ＤＮＡは、遺伝子治療に用いることができる。

配列番号１は、Ｕ６プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号２は、Ｈ１プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号３は、ｔＲＮＡプロモーターの塩基配列を示す。
配列番号４は、トロンビンに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、トロンビンに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、トロンビンに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、トロンビンに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号８は、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９に結合するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、ｐＵ６ｉ−ＥＧＦＰにおけるＵ６プロモーター直後の挿入配列の塩基配列を示す。
配列番号１０は、ｐＵ６ｉ−ｌａｍｉｎにおけるＵ６プロモーター直後の挿入配列の塩基配列を示す。
配列番号１１は、ＰＣＲのためのプライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１２は、ＰＣＲのためのプライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１３は、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃａｐの塩基配列を示す。
配列番号１４は、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃａｐの塩基配列を示す。
配列番号１５は、ＰＣＲのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１６は、ＰＣＲのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１７は、ＰＣＲのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１８は、ＰＣＲのための共通プライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号１９は、ＰＣＲのためのプライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号２０は、ＰＣＲのためのプライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号２１は、ｓｉＲＮＡをコードする直鎖状ＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号２２は、Ｕ６（９０）プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号２３は、Ｕ６（１１０）プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号２４は、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、Ｕ６（２４０）プロモーター（天然型のＵ６プロモーター）の塩基配列を示す。

Claims (32)

1. 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡの製造方法であって、以下の工程：
   １）センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有し、
   （ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
   （ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
   （ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
   （ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
   ２）１）の工程で得られたＤＮＡ増幅産物を（ａ）のニック酵素で処理する工程、
   ３）２）の工程でニック酵素処理されたＤＮＡ増幅産物を加熱し、その後にアニーリングする工程、及び
   ４）３）の工程で加熱及びアニーリングされたＤＮＡ増幅産物をＤＮＡリガーゼで処理する工程
   を含み、ここで、
   １）の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端がリン酸化されているか、あるいは１）の工程が行われた後４）の工程が行われる前にＤＮＡ増幅産物の５’末端がリン酸化される、前記方法。
2. ダンベル型ＤＮＡが、ＲＮＡ転写のためのベクターとして用いられるものである請求項１記載の方法。
3. 目的のＤＮＡ配列が１個以上のプロモーター配列及びｓｉＲＮＡ転写配列を有する請求項１または２記載の方法。
4. ダンベル型ＤＮＡがタンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターあるいはステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクターである請求項３記載の方法。
5. センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーが、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有し、ここで、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、（ａ）の配列がＴＮ^１ＡＧＧ（配列中、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表され、（ｂ）の配列が（Ｔ）_ｎ（配列中、Ｔはチミンであり、ｎは１以上の整数である。）で表され、（ｃ）の配列がＣＣＴＮ^１１ＡＧＣ（配列中、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｎ^１１はアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンのいずれかである。）で表される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. センスプライマー及びアンチセンスプライマーが、さらに、第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を有し、センスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＡＧで表され、第２のスペーサー配列がＴＣで表され、アンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列がＴＣで表され、第２のスペーサー配列がＡＧで表され、かつ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、第１のスペーサー配列と第２のスペーサー配列とは（ｂ）の配列を挟んで対向するように連結されている請求項６記載の方法。
8. センスプライマーの配列及びアンチセンスプライマーについて、（ｂ）の配列がＴＴＴＴで表される請求項７記載の方法。
9. センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーが、（ｂ）の配列及び／又はスペーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも１箇所で官能基により修飾されている請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. １）の工程の後に、官能基変換を行う工程をさらに含む請求項９記載の方法。
11. センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも一組のプライマーを含む組成物であって、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマーが、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有する、前記組成物。
    （ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
    （ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
    （ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
    （ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
12. 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡを製造するために用いられる請求項１１記載の組成物。
13. 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡを製造するために用いられるキットであって、センスプライマー及びアンチセンスプライマーからなる少なくとも一組のプライマーを含み、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマーが、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有する、前記キット。
    （ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
    （ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
    （ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
    （ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
14. 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡにデリバリー剤を結合させた核酸ベクターの製造方法であって、以下の工程：
    １）センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’末端に下記の（ａ）の配列を有し、かつ、５’末端側から３’末端側の方向に向かって順に下記の（ｂ）の配列、（ｃ）の配列及び（ｄ）の配列を有し、
    （ａ）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
    （ｂ）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
    （ｃ）（ａ）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
    （ｄ）目的のＤＮＡ配列の全部又は一部に相補的な配列
    ２）１）の工程で得られたＤＮＡ増幅産物を（ａ）のニック酵素で処理する工程、
    ３）２）の工程でニック酵素処理されたＤＮＡ増幅産物を加熱し、その後にアニーリングする工程、
    ４）３）の工程で加熱及びアニーリングされたＤＮＡ増幅産物をＤＮＡリガーゼで処理する工程、及び
    ５）４）の工程でＤＮＡリガーゼ処理されたＤＮＡ増幅産物中の目的のＤＮＡ配列以外の配列にデリバリー剤を結合させる工程
    を含み、ここで、
    １）の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの５’末端がリン酸化されているか、あるいは１）の工程が行われた後４）の工程が行われる前にＤＮＡ増幅産物の５’末端がリン酸化される、前記方法。
15. 請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で作製されたダンベル型ＤＮＡ。
16. 直鎖状２本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖ＤＮＡで連結されているダンベル型ＤＮＡであって、以下の（ａ’）〜（ｄ’）の配列を含む前記ダンベル型ＤＮＡ。
    （ａ’）ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によりニックが入る部位から３’末端側の配列を含む配列
    （ｂ’）一本鎖でループ構造を形成することができる配列
    （ｃ’）（ａ’）のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
    （ｄ’）目的のＤＮＡ配列
17. 細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させることができる請求項１５または１６記載のダンベル型ＤＮＡ。
18. 発現する機能性核酸がｓｉＲＮＡあるいはヘアピンＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである請求項１７記載のダンベル型ＤＮＡ。
19. 発現する機能性核酸がリボザイムである請求項１７に記載のダンベル型ＤＮＡ。
20. 発現する機能性核酸がアンチセンスＲＮＡである請求項１７記載のダンベル型ＤＮＡ。
21. ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含む請求項１７〜２０のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
22. ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの少なくとも１つの配列を含む２５０塩基以下の配列を含む請求項２１記載のダンベル型ＤＮＡ。
    （ｉ）ＴＡＴＡ
    （ｉｉ）ＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ
    （ｉｉｉ）ＹＹＴＣＣＣＡＮＮＲＴＮＣＮＮＹＧＣＲＲ
    （ｉｖ）ＡＴＧＣＡＡＡＴあるいはこれに相補的な配列
    （配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
23. ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩから転写されるプロモーター領域の全部又は一部が、以下の（ｉ’）〜（ｉｉ’）のうちの少なくとも１つの配列を含む１５０塩基以下の配列を含む請求項２１記載のダンベル型ＤＮＡ。
    （ｉ’）ＲＲＹＮＮＡＲＹＧＧ
    （ｉｉ’）ＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ
    （配列中、Ｒはグアニンまたはアデニンいずれかであり、Ｙはシトシンまたはチミンのいずれかであり、Ｎはグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。）
24. 配列番号１、２２、２３または２５のいずれかの配列を含む請求項２１〜２３のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
25. 発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である請求項１７〜２４のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
26. ウイルスがＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶからなる群より選択される請求項２５記載のダンベル型ＤＮＡ。
27. 細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる請求項１５または１６記載のダンベル型ＤＮＡ。
28. ＤＮＡザイムである請求項２７記載のダンベル型ＤＮＡ。
29. デコイとして作用する請求項２７記載のダンベル型ＤＮＡ。
30. ダンベル型ＤＮＡが光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型ＤＮＡである請求項１５〜２９のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡ。
31. 請求項１５〜３０のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡを含む組成物。
32. 請求項１５〜３０のいずれかに記載のダンベル型ＤＮＡを含む医薬組成物。

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