JP4505566B2 - 肺癌治療剤 - Google Patents
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即ち、本発明は、第1の態様において、神経内分泌分化を示す肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、ヒトASH1 mRNA又はその選択的スプライス型RNA配列からの連続する19〜25ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むsiRNA又はその前駆体をコードするDNA配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを、医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
前記プロモーターの例は、哺乳類、特にマウス又はヒトU6又はH1プロモーターである。
前記ヒトASH1 mRNAの特定の例は、配列番号1に示されるヒトASH1 核酸配列によってコードされる配列を含むものである。
本発明はさらに、第3の態様において、上に定義のDNAによってコードされるsiRNA又はその前駆体を提供する。
GCCCAAGCAAGUCAAGCGACAG (センス鎖)
CGGGUUCGUUCAGUUCGCUGUC (アンチセンス鎖)
GCTGCAGCAGCTGCTGGACGAG (配列番号7)
CCGCGTCAAGTTGGTCAACCTG (配列番号8)
GCTCGCCGGTCTCATCCTACTC (配列番号9)
CAGCGCTCGTCTTCGCCCGAAC (配列番号10)
CGCGCTGCAGCAGCTGCTGGAC (配列番号11)
TGGTCAACCTGGGCTTTGCCAC (配列番号12)
CTCCAACGACTTGAACTCCATG (配列番号13)
GTCAGCGCCCAAGCAAGTCAAG (配列番号14)
CCGGCTCAACTTCAGCGGCTTT (配列番号15)
CACAAGTCAGCGCCCAAGCAAG (配列番号16)
TGGCTACAGCCTGCCGCAGCAG (配列番号17)
AGGAGCTTCTCGACTTCACCAA (配列番号18)
CGCGCAGCAGCAGCAGCAGCAG (配列番号19)
CGCCGGTCTCATCCTACTCGTC (配列番号20)
CCGCAACGAGCGCGAGCGCAAC (配列番号21)
CGGCTCGCCGGTCTCATCCTAC (配列番号22)
CGCCCGCAGCCTGTTTCTTTGC (配列番号23)
CCGCCCGCAGCCTGTTTCTTTG (配列番号24)
siRNAを直接患部に注入する場合には、それらをリポソーム、たとえばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームと複合体形成して注入することもできる。
(a)5'-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGTTCCAGCTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTT-3'(配列番号2)
(b)5'-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGCTTCCTGTCACTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTT-3'(配列番号3)
(c)5'-(マウスU6プロモーター配列)-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGTTTTT-(マウスU6プロモーター配列)-CTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTT-3'(配列番号4)
(下線はセンス又はアンチセンス鎖配列を示す。なお、配列番号4の配列中、1〜315及び342〜656は共にマウスU6プロモーター配列、316〜336はセンス鎖配列、657〜678はアンチセンス鎖配列、337〜341及び679〜683はともに転写停止シグナル配列であり、またベクターの合成の際には、プロモーター配列とセンス又はアンチセンス鎖配列との境界、或いは、プロモーター配列の5'末端、には制限部位を付加又は挿入することもできる。)
1)肺癌細胞株A549にASH1発現ベクターとASH1−RNAiプラスミドとを、lipofectamine 2000(Invitrogen社)を用いて遺伝子導入し、ピューロマイシンを含む培地中で遺伝子導入された細胞だけを選択した。ピューロマイシン選択後に細胞抽出液を作製し、Western blotにて、ASH1蛋白の発現量を調べた。その結果、本発明のshort hairpin oligoによるASH1 RNAiは、強いRNAi作用を示し、ASH1の発現レベルを強く抑制した(図1〜5)。
(通称名) (正式名)
SK3: ACC−LC−172
YS: ACC−LC−91
KS: ACC−LC−176
(1)ASH1 RNAi用のshort−hairpinオリゴ
記載される方法(D.H.Mathews et al.,J.Mol.Biol.(1999),288:911−940)を利用して、ヒトASH1 mRNAの二次構造からASH1 RNAiのターゲット部位を予測、選択し(図3)、次の2つの二重鎖オリゴを外部の合成委託会社に依頼して合成した。
pU6−siASH1L1−puroに挿入されるオリゴ1:
5’-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGTTCCAGCTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTTTG-3’
3’-GGGTTCGTTCAGTTCGCTGTCAAGGTCGACAGCGAACTGAACGAACCCGAAAAAACTTAA-5’
(左端はbluntでApaI + T4 DNA polymeraseに対応し、右端はEcoRI断端に対応する)
pU6−siASH1L2−puroに挿入されるオリゴ2:
5’-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGCTTCCTGTCACTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTTG-3’
3’-GGGTTCGTTCAGTTCGCTGTCGAAGGACAGTGACAGCGAACTGAACGAACCCGAAAAACTTAA-5’
(同様に左端はblunt、右端はEcoRI断端に対応する。)
上記配列中のセンス、アンチセンス、ループの位置は下記のとおりである。
(オリゴ1)
5'-GCCCAAGCAAGTCAAGCGACAGTTCCAGCTGTCGCTTG
(ASH1センス) (ループ)
ACTTGCTTGGGCTTTTTG-3'
(ASH1アンチセンス)
(オリゴ2)
5'-GCCCAAGCAAGTCAAGCGACAGCTTCCTGTCACTGTCG
(ASH1センス) (ループ)
CTTGACTTGCTTGGGCTTTTTG-3'
(ASH1アンチセンス)
(上記オリゴ1及びオリゴ2の配列中、TTTTTは転写停止シグナル配列である。)
I.RNAiプラスミドベクター
1)puromycin耐性遺伝子発現ベクターpCMV−puroの作製
pIRES−puro2 (clontech社)からIRES領域を含む不要な部分をHindIIIにて切断し、自己連結(self−ligation)させて、CMVプロモーターから直接ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するpCMV−puroベクターを作製した。
ベクターによるRNAiとして、U6遺伝子プロモーターを用いることは公知であり(Guangchao Sui et al., ‘A DNA vector−based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells’ PNAS(2002), 99:5515−5520)、それに従いRNAiマウスゲノムからU6遺伝子プロモーターを単離しpBSSK(Stratagene社)のBamHI−SmaI部位に挿入した。慣用のin vitro突然変異誘発法にてApaI切断部位を転写開始点に導入した。U6プロモーター転写開始点からApaI−EcoRI−EcoRVの制限部位構成となる(配列番号25)。
1)のpCMV−puroのNruI−BglII部位(CMVプロモーターの5’上流部位)に、2)のBamHI−EcoRV断片(U6プロモーター−ApaI−EcoRI断片)を挿入した。これによりこの1個のベクターで、U6プロモーターから(細胞内でsiRNAになる)short hairpin RNA(shRNA)を発現し、同時にピューロマイシン耐性遺伝子を発現させることができる。
通常のCMVプロモーターから通常遺伝子を発現するAdeno−X発現系(Clontech社)を改変した。Adeno−X系では、発現させる遺伝子のcDNAを、pShuttle2ベクター(Clontech社)に挿入し、そのpShuttle2ベクターとAdeno−XウイルスDNAとを(ともに制限酵素I−CeuI及びPI−Sce−Iで切断後に)結合し、目的遺伝子発現adenovirus DNAとなる。今回はpShuttle2のCMV−MCS(multiple cloning sites)−polyA siteを切除し、上記IのASH1−RNAiプラスミドベクターの(ASH1−shRNAを含む)BamHI−EcoRV断片を挿入し、RNAi用のShuttleベクターに改変した。その後、型の通りに制限酵素I−CeuI及びPI−Sce−Iで切断後、Adeno−XウイルスDNAと結合し、ASH1に対するRNAi−adenovirusベクターとした(図13)。
ヒトASH1 cDNA(ORF全長)を、ヒト小細胞肺癌細胞株ACC−LC−170(通称SA)のcDNAからPCR法にて増幅した。PCRは、rTaq (Takara)を用いてDMSO5%存在下で、アニール温度55℃の3−step PCRを実施した。使用したプラーマーは以下のとおりである。
センスプライマー:5'-CCTGAATTCTATGGAAAGCTCTGCCAAGAT-3'
アンチセンスプライマー:5'-ACTTCACCAACTGGTTCTGACTCGAGCAG-3'
そのPCR産物を通常の遺伝子発現ベクターpcDNA3(Invitrogen社)に挿入した。ASH1蛋白に対する抗体の使用を容易にするため、ORF 5’にmyc−tagをつけた。
(1)RNAiによる発現抑制(A549)
ASH1発現陰性の肺癌細胞株A549、約1x105 個に対し、ASH1発現ベクターとRNAi−プラスミドベクターを等量混合し、Lipofectamine2000(Invitrogen社)にて遺伝子導入した。その後ピューロマイシン(puromycin)(2μg/ml)を添加した牛胎児血清(FBS) 5%添加RPMI−1640培地中で37℃、48時間培養した。遺伝子導入された細胞だけが残るので、通常のSDS−lysis bufferで細胞溶解液を作製した。ウエスタンブロット(Western blot)し、9E10 myc tag抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)で、ASH1蛋白の発現を検討した。Western blotのバンドの濃度をデンシトメトリーで定量して、RNAi効果(つまり、発現抑制効果)を検討した。
なお、抗ASH1抗体でも同様の結果であった。
肺腺癌に由来する肺癌細胞株293T細胞、SK3(正式名ACC−LC−172)及びA549へ、pU6−puroベクター(U6−empty)或いはpU6−siASH1−puroベクター(U6−siASH1L1又はU6−siASH1L2)を、lipofectamine2000(Invitrogen社)と混和し、(製造業者の説明書に従って)遺伝子導入した。293Tは遺伝子導入後24時間後に、SK3及びA549に関してはピューロマイシン(2μg/ml)を含むFBS5%添加RPMI−1640培地中で37℃、48時間選択した後に、RNeasy kit(Qiagen社)にてRNA回収した。RNA(15μg)は15%ポリアクリルアミドゲル0.5xTBEバッファーにて電気泳動し、泳動後にナイロン膜Zeta−probe(Bio−Rad社)に電気転写した。得られたZeta−probe膜を、ASH1 RNAi部位のオリゴを32P−gamma−ATP・T4ポリヌクレオチドキナーゼにて放射能標識したプローブとハイブリダイズした。
ASH1発現ベクター中のASH1の配列の中のRNAi部位に、PfuTURBO polymerase−PCRを用いたin vitro突然変異誘発法(Papworth, C. et al., Strategies(1996),9(3):3-4に記載されるQuikChange(登録商標)Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)使用)にて、アミノ酸変異を起こさないDNA変異を導入しRNAi抵抗性ASH1発現vectorを作製した(図5)。図5中、上段の配列は正常(又は天然)DNA配列、下段は変異を導入したDNA配列をそれぞれ示す。
図6(A)に示される6種の肺癌細胞株に、pU6−puro(「empty」)或いはpU6−siASH1−puro(「siASH1」)をlipofectamine2000とともに遺伝子導入し、約18時間後からピューロマイシン(2μg/ml)を含むFBS5%添加RPMI−1640培地中で37℃、約2週間選択培養した。その後Tetracolor ONE(生化学工業)を加え吸光度測定し、生細胞数の定量を行った。図6(A)はpU6−puroの細胞数に対するpU6−siASH1−puroの細胞数の比率を示す。
ASH1陽性肺癌細胞株YS(正式名ACC−LC−91)に、pU6−puro(「U6blank」又は「U6b」)或いはpU6−siASH1−puro(「siASH1L1」又は「siASH1L2」)をlipofectamine2000とともに遺伝子導入し、約18時間後からピューロマイシン(2μg/ml)を含むFBS5%添加RPMI−1640培地中で37℃、48時間選択培養した。界面活性剤Igepal CA−630(Sigma)0.5%にて細胞融解し、抽出された核をヨウ化プロピジウム(Sigma社)で染色し、FACScan(Becton Dickinson社)にて細胞周期解析を行った。
(5)と同様にASH1陽性肺癌細胞株YS(正式名ACC−LC−91)に、pU6−puro(「U6-blank」)或いはpU6−siASH1−puro(「U6−siASH1L1」又は「U6−siASH1L2」)をlipofectamine2000とともに遺伝子導入するが、この際に、空の発現ベクター(pcDNA3)或いはRNAi抵抗性変異ASH1発現ベクター(pcDNA3−ASH1mut)も同時に遺伝子導入し、約18時間後からピューロマイシン(2μg/ml)を含むFBS5%添加RPMI−1640の培地中で37℃、48時間選択培養した。(5)と同様にFACScan(Becton Dickinson)にて細胞周期解析を行った。
RNAi−plasmidをHEK293細胞に遺伝子導入し、約48時間後にRNAを回収して、Northern blotで解析した。一方、アデノウイルス(「RNAi−Adeno」)はHEK293細胞に感染させて約48時間後にRNAを回収し、Northern blotで解析した。
FBS5%添加RPMI−1640培地中のASH1陽性肺癌細胞株NCI−H460−LNM35或いはASH1陰性肺癌細胞株A549の培養液中に、ASH1−RNAi−adenovirus(「Ad−siASH1」)或いはAdenovirus−LacZ(「Adeno(empty)」又は「Ad」)を添加し感染させた。添加後図10のグラフに示す日数ごとにTetraColor One(生化学工業)にて生細胞数を定量した。
ASH1陽性肺癌細胞株NCI−H460−LNM35(2x106個)或いはASH1陰性肺癌細胞株ACC−LC−176(1x107個)をSCIDマウスの背中の皮下に注入し腫瘍を形成させた。その約1週間後に腫瘍径が約5mmとなったところで、ASH1−RNAi-adenovirus(「Ad−siASH1」)或いはAdenovirus−LacZ(「Ad」)を腫瘍内に注射器にて直接注入した(4x107 ifu、隔日2回)。最初の注入から1週間後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出し、重量を測定し、病理標本を作製した。
配列番号3: ヘアピン型RNAをコードするDNA配列。
配列番号4: タンデム型DNA配列。
配列番号25: U6プロモーター プラス ApaI-EcoRI-EcoRV配列。
Claims (13)
- 神経内分泌分化を示すASH1陽性肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、ヒトASH1の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖配列5'-(G)CCCAAGCAAGUCAAGCGACAG-3'(配列番号5;ここで括弧内のGは含まなくてもよい。)及びその相補的配列であるアンチセンス鎖配列3'-CGGGUUCGUUCAGUUCGCUGUC-5'を含むRNAをコードするDNAをプロモーターの調節下に含む発現ベクターを、医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
- 前記DNAが配列番号2又は配列番号3に示される塩基配列を含む、請求項1記載の医薬組成物。
- 前記発現ベクターが配列番号4に示される塩基配列を含む、請求項1記載の医薬組成物。
- 前記発現ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項4記載の医薬組成物。
- 神経内分泌分化を示すASH1陽性肺癌の増殖を抑制するための医薬の製造における、ヒトASH1の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖配列5'-(G)CCCAAGCAAGUCAAGCGACAG-3'(配列番号5;ここで括弧内のGは含まなくてもよい。)及びその相補的配列であるアンチセンス鎖配列3'-CGGGUUCGUUCAGUUCGCUGUC-5'を含むRNAをコードするDNAをプロモーターの調節下に含むベクターの使用。
- 前記DNAが配列番号2又は配列番号3に示される塩基配列を含む、請求項8記載の使用。
- 前記ベクターが配列番号4に示される塩基配列を含む、請求項8に記載の使用。
- 配列番号2〜4のいずれかの塩基配列を含むDNA。
- センス鎖配列5'-(G)CCCAAGCAAGUCAAGCGACAG-3'(配列番号5;ここで括弧内のGは含まなくてもよい。)及びその相補的配列であるアンチセンス鎖配列3'-CGGGUUCGUUCAGUUCGCUGUC-5'を含むsiRNA。
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