JP4486821B2 - 高忠実度dnaポリメラーゼ組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
(a)野生型Pfu DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップと;
(b)変異型Pfu DNAポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するためにポリヌクレオチド内へ1つ以上のヌクレオチド突然変異を導入するステップと;および
(c)変異型Pfu DNAポリメラーゼを産生するために変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ここで変異型Pfu DNAポリメラーゼはT542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で1つ以上の突然変異を含むステップ
によって産生する。
本明細書で使用する「合成」とは、ポリヌクレオチドの新規ストランドを作製する、または既存ポリヌクレオチド(すなわち、DNAもしくはRNA)を伸長させるあらゆるin vitro法を意味する。本発明による合成には、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列の多数のコピーを増加させる増幅が含まれる。ポリヌクレオチド合成(例、増幅)は、ポリヌクレオチド(すなわち、プライマー)内へのヌクレオチドの取り込みを生じさせ、それによって該ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新規ポリヌクレオチド分子を形成する。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、追加のポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用できる。
DNAポリメラーゼおよびそれらの特性は、特に「DNA複製 第2版」KornbergとBaker,W.H.Freeman&Company,ニューヨーク,ニューヨーク州(1991年)の中に詳細に記載されている。
本発明によるDNA重合活性を備える酵素には、DNAポリメラーゼおよび逆転写酵素等の酵素が含まれる。
本発明による3’−5’エキソヌクレアーゼ活性(すなわち、プルーフリーディングDNAポリメラーゼ)を備える酵素には、DNAポリメラーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼI、大腸菌エキソヌクレアーゼIII、大腸菌recBCDヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ等が含まれるが、それらに限定されない(例えば、Kuo,1994年,Ann NY Acad Sci.,726:223−34を参照されたい)。
バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ、φ29DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ;大腸菌pol IIDNAポリメラーゼ;ヒトDNAポリメラーゼσ、ヒトDNAポリメラーゼγ、古細菌DNAポリメラーゼI(表1)。
大腸菌DNA pol I(クレノウフラグメント)、Thermotoga maritima(UlTmaフラグメント)。
例えば、Cannら(1998年)PNAS 95:14250−5に記載されている古細菌DNAポリメラーゼII(DP1/DP2)。
Vent Thermococcus litoralis
受入番号AAA72101
PID g348689
バージョンAAA72101.1 GI:348689
DBSOURCE 遺伝子座THCVDPE 受入番号M74198.1
THEST THERMOCOCCUS種(TY系統)
受入番号O33845
PID g3913524
バージョンO33845 GI:3913524
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_THEST、受入番号O33845
Pab Pyrococcus abyssi
受入番号P77916
PID g3913529
バージョンP77916 GI:3913529
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_PYRAB、受入番号P77916
PYRHO Pyrococcus horikoshii
受入番号O59610
PID g3913526
バージョンO59610 GI:3913526
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_PYRHO、受入番号O59610
PYRSEPYROCOCCUS種(GE23系統)
受入番号P77932
PID g3913530
バージョンP77932 GI:3913530
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_PYRSE、受入番号P77932
DeepVent Pyrococcus種
受入番号AAA67131
PID g436495
バージョンAAA67131.1 GI:436495
DBSOURCE 遺伝子座PSU00707、受入番号U00707.1
Pfu Pyrococcus furious
受入番号P80061
PID g399403
バージョンP80061 GI:399403
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_PYRFU、受入番号P80061
JDF−3 Thermococcus種
未公表
米国特許第5602011号からのBaross gi|2097756|pat|US|5602011|12配列12
9degN THERMOCOCCUS種(90N−7系統)
受入番号Q56366
PID g3913540
バージョンQ56366 GI:3913540
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_THES9、受入番号Q56366
KOD Pyrococcus種
受入番号BAA06142
PID g1620911
バージョンBAA06142.1 GI:1620911
DBSOURCE 遺伝子座PYWKODPOL受入番号D29671.1
Tgo Thermococcus gorgonarius.
受入番号4699806
PID g4699806
バージョンGI:4699806
DBSOURCE pdb:鎖65,1999年2月23日リリース
THEFM Thermococcus fumicolans
受入番号P74918
PID g3913528
バージョンP74918 GI:3913528
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_THEFM、受入番号P74918
METTH Methanobacterium thermoautotrophicum
受入番号O27276
PID g3913522
バージョンO27276 GI:3913522
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_METTH、受入番号O27276
Metja Methanococcus jaimaschii
受入番号Q58295
PID g3915679
バージョンQ58295 GI:3915679
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_METJA、受入番号Q58295
POC Pyrodictium occultum
受入番号B56277
PID g1363344
バージョンB56277 GI:1363344
DBSOURCE pir:遺伝子座B56277
ApeI Aeropyrum pernix
受入番号BAA81109
PID g5105797
バージョンBAA81109.1 GI:5105797
DBSOURCE 遺伝子座AP000063、受入番号AP000063.1
ARCFUのArchaeoglobus fulgidus
受入番号O29753
PID g3122019
バージョンO29753 GI:3122019
DBSOURCE swissprot:遺伝子座DPOL_ARCFU、受入番号O29753
Desulfurococcus種 Tok.
受入番号6435708
PID g64357089
バージョンGT:6435708
DBSOURCE pdb鎖65、1999年6月2日リリース
クローン化した野生型exo+DNAポリメラーゼは、低下した重合活性を示す形態を生成するために多数の方法によって修飾することができる。これらには、以下に記載した方法および当技術分野において知られている方法が含まれる。本発明における低下したDNA重合活性を備えるexo+DNAポリメラーゼを調製するためにはあらゆるexo+DNAポリメラーゼを使用できる。
低下したDNA重合活性を備えるDNAポリメラーゼを調製する好ましい方法は遺伝子組み換えによる方法である(例えば、野生型DNAポリメラーゼのDNA配列を修飾することにより)。exo+DNAポリメラーゼの配列内では、遺伝子組み換えのために好ましい配列は重合ドメインをコードするDNA配列である。多数のDNAポリメラーゼの重合ドメインおよびエキソヌクレアーゼドメイン(すなわち、それらの結晶構造)は、当技術分野において知られている(例えば、Rodriguezら、2000年,J.Mol.Biol.299:447−62;Zhaoら、1999年,Structure Fold Des.7:1189−99;Bakerら、1998年,Proc Natl Acad Sci USA.95:3507−12;Kieferら、1997年,Structure 5:95−108;Kimら、1995年,Nature,376:612−6;Kongら、1993年,J Biol Chem.268:1965−75を参照されたい)。
当技術分野において知られている、または本明細書で記載した通りに生成して細菌内で発現させたランダムもしくは部位特異的突然変異誘発は、低下した重合について数種のアッセイ法によってスクリーニングすることができる。変異型および野生型酵素の発現についての実施態様は、下記の第C章で記載する。1つの方法では、例えば、登録商標λZapII(商標)に基づく発現ベクターを用いた宿主細菌の感染によって生成した溶菌性λファージプラーク内で発現したexo+DNAポリメラーゼタンパク質を膜支持体へ移す。固定化タンパク質をその後、DNA鋳型および取り込みについて監視される非従来型ヌクレオチドを含有するバッファー中に膜を浸漬することにより膜上でポリメラーゼ活性について検査する。
(変異型DNAポリメラーゼについて修正されたcpm)×(野生型DNAポリメラーゼのng)
―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
(野生型DNAポリメラーゼについて修正されたcpm)×(変異型DNAポリメラーゼのng)
(修正されたサンプルのcpm)×(8nMのdNTP)× (1単位)
総cpm 反応 (取り込まれた10nMのdNTP)
変異型DNAポリメラーゼの特異的ポリメラーゼ活性(U/mg)
野生型DNAポリメラーゼの特異的ポリメラーゼ活性(U/mg)
(修正されたサンプルのcpm)×(DNAのng)× (1nMのdNMP)
全Cpm 反応 (330ng dNMP)
エキソヌクレアーゼ活性率の単位(30分間で)は下記の通りに決定できる:
(1時間当たりに放出されたdNMPのnM)× (1単位)
2 (放出された10nMのdNMP)
エキソヌクレアーゼ比活性(U/mg)は、単位対酵素量のプロットの直線状部分の勾配から外挿できる。最後に、活性率(%)は下記の通りに決定できる:
変異型DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ比活性(U/mg)
野生型DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ比活性(U/mg)
当技術分野において知られている方法を適用すると、本発明によるDNAポリメラーゼの突然変異形(すなわち、第2酵素)を発現および単離することができる。本明細書に記載した方法はさらに、本発明において有用な野生型酵素(例、第1酵素)の発現に対しても適用することができる。多数の細菌発現ベクターは、異種配列によってコードされたタンパク質の高レベル誘導性発現を可能にする配列エレメントまたは配列エレメントの組み合わせを含有する。例えば、上記で言及したように、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の統合された誘導性形を発現する細菌は、T7プロモーターへ連結した変異DNAポリメラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを用いて形質転換させることができる。例えばlac−誘導性プロモーターのためのイソプロピル−β―Dチオガラクトピラノシド(IPTG)のような適切な誘導因子の添加によるT7 RNAポリメラーゼの誘導は、T7プロモーターからの変異遺伝子の高レベル発現を誘導する。
増幅反応において高いDNA重合活性を有する副作用を防止するために、本発明の組成物の重合活性はさらに物理的および/または化学的修飾および/または阻害によって低下させることができる。
本酵素混合物組成物は、DNA重合活性を備える第1酵素、ならびに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および低下したDNA重合活性を備える第2酵素を含む。
DNA合成のための本方法では、DNA重合活性を備える酵素は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および低下したDNA重合活性を備える第2酵素と混合することができる。
様々なDNA合成および増幅手法では、本発明の組成物は、単一DNAポリメラーゼまたは2種の野生型DNAポリメラーゼを含む混合物を用いて得られる合成結果と比較して、はるかに優れた合成結果(例えば、より高い忠実度および効率)を提供する。本組成物を使用する場合は、酵素混合物中の全重合活性および全エキソヌクレアーゼ活性の比率はDNA合成の最適の効率および忠実度にとって極めて重要である。
1つの態様では、本発明は本発明の組成物を使用するDNA合成方法を提供する。本組成物は、本組成物中に存在するDNAポリメラーゼまたは他の合成酵素と本質的に同一方法で様々なポリヌクレオチド合成方法で使用することができる。典型的には、ポリヌクレオチドの合成には、合成プライマー、合成鋳型、新規合成ポリヌクレオチドに取り込むためのポリヌクレオチド前駆体を必要とする(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。ポリヌクレオチド合成を実施するための詳細な方法は当業者にはよく知られており、例えば「分子クローニング(Molecular Cloning)第2版」,Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press,コールドスプリングハーバー,ニューヨーク州(1989年)の中で見いだすことができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」もしくは「PCR」とは、特異的なポリヌクレオチド鋳型配列を増幅させるin vitro法を意味する。PCRの技術は、「PCR:実際的アプローチ(PCR:A Practical Approach)」,M.J.McPhersonら、InnisらによるIRL Press(1991年),「PCRプロトコル:方法および適用に関する指針(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)」,Academic Press(1990年)および「PCRテクノロジー:DNA増幅のための原理および適用(PCR Technology:Principals and Applications for DNA Amplification)」,H.A.Erlich,Stockton Press(1989年)を含む多数の出版物に記載されている。PCRについては、各々が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第4,683,195号;第4,683,202号;第4,800,159号;第4,965,188号;第4,889,818号;第5,075,216号;第5,079,352号;第5,104,792号;第5,023,171号;第5,091,310号;および第5,066,584号を含む多数の米国特許にも記載されている。
PCR増幅のために、本発明で使用された酵素は、好ましくは耐熱性である。本明細書で使用する「耐熱性」とは、熱に対して安定性である、熱抵抗性である、そして例えば50〜90℃のような高温で機能する酵素を意味する。本発明による耐熱性酵素は増幅反応のために有効な単一の基準を満たさなければならない、すなわち、酵素は二本鎖ポリヌクレオチドの変性を実行するために必要な時間に渡り高温に曝露させたときに不可逆性に変性(不活化)されてはならない。この関連で本明細書で使用する「不可逆性変性」とは、酵素活性の永久的かつ完全な消失をもたらす工程を意味する。変性のために必要な加熱条件は、例えばバッファー塩濃度および変性させられるポリヌクレオチドの長さおよびヌクレオチド組成に依存し、典型的には主としてより短いポリヌクレオチドに対する0.25分間からより長いDNA片についての4.0分間の範囲内である時間に依存して、より短いポリヌクレオチドに対しては、典型的には85℃〜105℃の範囲に及ぶ。バッファー塩濃度および/またはポリヌクレオチドのGC組成が増加するにつれてより高い温度を許容することができる。好ましくは、酵素は90〜100℃では不可逆的には変性しないであろう。本発明による、不可逆性に変性しない酵素は、増幅反応中に少なくとも10%、もしくは少なくとも25%、または少なくとも50%以上の機能もしくは活性を保持する。
本酵素混合物に加えて、当業者はさらに合成/増幅反応の忠実度を増加させるために他のPCRパラメータを利用することができる。PCR忠実度は、dNTP濃度、pH、反応1回につき使用する酵素の単位、および反応内に存在するMg2+対dNTPの比率における変化等の要素によって影響を受ける可能性がある(Mattilaら、1991年,前記)。
鋳型GC含量が高いと、変性時間が増加する可能性がある。高いGC含量を備えるプライマーまたはより長いプライマーのためには、より高いアニーリング温度が必要になることがある。グラジエントPCRは、アニーリング温度を決定するための有用な方法である。より大きなPCR産物増幅のためには、伸長時間を伸ばさなければならない。しかし、酵素に対する損傷を制限するために可能な場合は常に、伸長時間の短縮が必要なことがある。
PCR促進因子は、増幅の効率を改善するためにも使用できる。本明細書で使用する「PCR促進因子」もしくは「ポリメラーゼ促進因子」(PEF)とは、ポリヌクレオチド有する複合体またはタンパク質のポリメラーゼ促進活性を意味する(どちらもこれにより参照して本明細書に組み込まれるHogrefeら、1997年,Strategies 10::93−96;および米国特許第6,183,997号)。Pfu DNAポリメラーゼについては、PEFは自然形でのP45(P50とP45の複合体として)または組み換えタンパク質のどちらかを含む。Pfu P50およびP45の自然複合体では、P45だけがPCR促進活性を示す。P50タンパク質は構造が細菌フラビンタンパク質と類似している。P45タンパク質は、その構造がdCTPデアミナーゼおよびdUTPaseと類似するが、dUTPをdUMPおよびピロリン酸塩へ転換するdUTPaseとしてのみ機能する。本発明によるPEFは、さらに古細菌起源(例、Pyrococcus furiosus)から入手したタンパク質を増強する単離もしくは精製天然型ポリメラーゼ;Pfu P45と同一アミノ酸配列を有する完全もしくは部分合成タンパク質もしくはポリメラーゼ促進活性を有するそのアナログ;1つ以上の前記天然型または完全もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進混合物;1つ以上の前記天然型または完全もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進タンパク質複合体;または1つ以上の前記天然型タンパク質を含有するポリメラーゼ促進部分精製細胞抽出液、からなる群から選択することもできる(前記の米国特許第6,183,997号)。PEFのPCR促進活性は、当技術分野においてよく知られている手段によって定義される。PEFについての単位の定義は、PEFのdUTPase活性(P45)に基づいており、これはdUTPからのピロリン酸塩(PPi)の産生を監視することによって決定される。例えば、PEFは、dUTP(1×クローン化Pfu PCRバッファー中の10mMのdUTP)とともにインキュベートされ、その時間内にPEFはdUTPをdUMPおよびPPiへ加水分解する。形成されたPPiの量は、シグマ(Sigma)社から市販で入手できる結合酵素アッセイシステム(製品番号P7275)を使用して定量される。1単位の活性は、1時間当たりに(85℃で)形成される4.0nMのPPiであると機能的に定義されている。
用語「逆転写酵素」とは、RNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴付けられたポリメラーゼのクラスを説明する。知られているすべての逆転写酵素は、RNA鋳型からDNA転写産物を合成するためのプライマーを必要とする。歴史的に見ると、逆転写酵素は主としてその後の操作(例、DNA依存性DNAポリメラーゼによるPCR増幅)のためのベクター内へクローン化することのできるcDNA内へmRNAを転写するために使用されてきた。
増幅したポリヌクレオチド産物の検出は、よく知られている様々な技術のいずれかによって実施できる。好ましい実施態様では、増幅産物はゲル電気泳動法により分子量に基づいて分離され、そして分離した産物はゲル内に存在する溶解した増幅産物の別個の種を観察することを可能にするポリヌクレオチド特異的染色を使用して可視化される。電気泳動法により分離されたポリヌクレオチドを可視化するために適する多数のポリヌクレオチド特異的染色が存在するが、好ましいのは臭化エチジウムである。
その上、本組成物を使用した増幅産物が当技術分野において知られているあらゆる方法によってクローニングできることは理解されている。1つの実施態様では、本発明はPCR増幅産物の直接クローニングを可能にする組成物を提供する。
本発明は、本組成物の1つ以上の容器を有するパッケージユニット、および一部の実施態様ではPCRにおける合成を含むポリヌクレオチド合成のために使用される様々な試薬の容器を含むキット構成もまた予期している。このキットは、次の品目の1つ以上をさらに含有していてよい:ポリヌクレオチド合成前駆体、プライマー、バッファー、取扱説明書、および対照。キットは、本発明による方法を実施するために適切な比率で一緒に混合される試薬容器をさらに含んでいてよい。試薬容器は、好ましくは本方法を実施する際の測定ステップを不要にする単位量で試薬を含有している。
本発明者らは、DNAポリメラーゼ活性を低下または排除する可能性があるがプルーフリーディング活性にはほんの小さな作用しか及ぼさないPfu DNAポリメラーゼ内に突然変異を導入した。選択した突然変異は、関連ファミリーB DNAポリメラーゼを使用して実施された以前の突然変異誘発試験から同定した。本発明者らは、Pfu中の次の残基で重合ドメインにおいて同一アミノ酸側鎖置換を作製した(D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S)(表1)。
Pfu突然変異体の細菌発現。プラスミドDNAは、登録商標ストラタプレップ(StrataPrep(商標))プラスミド・ミニプレップキット(Plasmid Miniprep Kit)(ストラタジーン社製)を使用して精製し、そしてXL−10 Gold細胞を形質転換させるために使用した。中等度のエアレーションを行いながら37℃で商標ターボアンプ(Turbo Amp(登録商標))抗生物質(100μg/μL)を含有する1〜5LのLB培地中でアンピシリン耐性コロニーを増殖させた。細胞は遠心分離により収集し、−20℃で保存した。
Pfu変異体調製物をDNAポリメラーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性について下記の通りに検査した。
Pfu K593TおよびG387P変異体の非標識化またはアフィニティー標識化融合物を以下の通りに精製した。細胞ペレット(12〜24g)は、3容量の溶解バッファー(バッファーA:50mMのトリス塩酸(pH8.2)、1mMのEDTA、およびlOmMのβME)中に再懸濁させた。リゾチーム(1mg/g 細胞)およびPMSF(1mM)を添加し、細胞を4℃で1時間溶解させた。細胞混合液を超音波処理し、15,000rpmでの30分間(4℃)の遠心分離により細胞破片を除去した。トウィーン(Tween)20およびIgepal CA−630を最終濃度0.1%へ添加し、上清を72℃で10分間加熱した。その後、熱変性大腸菌タンパク質は、15,000rpmでの30分間(4℃)の遠心分離により除去した。
定性的アッセイを使用して、His6−標識化Pfu変異体がPCR条件下で3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を保持することを検証した。このアッセイでは、DNA鋳型へアニーリングするとdG/dGミスマッチを産生する3‘dGを含有するフォワードプライマーを使用して、exo−Pfu DNAポリメラーゼ(2.5U/50μL)を用いて900bpのHα1AT標的を増幅させた。このアプリコンは、フォワードプライマー:5’−GAG.GAG.AGC.AGG.AAA.GGT.GGA.AG−3’[配列番号8](100ng/50μL rxn)およびリバースプライマー:5’−GAG.GTA.CAG.GGT.TGA.GGC.TACT.G−3’[配列番号9](100ng/50μL rxn)を使用して、ヒトゲノムDNAから増幅させた。増幅は、次のプログラムを用いて様々な量のHis6−標識化Pfu変異体の不在下または存在下において、パーキン・エルマー(Perkin/Elmer)9600サーマルサイクラー上で実施した:(1サイクル)95℃で2.5分間;(30サイクル)95℃で40秒間、61℃で10秒間、72℃で2.5分間;(1サイクル)72℃で7分間。プルーフリーディング活性が不在であると、この酵素exo−PfuはおそらくdG/dGミスマッチを効率的に伸長させることができないので、低収率の産物を産生する。プルーフリーディング活性を備えるPfu変異体の存在下では、3’dGはプライマーから切断され、exo−Pfuが高収率で標的を増幅させることが可能になるはずである。このPCRアッセイを使用して、忠実度アッセイで試験したPfu変異体がミスマッチPCRプライマーを切断するためのPCR条件下で十分なプルーフリーディング活性を保持することを確認した。さらに、このアッセイにより、本発明者らは増幅を阻害させずにPCR反応に添加できるタンパク質の濃度範囲を決定することが可能になった。
Pfuブレンド。2.5−5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ(2.5U/μLのクロ−ン化Pfu DNAポリメラーゼ+1U/μLの自然または2U/μLのクロ−ン化Pyrococcus furiosus dUTPase(PEF))および様々な濃度のポリメラーゼが欠如するPfu変異体を備えるクロ−ン化Pfu PCRバッファー(10mMのKCl、10mMの(NH4)2SO4、20mMのトリス塩酸(pH8.8)、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(Triton)X−100、および100g/mLのBSA)中において、PCR反応を標準条件下で実施した。長さが0.3〜9kbのゲノム標的については、PCR反応液は2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ、100ngのヒトゲノムDNA、200μMの各dNTP、および100ngの各プライマーを含有していた。長さが11.9kbおよび17kbのゲノム標的については、PCR反応液は5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ、250ngのヒトゲノムDNA、500μMの各dNTP、および200ngの各プライマーを含有していた。
His6−標識化PfuG387PおよびK593T変異体を含有するPfuおよびTaqブレンドのエラー率をCline J.,Braman,J.C.,およびHogrefe H.H.(96),NAR 24:3546−3551に記載されたlacI PCR忠実度アッセイにおいて試験した。手短には、lacIOlacZα標的遺伝子をコードする1.9kbのフラグメントを、クローン化Pfu PCRバッファー中の2.5UのPfu TurboまたはTaqもしくはHerculase PCRバッファー中の2.5UのTaqを使用してpPRIAZプラスミドDNAから増幅させた。一定の反応液へ様々な量のPfu G387PおよびK593T変異体を添加した。比較のために、lacI標的もまた製造業者が推奨するPCRバッファーを使用して、Pfx(Thermococcus種KOD DNAポリメラーゼ;インビトロジェン社製)およびTgo(Thermococcus gorgonarius DNAポリメラーゼ;ロシュ社製)を用いて増幅させた。lacIを含有するPCR産物をその後、λGT10腕内にクローン化し、そして(Lundberg K.S.,Shoemaker D.D.,Adams M.W.W.,Short J.M.,Sorge J.A.,およびMathur,E.J.(1991年),Gene 180:1−8)に記載されているように、カラースクリーニングアッセイでlacI変異体のパーセンテージを決定した(MF、突然変異発生頻度)。エラー率は、1複製当たり1bp当たりの突然変異発生頻度(MF/bp/d)として表示されるが、ここでbpはlacI遺伝子配列において検出可能な部位数(349)であり、dは効率的な標的倍加の数である。各酵素について、少なくとも2回の独立したPCR増幅を実施した。
Taqの末端トランスフェラーゼ活性にポリメラーゼが欠如するPfu変異体が及ぼす作用を決定するために、本発明者らは、一連のアプリコンをPfu G387P変異体(Taq PCRバッファー中)の不在下またはPfu G387P変異体の存在下(Herculase PCRバッファー中)でTaqを用いて増幅させた。同様の増幅は、Pfu TurboおよびHerculaseを使用してそれらの推奨PCRバッファー中で実施した。PCR産物収率は、SYBR金を用いて染色した1%アガロースゲル上で産物を分析することによって定量した。同量の各PCR産物は、TOPO TAクローニングキット(#K4500−01)の取扱説明書にしたがって、6μLの最終反応容量中の1μLのpCR 2.1−TOPOベクター(インビトロジェン社製)へ添加した。この反応液を室温で5分間インキュベートし、次に氷上へ移した。この反応液を製造業者の推奨にしたがって、ワンショット(One−Shot)セル(インビトロジェン社製)内へ変換させた。各形質転換の一定分量はインビトロジェン社製TOPO TAクローニングの取扱説明書に記載されている通りに調製したアンピリシン/IPTG/X−galプレート上でプレーティングした。所望のインサートを含有するクローンの頻度(クローニング効率(%))は、(白色コロニー)/(プレーティングしたコロニーの全数)の数として定量した。
His6−標識をHis6−標識化PfuG387Pクローンから削除し、非標識化変異体を発現させ、実施例4に記載した通りに精製した。4つのPfu G387P変異体サンプルを調製し、それらのタンパク質濃度をアミノ酸分析により決定した。基質として3H−大腸菌ゲノムDNAを使用してエキソヌクレアーゼ活性を測定し、表8において変異体調製物のエキソヌクレアーゼ比活性を野生型Pfuのエキソヌクレアーゼ比活性と比較した。Pfu G387P変異体変異体調製物のエキソヌクレアーゼ比活性は1,300−2,200U/mgの範囲に及び、野生型Pfuのエキソヌクレアーゼ比活性(350−950U/mg)よりいくらか高いと思われた。
実施例7に記載した通りに、非標識化PfuG387P変異体を含有するPfuおよびTaqブレンドのエラー率をlacI PCR忠実度アッセイで試験した。図4に示したように、エラー率における最高低下(3分の1未満)は、6〜10ngのPfu G387P調製物Jを2.5UのPfu(50μLの反応液)へ添加したときに観察された。予想外にも、忠実度はPfu G387P変異体の量(>10ng)が増加するに伴って低下するように思われた。lacIアンプリコンの収率もまたPfu G387P変異体の量の増加に伴って低下し、これはより低い忠実度が低下した収率と相関している可能性があることを示唆している。調製物Jを使用すると、最適忠実度(最低エラー率)は、−1−3Uの野生型Pfuによって示された3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の量である0.0125Uから0.0208Uのエキソヌクレアーゼ活性(調製物J;2090U/mg)を添加することによって達成された。これらの推定は、348−950Uのエキソヌクレアーゼ/mgの比活性および0.0174U/2.5U−0.02176U/2.5Uのexo/pol比を示すPfuに基づいている。表7を参照されたい。
前記の実施例は、本発明を作製および実行する際に本発明者らが実施および意図した実験を示したものである。これらの実施例には、本発明の実践の技術を通知し、そしてその有用性を証明する両方のために役立つ技術の開示が含まれている。当業者には、同様の結果を達成するために一般に多数の等価の方法および技術を利用できることを前提に、本明細書に開示した技術および実施態様は好ましい実施態様であることが理解されるであろう。
Claims (44)
- 第1の熱安定性酵素および第2酵素を含む酵素混合物であって、前記第1の熱安定性酵素はDNA重合活性を備え、そして前記第2酵素は配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Pfu DNAポリメラーゼであって、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼは野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有する、酵素混合物。
- 前記第1の熱安定性酵素がDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項1の酵素混合物。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、UlTma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼおよびDP1/DP2 DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項2の酵素混合物。
- 前記変異型Pfu DNAポリメラーゼがG387Pの突然変異を含む、請求項1の酵素混合物。
- PCR促進因子および/または添加剤をさらに含む、請求項4の酵素混合物。
- PCR促進因子および/または添加剤をさらに含む、請求項1の酵素混合物。
- 前記酵素混合物が(2.5−5U)/(0.02−5U)の重合活性/エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項1の酵素混合物。
- 前記酵素混合物が(2.5U)/(0.04−0.08U)の重合活性/エキソヌクレアーゼ活性の比率を備える、請求項7の酵素混合物。
- 第1の熱安定性酵素および第2酵素を含む酵素混合物であって、前記第1の熱安定性酵素がDNA重合活性を含み、および前記第2酵素が配列番号29のD404、Y409、T541、D542、K592、Y594、Y384、G386、およびG387からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D404E、Y409F、T541P、D542G、K592T、Y594S、Y384Q、Y384S、Y384N、Y384L、Y384H、G386S、G386P、G387AおよびG387Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Tgo DNAポリメラーゼであって、前記変異型Tgo DNAポリメラーゼは野生型Tgo DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;配列番号39のD404、Y409、T541、D542、K592、Y594、Y384、G386、およびG387からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D404E、Y409F、T541P、D542G、K592T、Y594S、Y384Q、Y384S、Y384N、Y384L、Y384H、G386S、G386P、G387AおよびG387Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型KOD DNAポリメラーゼであって、前記変異型KOD DNAポリメラーゼは野生型KOD DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;配列番号49のD407、Y412、T544、D545、K595、Y597、Y387、G389、およびG390からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D407E、Y412F、T544P、D545G、K595T、Y597S、Y387Q、Y387S、Y387N、Y387L、Y387H、G389S、G389P、G390AおよびG390Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Vent DNAポリメラーゼであって、前記変異型Vent DNAポリメラーゼは野生型Vent DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;配列番号59のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Deep Vent DNAポリメラーゼであって、前記変異型Deep Vent DNAポリメラーゼは野生型Deep Vent DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有する;からなる群から選択される変異型DNAポリメラーゼである、酵素混合物。
- 前記第1の熱安定性酵素がDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項9の酵素混合物。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、UlTma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼおよびDP1/DP2 DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項10の酵素混合物。
- 第1の熱安定性酵素、第2酵素、および第3酵素を含む酵素混合物であって、前記第1の熱安定性酵素がDNA重合活性を含み、および前記第2酵素および第3酵素が変異型Pfu DNAポリメラーゼ、変異型Tgo DNAポリメラーゼ、変異型KOD DNAポリメラーゼ、変異型Vent DNAポリメラーゼ、および変異型Deep Vent DNAポリメラーゼの群から選択される酵素であり、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼは野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;前記変異型Tgo DNAポリメラーゼが配列番号29のD404、Y409、T541、D542、K592、Y594、Y384、G386、およびG387からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D404E、Y409F、T541P、D542G、K592T、Y594S、Y384Q、Y384S、Y384N、Y384L、Y384H、G386S、G386P、G387AおよびG387Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、前記変異型Tgo DNAポリメラーゼは野生型Tgo DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;前記変異型KOD DNAポリメラーゼが配列番号39のD404、Y409、T541、D542、K592、Y594、Y384、G386、およびG387からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D404E、Y409F、T541P、D542G、K592T、Y594S、Y384Q、Y384S、Y384N、Y384L、Y384H、G386S、G386P、G387AおよびG387Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、前記変異型KOD DNAポリメラーゼは野生型KOD DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;前記変異型Vent DNAポリメラーゼが配列番号49のD407、Y412、T544、D545、K595、Y597、Y387、G389、およびG390からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D407E、Y412F、T544P、D545G、K595T、Y597S、Y387Q、Y387S、Y387N、Y387L、Y387H、G389S、G389P、G390AおよびG390Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、前記変異型Vent DNAポリメラーゼは野生型Vent DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有し;前記変異型Deep Vent DNAポリメラーゼが配列番号59のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、前記変異型Deep Vent DNAポリメラーゼは野生型Deep Vent DNAポリメラーゼと比較して低下した活性を有する、酵素混合物。
- 前記第1の熱安定性酵素が野生型DNAポリメラーゼである、請求項12の酵素混合物。
- 前記第1の熱安定性酵素が3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有していないDNAポリメラーゼまたは3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼである、請求項13の酵素混合物。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有していない前記DNAポリメラーゼがTaq DNAポリメラーゼである、請求項14の酵素混合物。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記DNAポリメラーゼがPfu DNAポリメラーゼ、Tgo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、およびDeep Vent DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項14の酵素混合物。
- 第1酵素および第2酵素を含む酵素混合物であって、前記第1酵素は野生型Pfu DNAポリメラーゼであり、前記第2酵素は配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Pfu DNAポリメラーゼであって、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼである、酵素混合物。
- 前記第1の熱安定性酵素が野生型Taq DNAポリメラーゼまたは野生型Pfu DNAポリメラーゼである、請求項1の酵素混合物。
- 低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼであって、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する、変異型Pfu DNAポリメラーゼ。
- 前記変異型Pfu DNAポリメラーゼがT542P、D543G、K593T、Y595SおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む、請求項19の変異型DNAポリメラーゼ。
- 変異型Pfu DNAポリメラーゼを含む組成物であって、前記変異型DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する、組成物。
- 配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する変異型Pfu DNAポリメラーゼを産生するために、野生型Pfu DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内へ1つの突然変異を導入することにより産生した、変異型Pfu DNAポリメラーゼ。
- 野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼであって、以下のステップによって産生される変異型Pfu DNAポリメラーゼ:
(a)野生型Pfu DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ;
(b)前記変異型Pfu DNAポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するために前記ポリヌクレオチド内へ1つ以上のヌクレオチド突然変異を導入するステップ;および
(c)前記変異型Pfu DNAポリメラーゼを産生するために前記変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ここで変異型Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む。 - 野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備えるPfu DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生した変異型Pfu DNAポリメラーゼを含む組成物であって、前記Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む、組成物。
- 野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼを含む組成物であって、以下のステップによって産生される変異型Pfu DNAポリメラーゼを含む、組成物:
(a)T542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む配列番号19の変異型Pfu DNAポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するために野生型Pfu DNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内に1つの突然変異を導入するステップ;
(b)前記変異型Pfu DNAポリメラーゼを含む前記組成物を産生するために前記変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップ。 - 第1の熱安定性酵素、第2酵素、およびそれらのための包装材料を含むキットであって、前記第1の熱安定性酵素がDNA重合活性を備え、前記第2酵素は配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する変異型Pfu DNAポリメラーゼである、キット。
- 前記第1の熱安定性酵素がDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項26のキット。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、UlTma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼおよびDP1/DP2 DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項27のキット。
- 前記第1の熱安定性酵素が野生型Taq DNAポリメラーゼまたは野生型Pfu DNAポリメラーゼである、請求項26のキット。
- 第1酵素と第2酵素、およびそのための包装材料を含むキットであって、前記第1酵素が野生型Pfu DNAポリメラーゼであり、前記第2酵素はD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含む変異型Pfu DNAポリメラーゼであって、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼである、キット。
- デオキシヌクレオチド、反応バッファー、PCR促進因子および/または添加剤、対照DNA鋳型および対照プライマーからなる群から選択される1つ以上の成分をさらに含む、請求項26または30のキット。
- 前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが、G387P突然変異を含む、請求項26のキット。
- 前記酵素混合物が(2.5−5U)/(0.02−5U)の重合活性/エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項30のキット。
- 前記酵素混合物が(2.5U)/(0.04−0.08U)の重合活性/エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項33のキット。
- 前記変異型Pfu DNAポリメラーゼがG387Pの突然変異を含む、請求項31のキット。
- 野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える変異型Pfu DNAポリメラーゼおよびそのための包装材料を含むキットであって、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含むキット。
- 変異型Pfu DNAポリメラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが配列番号19のT542、D543、K593、Y595、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、T542P、D543G、K593T、Y595S、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する、単離ポリヌクレオチド。
- DNA合成のための、以下のステップを含む方法:
(a)酵素混合物を提供するステップであって、前記酵素混合物がDNA重合活性を備える第1の熱安定性酵素と、配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を有する変異型Pfu DNAポリメラーゼである第2酵素と、を含むステップ;および
(b)前記酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、前記酵素混合物がDNA合成を可能にするステップ。 - 前記核酸鋳型がDNA分子である、請求項38の方法。
- 前記第1の熱安定性酵素がDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項38の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、UlTma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼおよびDP1/DP2 DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項40の方法。
- DNA合成産物のTAクローニングのための、以下のステップを含む方法:
(a)酵素混合物を提供するステップであって、前記酵素混合物はTaq DNAポリメラーゼを第1酵素、および、配列番号19のD405、Y410、T542、D543、K593、Y595、Y385、G387、およびG388からなる群から選択されるアミノ酸位置で、D405E、Y410F、T542P、D543G、K593T、Y595S、Y385Q、Y385S、Y385N、Y385L、Y385H、G387S、G387P、G388AおよびG388Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異を含み、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性および野生型Pfu DNAポリメラーゼと比較して低下したDNA重合活性を備える、変異型Pfu DNAポリメラーゼを第2酵素として含む、ステップ;
(b)前記酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、前記酵素混合物が合成DNA産物を生成するためにDNA合成を可能にするステップ;および
(c)TAクローニングベクター内へ合成DNA産物を挿入するステップ。 - 前記変異型Pfu DNAポリメラーゼが、G387P突然変異を含む、請求項42の方法。
- 前記反応混合物がPCR促進因子および/または添加剤をさらに含む、請求項38または42の方法。
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