JP4482233B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は、新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドを用いたフコース含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該組換え体ベクターを保有する形質転換体を用いたフコース含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法に関する。
背景技術
フコース含有糖鎖は、発生・分化、細胞認識といった生命現象に関与しているほか、炎症、癌、感染症、自己免疫疾患、およびその他多くの病気の発生、進行に深く関係していると考えられている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（１９９３年）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，９７（１９９３）〕。
フコース含有糖鎖は、タンパク質や脂質に付加して、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質として存在するほか、オリゴ糖としても存在する。
フコース含有糖鎖の一つであるルイスｘ糖鎖〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕は、初期胚、脳、および腎臓の発生の過程で規則正しく出現する。また、ルイスｘ糖鎖は互いに親和性を有することや、マウス初期胚の発生過程における細胞緊密化（ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）に関与することから、ルイス糖鎖が接着分子あるいは糖鎖シグナルとして作用し、初期胚、脳、および腎臓の発生に重要な役割を果たしていると考えられている。
従って、それらの発生の過程で出現するルイスｘ糖鎖の合成に関与するα１，３−フコース転移酵素の遺伝子をクローン化し、その役割を解析することにより、該遺伝子と遺伝性疾患等との関連を調べることが可能になる。
シアリルルイスｘ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、シアリルルイスａ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、ルイスｘ糖鎖およびルイスｙ糖鎖〔Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕は、癌関連糖鎖として知られている。
シアリルルイスａ糖鎖は、主に大腸癌や膵癌等の消化器系の癌において高頻度に検出される。一方、シアリルルイスｘ糖鎖、ルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖は、消化器系癌のほか、肺癌、卵巣癌、腎癌で検出される。
同じ糖鎖が出現する場合でも、該糖鎖の合成に関与する糖転移酵素は、細胞により異なることが明らかになっているため、例えばそれぞれの癌細胞においてルイスｘ糖鎖の生合成に関与しているα１，３−フコース転移酵素を同定し、特定の癌との相関を調べることにより、より正確な癌の診断が可能になると推定される。
ルイスｘ糖鎖は、該糖鎖を含有する糖タンパク質の血中におけるクリアランスや目的臓器へのターゲティングにも関与している。任意のタンパク質に人為的にルイスｘ糖鎖を付加することにより、任意のタンパク質の血中クリアランス速度を制御したり、肝臓へのターゲティングを可能にすることができると考えられる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２４０２４−２４０３１（１９９５）〕。
また、ルイスｘ糖鎖には、該糖鎖間での相互接着能があることが知られていることから〔Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，１１，２３８−２４８（１９９４）、Ｇｌｙｃｏｂｉｌｏｇｙ，８，１３９−１４６（１９９８）〕、任意のタンパク質にルイスｘ糖鎖を付加することにより、該タンパク質をルイスｘ糖鎖を高発現している癌組織へターゲティングできる可能性がある。
一方、タンパク質にシアリルルイスｘ糖鎖が付加した場合は、該タンパク質はセレクチンを発現した細胞（例えば炎症部位の血管内皮細胞）へターゲティングされると考えられる。
従って、任意のタンパク質を肝臓や癌組織へ効率よくターゲティングするためには、タンパク質へ効率よくルイスｘ糖鎖を付加させるとともに、シアリルルイスｘ糖鎖を付加させないことが望ましい。組換え糖タンパク質の生産に適した宿主細胞（例えばＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ＣＨＯ細胞等）において、任意の組換え糖タンパク質に、シアリルルイスｘ糖鎖を付加させることなく、ルイスｘ糖鎖を効率よく付加させる方法の開発は、産業上重要な課題である。
これまでに、α１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＶ）を特定のＣＨＯ細胞株に発現させると、シアリルルイスｘ糖鎖の発現なしに、ルイスｘ糖鎖が発現することが報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１７４６７−１７４７７（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１７７７−２１７８３（１９９１）〕。しかし、Ｆｕｃ−ＴＩＶは本来シアリルルイスｘ糖鎖を合成する活性を有しているために、他の細胞（例えば別のＣＨＯ細胞株やＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞）にＦｕｃ−ＴＩＶを発現させた場合には、ルイスｘ糖鎖に加えてシアリルルイスｘ糖鎖が発現する〔Ｃｅｌｌ．，６３，１３４９−１３５６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）〕。
導入する細胞により、Ｆｕｃ−ＴＩＶによるシアリルルイスｘ糖鎖の合成量が異なる原因としては、これら細胞中に存在する基質となる糖鎖の量や質が異なること、および発現させたＦｕｃ−ＴＩＶや他の糖転移酵素（例えばα２，３−シアル酸転移酵素）の発現量がこれら細胞で異なること等をあげることができる。
例えば、α２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩあるいはＳＴ３Ｇａｌ ＩＶ）とＦｕｃ−ＴＩＶは同じ基質（Ｎ−アセチルラクトサミン構造を有する糖鎖）に対して競合すると考えられる。
α２，３−シアル酸転移酵素の活性がＦｕｃ−ＴＩＶに比べて相対的に強ければ、優先的にα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン糖鎖ができ、Ｆｕｃ−ＴＩＶにより該糖鎖にフコースが付加されシアリルルイスｘ糖鎖が合成されるが、Ｆｕｃ−ＴＩＶの活性が相対的に強ければフコシルＮ−アセチルラクトサミン糖鎖（ルイスｘ糖鎖）が優先的に合成される。α２，３−シアル酸転移酵素はルイスｘ糖鎖にシアル酸を付加する活性が弱いため、α２，３−シアル酸転移酵素によるシアリルルイスｘ糖鎖の合成は行われにくい。
一方、ルイスｘ糖鎖を合成する活性は有するが、シアリルルイスｘ糖鎖を合成する活性を持たない新規なα１，３−フコース転移酵素が取得できれば、宿主細胞中でその酵素を発現させることにより、シアリルルイスｘ糖鎖を合成することなく、ルイスｘ糖鎖を効率よく合成することが可能と考えられる。物質生産に適した細胞を含む多くの細胞は、ルイスｘ糖鎖の前駆体であるＮ−アセチルラクトサミン構造を有している。従って、該新規酵素が取得できれば、多くの細胞を宿主として、シアリルルイスｘ糖鎖を合成することなく、ルイスｘ糖鎖を効率よく合成することが可能となる。しかしながら、これまでにこのような酵素は知られていない。
ルイスｘ糖鎖を認識する抗体である抗ＣＤ１５抗体は、先体反応後のヒト***と結合し、***と卵子の相互作用を阻害することから、ルイスｘ糖鎖は受精において重要な役割を果たしていると推定される〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３７，１７２−１８３（１９９７）〕。従って、ヒト***上のルイスｘ糖鎖の生合成に関与しているα１，３−フコース転移酵素を同定し、不妊症との関連を調べることは、不妊症の診断や治療に有用であり、ルイスｘ糖鎖またはルイスｘ糖鎖が付加したタンパク質を用いて、安全で確実な非妊法が確立できる可能性もある。
従って、この目的においても、任意のタンパク質にルイスｘ糖鎖を効率よく付加させる方法の開発は重要な課題である。
白血球の炎症部位への集積やリンパ球のリンパ節へのホーミングには、接着分子セレクチン（Ｅ−、Ｐ−、およびＬ−セレクチン）とその糖鎖リガンド（シアリルルイスｘ糖鎖またはその関連糖鎖）の接着が関与していることが明らかとなっている。
シアリルルイスｘ糖鎖およびその構造異性体であるシアリルルイスａ糖鎖は、癌化に伴って発現量が増加する癌関連抗原としても知られており、これらの糖鎖に対する抗体は癌の血清診断に利用されている。
これらの糖鎖がセレクチンと結合することから、これらの糖鎖は癌の転移にも関与すると考えられている。最近、マウスの腎臓に存在するルイスｘ糖鎖を含有する糖脂質が、Ｅ−セレクチンと強く結合することが明らかにされた〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２１８，６１０−６１５（１９９６）〕。
セレクチンに強い結合能を有する糖鎖は、セレクチンアンタゴニストとして、炎症や癌転移の治療および予防に有用である。従って、マウス腎臓で発現しているα１，３−フコース転移酵素は、セレクチンアンタゴニストの効率的合成に利用可能と推定され、該酵素の同定と生産は重要と考えられるが、これまでに、該酵素は同定されていない。
これまでに５種類のα１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶ、Ｆｕｃ−ＴＶＩ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ）の遺伝子がクローン化され、それぞれの酵素の受容基質特異性が解析されている〔Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら：Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．４，１２８８−１３０３（１９９０）、Ｇｏｅｌｚら：Ｃｅｌｌ ６３，１３４９−１３５６（１９９０）、Ｌｏｗｅら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１７４６７−１７４７７（１９９１）、Ｋｕｍａｒら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１７７７−２１７８３（１９９１）、Ｗｅｓｔｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，４１５２−４１６０（１９９２）、Ｗｅｓｔｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ７，２４５７５−２４５８４（１９９２）、Ｋｏｓｚｄｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８７，１５２−１５７（１９９２）、Ｓａｓａｋｉら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｎａｔｓｕｋａら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１６７８９−１６７９４（１９９４）〕。
Ｆｕｃ−ＴＩＩＩは、α１，３−フコース転移酵素活性とα１，４−フコース転移酵素を有し、シアリルルイスｘ糖鎖、ルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、およびルイスｂ糖鎖〔Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を合成可能である（ルイスａ糖鎖およびルイスｂ糖鎖を合成する活性が強い）。
Ｆｕｃ−ＴＩＶは、シアリルルイスｘ糖鎖、ルイスｘ糖鎖、およびルイスｙ糖鎖を合成可能である（ルイスｘ糖鎖およびルイスｙ糖鎖を合成する活性が強い）。
Ｆｕｃ−ＴＶは、シアリルルイスｘ糖鎖、ルイスｘ糖鎖、およびルイスｙ糖鎖を合成可能である。
Ｆｕｃ−ＴＶＩは、シアリルルイスｘ糖鎖、ルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖を合成可能である。
Ｆｕｃ−ＴＶＩＩは、シアリルルイスｘ糖鎖のみ合成可能である。
上述のように、クローン化された５種のα１，３−フコース転移酵素は、一部重複した受容基質特異性を示すが、厳密にはそれぞれ異なる受容基質特異性を示す。また、それぞれの酵素は、細胞特異的あるいは時期特異的に発現し、１つの細胞に複数の酵素が同時に発現する場合のあることが明らかとなっている。これらの酵素は、類似の構造を有するフコース含有糖鎖を合成可能であるが、発現する細胞や発現する時期が異なることから、それぞれ別々の機能を担っていると考えられる。
細胞や組織の抽出液を酵素源とした酵素学的解析により、該組織や該細胞で発現しているα１，３−フコース転移酵素を特定することはある程度可能である〔Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２８，２６５−２７６（１９９２）、Ｗｅｓｔｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２４５７５−２４５８４（１９９２）〕。しかし、該酵素学的解析では、複数のα１，３−フコース転移酵素を発現している細胞や組織において発現しているα１，３−フコース転移酵素各々を特定すること、ならびにそれらのα１，３−７コース転移酵素各々についての酵素学的特性を明らかにすることはできない。
特定のα１，３−フコース転移酵素の発現を検出するためには、特異的抗体を用いた免疫的検出法か、遺伝子の塩基配列に基づいた検出法（例えばノーザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法）を用いる必要がある。
発明の開示
本発明は、新規なα１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドを利用し、抗炎症、抗感染症、または癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品、タンパク質の改善法、および脳疾患、腎疾患、または癌等の疾患の診断法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の（１）〜（５０）に関する。
（１）糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと略す）残基にα１，３結合でフコース（以下、Ｆｕｃと略すこともある）を転移する活性を有し、かつ糖鎖の非還元末端に存在するα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌ β１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性を有しないポリペプチド。
（２）以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチド。
（ａ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５６番目から３５９番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性を有し、かつ糖鎖の非還元末端に存在するα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性を有しないポリペプチド。
上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。
かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
（３）糖鎖の非還元末端に存在するＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性がルイスｘ糖鎖〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕およびルイスｙ糖鎖〔Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を合成する活性であり、糖鎖の非還元末端に存在するＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性がシアリルルイスｘ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を合成する活性である、上記（１）または（２）のポリペプチド。
（４）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）から選ばれるＤＮＡ。
（ａ）上記（１）、（２）および（３）記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列の２８０から１１９４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列の１１５から１１９４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列の１４５４から２３６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列の１２８９から２３６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｆ）配列番号５で表される塩基配列の４６０から１３７４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｇ）配列番号５で表される塩基配列の２９５から１３７４番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のＤＮＡから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有し、かつ糖鎖の非還元末端に存在するα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有しないポリペプチドをコードするＤＮＡ。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のＤＮＡから選ばれるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８と略記する）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（５）上記（４）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（６）組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９またはプラスミドｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）である、上記（５）の組換え体ＤＮＡ。
（７）上記（５）または（６）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（８）形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物から選ばれる形質転換体である、上記（７）の形質転換体。
（９）微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、上記（８）の形質転換体。
（１０）動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞から選ばれる動物細胞である、上記（８）の形質転換体。
（１１）昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞から選ばれる昆虫細胞である、上記（８）の形質転換体。
（１２）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１３）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１４）生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（１３）の製造法。
（１５）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１６）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により該タンパク質を合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１７）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、ｉｖ）それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が硫酸基で修飾された誘導体、およびｖ）それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が糖で修飾された誘導体であり、かつ該Ｎ−アセチルラクトサミン構造中のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体から選ばれる受容基質、および
（ｃ）グアノシン５’−二リン酸フコース（以下、ＧＤＰ−Ｆｕｃと略す）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルラクトサミン構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
（１８）誘導体が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３ −）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、および該糖鎖を含有する複合糖質から選ばれる誘導体である、上記（１７）記載の製造法。
（１９）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ｉ）ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｉｉ）ラクトース構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、ｉｖ）それらのラクトース構造が硫酸基で修飾された誘導体、およびｖ）それらのラクトース構造が糖で修飾された誘導体であり、かつ該ラクトース構造中のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体から選ばれる受容基質、および
（ｃ）ＧＤＰ−Ｆｕｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトースのグルコース残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
（２０）誘導体が、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（６ＳＯ３ −）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、および該糖鎖を含有する複合糖質から選ばれる誘導体である、上記（１９）記載の製造法。
（２１）上記（８）の微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞から選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にＦｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該複合糖質を採取することを特徴とする、該複合糖質の製造法。
（２２）上記（８）の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該複合糖質を採取することを特徴とする、該複合糖質の製造法。
（２３）上記（８）のトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該複合糖質を採取することを特徴とする、該複合糖質の製造法。
（２４）複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、上記（１７）〜（２３）のいずれか一つに記載の製造法。
（２５）生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（２２）の製造法。
（２６）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（２７）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドの誘導体オリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド。
（２８）誘導体オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドから選ばれる誘導体オリゴヌクレオチドである、上記（２７）のオリゴヌクレオチド。
（２９）上記（２７）または（２８）のオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（３０）上記（２６）または（２９）の方法を用いた、脳疾患、腎疾患または癌の検出法。
（３１）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡを用い、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を抑制する方法。
（３２）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡを用い、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（３３）上記（２７）または（２８）のオリゴヌクレオチドを用い、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を抑制する方法。
（３４）上記（２７）または（２８）のオリゴヌクレオチドを用い、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（３５）上記（３１）〜（３４）のいずれか一つに記載の方法を用いた、腎疾患または癌の治療法。
（３６）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを認識する抗体。
（３７）上記（３６）の抗体を用いる、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドの免疫学的検出法。
（３８）上記（３６）の抗体を用い、上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
（３９）上記（３６）の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
（４０）上記（３６）の抗体を含有する、脳疾患、腎疾患または癌の診断薬。
（４１）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法。
（４２）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、抗ルイスｘ抗体または抗ルイスｙ抗体を用い、ルイスｘ糖鎖含量またはルイスｙ糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（４３）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、上記（３６）の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（４４）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
（４５）プロモーターＤＮＡが、神経細胞、腎細胞、胃上皮細胞、白血球細胞、脳腫瘍細胞、神経芽細胞腫細胞、メラノーマ細胞、腎癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、および膵癌細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、上記（４４）のプロモーターＤＮＡ。
（４６）プロモーターＤＮＡが、ヒトまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、上記（４４）または（４５）のプロモーターＤＮＡ。
（４７）上記（４４）、（４５）および（４６）のプロモーターＤＮＡから選ばれるプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
（４８）レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、上記（４７）のスクリーニング法。
（４９）上記（１）、（２）および（３）のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
（５０）ノックアウト非ヒト動物がマウスである、上記（４９）のノックアウト非ヒト動物。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、新規α１，３−フコース転移酵素遺伝子と略すこともある）の取得並びに該ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの製造
ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖を発現している細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法等があげられる。
ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖を発現している細胞としては、ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖を発現している細胞であればいかなる細胞でも用いることができ、例えば、マウスやヒトの脳、腎臓、胃、膀胱、精巣等の組織、マウスＦ９細胞、ヒト神経芽細胞腫細胞株等を用いることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７．，９４９４（１９８９）〕、λｚａｐ ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ クローニング、ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭＯ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕等をあげることができる。
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭ Ｓｔｒａｉｎ〔ストラタジーン社より市販〕およびＥ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーとして、例えば以下のようにして作製したｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
マウス脳由来のｍＲＮＡよりＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）キットを用いてｃＤＮＡを合成する。
該ＤＮＡの両末端にＳｆｉＩリンカーを付与した後、クローニングベクターｐＡＭｏのＳｆｉＩ部位に挿入したプラスミドを作製する。
該プラスミドを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作成する。
作成したｃＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクローンを以下の方法で選択する。
上記で作成したｃＤＮＡライブラリーから、常法あるいはキィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のプラスミド調製キットである／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ（商品番号 ４１０３１）等のキットを用いてプラスミドを調製する。
ｐＡＭｏは、動物細胞用の発現ベクターであり、該プラスミドを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーは、そのまま以後の操作に利用することができる。
もし発現ベクター以外のベクターでｃＤＮＡライブラリーを作製した時には、該ｃＤＮＡライブラリーより挿入ｃＤＮＡを切り出し、動物細胞あるいは昆虫細胞で発現可能な発現ベクターに組み込み直す必要がある。
該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＶＬ１３９２（インビトロジェン社製）、ｐＶＬ１３９３（インビトロジェン社製）、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、目的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞あるいは昆虫細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。
該発現ベクターの導入方法としては、動物細胞あるいは昆虫細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、およびＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等に記載の方法をあげることができる。
動物細胞としては、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞のサブラインであるＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができ、好ましくは、Ｎａｍａｌｗａ細胞またＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞をあげることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
得られた形質転換細胞を常法により培養する。
具体的には、以下の形質転換体の培養方法をあげることができる。
形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
該培養により得られた細胞を、抗ルイスｘ糖鎖抗体または抗ルイスｙ糖鎖抗体を用いて蛍光染色した後、フルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；以下、ＦＡＣＳと略記する）を利用して、上記抗体の結合量が増加した細胞を濃縮分離する。
ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖に対する抗体としては、ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖と反応する抗体であれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、抗ルイスｘ糖鎖抗体である７３−３０〔生化学工業社製〕やＰＭ−８１、あるいは抗ルイスｙ糖鎖抗体であるＡＨ−６〔大塚社製〕をあげることができる。また、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖上のルイスｘ糖鎖を認識するＳＳＥＡ−１抗体を使用することもできる。
このようにして濃縮分離された細胞から公知の方法、例えば、ハート法〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，２８３７（１９８８）〕により、本発明のＤＮＡを含むプラスミドを回収し、該ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を取得することができる。
本発明のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９をあげることができる。
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
該方法により取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表されるペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができ、具体的には、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、他の組織あるいは、他の動物由来、例えばヒト由来の目的とするＤＮＡを取得することができる。
該ＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表されるペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができ、具体的には、配列番号４あるいは５で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号５のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）をあげることができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅ１３９２等をあげることができる。
また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと略記する）〔モレキュラー・クローニング第２版およびＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕等を行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法あるいはＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号３、４または５で表される塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該誘導体オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
（２）新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドの製造
上記の方法により得られた本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、新規α１，３−フコース転移酵素遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、新規α１，３−フコース転移酵素遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規α１，３−フコース転移酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨ８１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｍｂｅ、ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓ ｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、ポリペプチド全長を発現させる以外に、α１，３−フコース転移酵素活性を有する領域を含む部分ポリペプチドとして発現させることもできる。糖転移酵素は、一般にタイプ２型の膜タンパク質のトポロジーを有し、Ｎ末端の数から数十アミノ酸からなる細胞質領域、疎水性の高いアミノ酸配列を有する膜結合領域、数から数十アミノ酸からなる幹領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなっている。幹領域と触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分は、ゴルジ体内腔に露出していると考えられる。幹領域と触媒領域の境界は、Ｎ末端を欠失させたポリペプチドを作製し、どこまで欠失させると活性がなくなるかを検討することにより、実験的に求めることができる。一方、幹領域と触媒領域に関する知見のある類似の糖転移酵素とアミノ酸配列を比較することにより、幹領域と触媒領域を予想することもできる。
本発明の新規α１，３−フコース転移酵素の構造も、他の糖転移酵素と同様の構造を有していた。すなわち、新規α１，３−フコース転移酵素は、Ｎ末端の１０アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２０アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも２５アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。他のα１，３−フコース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のα１，３−フコース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，８７１２−８７２２（１９９５）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，９２１−９２７（１９９７）〕を基に、幹領域は少なくとも２５アミノ酸からなると予想された。したがって、５６番目から３５９番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
上記のポリペプチド全長またはα１，３−フコース転移酵素活性を有する領域（触媒領域）を含む部分ポリペプチドは、直接発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌タンパク質または融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、触媒部位を含むと考えられる５６番目から３５９番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと触媒領域を含むポリペプチドの間、または触媒領域を含むポリペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。
例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ポリペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
また、通常の糖転移酵素の精製方法〔Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，４５８〕に準じて精製できる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて本発明のα１，３−フコース転移酵素を生産することができる。
更に、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、パーキン・エルマー社、ファルマシアバイオテク社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ）社、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
本発明の新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチドのα１，３−フコース転移酵素活性は、公知の測定法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７９，３９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、特開平０６−８２３０２１〕に準じて測定することができる。
（３）Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造
上記（２）で取得した微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体から選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にＦｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することにより、該糖鎖または複合糖質を製造することができる。
Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基に付加した構造を有する糖鎖として、ルイスｘ構造を含有する糖鎖、ルイスｙ構造を含有する糖鎖等をあげることができる。
培養は上記（２）に準じて行うことができる。
上記形質転換体において、本発明のポリペプチドと任意の組換え糖タンパク質（例えば医薬用組換え糖タンパク質）を、糖鎖合成可能な形質転換体中で同時に生産させることにより、該組換え糖タンパク質にＦｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を付加することができる。
また、上記（２）で取得した動物個体または植物個体を用い、上記（２）の方法に準じて、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該生成物を採取することにより、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該生産物を採取することにより、Ｆｕｃがα１，３結合でＧｌｃＮＡｃ残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中でＮ−アセチルラクトサミン構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
即ち、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を非還元末端に有するオリゴ糖、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が硫酸基で修飾された誘導体、それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が糖で修飾された誘導体でありかつ該Ｎ−アセチルラクトサミン構造のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体等を受容基質として、上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびＧＤＰ−Ｆｕｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルラクトサミン構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
酵素源は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を基質として、３７℃で１分間に１μモルのラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ〔Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩＩ，Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ〕を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。また、上記（２）記載の培養により得られた形質転換体の培養液、上記（２）記載の非ヒトトランスジェニック動物より得られたミルクを水性媒体として用いることもできる。
水性媒体に、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンシルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｆｕｃ含有糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＵＤＰ−Ｆｕｃとしては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。
該ＵＤＰ−Ｆｕｃは０．１〜５００ｍＭの濃度で用いることができる。
上記において、Ｎ−アセチルラクトサミン構造が硫酸基で修飾された誘導体あるいはＮ−アセチルラクトサミン構造が糖で修飾された誘導体であり、かつ該Ｎ−アセチルラクトサミン構造のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体として、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３ −）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、該糖鎖を含有する複合糖質等をあげることができる。
受容基質は０．０１〜５００ｍＭの濃度で用いることができる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール等を添加することができる。
生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
また、上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中でラクトース構造中のグルコース残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
即ち、ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ラクトース構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、それらのラクトース構造が硫酸基で修飾された誘導体、それらのラクトース構造が糖で修飾された誘導体でありかつ該ラクトース構造のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体等を受容基質として、上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびＧＤＰ−Ｆｕｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトース構造中のグルコース残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
上記においてラクトース構造が硫酸基で修飾された誘導体あるいはラクトース構造が糖で修飾された誘導体でありかつ該ラクトース構造のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体として、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（６ＳＯ３ −）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造な糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、該糖鎖を含有する複合糖質等をあげることができる。
生成反応は、受容基質の種類を変える以外、上記受容基質のＮ−アセチルラクトサミン構造中のＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃが付与された反応産物を生成させる反応条件と同じ条件で行うことができる。
上記方法により生産される糖鎖または複合糖質より、公知の酵素的手法または化学的手法により糖鎖の一部を切り出すことができる〔日本生化学会編，続生化学実験講座，第４巻，複合糖質研究法Ｉ，ＩＩ，東京化学同人，（１９８６年）、谷口直之・鈴水明身・古川清・菅原和幸 監修，グリコバイオロジー実験プロトコール，秀潤社，（１９９６年）〕。
（４）本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを用いた疾患の治療や診断等への利用
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕を用いた脳疾患、腎疾患、または癌等の疾病の治療、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いたそれら疾病の診断に利用することが可能である。
例えば、上記（１）記載の本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。
即ち、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うことが可能である。
また、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
更に、本発明のＤＮＡをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。例えば、ヒトの神経細胞、腎臓細胞、胃上皮細胞、白血球細胞、脳腫瘍細胞、神経芽細胞腫細胞、メラノーマ細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、または膵臓癌細胞で、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するプロモーター領域をあげることができる。該プロモーターは後述のスクリーニング法に利用することができる。
（５）本発明のポリペプチドを認識する抗体の生産
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上述（２）の方法により取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞なＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）〕に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）本発明の抗体の利用
（ａ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することができる。具体的にはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法等を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現する細胞の免疫組織染色に利用できる。
（ｃ）本発明の抗体を用いて、脳疾患、腎疾患または癌等の疾病の診断に利用することができる。
（７）スクリーニング法への応用。
本発明のポリペプチドは、新規α１，３−フコース転移酵素活性を有することから、該ポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物を用いて、細胞におけるルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖、またはそれらの修飾糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。
また、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該ポリペプチドの発現を制御し、細胞におけるルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖、またはそれらの修飾糖鎖の合成量を制御することが可能である。
上記化合物は、脳疾患、腎疾患、または癌等の疾病の治療や、ルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖、またはそれらの修飾糖鎖の合成に有用と考えられる。
該化合物は、以下（ａ）〜（ｅ）に示す方法により取得可能である。
（ａ）上記（２）で記載した方法を用いて調製した本発明の新規α１，３−フコース転移酵素活性を有するポリペプチド（精製物あるいは該ポリペプチドを発現する形質転換体の細胞抽出液または培養上清）を酵素として用い、被験試料の存在下、公知の方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７９，３９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、特開平０６−８２３０２１〕を用いてα１，３−フコース転移酵素活性を測定し、α１，３−フコース転移酵素活性を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する細胞または上記（２）で記載した形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞表面のルイスｘ糖鎖、ルイスｙ糖鎖、またはそれらの修飾糖鎖の量をそれぞれの糖鎖に対する抗体を用いて測定し、該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
上記抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、上記（５）で記載した本発明の抗体を用いて測定し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｄ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の量を、上記（４）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等の方法を用いて測定し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｅ）上記（４）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記（２）記載の動物細胞に、上記（２）記載の方法に準じて導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
（８）ノックアウト動物の作製
本発明のＤＮＡを含むベクターを用い、目的とする動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）〕。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体（ノックアウト動物）を得ることができる。
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。
このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）〕が知られている。
従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。
このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。
従って、本発明のノックアウト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願平１０−２１３８２３）の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された公知の方法を用いた。
〔実施例１〕新規マウスα１，３−フコース転移酵素遺伝子（ｃＤＮＡ）のクローン化
（１）マウス脳からのｍＲＮＡの取得
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脳より、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞を用いて、約３０μｇのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
（２）マウス脳ｃＤＮＡのライブラリーの作製
上記（１）で取得したマウス脳由来のｍＲＮＡ ８μｇ、およびＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用い、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
これら二本鎖ｃＤＮＡの両末端に以下の方法でＳｆｉＩリンカーを付与した。〔ＳｆｉＩリンカーの付与〕
配列番号６で示された一本鎖ＤＮＡおよび配列番号７で示された一本鎖ＤＮＡをアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成一本鎖ＤＮＡをそれぞれ５０μｇずつ、別々に５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３０単位を加えて、３７℃で１６時間リン酸化反応を行ない、１１塩基および８塩基のリンカーを取得した。
１１塩基のリンカー４μｇ、８塩基のリンカー２．９μｇおよび上記で合成した２本鎖ｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液４５μｌに溶解後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０５０単位を加え、１６℃で１６時間反応させ、該二本鎖ＤＮＡ各々にＳｆｉＩリンカーを付与した。
得られた反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
直接発現クローニングベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕２４μｇを、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）５９０μｌに溶解後、８０単位のＳｆｉＩ（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行なった。
該反応液に４０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で調製したＳｆｉＩリンカーを付与したＤＮＡ（ｍＲＮＡ ８μｇ由来分）をＴ４リガーゼ緩衝液２５０μｌに溶解後、該溶解液に、該約８．８ｋｂのＤＮＡ断片２μｇおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
反応後、該反応液にトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）２０μｌに溶解した。
該反応液を用い、エレクトロポーレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕により大腸菌ＬＥ３９２株〔モレキュラー・クローニング第２版〕を形質転換し、約１００万個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
（３）形質転換細胞に抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）との反応性を増加させる遺伝子（ｃＤＮＡ）のクローン化
上記（２）で構築したｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）から、キィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のプラスミド調製キットである／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ（商品番号４１０３１）を用いてプラスミドを調製した。
該プラスミドをエタノール沈殿後、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
該プラスミド（４０μｇ）を、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕により、Ｎａｍａｌｗａ細胞に導入した。
１．６×１０６細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地［７．５％ＮａＨＣＯ３を１／４０量、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を０．５％添加したＲＰＭ１１６４０培地（日水製薬社製）］に懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。
培養後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更に１０日間培養し安定形質転換株を取得した。
該形質転換株を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０で培養後、得られた約４×１０７個の細胞を、ルイスｘ糖鎖に対する抗体であるＰＭ−８１を用いた間接蛍光抗体染色に供した。
具体的方法を以下に示す。
約４×１０７の安定形質転換細胞を５０ｍｌの遠心チューブ（２０５９チューブ：ファルコン社製）に取り、遠心分離（１３０×ｇ、１０分間）により細胞を集めた。
該細胞を、０．１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ−ＰＢＳ：８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ １．１５ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％アジ化ナトリウム）２０ｍｌを用いて洗浄した。
該洗浄細胞に、Ａ−ＰＢＳで約１０μｇ／ｍｌに希釈した抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）を０．５ｍｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
反応後、該細胞をＡ−ＰＢＳ ２０ｍｌで１回洗浄した後、該細胞に、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識した抗マウスＩｇＭ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）をＡ−ＰＢＳで１６倍希釈した溶液を３００μｌ加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。
反応後、該細胞をＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、Ａ−ＰＢＳ １ｍｌに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター〔エピックス・エリート・フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）；コールター（ＣＯＵＬＴＥＲ）社製〕を用いて、蛍光強度の高い細胞（上位２．０％）を無菌的に分離回収した。
回収した細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い培養し、増殖させた後、上記と同様の操作により蛍光強度の高い細胞を無菌的に分離回収した。
該操作を再度繰り返し、蛍光強度の高い細胞を分離濃縮した。
２回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位１．５％）を、３回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位１．５％）を、４回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位１．０％）を分離回収した。
該分離操作により、蛍光強度の増加した細胞、すなわちルイスｘ糖鎖の発現量の増加した細胞を取得した。
該細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養後、約２×１０６個の細胞からハート法〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，２８３７（１９８８）〕によりプラスミドを回収した。
該プラスミドを、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕により大腸菌ＬＥ３９７株に導入し、アンピシリン耐性を有する形質転換体を取得した。
該形質転換体４０個よりプラスミドを調製し、それぞれのプラスミドを、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して挿入されたｃＤＮＡの構造を調べた。
該プラスミドをフェノールークロロホルム抽出した後、エタノール沈澱を行い、該プラスミドを回収した。
該プラスミドをＴＥ緩衝液１０μｌに溶解し、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりそれぞれのプラスミドをＮａｍａｌｗａ細胞に導入した。
即ち、１．０〜１．６×１０６個の細胞（２００μｌ）に対し、上記で調製したプラスミド３μｌまたはｐＡＭｏ（コントロールプラスミド）４μｇをそれぞれエレクトロポレーション法で導入した後、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、さらに１０〜１４日培養し、形質転換細胞を取得した。
得られた形質転換細胞について、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）を用いた間接蛍光抗体染色を行なったところ、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９と命名したプラスミドを導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）への反応性（ヒストグラムのピーク値）が約２０倍に増加していた。
以上の結果より、プラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９中に挿入されているｃＤＮＡにより、形質転換細胞の抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）への反応性が増加することが明らかとなった。
抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）を用いた間接蛍光抗体染色は以下のようにして行なった。
約１×１０６個の形質転換細胞をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：エッペンドルフ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
該細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで洗浄した後、該洗浄細胞にＡ−ＰＢＳで約１０μｇ／ｍｌに希釈した抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
反応後、細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗マウスＩｇＭ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）をＡ−ＰＢＳで１６倍希釈した溶液を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。
反応後、細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、０．６ｍｌのＡ−ＰＢＳに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーターを用いて解析を行なった。また対照実験として、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１）の代わりにＡ−ＰＢＳを用いて同様の解析を行なった。
（４）プラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（３）で得られたプラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９が含むｃＤＮＡの制限酵素地図を作成後、該ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）にサブクローニングし、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列は、パーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて決定した。塩基配列の決定は、パーキンエルマー社のキットを使用し、キットの指示に従って行った。
その結果をつなぎ合わせることにより、プラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９が含むｃＤＮＡの全塩基配列（２１７０ｂｐ）を決定した。
該ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示した。
該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３５９アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。該ポリペプチドはこれまでにクローン化された５種のヒトα１，３−フコース転移酵素とアミノ酸レベルで３５％〜３８％の相同性を示したことから、新規なα１，３−フコース転移酵素であると考えられた。該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に示した。
該ポリペプチドは、Ｎ末端の１０アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２０アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも２５アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。他のα１，３−フコース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のα１，３−フコース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，８７１２−８７２２（１９９５）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，９２１−９２７（１９９７）〕を基に、幹領域は少なくとも２５アミノ酸からなると予想された。したがって、５６番目から３５９番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
以下、該ｃＤＮＡをマウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドをマウスＦｕｃ−ＴＩＸと呼ぶ。
〔実施例２〕実施例１で取得したマウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミドを導入したヒト培養細胞における、ルイスｘ糖鎖およびルイスｙ糖鎖の合成
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）およびマウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９）をそれぞれ、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法によりＮａｍａｌｗａ細胞に導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞について、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１、７３−３０）、抗ルイスｙ糖鎖抗体（ＡＨ−６）、抗シアリルルイスｘ糖鎖抗体（ＫＭ９３）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった。
間接蛍光抗体染色は、実施例１の（３）に記載した方法に従って行った。その結果、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９を導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１、７３−３０）への反応性（ヒストグラムのピーク値）がそれぞれ約２０倍、抗ルイスｙ糖鎖抗体（ＡＨ−６）への反応性が約７倍増加していた。
一方、抗シアリルルイスｘ糖鎖抗体（ＫＭ９３）との反応性はほとんど変化していなかった（第１図参照）。
また比較のために、他のα１，３−フコース転移酵素（マウスＦｕｃ−ＴＩＶ、ヒトＦｕｃ−ＴＶＩ）を発現させたＮａｍａｌｗａ細胞についても同様の解析を行った。即ち、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ４）およびヒトＦｕｃ−ＴＶＩ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｈＦＴ６）を導入したＮａｍａｌｗａ細胞を取得し、該細胞について上記抗体との反応性を調べた（第１図参照）。
同様にして、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９）、ヒトＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ＦＴ４）およびヒトＦｕｃ−ＴＶＩＩ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ＦＴ７）を導入したＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞を取得し、該細胞について抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＫＭ３８０）および抗シアリルルイスｘ糖鎖抗体（ＣＳＬＥＸ−１，ＫＭ９３）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった（第２図参照）。
また、コントロールプラスミド（ｐＣＤＭ８）、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｍＦＴ９）、およびヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−Ｌｅ）を導入したＣＯＳ−１細胞を取得し、該細胞について抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ、生化学工業社製）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった（第３図参照）。
各発現プラスミドの作製法およびＣＯＳ−１細胞への導入法は、実施例３に記す。
以上の結果から、Ｆｕｃ−ＴＩＸは形質転換細胞中でルイスｘ糖鎖およびルイスｙ糖鎖を合成可能であるが、シアリルルイスｘ糖鎖およびルイスａ糖鎖は合成しないことが示された。この酵素特性は、これまでにクローン化されているα１，３−フコース転移酵素のいずれとも異なり、Ｆｕｃ−ＴＩＸは新規な基質特異性を有する新規なα１，３−フコース転移酵素であることが判明した。
Ｆｕｃ−ＴＩＸの基質特異性は、これまでにクローン化されたα１，３−フコース転移酵素の中ではＦｕｃ−ＴＩＶに類似しているが、Ｆｕｃ−ＴＩＶがシアリルルイスｘ糖鎖も合成するのに対して、Ｆｕｃ−ＴＩＸは合成しないという点で明らかに異なっている。
またこの結果は、Ｆｕｃ−ＴＩＸを細胞で発現させることにより、ルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖を含有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質を新たに合成できることを意味している。
以上のことより、Ｆｕｃ−ＴＩＸを発現させた細胞を宿主として、有用な糖タンパク質を分泌生産することにより、分泌生産される糖タンパク質にルイスｘ糖鎖またはルイスｙ糖鎖を付与することが可能と考えられる。
〔実施例３〕マウスＦｕｃ−ＴＩＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ基質特異性
実施例１で取得したマウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡがコードするＦｕｃ−ＴＩＸのｉｎ ｖｉｔｒｏでの基質特異性を以下のようにして調べた。
動物細胞でマウスＦｕｃ−ＴＩＸを発現させるため、マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターｐＣＤＭ８に以下のようにしてサブクローン化した。
即ち、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９から、マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）部分を含む１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｅＩ断片を単離し、切断末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑在後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。
クローニングサイトに隣接したＨｉｎｄＩＩＩサイト側にｃＤＮＡの５’側が、ＰｓｔＩサイト側にｃＤＮＡの３’側が存在する方向でサブクローニングされているプラスミドを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩとｐｓｔＩで切断して、マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡを含む１．２ｋｂの断片を単離した。
該１．２ｋｂの断片を、ｐＣＤＭ８のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ間にサブククローン化し、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミドｐＣＤＭ８−ｍＦＴ９を作製した。
また、他のα１，３フコース転移酵素と基質特異性を比較するため、ヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩ ｃＤＮＡ、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ ｃＤＮＡ、およびヒトＦｕｃ−ＴＶＩ ｃＤＮＡを、それぞれｐＣＤＭ８にサブクローン化した発現プラスミドｐＣＤＭ８−Ｌｅ（ヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩ）、ｐＣＤＭ８−ｍＦＴ４、ｐＣＤＭ８−ｈＦＴ６を作製した〔Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，１２，８０２−８１２（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２９２７１−２９２７８（１９９４）〕。
ｐＣＤＭ８−ｍＦＴ４は以下のようにして作製した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスの胃から実施例１と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。
該ｃＤＮＡに対して配列番号８、９に示したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりマウスＦｕｃ−ＴＩＶ ｃＤＮＡのＯＲＦ部分を増幅した。
増幅に用いたプライマーは末端にＥｃｏＲＩ認識配列を持っているため、増幅断片をＥｃｏＲＩで切断後、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローン化し、ｐＢＳ−ｍＦＴ４を作製した。
別にベクターｐＣＤＭ８をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化後、ＥｃｏＲＩリンカーを挿入し、ＨｉｎｄＩＩＩサイトをＥｃｏＲＩサイトに変換したベクターを作製した。
該ベクターのＥｃｏＲＩサイトに、ｐＢＳ−ｍＦＴ４のマウスＦｕｃ−ＴＩＶｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ断片をサブクローン化し、ｐＣＤＭ８−ｍＦＴ４を作製した。
各α１，３−フコース転移酵素発現用プラスミド（１５μｇ）を、ＣＯＳ−１細胞１×１０７個にそれぞれ導入した。
導入方法はジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法で行い、具体的方法はＢｉｏ−Ｒａｄ社添付のマニュアルに従った。この際、遺伝子導入効率の指標となるように、ルシフェラーゼ発現ベクター（ベクターｐＳＶＯＡ／Ｌ〔実験医学，７，９６（１９８９）〕のＨｉｎｄＩＩＩサイトにβ−アクチンプロモーターを挿入したもの）１μｇを一緒に遺伝子導入した。
遺伝子導入後、各々のＣＯＳ−１細胞を径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュ３枚に分注して４８時間培養した。
上記３枚の内の１枚のディッシュを用い、該ディッシュ中の細胞から、後述する実施例４と同様にして全ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、各α１，３−フコース転移酵素遺伝子の転写量を測定した。
残り２枚のディッシュを用い、該ディッシュ中の細胞を回収し、溶液〔２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００〕に懸濁後、短時間超音波にかけて細胞溶解液を調製した。該細胞溶解液の蛋白質濃度はマイクロＢＣＡ蛋白質アッセイ試薬キット（ＰＩＥＲＣＥ社）により測定した。
該細胞溶解液を用いて、ルシフェラーゼおよびα１，３−フコース転移酵素の酵素活性を測定した。
ルシフェラーゼ活性は文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２９２７１−２９２７８（１９９４）〕記載の方法で測定し、遺伝子導入効率の検定をした。
その結果、いずれの遺伝子を導入したＣＯＳ−１細胞においても、ルシフェラーゼ活性は誤差±２０％以内でほぼ一定であり、遺伝子の導入効率にはフコース転移酵素遺伝子間で大きな差はみられなかった。
また、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した各フコース転移酵素遺伝子の発現量と導入効率はほぼ同じであった。
サンプル間の遺伝子導入効率を完全に合わせるため、容積あたりのルシフェラーゼ活性が一定になるように各細胞溶解液を希釈した。
ピリジルアミフ化した糖鎖基質の調製や活性測定は、既知の方法〔特開平０６−８２３０２１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）〕に準じて行った。
具体的には、活性測定は、１０μｌのアッセイ溶液〔５０ｍＭ カコジル酸−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、ＳｍＭ ＡＴＰ（ＳＩＧＭＡ社）、７５μＭ ＧＤＰ−Ｆｕｃ（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍＭ Ｌ−Ｆｕｃ（ＳＩＧＭＡ社）、２５μＭ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記細胞溶解液〕中で３７℃、２時間反応後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生産物を同定することにより行った。
基質として、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮｎＴと略記する）、ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮＴと略記する）（いずれもオックスフォード・グライコシステムズ社製）をアミノピリジンで蛍光標識したもの、およびアミノピリジンで蛍光標識されたＬＮｎＴを基質として分泌型のα２，３−シアル酸転移酵素（ＳＴ３Ｇａｌ ＩＶ）を反応させることにより、アミノピリジンで蛍光標識されたシアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、α２，３−シアリルＬＮｎＴと略記する）を用いた。
スタンダードとして、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ〔Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩ，Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮＦＰ−ＩＩと略記する〕、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ〔Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩＩ，Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮＦＰ−ＩＩＩと略記する〕、（いずれもオックスフォード・グライコシステムズ社製）をアミノピリジンで蛍光標識したもの、およびアミノピリジンで蛍光標識されたα２，３−シアリルＬＮｎＴを基質としてＦｕｃ−ＴＶＩの分泌型酵素を反応させることにより調製したシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ〔Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩＩ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；α２，３−シアリルＬＮＦＰ−ＩＩＩ］を用いた。
基質の蛍光標識は、常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕に従って行った。
それぞれの基質について、ＧＤＰ−Ｆｕｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＬＣで解析し、ＧＤＰ−Ｆｕｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアッセイ溶液は、１００℃で３分間処理後、１０，０００×ｇで５分間遠心して上清を取得し、その一部をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）を使用し、溶出液として０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度３５℃、流速１ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。
生成物の同定は、スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。
生成物の定量は、アミノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
反応生成物の量を、上記で測定した各α１，３−フコース転移酵素遺伝子の転写量に基いて校正し、活性とした。
ヒトＦｕｃ−ＴＶＩのα２，３−シアリルＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００として、各α１，３−フコース転移酵素の各基質に対する相対活性を求めた。
結果を表１に示す。なお、コントロールプラスミド（ｐＣＤＭ８）を導入したＣＯＳ−１細胞では、いずれの基質を用いた場合にも活性は検出されなかった。
Figure 0004482233
マウスＦｕｃ−ＴＩＸはＬＮｎＴに対してのみ強い活性を示した。
ヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩは、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、およびα２，３−シアリルＬＮｎＴの全てに活性を示した（ＬＮＴに最も強い活性）。
マウスＦｕｃ−ＴＩＶはＬＮｎＴに強い活性、α２，３−シアリルＬＮｎＴに弱い活性を示した。
ヒトＦｕｃ−ＴＶＩは、α２，３−シアリルＬＮｎＴおよびＬＮｎＴに活性を示した（α２，３−シアリルＬＮｎＴに最も強い活性）。
Ｆｕｃ−ＴＩＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ基質特異性は、これまでに精製またはクローン化されたいずれのα１，３−フコース転移酵素の基質特異性とも異なることから、Ｆｕｃ−ＴＩＸは新規な基質特異性をもつα１，３−フコース転移酵素であることが証明された。
Ｆｕｃ−ＴＩＸのｉｎ ｖｉｔｒｏの基質特異性は、実施例２で示された細胞中でのＦｕｃ−ＴＩＸの基質特異性とよく一致していた。また、Ｆｕｃ−ＴＩＸは他のα１，３−フコース転移酵素に比較して、ＬＮｎＴのＧｌｃＮＡｃ残基にα１，３結合でＦｕｃを転移する活性が強いことも明らかとなり、ルイスｘ糖鎖の合成に有用であることが示された。
〔実施例４〕Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の各種臓器での発現
（１）ノーザンブロットによる解析
マウス各組織（脳、胸腺、胃、肝臓、脾臓、腎臓、大腸、子宮、卵巣、肺、精巣、小腸、副睾丸）より実施例１と同様にしてＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを単離し、５μｇを、変性溶液〔５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、２．２Ｍホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホノ）プロパンスルホン酸〕（ＰＨ７．０）、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕中で６５℃で５分間加熱して変性させ、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動じた。
電気泳動後、ゲル中のＲＮＡをニトロセルロースフィルター（Ｏｐｔｉｍａｌ ＢＡ−Ｓ８５；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）上にブロッティングし、減圧下８０℃で１時間加熱し固定化した。
該フィルターをハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ***ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）〕中に浸漬しプレハイブリダイゼーションを行った。
プレハイブリダイゼーション後、該溶液にプローブを添加し、さらに６５℃でハイブリダイゼーションを行った。
プローブとしては、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９中のマウスＦｕｃ−ＴＩＸのＯＲＦを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｅＩ断片を、マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて３２Ｐで標識したものを用いた。
ハイブリダイゼーション後のフィルターを０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸ナトリウム）で２回洗浄した後、イメージングプレートを感光させ、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）でマウスＦｕｃ−ＴＩＸ ｍＲＮＡのバンドを検出した。
この結果、脳と腎臓で５．５ｋｂと３．０ｋｂの２種類のバンドが見られたが、他の組織ではバンドは検出されなかった。従って、Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子は主に腎臓と脳で発現していることが判明した。脳と腎臓でのノーザンブロットの結果を第４図に示した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲを用いた各種臓器におけるＦｕｃ−ＴＩＸ転写物の定量
Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の発現量を臓器ごとに定量するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
検量線の作成に用いるスタンダード用プラスミドとしては、ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９のＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡを含む約１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ間にサブクローニングしたｐＢＳ−ｍＦＴ９を用いた。
ｐＢＳ−ｍＦＴ９を制限酵素ＸｃｍＩとＢｐｕ１１２０Ｉで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した後、再度ライゲーションすることにより、Ｆｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡ中のＸｃｍＩ−Ｂｐｕ１１２０Ｉ間１２７ｂｐを欠失させたｐＢＳ−ｍＦＴ９ｄを作成した。
該ｐＢＳ−ｍＦＴ９ｄをＲＴ−ＰＣＲの際競合させる内部コントロール用プラスミドとして用いた。
マウスβ−アクチンｃＤＮＡの取得を、実施例３のマウスＦｕｃ−ＴＩＶｃＤＮＡの取得法に準じて、以下のように行った。該マウスβ−アクチンｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成の指標となるコントロールとして用いた。
マウス胃ｍＲＮＡ由来の１本鎖を鋳型として、配列番号１０、１１に示したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、マウスβ−アクチンｃＤＮＡを増幅した。
増幅に用いた配列番号１０のプライマーは末端にＥｃｏＲＩ認識配列、配列番号１１のプライマーは末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を持っているので、増幅断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイト間にサブクローン化し、β−アクチン遺伝子のスタンダード用プラスミドｐＢＳ−ｍβ−ａｃｔｉｎを作製した。
また、ｐＢＳ−ｍβ−ａｃｔｉｎを制限酵素ＭｓｃＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した後、再度ライゲーションすることにより、β−アクチンｃＤＮＡ中のＭｓｃＩ−ＢｓｔＥＩＩ間２０８ｂｐを欠失させたｐＢＳ−ｍβ−ａｃｔｉｎｄを作成し、内部コントロール用プラスミドとして用いた。
比較のために、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ遺伝子の発現分布も検討した。スタンダードプラスミドとしては、実施例３で作製したｐＢＳ−ｍＦＴ４を使用した。また、ｐＢＳ−ｍＦＴ４を制限酵素ＥｃｏＮＩおよびＣｓｐ４５Ｉで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した後、再度ライゲーションすることにより、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ ｃＤＮＡ中のＥｃｏＮＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ間１６８ｂｐを欠失させたｐＢＳ−ｍＦＴ４ｄを作成し、内部コントロール用プラスミドとして用いた。
成体ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織（脳、胸腺、胃、肝臓、脾臓、腎臓、大腸、子宮、卵巣、肺、心臓、精巣、小腸、副睾丸）から酸グアニジウムチオシアネート フェノール−クロロホルム法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−１５９〕により全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡ各々６μｇに、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を５単位／ｍｌずつ添加し、室温で５分間反応させた。
反応後、６５℃で１５分間加熱することにより、酵素を失活させた。
得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりｃＤＮＡを合成した。反応は２０μｌで行い、反応後の溶液を水で５０倍希釈し、使用するまで−８０℃で保管した。
上述の各組織由来のｃＤＮＡ １０μｌおよび内部コントロール用プラスミド１０μｌ（１０ｆｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μＭ 遺伝子特異的プライマー〕で、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｆｕｃ−ＴＩＸ特異的プライマーの塩基配列を配列番号１２、１３に、β−アクチン特異的プライマーの塩基配列を配列番号１４、１５に、Ｆｕｃ−ＴＩＶ特異的プライマーの塩基配列を配列番号１６、１７に示した。
このプライマーにより、マウスＦｕｃＴＩＸ ｃＤＮＡについては５３０ｂｐ、ｐＢＳ−ｍＦＴ９ｄからは４０３ｂｐの断片が増幅し、β−アクチンｃＤＮＡについては７９２ｂｐ、ｐＢＳ−ｍβ−ａｃｔｉｎｄからは５８４ｂｐの断片を増幅させることができる。また、マウスＦｕｃＴＩＶｃＤＮＡについては５１１ｂｐ、ｐＢＳ−ｍＦＴ４ｄからは３４３ｂｐの断片を増幅させることができる。
ＰＣＲの条件は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、Ｆｕｃ−ＴＩＸとＦｕｃ−ＴＩＶについては３８〜４２サイクル、β−アクチンについては２２〜２６サイクルの反応を行った。
反応後の溶液のうち１０μｌを１％のアガロースゲルで電気泳動じ、エチジウムブロマイドで染色し、写真を撮影した。写真をＮＩＨイメージシステムによりスキャニングすることにより増幅した断片の染色の強さを測定し、増幅量とした。
組織ｃＤＮＡのかわりにスタンダードプラスミドを１．２５ｆｇ、２．５ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２０ｆｇ、４０ｆｇ用いて、ＰＣＲを行い、増幅断片の増幅量を測定し、ｃＤＮＡの量と断片の増幅量をプロットして検量線を作成した。
この検量線と各組織ｃＤＮＡでの断片の増幅量から、各組織でのｃＤＮＡの量を計算し、これを各組織でのｍＲＮＡ転写量すなわち遺伝子の発現量とした。なお、β−アクチンは各組織で普遍的に発現している遺伝子と考えられるので、どの組織においてもその発現量は同程度と考えられる。従って、各組織におけるβ−アクチン遺伝子の発現量の差は、ｃＤＮＡ合成反応の効率の差と考えられるのでＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の発現量を比較する際にβ−アクチンの発現量も考慮した。
結果を第５図に示した。
Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子は、腎臓で最も多く、それに次いで脳で多く発現していることがわかった。また、胃、大腸、子宮、副睾丸でも発現が確認された。しかし、胸腺、肝臓、脾臓、卵巣、肺、心臓、精巣、小腸では発現はみられなかった。マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の発現分布は、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ遺伝子の発現分布とは明らかに異なっていた（第５図参照）。
〔実施例５〕ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の脳内発現分布の解析
配列番号１８、１９に塩基配列を示したプライマーセットを用いて、マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡの一部を増幅し、この増幅断片をＴＡクローニング用ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。
同様にして別のプライマーセット（塩基配列を配列番号２０および２１に示した）を用いて、マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡの一部の断片を増幅し、ｐＣＲ３にサブクローニングした。
増幅断片の方向を確認後、これらのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ジゴキシゲニン標識用ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロ転写反応を行うことにより、ジゴキシゲニン標識されたアンチセンス・リボプローブあるいはセンス・リボプローブを作製した（アンチセンスかセンスかどうかは増幅断片の方向による）。また、これらのプラスミドをＸｈｏＩで切断後、同様にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロ転写反応を行うことにより、ジゴキシゲニン標識されたアンチセンス・リボプローブあるいはセンス・リボプローブを作製した（アンチセンスかセンスかどうかは増幅断片の方向による）。
成体ＢＡＬＢ／ｃマウスの脳組織を４％パラホルムアルデヒド中で一晩処理して固定化し、パラフィンに包埋した。
該パラフィンに包埋した脳組織を用い、該脳組織の切片を作製後、切片のパラフィンを除去し水和させた。
該脳組織切片を０．２Ｍ塩酸で２０分間処理することにより、組織中に元からあるアルカリホスファターゼを不活化した後、４μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を添加し３７℃で１５分間反応させた。
該切片を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）中で１０分間処理して固定化後、非特異的な染色を避けるために、０．２％グリシン／ＰＢＳ（ｗ／ｖ）中に１０分間浸した。
該切片を脱水後、ハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホルムアルデヒド、１０％硫酸デキストラン、１×デンハルト溶液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、２００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ〕中で、リボプローブと５０℃で１６時間ハイブリダイズさせた。
該切片を、２×ＳＳＣで室温で１５分間、２回洗浄後、０．１×ＳＳＣで５０℃で３０分間洗浄した。
抗ジゴキシゲニン抗体とＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いてプローブとハイブリダイズしたシグナルを検出した。
結果の一例を第６図に示す。
アンチセンスプローブを用いた際には、海馬のニューロン細胞体で染色がみられ、Ｆｕｃ−ＴＩＸ ｍＲＮＡの発現が検出されたが、グリア細胞では発現が検出されなかった。
一方、ネガティブコントロールとして用いたセンスプローブでは、いずれの細胞についても染色はみられなかった。
以上のことから、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子はニューロン細胞体で発現しており、グリア細胞では発現していないことが判明した。
〔実施例６〕ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体ＤＮＡのクローン化
マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃ ＤＮＡに対応するヒトの遺伝子として、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体ＤＮＡのクローン化を行った。
まず、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子に特異的なプライマー（塩基配列を配列番号２２および２３に示した）を用いたＰＣＲにより、ヒト染色体ＤＮＡライブラリー（ＰＡＣライブラリー）をスクリーニングすることにより、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体ＤＮＡを含有するクローンの取得を行った。
該ＰＡＣライブラリーの各クローンのうち、４０５５０４クローンを、１０５６枚の３８４穴プレート（縦１６×横２４穴）上に１クローン／穴になるようにして培養後、このプレート１０５６枚を横（Ｘ軸：１〜１２）１２枚、縦（Ｙ軸：Ａ〜Ｈ）８枚、高さ（Ｚ軸：１〜１１）１１枚に積み重ねた。各（Ｚ，Ｙ）座標ごとにＸ軸方向の１２プレート分の全てのクローンを混合し８８個のプールを作製した。
別に、各（Ｚ，Ｘ）座標ごとにＹ軸方向の８プレート分の全てのクローンを混合し１３２個のプールを作製した。
上記８８個のプールについて上記プライマーを用いたＰＣＲを行い、どの（Ｚ，Ｙ）座標のプールを鋳型として用いた時にヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子断片が増幅されるか調べた結果、（Ｚ，Ｙ）座標が（８，Ｈ）に存在するプールにヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含むクローンの存在が認められた。
同様に、上記１３２プールのうち、特定したＺ座標８を含む（８，１〜１２）の１２個のプールについて同様のＰＣＲを行い、（Ｚ，Ｘ）座標が（８，１２）に存在するプールにヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含むクローンの存在が認められた。
以上の結果より、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含むクローンは（Ｚ，Ｙ，Ｘ）座標（８，Ｈ，１２）に存在することがわかった。
特定した座標（８，Ｈ，１２）のプレート上に存在する３８４種の各クローンを、３８４（縦１６×横２４）穴プレート用の剣山で同時につついて、２×ＴＹ培地の入った縦溝プレート（３８４穴プレートの縦１６穴がつながった２４本の縦溝をもつプレート）および横溝プレート（３８４穴プレートの横２４穴がつながった１６本の横溝をもつプレート）に植菌し、一晩培養した。
各溝の培養液（４０種）のうち１μｌを鋳型として上記と同様のＰＣＲを行い、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子断片の増幅が見られた縦溝と横溝の交点の座標を求めることにより、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含むクローンの存在する座標を特定した。
特定した座標のクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで切断後、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ ｃＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。プローブの作製法を以下に示す。
マウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２４および２５に示したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ ｃＤＮＡ断片を増幅した。
次いで、該断片をマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて３２Ｐで標識し、プローブとした。
サザンハイブリダイゼーションの結果、約２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片がマウスＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡとハイブリダイズした。
ハイブリダイズの結果より、これらの断片がヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体由来の断片であると考え、該約２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローン化し、ｐＢＳ−ｈｇＦＴ９Ｈを作製した。
また、該約１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローン化し、ｐＢＳ−ｈｇＦＴ９Ｅを作製した。
ｐＢＳ−ｈｇＦＴ９ＨおよびｐＢＳ−ｈｇＦＴ９Ｅの塩基配列を実施例１と同様にして決定し、その結果をつなぎ合わせることにより、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体ＤＮＡの塩基配列（２８２２ｂｐ）を決定した。該塩基配列を配列番号４に示した。
ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体は、３５９アミノ酸からなるポリペプチドをコードするＯＲＦを有していた。該アミノ酸配列はマウスＦｕｃ−ＴＩＸのアミノ酸配列（配列番号２に示す）と９９．２％（３５９アミノ酸中３５６アミノ酸が一致）のホモロジーを示したことから、配列番号４の１２８９〜２３６８番目の領域は、イントロンを含まないヒトＦｕｃ−ＴＩＸをコードする塩基配列であると結論した。
ヒトＦｕｃ−ＴＩＸのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
〔実施例７〕ヒトＦｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡのクローン化
ヒト胃粘膜のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡよりｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ ａｄａｐｔｏｒ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を付加した後、クローニングベクターλＺＡＰ ＩＩ（λＺＡＰ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
実施例６で取得したヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体を含むＰＡＣクローンを鋳型として、配列番号２６および２７に示したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体断片を増幅した。
該断片をマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて３２Ｐで標識し、プローブを作製した。
該プローブを用いて、上記で作製したｃＤＮＡライブラリー５×１０５クローンについてプラークハイブリダイゼーションを行った。
該ハイブリダイゼーションにおいて、フィルターを、２倍濃度のＳＳＰＥ〔１倍濃度のＳＳＰＥの組成は、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）よりなる（ｐＨ７．４）〕、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回、１倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１５分間浸漬する条件で１回、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回洗浄した。
該プラークハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズする４個の独立したクローンが得られた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従ってｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎを行い、該クローンよりそれぞれプラスミドを回収し、制限酵素解析、塩基配列決定を行った。
塩基配列決定の結果、回収したプラスミドの一つであるｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）には、配列番号５に記載した約２．７ｋｂのｃＤＮＡが含まれることが判明した。
該ｃＤＮＡは、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸ染色体がコードするポリペプチドと同じアミノ酸配列（配列番号２に示す）を有するポリペプチドをコードしていた。ｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）を含む大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭ Ｓｔｒａｉｎ／ｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）は、平成１０年７月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６４１６として寄託されている。
ｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）の構造を第７図に示す。
〔実施例８〕Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のノックアウトマウスの作製
（１）マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の取得
実施例４の（１）で使用したプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより、λＦＩＸＩＩ／１２９ゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をスクリーニングした。約６×１０４個をスクリーニングして、４個の陽性クローンを得た。
二次、三次スクリーニングを行うことにより、それぞれ単一のクローンを取得した。マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子特異的な、配列番号１２で示した塩基配列を有するプライマー（ＣＢ−５５）および配列番号１３で示した塩基配列を有するプライマー（ＣＢ−５６）を使用したＰＣＲおよび制限酵素切断による解析の結果、４つのクローンは全て同一であり、Ｆｕｃ−ＴＩＸｃＤＮＡの全翻訳領域と３’非翻訳領域全部を含むことを確認した。このファージクローンをλＭＦＴ９−３１と呼ぶ。
λＭＦＴ９−３１ ＤＮＡをＳａｌＩで消化してＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含む染色体ＤＮＡを切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−のＳａｌＩ部位にサブクローン化することにより、プラスミドｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９を造成した。
Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの長さは約２０ｋｂであった。該染色体ＤＮＡの塩基配列を決定した結果、該染色体ＤＮＡは、約４ｋｂからなるマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のイントロン２の一部、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のエクソン３（８ｂｐの５’非翻訳領域、翻訳領域全部、３’非翻訳領域全部を含む）、および該エクソン３に続く約１４ｋｂの染色体遺伝子部分を含んでいた。プラスミドｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９中の該染色体ＤＮＡ部分の構造を第８図に示す。一方、５’非翻訳領域はほとんどこのクローンには含まれてはいなかった。
５’非翻訳領域部分の遺伝子を取得するために、以下の実験を行った。
５’ＲＡＣＥ法を用いてマウスＦｕｃ−ＴＩＸ ｃＤＮＡの５’非翻訳領域部分のＤＮＡを取得した。該ＤＮＡをプローブとしてλＦＩＸＩＩ／１２９ゲノムライブラリーをスクリーニングし、独立した２種類の陽性クローン（以下、λＭＦＴ９−１１およびλＭＦＴ９−２５と呼ぶ）を取得した。
λＭＦＴ９−１１およびλＭＦＴ９−２５のＤＮＡをＳａｌＩで消化してＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含む染色体ＤＮＡを切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−のＳａｌＩ部位にそれぞれサブクローンした。λＭＦＴ９−１１およびλＭＦＴ９−２５のＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの長さは、それぞれ約１２ｋｂと約１６ｋｂであった。塩基配列を決定した結果、λＭＦＴ９−１１およびλＭＦＴ９−２５は、それぞれエクソン１およびエクソン２を含むことが判明した。
以上の結果、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子は３つのエクソンから構成されることが判明した。エクソン／イントロン結合部位の配列は、ＧＴ−ＡＧルールに一致していた。エクソン１の上流はマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられる。エクソン１〜３の配列およびプロモーター領域を含むと考えられるエクソン１の上流部分の塩基配列を、それぞれ配列番号２８〜３１に示す。マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の構造を第９図に示す。
また、常法〔Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ，５，２５３（１９９４）〕に従ってｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ＤＮＡ ｐａｎｅｌを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子（第１０図中Ｆｕｔ９として示す）の染色体上の位置を調べた。
プライマーとして、配列番号１３に示される塩基配列を有するＤＮＡ（ＣＢ−５６）および配列を配列番号３２に示される塩基配列を有するＤＮＡ（ＣＢ−１９７）をそれぞれ用いた（第８図参照）。ＣＢ−１９７はイントロン２中に設定したプライマーである。
ＰＣＲ反応は、ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ＤＮＡ ｐａｎｅｌの染色体ＤＮＡ（１０ｎｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μＭ遺伝子特異的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）１μｌ］を用いて、９４℃で１分間、６４℃で１分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＰＣＲの結果、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子は第４番染色体に位置し（第１０図）、マーカー遺伝子（Ａｏｐ２−ｒｓ２、Ｄ４Ｅｒｔｄ５１９ｅ、Ｄ４Ｅｒｔｄ５８２ｅ）の近傍に存在していることが明白となった。また、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子はマーカー遺伝子Ｄ４Ｅｒｔｄ３８９ｅからは１．１±１．１ｃＭ遠位に、マーカー遺伝子Ｄ４Ａｂｂｌｅからは４．２５±２．１ｃＭ近位に位置していた。
（２）相同組換え用ターゲティングベクターの作製
マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の翻訳領域の３’末端側半分と３’非翻訳領域全部を除去し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子を組み込むことにより、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子ノックアウトマウスを作製するためのターゲティングベクターであるｐＦｕｔ９Ｆ［ｔｋｎｅｏ］を、以下の方法で作製した（第８および１１図）。
プラスミドｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９に含有されるＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子を含む染色体ＤＮＡを３断片（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）に分けてサブクローン化を行った。
プラスミドｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９をＢａｍＨＩで切断し、約１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を取得した。該断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−のＢａｍＨＩ部位に組み込むことにより、プラスミドｐＢ１を作製した。
プラスミドｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９をＢａｍＨＩで切断し、約６．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片を取得した。該断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−のＢａｍＨＩ部位に組み込むことにより、プラスミドｐＢ２を作製した。
プラスミドｐＦｕｔ９ｗｔ−１２９をＢａｍＨＩで切断し、１５ｋｂのＢａｍＨＩ断片を取得した。該断片を連結して環状にすることにより、プラスミドｐＢ３を作製した。
上記で得られた、ｐＢ２を利用して、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の翻訳領域の３’末端側半分と３’非翻訳領域全部を除去し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子を組み込むこんだプラスミドｐＢ２−Ｎｅｏを造成した。
プラスミドｐＢ２をＸｈｏＩで切断し９．０ｋｂのＸｈｏＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片で処理することにより、ＸｈｏＩ切断末端を平滑末端に変換した後、該断片を連結して環状にすることにより、ｐＢ２のＸｈｏＩ切断部位を消失させたプラスミドを造成した。
該プラスミドをＳａｃＩで部分切断し、約６．１ｋｂのＳａｃＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片で処理することにより、ＳａｃＩ切断末端を平滑末端に変換した後、ＸｈｏＩリンカーを付加し、該ＤＮＡ断片を連結して環状にすることにより、ｐＢ２−ＸｈｏＩを造成した。
ｐＢ２−ＸｈｏＩをＸｈｏＩで切断し、６．１ｋｂのＸｈｏＩ断片を取得した。また、ｐＭＣｌＮｅｏｐｏｌｙＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＸｈｏＩとＳａｌＩで切断することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む１．２ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢ２−ＸｈｏＩ由来の６．１ｋｂのＸｈｏＩ断片と、ｐＭＣｌＮｅｏｐｏｌｙＡ由来の１．２ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を連結することにより、プラスミドｐＢ２−Ｎｅｏを造成した。
更に、ｐＢ３を利用して、Ｂ３断片の３’末端にネガティブセレクション用のマーカーであるチミジンキナーゼ遺伝子を連結したプラスミドｐＢ３−ｔｋを、以下のように造成した。
ｐＢ３をＸｈｏＩで切断し、１５ｋｂのＸｈｏＩ断片を取得した。また、プラスミドＭＣ−１−ＴＫ（Ｎａｔｕｒｅ，３３６，３４８（１９８８））をＸｈｏＩとＳａｌＩで切断することにより、チミジンキナーゼ遺伝子を含む１．８ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢ３由来の１５ｋｂのＸｈｏＩ断片と、ＭＣ−１−ＴＫ由来の１．８ｋｂのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を連結することにより、プラスミドｐＢ３−ｔｋを造成した。
上記で作製したｐＢ２−ＮｅｏをＢａｍＨＩで切断し、４．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片を取得した。また、上記で作製したｐＢ３−ｔｋをＢａｍＨＩで切断し、１７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を取得した。ｐＢ２−Ｎｅｏ由来の４．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片と、ｐＢ３−ｔｋ由来の１７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を連結することにより、プラスミドｐＦｕｔ９Ｆ［ｔｋｎｅｏ］を造成した。
（３）相同組換えした杯性幹細胞（ＥＳ細胞）株の作製
上記（２）で作製したプラスミドｐＦｕｔ９Ｆ［ｔｋｎｅｏ］をＮｏｔＩで切断したＤＮＡ断片（２５μｇ）を、ＰＢＳで２．５×１０７細胞／ｍｌに調製したＥＳ細胞０．８ｍｌと混合した。
Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて０．３５ｋＶ、９５０μＦの条件でエレクトロポレーションを行うことにより、ＮｏｔＩ切断ＤＮＡ断片をＥＳ細胞に導入した。
該ＥＳ細胞を、予めフィーダー細胞をまいた１０ｃｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに１×１０７細胞ずつまき、１５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地〔１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＥＳＧＲＯ（ＧＩＢＣＯ社製）、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ＧＩＢＣＯ社製）、および１００μｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（ＧＩＢＣＯ社製）を含む〕で培養した。２日目より２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）と２μＭのＧａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（Ｓｙｎｔｅｘ社製）を添加し、遺伝子導入細胞の選択を行った。
選択を開始してから８〜１０日後に出現したコロニーの単離を行い、計１４４種のＥＳ細胞株を単離した。そのうち３９種のＥＳ細胞から常法にしたがって染色体ＤＮＡを単離し、ＰＣＲを用いてターゲティングベクターが相同組換えにより組み込まれた細胞の選別を行った。
染色体ＤＮＡの単離は以下のように行った。
２４穴プレートで培養した細胞に５００μｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ〕を加えて細胞を溶解し、フェノール抽出、エタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを単離した。
ＰＣＲには、ターゲティングベクター中に組み込まれたマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のさらに上流部分に設定した配列番号３２に示される塩基配列を有するＤＮＡ（ＣＢ−１９７）およびネオマイシン耐性遺伝子中に設定した配列番号３３に示される塩基配列を有するＤＮＡ（ＣＢ−１９９）（第８図参照）をプライマーとして用いた。
ＰＣＲは以下の条件で行った。
ＥＳ細胞から単離した染色体ＤＮＡを含む５０μｌの反応溶液〔１×ＬＡ ＰＣＲＴＭ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ各０．４ｍＭ、上記プライマー各０．２μＭ、２ｕｎｉｔ Ｔａｋａｒａ ＬＡ ＴａｑＴＭ〕を用いて、９４℃で１分間加熱した後、９８℃で２０秒間、６８℃で８分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った。
マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子とターゲッティングベクターが相同組換えを起こし、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のエクソン３の後半部分が破壊されたＥＳ細胞では、約３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されることになる。３９種のＥＳ細胞株について解析した結果、３種のＥＳ細胞株について約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。これらの３種のＥＳ細胞株については、目的通りマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子が破壊されていると結論された。
（４）マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子ノックアウトマウスの作製
交配後３．５日目のＣ５７ＢＬ／６マウス（４週齢の雌）から子宮を摘出し、胚盤胞を採取した。上記（３）で取得したマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子が破壊されたＥＳ細胞（３種類）を、それぞれマイクロマニュピレーターを用いて胚盤胞に導入（胚盤胞１個当たりＥＳ細胞１５個程度）し、偽妊娠した仮親マウス（ＩＣＲ）の子宮の両側に各１０個ずつ胚盤胞を移植した。
その結果、９５匹の産子が得られ、そのうち４４匹（雄３１匹、雌１３匹）が毛色からキメラマウスと判断された。これらキメラマウスと正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスを交配してヘテロマウスを取得した後、さらにヘテロマウス同士を交配することによってノックアウトマウスを取得した。
ヘテロマウス同士を交配することによって得られた産仔について、尾から染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により遺伝子型の検定を行った。
プライマーＣＢ−１９７、ＣＢ−１９９および配列番号３４に示す塩基配列を有するＤＮＡ（ＣＢ−２８０）（第８図参照）を同時に使用してＬｏｎｇ ＰＣＲを行うと、野生型マウスではＣＢ−１９７とＣＢ−２８０によって増幅される約３．５ｋｂのバンドのみが検出され、欠損型のＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子をホモで有するマウスでは、ＣＢ−１９７とＣＢ−１９９よって増幅される約３．０ｋｂのバンドのみが検出され、ヘテロマウスではＣＢ−１９７とＣＢ−２８０によって増幅される約３．５ｋｂのバンドと、ＣＢ−１９７とＣＢ−１９９によって増幅される約３．０ｋｂのバンドの両方が検出される。
第１２図に、ＰＣＲによる解析結果の一例を示す。Ｎｏ．５のマウスは、欠損型のＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子をホモで有するマウス（Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子ノックアウトマウス）であることがわかる。
ヘテロマウス同士を交配することによって３４匹の産仔を取得し、このうち、野生型マウスは１１匹、ヘテロマウスは１７匹、Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子ノックアウトマウスは６匹（雄４匹、雌２匹）であった。
Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子ノックアウトマウスは、Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の生理学的機能および病理学的機能の解析に極めて有用である。
〔実施例９〕Ｆｕｃ−ＴＩＸの反応特異性の解析
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ１，３結合で繰り返し結合した構造〔（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎ；ｎは２以上〕を有する糖鎖で、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合型糖鎖やＯ−グリコシド結合型糖鎖中に存在するほか、糖脂質の糖鎖中やオリゴ糖中にも存在する。
ヒトＦｕｃ−ＴＩＸおよびこれまでにクローン化された５種のヒトα１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶ、Ｆｕｃ−ＴＶＩ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ）について、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を基質として用いたとき、該糖鎖中のどのＧｌｃＮＡｃにフコースを転移することができるか検討した。
実施例７で取得したｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）をｐｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片により切断末端を平滑末端に変換した。変換後、実施例１の（２）で調製したＳｆｉＩリンカーを付加し、約１．６ｋｂの断片を取得した。
発現ベクターｐＡＭｏをＳｆｉＩで切断し、約８．７ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。
ｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）由来の約１．６ｋｂの断片と、ｐＡＭｏ由来の約８．７ｋｂのＳｆｉＩ断片を連結することにより、ヒトＦｕｃ−ＴＩＸの発現プラスミドであるｐＡＭｏ−ＦＴ９を造成した。
実施例１の（３）に示した方法に従って、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）とヒトＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミドｐＡＭｏ−ＦＴ９をＮａｍａｌｗａ細胞に導入し、安定形質転換細胞を取得した。
既報〔Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ，，１３，８０２−８１２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３７，１３１−１３７（１９９７）〕に従って、他の５種のヒトα１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶ、Ｆｕｃ−ＴＶＩ、Ｆｕｃ−ＴＶＩＩ）を発現するＮａｍａｌｗａ細胞を取得した。
上記形質転換細胞（約１×１０７個）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：エッペンドルフ社製）に各々採取し、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
該細胞を０．９ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、該洗浄細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００からなる溶液（１００μｌ）に懸濁し４℃で１０分間放置した後、超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ；コスモ・バイオ社製）を用いて細胞を破砕した。
破砕後、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により各々上清を取得し、該上清を酵素サンプルとした。
基質として、６糖からなるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）を用いて蛍光標識した糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ：第１３図、第１５図および表３中ではＳと略した）を使用した。
蛍光標識はＳｉｇｎａｌＴＭ ２−ＡＢ ｇｌｙｃａｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）の調製は〔ＷＯ９８／０３５２４］に従って行った。
活性測定は以下のようにして行った。
２０μｌのアッセイ溶液〔５０ｍＭ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ（ｐＨ６．８）、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ、７５μＭ ＵＤＰ−Ｆｕｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１５μＭ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記細胞溶解液６μｌ〕中で３７℃、２時間反応後、１００℃で３分間処理することにより反応を停止した。停止後、２００μｌの水を添加後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得し、その一部（１０μｌ）を用い、下記ＨＰＬＣ条件で生成物を解析した。
ＨＰＬＣ：
カラム −ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（４．６×２５０
ｍｍ；東ソー）
溶出液 −７％のメタノールを含む０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ４．０）
溶出温度−５０℃
流速 −１．０ｍｌ／分の条件で行った。
検出 −蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光社製）（
励起波長３３０ｎｍ、放射波長４２０ｎｍ）
ＨＰＬＣ解析の結果の１例を第１３図に示す。第１３図の（ａ）はコントロールプラスミドを導入した細胞由来の抽出液を酵素サンプルとして使用したものである。第１３図の（ｂ）は、Ｆｕｃ−ＴＩＶを発現させた細胞由来の抽出液を酵素サンプルとして使用したものである。第１３図の（ｃ）は、Ｆｕｃ−ＴＩＸを発現させた細胞由来の抽出液を酵素サンプルとして使用したものである。
Ｆｕｃ−ＴＩＶまたはＦｕｃ−ＴＩＸを発現させた細胞由来の抽出液を酵素サンプルとして使用した場合には、３種の生産物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）が生産されることが明らかとなった。
基質の還元末端のＧｌｃＮＡｃは、２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）による蛍光標識により開環しているため、生産物としては以下の３種が考えられた。Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ。
生産物の構造を、以下の方法で確認した。
各生産物（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３）を分取後、スピードバック（ＳＡＶＡＮＴ社製）を用いて完全に乾燥した。次いで、乾燥物を水にとかし、不溶画分を遠心で除去した後、以後の解析に使用した。
該各生産物（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３）を、下記ＨＰＬＣ条件で解析することにより、生産物の分子量の大きさを比較した。
ＨＰＬＣ：
カラム −ＧｌｙｃｏＳｅｐＴＭ Ｎ ＨＰＬＣカラム
（４．６×２５０ｍｍ；Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎ
ｃｅ社製）
溶出液 −６５％のアセトニトリルを含む０．２５Ｍ蟻酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ４．４）
溶出温度−３０℃
流速 −１．０ｍｌ／分
検出 −蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光）
（励起波長３３０ｎｍ、放射波長４２０ｎｍ）
分子量マーカー−２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉ
ｄｅ）で蛍光標識したグルコースホモポリマー（Ｏｘｆｏｒｄ
ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）
結果を第１４図の（ａ）〜（ｃ）に示す。
Ｐ１とＰ２は同じ位置に溶出され〔第１４図の（ａ）と（ｂ）参照〕、Ｐ３の溶出時間よりＰ３はＰ１およびＰ２に比較して約グルコース１個分大きいことが判明した〔第１４図の（ｃ）参照〕。
以上のことより、Ｐ１およびＰ２は、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢのどちらかに対応し、Ｐ３はＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢと考えられた。
分取した各生産物（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３）を３００ｍＵ／ｍｌのＪａｃｋ ｂｅａｎ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中で３７℃で１５時間処理後、上記と同様にして反応液をＧｌｙｃｏＳｅｐＴＭ Ｎ ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ；Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を用いたＨＰＬＣで解析した。
結果を第１４図の（ｄ）〜（ｆ）に示す。
生産物Ｐ１と生産物Ｐ３の溶出位置はＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ処理の前後で変化がなかった〔第１４図の（ａ）と（ｄ）または（ｃ）と（ｆ）参照〕が、生産物Ｐ２は、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ処理後に、グルコース約１個分の分子量が減少した〔第１４図の（ｂ）と（ｅ）参照〕。この結果は、生産物Ｐ２の構造はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢであることを示している。したがって、生産物Ｐ１の構造はＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢであると考えられた。
各種グリコシダーゼを用いて、さらに詳細に生産物の構造を確認した。
分取した各生産物（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３）を０．２ｍＵ／ｍｌのａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で３７℃で１５時間処理後、上記と同様にして、反応液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（４．６×２５０ｍｍ；東ソー）を用いるＨＰＬＣにより解析した（第１５図）。
その結果、生産物Ｐ１の溶出位置はａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ処理の前後で変化し〔第１５図の（ａ）と（ｂ）参照〕、酵素処理後の溶出位置は基質の溶出位置と一致した〔第１５図の（ｂ）と（ｃ）参照〕。
生産物Ｐ２の溶出位置はａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ処理の前後で変化しなかった〔第１５図の（ｄ）と（ｅ）参照〕。
生産物Ｐ３の溶出位置はａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ処理の前後で変化し〔第１５図の（ｊ）と（ｋ）参照〕、酵素処理後の溶出位置は生産物Ｐ２の溶出位置と一致した〔第１５図の（ｋ）と（ｄ）参照〕。
上記結果は、生産物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の構造はそれぞれＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢであることを示している。
生産物Ｐ２の構造をさらに確認するために、生産物Ｐ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅおよびａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで順次処理し、反応液を、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（４．６×２５０ｍｍ；東ソー）を用い、上記と同じ条件でＨＰＬＣにより解析した。
生産物Ｐ２を６００ｍＵ／ｍｌのＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で３７℃で１５時間処理後、１００℃で５分間処理することにより反応を停止した。
得られた反応液の一部にＪａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１０Ｕ／ｍｌ添加し、３７℃で１５時間処理後、１００℃で５分間処理することにより反応を停止した。
得られた反応液に更に０．２ｍＵ／ｍｌのａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を添加し、３７℃で１５時間処理後、１００℃で５分間処理することにより反応を停止した。
第１５図の（ｆ）に生産物Ｐ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅのみで処理した時のＨＰＬＣパターンを、第１５図の（ｇ）に生産物Ｐ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ処理後、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅで処理した時のＨＰＬＣパターンを、第１５図の（ｈ）に生産物Ｐ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ処理後、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅおよびａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで順次処理した時のＨＰＬＣパターンを示した。
生産物Ｐ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ処理後、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅおよびａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで順次処理した時の溶出位置〔第１５図の（ｈ）参照〕は、４糖からなるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）を用いて蛍光標識した糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ）の溶出位置〔第１５図の（ｉ）参照〕と一致していた。
以上の結果より、生産物Ｐ２の構造はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢであることを確認した。
４糖からなるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖はＷＯ９８／０３５２４記載の方法に準じて調製し、ＳｉｇｎａｌＴＭ ２−ＡＢ ｇｌｙｃａｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて蛍光標識した。
生産物Ｐ３をａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ処理後、生産物Ｐ２に関して行った条件と同じ条件で、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅおよびａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで順次処理することにより、Ｐ３の構造がＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢであることを確認した。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｓ）を基質として酵素反応を行うと、Ｆｕｃ−ＴＩＶを発現するＮａｍａｌｗａ細胞の抽出液を酵素として用いた場合には、生産物Ｐ２（ＶＩＭ２糖鎖）が主に生産され〔第１３図の（ｂ）、表２参照〕、Ｆｕｃ−ＴＩＸを発現するＮａｍａｌｗａ細胞の抽出液を酵素として用いた場合には、生産物Ｐｌ（Ｌｅｘ糖鎖）が主に生産された〔第１３図の（ｃ）、表２参照〕。
同様にして解析した結果、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＶ、またはＦｕｃ−ＴＶＩを発現するＮａｍａｌｗａ細胞の抽出液を酵素として用いた場合には、生産物Ｐ２（ＶＩＭ２糖鎖）が主に生産された（表２）。Ｆｕｃ−ＴＶＩＩを発現するＮａｍａｌｗａ細胞の抽出液を酵素として用いた場合には、生産物は生産されなかった（表２）。
Figure 0004482233
以上の結果から、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶ、およびＦｕｃ−ＴＶＩは、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の内側のＧｌｃＮＡｃ残基にフコースを転移し、ＶＩＭ２糖鎖を合成する活性が強いことが明らかとなった。一方、Ｆｕｃ−ＴＩＸは非還元末端側のＧｌｃＮＡｃ残基にフコースを転移し、Ｌｅｘ糖鎖を合成する活性が強いことが明らかとなった。Ｆｕｃ−ＴＩＸは、他のα１，３−フコース転移酵素と比較して明らかに異なる活性を有するα１，３−フコース転移酵素であることが示された。また、Ｆｕｃ−ＴＩＸを用いて、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の末端に効率よくＬｅｘ糖鎖を合成できることが示された。
上記基質（Ｓ）に加え、生産物Ｐ１または生産物Ｐ２を基質として用い、Ｆｕｃ−ＴＩＶ、Ｆｕｃ−ＴＶＩおよびＦｕｃ−ＴＩＸの酵素活性を測定した。
結果を表３に示す。
Ｆｕｃ−ＴＩＶおよびＦｕｃ−ＴＶＩは、生産物Ｐ１をよい基質として生産物Ｐ３を合成した。一方、Ｆｕｃ−ＴＩＸは、生産物Ｐ２をよい基質として生産物Ｐ３を合成した。
以上の結果より、生産物Ｐ３（ｄｉｍｅｒｉｃ Ｌｅｘ糖鎖）は、Ｆｕｃ−ＴＩＸと他のα１，３−フコース転移酵素（例えばＦｕｃ−ＴＩＶまたはＦｕｃ−ＴＶＩ）が共に働くことにより、効率的に合成されると考えられた。
Figure 0004482233
〔実施例１０〕ヒトＦｕｃ−ＴＩＸの発現プラスミドを導入したヒト培養細胞におけるＶＩＭ２糖鎖の合成
実施例９で造成した、ヒトＦｕｃ−ＴＩＶまたはヒトＦｕｃ−ＴＩＸを発現させたＮａｍａｌｗａ細胞、およびコントロールベクターｐＡＭｏを導入したＮａｍａｌｗａ細胞について、抗ＶＩＭ２糖鎖抗体（抗ＣＤｗ６５抗体：Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）ならびに抗Ｌｅｘ糖鎖抗体［７３−３０（生化学工業社製）および抗ＣＤ１５抗体（Ｃ３Ｄ−１：Ｄａｋｏ社製）］を用いて間接蛍光抗体染色を行なった。ＶＩＭ２糖鎖は、糖鎖の非還元末端にＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃという構造を有する糖鎖である。
間接蛍光抗体染色は、実施例１の（３）に記載した方法に従って行った。抗ＶＩＭ２糖鎖抗体、７３−３０、Ｃ３Ｄ−１は、それぞれ１／５０、１／１００、１／５０希釈して使用した。
結果を第１６図に示す。
Ｆｕｃ−ＴＩＶを発現させたＮａｍａｌｗａ細胞においては、ｐＡＭｏを導入したＮａｍａｌｗａ細胞に比較して、抗ＶＩＭ２糖鎖抗体への反応性が顕著に増加していたが、Ｆｕｃ−ＴＩＸを発現させたＮａｍａｌｗａ細胞においては、抗ＶＩＭ２糖鎖抗体への反応性の増加はわずかであった。一方、抗Ｌｅｘ糖鎖抗体［７３−３０および抗ＣＤ１５抗体］への反応性は、Ｆｕｃ−ＴＩＸを発現させたＮａｍａｌｗａ細胞の方が、Ｆｕｃ−ＴＩＶを発現させたＮａｍａｌｗａ細胞に比較して強かった。
以上の結果から、Ｆｕｃ−ＴＩＶは、形質転換細胞中でＶＩＭ２糖鎖を合成する活性が強いことが示された。一方、Ｆｕｃ−ＴＩＸは形質転換細胞中でＬｅｘ糖鎖を合成する活性は強いが、ＶＩＭ２糖鎖を合成する活性は弱いことが示された。これらの結果は、実施例９のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性のデータとよく一致している。
Ｆｕｃ−ＴＩＶとＦｕｃ−ＴＩＸの反応特異性は、細胞中でも明らかに異なることが示された。
産業上の利用可能性
本発明は、ルイスｘ糖鎖およびルイスｙ糖鎖を合成する活性を有し、かつシアリルルイスｘ糖鎖を合成する活性を有しない新規な基質特異性を有するα１，３−フコース転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの製造法、該ＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリペプチドを用いたＦｕｃ含有糖鎖の製造法、該組換え体ベクターを含有する形質転換体を用いたＦｕｃ含有糖鎖の製造法、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法、該ＤＮＡあるいは該抗体を用いた脳疾患、腎疾患または癌等の疾患の診断法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質あるいは該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質を用いた脳疾患、腎疾患または癌等の疾病の治療法を提供することができる。
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配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
Figure 0004482233
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【図面の簡単な説明】
第１図は、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９）、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ４）、あるいはヒトＦｕｃ−ＴＶＩ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｈＦＴ６）を導入したＮａｍａｌｗａ細胞について、抗ルイスｘ糖鎖抗体（ＰＭ−８１、７３−３０）、抗ルイスｙ糖鎖抗体（ＡＨ−６）、または抗シアリルルイスｘ糖鎖抗体（ＫＭ９３）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。影をつけたヒストグラムは、コントロールプラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞のものである。
第２図は、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ｍＦＴ９）、ヒトＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ＦＴ４）、あるいはヒトＦｕｃ−ＴＶＩＩ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−ＦＴ７）を導入したＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞について、抗シアリルルイスｘ糖鎖抗体（ＣＳＬＥＸ−１，ＫＭ９３）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。コントロールは、一次抗体の代わりにＡ−ＰＢＳを使用したもの。
第３図は、コントロールプラスミド（ｐＣＤＭ８）、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−ｍＦＴ９）、またはヒトＦｕｃ−ＴＩＩＩ発現プラスミド（ｐＣＤＭ８−Ｌｅ）を導入したＣＯＳ−１細胞細胞について、抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。影をつけたヒストグラムは、コントロールプラスミドを導入したＣＯＳ−１細胞のものである。
第４図は、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ転写物の発現分布を調べるために、マウスの各組織由来のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行った結果を示した電気泳動の図である。シグナルがみられた脳と腎臓についてのみ結果を示す。
第５図は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、マウスの各組織におけるマウスＦｕｃ−ＴＩＸ転写物の発現量を調べた結果を示した図である。
比較のために、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ転写物およびマウスβ−アクチン転写物についても同様に示した。
Ａ．はＲＴ−ＰＣＲ後のサンプルを、アガロースゲル電気泳動に供した時のパターンを示した電気泳動の図である（ａ．はＦｕｃ−ＴＩＸ転写物、ｂ．はＦｕｃ−ＴＩＶ転写物の発現量を調べたものである）。
それぞれのゲルでみられる下のバンドが内部コントロール由来のバンド、上のバンドがＦｕｃ−ＴＩＸ転写物またはＦｕｃ−ＴＩＶ転写物由来のバンドである。スタンダードプラスミドを用いて検量線を作成し、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ転写物、マウスＦｕｃ−ＴＩＶ転写物、およびマウスβ−アクチン転写物の発現量をそれぞれ数値化した図をＢ．に示した。発現量は、本文中に記載した方法で作製した一本鎖ｃＤＮＡ溶液１μｌ中での発現量である。
検量線を作成するために用いたスタンダードプラスミドの量をスタンダードＤＮＡとしてＡ．中に示した。（１）は４０ｆｇ、（２）は２０ｆｇ、（３）は１０ｆｇ、（４）は５ｆｇ、（５）は２．５ｆｇ、（６）は１．２５ｆｇである。
第６図は、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ転写物の発現分布を調べるために、マウスの脳組織の切片に対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示した写真である。ここに示した結果は、配列番号２０および２１に示したプライマーを使用して作製したプローブを用いた時のものである。アンチセンスプローブを用いた時には、神経細胞体でＦｕｃ−ＴＩＸ転写物の発現がみられた（Ａ）。一方、ネガティブコントロールとしてセンスプローブを用いた時には、シグナルはみられなかった（Ｂ）。
第７図は、プラスミドｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）の構造を示す。
図中のｃＤＮＡおよびＡｐは、それぞれヒトＦｕｃ−ＴＩＸ ｃＤＮＡおよびアンピシリン耐性遺伝子を表わしている。
第８図は、ターゲティングベクターｐＦｕｔ９Ｆ［ｔｋｎｅｏ］の構造を示した図である。比較のため、Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子をサブクローン化したプラスミドであるｐＦｕｔ９ＷＴ−１２９の構造を合わせて示す。四角で囲んだ領域の説明は図中に示したとおりである。黒の太線は、Ｆｕｃ−ＴＩＸ遺伝子のイントロン２の一部とＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の下流の染色体遺伝子を示している。黒の細線はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−部分を示している。図中５’ＵＴＲは５’非翻訳領域を、３’ＵＴＲは３’非翻訳領域を示している。ＰＣＲに使用したプライマーの名前と対応する位置を図中に示す。
第９図は、マウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子の構造を示した図である。ファージクローンλＭＦＴ９−１１、λＭＦＴ９−２５、およびλＭＦＴ９−３１が含むマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子部分を合わせて示す。図中のＢはＢａｍＨＩ部位、ＳｐはＳｐｅＩ部位、ＳａはＳａｃＩ部位を示している。
第１０図は、マウス第４染色体上におけるマウスＦｕｃ−ＴＩＸ遺伝子（図中Ｆｕｔ９として示す）の位置を示した図である。他のマーカー遺伝子の位置も合わせて示す。図はマウス第４染色体の一部のみ示してある。
第１１図は、ターゲティングベクターｐＦｕｔ９Ｆ［ｔｋｎｅｏ］の造成過程を示した図である。
第１２図は、ヘテロマウス同士を交配させて得たマウス個体の遺伝子型を解析した結果の一例を示した電気泳動の図である。Ｍは分子量マーカーを、１〜７は各マウスの遺伝子型の解析結果を示す。
第１３図は、Ｆｕｃ−ＴＩＸの反応特異性をＨＰＬＣで解析した結果を示した図である。Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ（図中Ｓで示す）に、Ｆｕｃ−ＴＩＶ発現細胞（ｂ）またはＦｕｃ−ＴＩＸ（ｃ）発現細胞の抽出液を酵素源として加えて反応後、ＨＰＬＣを用いて生産物の検出を行った結果を示した。（ａ）は、コントロールベクターを導入した細胞の抽出液を用いて反応した結果を示した。
第１４図は、Ｆｕｃ−ＴＩＸと基質Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢとを反応させ、得られた生産物（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）をＨＰＬＣで解析した結果を示した図である。分子量マーカーとして用いた、２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）で蛍光標識したグルコースホモポリマーの溶出位置を図上部に示した。該グルコースホモポリマーのグルコースユニットをｇ．ｕ．と略して記載した。（ａ）Ｐ１、（ｂ）Ｐ２および（ｃ）Ｐ３をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅでそれぞれ処理し、得られた生産物をＨＰＬＣで解析した〔それぞれ（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）〕。
第１５図は、生産物（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）を各種グリコシダーゼで処理し、得られた生成物をＨＰＬＣで解析した結果を示した図である。（ａ）はＰ１を解析した結果を、（ｂ）はＰ１をａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を、（ｃ）は基質Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢ（図中Ｓで示す）を解析した結果を、（ｄ）はＰ２を解析した結果を、（ｅ）はＰ２をａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を、（ｆ）はＰ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を、（ｇ）はＰ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅで処理後Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を、（ｈ）はＰ２をＪａｃｋ ｂｅａｎβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ｊａｃｋ ｂｅａｎβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅで処理後ａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を、（ｉ）はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２ＡＢを解析した結果を、（ｊ）はＰ３を解析した結果を、（ｋ）はＰ３をａｌｍｏｎｄ ｍｅａｌα１，３／４−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅで処理して得られる生産物を解析した結果を表す。
第１６図は、コントロールベクター、ヒトＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミド、またはヒトＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞について、抗ＶＩＭ２糖鎖抗体（図中ＶＩＭ−２と表記）、Ｌｅｘ糖鎖抗体［７３−３０（図中７３−３０と表記）または抗ＣＤ１５抗体（図中ＣＤ１５ Ｄａｋｏと表記）］を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。黒の細線はコントロールベクターを導入したＮａｍａｌｗａ細胞、グレーの太線はヒトＦｕｃ−ＴＩＶ発現プラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞、黒の太線はヒトＦｕｃ−ＴＩＸ発現プラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞の染色結果である。

Claims (35)

  1. 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチド。
    （ａ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｂ）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５６番目から３５９番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有し、かつ糖鎖の非還元末端に存在するα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有しないポリペプチド
  2. 糖鎖の非還元末端に存在するＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性がルイスｘ糖鎖〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕およびルイスｙ糖鎖〔Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を合成する活性であり、糖鎖の非還元末端に存在するＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性がシアリルルイスｘ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ］を合成する活性である、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）から選ばれるＤＮＡ。
    （ａ）請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号３で表される塩基配列の２８０から１１９４番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｃ）配列番号３で表される塩基配列の１１５から１１９４番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｄ）配列番号４で表される塩基配列の１４５４から２３６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｅ）配列番号４で表される塩基配列の１２８９から２３６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｆ）配列番号５で表される塩基配列の４６０から１３７４番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｇ）配列番号５で表される塩基配列の２９５から１３７４番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のＤＮＡから選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有し、かつ糖鎖の非還元末端に存在するα２，３−シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースを転移する活性を有しないポリペプチドをコードするＤＮＡ
  4. 請求項３記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
  5. 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−ｍＦＴ９またはプラスミドｐＢＳ−ｈＦＴ９（Ｓ２）である、請求項４記載の組換え体ＤＮＡ。
  6. 請求項４または５記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
  7. 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物から選ばれる形質転換体である、請求項６記載の形質転換体。
  8. 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、請求項７記載の形質転換体。
  9. 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞から選ばれる動物細胞である、請求項７記載の形質転換体。
  10. 昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞から選ばれる昆虫細胞である、請求項７記載の形質転換体。
  11. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  12. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  13. 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項１２記載の製造法。
  14. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  15. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  16. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを酵素源として用い、（ａ）該酵素源、
    （ｂ）ｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、ｉｖ）それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が硫酸基で修飾された誘導体、およびｖ）それらのＮ−アセチルラクトサミン構造が糖で修飾された誘導体であり、かつ該Ｎ−アセチルラクトサミン構造中のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体から選ばれる受容基質、および
    （ｃ）グアノシン５’−二リン酸フコースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルラクトサミン構造中のＮ−アセチルグルコサミン残基にα１，３結合でフコースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
  17. 誘導体が、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３−）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、および該糖鎖を含有する複合糖質から選ばれる誘導体である、請求項１６記載の製造法。
  18. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを酵素源として用い、（ａ）該酵素源、
    （ｂ）ｉ）ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｉｉ）ラクトース構造を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質、ｉｖ）それらのラクトース構造が硫酸基で修飾された誘導体、およびｖ）それらのラクトース構造が糖で修飾された誘導体であり、かつ該ラクトース構造中のガラクトース残基にα２，３結合でシアル酸が付加していない構造を有する誘導体から選ばれる受容基質、および
    （ｃ）グアノシン５’−二リン酸フコースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のラクトース構造中のグルコース残基にα１，３結合でフコースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
  19. 誘導体が、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（６ＳＯ３−）、これらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖、および該糖鎖を含有する複合糖質から選ばれる誘導体である、請求項１８記載の製造法。
  20. 請求項７記載の微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体から選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にフコースがα１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  21. 請求項７記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、フコースがα１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  22. 請求項７記載のトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、フコースがα１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン残基またはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  23. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項１６〜２２のいずれか一つに記載の製造法。
  24. 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２１記載の製造法。
  25. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
  26. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡの有する塩基配列中の連続した１０〜５０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドの誘導体オリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法であって、誘導体オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドから選ばれる誘導体オリゴヌクレオチドである、前記方法。
  27. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを認識する抗体。
  28. 請求項２７記載の抗体を用いる、請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドの免疫学的検出法。
  29. 請求項２７記載の抗体を用い、請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
  30. 請求項２７記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
  31. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法。
  32. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、抗ルイスｘ抗体または抗ルイスｙ抗体を用い、ルイスｘ糖鎖含量またはルイスｙ糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
  33. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項２７記載の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
  34. 請求項１および２記載のポリペプチドから選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
  35. ノックアウト非ヒト動物がマウスである、請求項３４記載のノックアウト非ヒト動物。
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