JP4481260B2

JP4481260B2 - Antibody binding peptide

Info

Publication number: JP4481260B2
Application number: JP2006072133A
Authority: JP
Inventors: 壮一守川; 慎一吉田; 雄二大窪
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2026-03-16
Also published as: JP2007244285A

Description

本発明は、ヒトＩｇＧ抗体と結合する新規なポリペプチドに関する。また、本発明は、該ポリペプチドを担持させた吸着材料に関する。また、本発明は、該吸着材料を用いたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換細胞、該ポリペプチドの製造方法に関する。 The present invention relates to novel polypeptides that bind to human IgG antibodies. The present invention also relates to an adsorbing material carrying the polypeptide. The present invention also relates to a method for separating and purifying human IgG antibody and IgG antibody derivative using the adsorbing material. The present invention also relates to DNA encoding the polypeptide, a vector having the DNA, a transformed cell transformed with the vector, and a method for producing the polypeptide.

プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）より見出されたプロテインＡ蛋白質（以下、ＳｐＡ蛋白質と称する）であり、ヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を持つ。プロテインＡ様物質（以下、ＳｐＡ様物質と称する）は、ＳｐＡ蛋白質を断片化したポリペプチド、ＳｐＡ蛋白質の変異体、該ポリペプチドの変異体、およびそれらを化学修飾した物質を含むものである。 Protein A is a protein A protein (hereinafter referred to as SpA protein) found from the bacterium Staphylococcus aureus and has a property of binding to a human IgG antibody. The protein A-like substance (hereinafter referred to as SpA-like substance) includes a polypeptide obtained by fragmenting the SpA protein, a variant of the SpA protein, a variant of the polypeptide, and a substance obtained by chemically modifying them.

ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法として、ＳｐＡ様物質を担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が知られている（特許文献１（プロテインＡ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物）、特許文献２（アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド））。該方法により分離精製されたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体は、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として、産業利用されている。 As a method for separating and purifying human IgG antibodies and IgG antibody derivatives, an affinity column chromatography purification method using an adsorbent carrying a SpA-like substance is known (Patent Document 1 (Gene of Protein A-like substance and The gene-containing microorganism), Patent Document 2 (affinity separation method and ligand used therein)). Human IgG antibodies and IgG antibody derivatives separated and purified by this method are industrially used as pharmaceuticals, analytical reagents or research reagents.

ＳｐＡ様物質がヒトＩｇＧ抗体と結合した複合体分子の立体構造は明らかにされており、ＳｐＡ様物質分子の一部分である２つのα−ヘリックス構造部分とヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ鎖構造部分とが特異的に結合することが知られている（非特許文献１）。ヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ鎖構造部分は、種々知られているＩｇＧ抗体サブクラスの間でアミノ酸配列の差が少ない部分である。そのため、Ｆｃ鎖構造部分を特異的に認識するＳｐＡ様物質は、さまざまなサブクラスを持つＩｇＧ抗体を吸着、分離精製するためのリガンド分子として、優れた汎用性を持つ。 The three-dimensional structure of the complex molecule in which the SpA-like substance is bound to the human IgG antibody has been elucidated. The two α-helix structure parts that are part of the SpA-like substance molecule and the Fc chain structure part of the human IgG antibody molecule It is known to bind specifically (Non-patent Document 1). The Fc chain structure portion of the human IgG antibody molecule is a portion having a small difference in amino acid sequence between various known IgG antibody subclasses. Therefore, the SpA-like substance that specifically recognizes the Fc chain structure portion has excellent versatility as a ligand molecule for adsorbing, separating and purifying IgG antibodies having various subclasses.

産業上の利用性をさらに高めるべく、野生型ＳｐＡ蛋白質のアミノ酸配列にさまざまな変異を加えた、ＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分を特異的に認識する種々のＳｐＡ様物質が知られている（特許文献２、非特許文献２〜４）。しかしながら、公知のＳｐＡ様物質は野生型ＳｐＡ蛋白質のアミノ酸配列を変異させることによって誘導されたポリペプチドのみである。野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有するポリペプチドは知られていない。
特開昭５９−１１３８９０号公報特表２００２−５２７１０７号公報Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８１年、２０巻、２３６１−２３７０頁Ｂｒａｉｓｔｅｄ、Ａ．Ｃ．＆Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、５６８８−５６９２頁Ｌｉ、Ｒ．ｅｔ．ａｌ．、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．、１９９７年、１６巻、１９０−１９５頁Ｌｉｎｈｕｌｔ、Ｍ．ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００４年、５５巻、４０７−４１６頁 Various SpA-like substances that specifically recognize the Fc chain structure part of IgG antibodies, in which various mutations are added to the amino acid sequence of the wild-type SpA protein in order to further increase industrial utility, are known (patents) Document 2, Non-Patent Documents 2-4). However, known SpA-like substances are only polypeptides derived by mutating the amino acid sequence of the wild-type SpA protein. A polypeptide derived from a protein other than the wild-type SpA protein and having a property of specifically binding to the Fc chain structure portion of the human IgG antibody is not known.
JP 59-1113890 A Japanese translation of PCT publication No. 2002-527107 Deisenhofer, J. et al. , Biochemistry, 1981, 20: 2361-2370 Braisted, A.M. C. & Wells, J.A. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5688-5692. Li, R.R. et. al. Nature Biotech. 1997, 16: 190-195 Linhult, M.M. et. al. Proteins, 2004, 55, 407-416.

本発明は、野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体と特異的に結合する性質を有する、プロテインＡ様の新規なポリペプチドを提供する。さらに本発明は、該ポリペプチドを吸着リガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧ抗体吸着剤、ならびに該吸着剤を用いてＩｇＧ抗体を分離除去または分離精製する方法を提供する。さらに本発明は該ポリペプチドを形質転換細胞を用いて生産する方法を提供する。 The present invention provides a novel protein A-like polypeptide that is derived from a protein other than the wild-type SpA protein and has a property of specifically binding to a human IgG antibody. Furthermore, the present invention provides an IgG antibody adsorbent characterized by using the polypeptide as an adsorbing ligand, and a method for separating or removing IgG antibodies using the adsorbent. Furthermore, the present invention provides a method for producing the polypeptide using transformed cells.

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、蛋白質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、数多くのポリペプチドを分子設計し、形質転換細胞から取得し、該ポリペプチドの物性を比較検討することにより、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２において単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより得られたポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号２、３または４で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して７０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、前記いずれかのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチド配列単位（１ドメイン単位）を１個以上１０個以下だけ含むポリペプチド（好適には、前記ドメイン単位２〜１０個を共有結合にて融合させたポリペプチド）であって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とする融合ポリペプチドに関する。さらに本発明は、該ポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするヒトＩｇＧ抗体吸着材料、および該吸着材料を用いることを特徴とするヒトＩｇＧ抗体を分離精製する方法に関する。さらに本発明は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換細胞、および該形質転換細胞を用いた前記ポリペプチドの製造方法に関する。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have designed a number of polypeptides using protein engineering techniques and genetic engineering techniques, obtained them from transformed cells, and compared the physical properties of the polypeptides. By studying, the present invention has been completed. That is, the present invention relates to the amino acid residue site of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, Ala-3, Met-7, His-8, Ser-9, Arg-11, Leu-12, Glu-15, Ala-25. A polypeptide obtained by substituting, inserting or deleting one or a plurality of amino acids in Val-28, Ser-32, or a combination thereof, wherein the polypeptide binds to a human IgG antibody . Furthermore, the present invention relates to a polypeptide that binds to a human IgG antibody represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4. Furthermore, the present invention relates to a polypeptide having a sequence homology of 70% or more with respect to the polypeptide represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, wherein the polypeptide binds to a human IgG antibody. . Furthermore, the present invention is a polypeptide in which 1 to 10 amino acid residues are covalently bonded to the N-terminus, C-terminus or amino acid side chain of any of the above polypeptides, and is characterized by binding to a human IgG antibody. The polypeptide relates to. Furthermore, the present invention provides a polypeptide comprising 1 to 10 polypeptide sequence units (one domain unit) represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4 (preferably sharing 2 to 10 domain units). And a fusion polypeptide characterized by binding to a human IgG antibody. Furthermore, the present invention relates to a human IgG antibody adsorbing material characterized by immobilizing the polypeptide on a water-insoluble carrier, and a method for separating and purifying human IgG antibody using the adsorbing material. The present invention further relates to a DNA encoding the polypeptide, a vector having the DNA, a transformed cell transformed with the vector, and a method for producing the polypeptide using the transformed cell.

本発明のその他の特徴およびそれらの利点は、以下の実施形態および図面によって明らかにされる。 Other features of the present invention and their advantages will become apparent from the following embodiments and drawings.

本発明は、野生型ＳｐＡ蛋白質あるいはその断片ペプチドとはアミノ酸配列上の相同性が異なり、それが故に野生型ＳｐＡ蛋白質あるいはその断片ペプチドとは種々の物理的ないし化学的物性が異なる、ヒトＩｇＧ抗体と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドを水不溶性担体に固定化した吸着材料を用いることにより、ヒトＩｇＧ抗体または種々のＩｇＧ抗体誘導体を分離精製することが可能となる。また本発明の形質転換細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを製造することが可能となる。 The present invention relates to a human IgG antibody having a different amino acid sequence homology from a wild-type SpA protein or a fragment peptide thereof, and hence different physical or chemical properties from the wild-type SpA protein or a fragment peptide thereof. A novel polypeptide having the property of specifically binding to is provided. By using an adsorbing material in which the polypeptide of the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier, it is possible to separate and purify human IgG antibodies or various IgG antibody derivatives. Moreover, the polypeptide of the present invention can be produced by using the transformed cell of the present invention.

以下、実施形態を用いて本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail using embodiments.

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。 In the present specification, amino acids, peptides, and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below. Unless otherwise indicated, the amino acid residue sequences of peptides and proteins are expressed from the N-terminus to the C-terminus from the left end to the right end, and the N-terminus is number 1.
A = Ala = alanine, C = Cys = cysteine,
D = Asp = aspartic acid, E = Glu = glutamic acid,
F = Phe = phenylalanine, G = Gly = glycine,
H = His = histidine, I = Ile = isoleucine,
K = Lys = Lysine, L = Leu = Leucine,
M = Met = methionine, N = Asn = asparagine,
P = Pro = proline, Q = Gln = glutamine,
R = Arg = arginine, S = Ser = serine,
T = Thr = threonine, V = Val = valine,
W = Trp = tryptophan, Y = Tyr = tyrosine,
B = Asx = Asp or Asn, Z = Glx = Glu or Gln,
X = Xaa = any amino acid.

本明細書において、「変異体」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。 As used herein, the term “variant” refers to a polypeptide having an amino acid sequence in which at least one amino acid contained in the amino acid sequence of the polypeptide is substituted, added, deleted, or modified.

本明細書において、「ドメイン」とは、蛋白質およびポリペプチドの高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なアミノ酸高分子の単位をいう。 In the present specification, a “domain” is a unit in a higher-order structure of proteins and polypeptides, and is composed of a sequence of several tens to several hundreds of amino acid residues, and has some physicochemical or biochemical function. A unit of amino acid polymer sufficient for expression.

本明細書において、「ＩｇＧ抗体誘導体」とは、ヒトＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＦａｂ鎖部分とを融合させたキメラＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のいくつかのＣドメイン部分と他生物種ＩｇＧ抗体のいくつかのＶドメイン部分とを融合させたキメラＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分を除いた残余の部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化ＩｇＧ抗体、およびそれらに化学的修飾を加えた蛋白質であって、Ｆｃドメイン部分を保持する蛋白質をいう。 As used herein, “IgG antibody derivative” refers to a human IgG antibody, a chimeric IgG antibody in which the Fc chain portion of a human IgG antibody and the Fab chain portion of another species IgG antibody are fused, A chimeric IgG antibody obtained by fusing a C domain portion with some V domain portions of another species IgG antibody, and a remaining portion excluding the CDR portion of a human IgG antibody and the CDR portion of the other species IgG antibody are fused. Humanized IgG antibodies, and proteins obtained by chemically modifying them, and proteins that retain the Fc domain portion.

１．アミノ酸の変異
以下、所望の変異体もしくはポリペプチドを取得するための、タンパク質のアミノ酸の変異について説明する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。 1. Amino acid mutations Hereinafter, protein amino acid mutations for obtaining a desired mutant or polypeptide will be described. Methods for performing amino acid substitution and the like include, but are not limited to, changing the codons of a DNA sequence encoding an amino acid in a technique utilizing chemical synthesis or genetic engineering.

本発明者らは、野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドの設計を、立体構造のデータを利用した種々の検討およびモデリングによる分析により実施した。これらの設計作業の結果として、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体に結合し得る種々のポリペプチドを考案した。考案したポリペプチドを遺伝子工学的手法により数多く取得し、それらポリペプチドの特徴を種々の科学的手法を用いて解析したところ、いくつかのポリペプチドにヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を見出した。 The present inventors utilized a three-dimensional structure data to design a novel polypeptide derived from a protein other than the wild-type SpA protein and having the property of specifically binding to the Fc chain structure portion of a human IgG antibody. It was carried out by various studies and analysis by modeling. As a result of these design work, various polypeptides have been devised that can bind to human IgG antibodies or IgG antibody derivatives. Many of the devised polypeptides were obtained by genetic engineering techniques, and the characteristics of these polypeptides were analyzed using various scientific techniques. As a result, they found that some polypeptides bind to human IgG antibodies.

２．ヒトＩｇＧ抗体結合能を有するポリペプチドの取得
前記設計による考案および実施形態を具体的に以下に示す。配列番号１で示されるポリペプチドは、ウイルス被覆蛋白質の一種であり、その立体構造情報は公開データベースであるプロテイン・データ・バンク（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）に、コード番号１Ｒ４Ｇとして登録公開されている。ＳｐＡ蛋白質ＺドメインとＩｇＧ抗体Ｆｃドメインとの複合体立体構造情報は、同データベースにコード番号１ＦＣ２として登録公開されている。 2. Acquisition of polypeptide having human IgG antibody-binding ability The device and embodiment of the above-mentioned design are specifically shown below. The polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 is a kind of virus coat protein, and its three-dimensional structure information is registered and published as a code number 1R4G in a protein data bank (Protein Data Bank) which is a public database. The three-dimensional structure information of the complex of the SpA protein Z domain and the IgG antibody Fc domain is registered and released in the same database as code number 1FC2.

配列番号１で示されるポリペプチドは５８残基であり、α−ヘリックス３個からなる高次構造を持つ。一方、上記ＳｐＡ蛋白質Ｚドメインは４０残基からなるポリペプチドであり、配列番号１で示されるポリペプチドとアミノ酸残基数が異なるものの、α−ヘリックス３個からなる高次構造を持つ。それら２種のポリペプチド間の配列相同性を、後述するプログラムＢＬＡＳＴにより計算したところ、該ポリペプチド間には相同性は見られない（相同性１％未満）という結果となった。すなわち、ＳｐＡ蛋白質Ｚドメインと配列番号１で示されるポリペプチドは全く異なる配列を持つと考えられた。前記した立体構造情報を種々比較検討することにより、配列番号１で示されるポリペプチドに上記ＩｇＧ抗体Ｆｃ部分との結合能を付与すべく、ポリペプチド変異体の分子設計を行った。分子設計により考案された種々のポリペプチドを遺伝子工学的手法により取得し、いくつかのポリペプチドにヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を見出した。すなわち、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２において単数または複数のアミノ酸を置換することにより、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体のＦｃ部分に結合しうるポリペプチドを得ることができる。上記「複数のアミノ酸」の数は特に限定されないが、２個、３個、４個、５個、好ましくは６個以上である。その他の実施形態として、上記したアミノ酸の置換に限らず、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２のいずれかの部位について、単数または複数のアミノ酸を、挿入もしくは欠失、または、それらいずれかの部位において、アミノ酸の置換、挿入、欠失を組合わせてもよい。 The polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 has 58 residues and has a higher order structure consisting of 3 α-helices. On the other hand, the SpA protein Z domain is a polypeptide consisting of 40 residues and has a higher order structure consisting of 3 α-helices although the number of amino acid residues is different from that of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1. When the sequence homology between these two polypeptides was calculated by the program BLAST described later, no homology was found between the polypeptides (less than 1% homology). That is, it was considered that the SpA protein Z domain and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 have completely different sequences. By conducting various comparative studies on the above-mentioned three-dimensional structure information, a polypeptide variant was designed to give the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 the ability to bind to the IgG antibody Fc portion. Various polypeptides devised by molecular design were obtained by genetic engineering techniques, and the properties of binding to human IgG antibodies to some polypeptides were found. That is, the amino acid residue site of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, Ala-3, Met-7, His-8, Ser-9, Arg-11, Leu-12, Glu-15, Ala-25, Val- 28. By substituting one or more amino acids in Ser-32, a polypeptide capable of binding to the Fc portion of a human IgG antibody or IgG antibody derivative can be obtained. The number of the “plural amino acids” is not particularly limited, but is 2, 3, 4, 5, and preferably 6 or more. As other embodiments, not only the amino acid substitution described above, but also the amino acid residue site of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, Ala-3, Met-7, His-8, Ser-9, Arg-11, Leu -12, Glu-15, Ala-25, Val-28, Ser-32, one or more amino acids are inserted or deleted, or substitution of amino acids at any of these sites, Insertion and deletion may be combined.

さらに、より好ましい実施形態としては、配列番号２、３、４で示されるポリペプチドが挙げられる。別の実施形態としては、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して７０％以上（好ましくは、８０％以上、より好ましくは９０％以上）の配列相同性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜４で示されるポリペプチドに対して十分な配列相同性を有するポリペプチドに関しても、本発明によるヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を示すことが期待できるためである。配列相同性は、プログラムＦＡＳＴＡ（ＰｅｒａｓｏｎＷ．Ｒ．ｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳｔｅｐｈｅｎＦ．ｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。 Furthermore, as more preferable embodiment, polypeptide shown by sequence number 2, 3, and 4 is mentioned. In another embodiment, a polypeptide having a sequence homology of 70% or more (preferably 80% or more, more preferably 90% or more) to the polypeptide represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 is provided. Can be mentioned. This is because a polypeptide having sufficient sequence homology to the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 can be expected to show the ability to bind to human IgG antibodies and IgG antibody derivatives according to the present invention. Sequence homology is determined by the program FASTA (Perason WR et al., Genomics, 46, 24-36 (1997)) and BLAST (Altschul, Stephen F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 ( 1997))) and can be determined by amino acid sequence homology analysis.

３．リンカー
本発明の別の実施形態としては、それらのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、それら付与したアミノ酸残基が該ポリペプチド間のリンカーとして、あるいは担持材料（担体）とのリンカーとして利用できるポリペプチドが挙げられる。好ましくは、ポリペプチド間のリンカーとしてはＩｇＧ抗体との相互作用が少ないＧｌｙ、Ａｌａ等が挙げられ、担体とのリンカーとしてはチオール基を持つＣｙｓ、アミノ基を持つＬｙｓ、カルボキシル基を持つＧｌｕ、Ａｓｐ等が挙げられ、さらにそれらのアミノ酸残基を複数個利用することもできる。 3. Linker Another embodiment of the present invention is a polypeptide in which 1 to 10 amino acid residues are covalently bonded to the N-terminal, C-terminal or amino acid side chain of these polypeptides, and the amino acid residues provided Are polypeptides that can be used as a linker between the polypeptides or as a linker with a support material (carrier). Preferably, the linker between polypeptides includes Gly, Ala, etc. with little interaction with IgG antibody, and the linker with the carrier is Cys having a thiol group, Lys having an amino group, Glu having a carboxyl group, Asp and the like can be mentioned, and a plurality of these amino acid residues can also be used.

４．融合ポリペプチド
さらに別の実施形態としては、それらのポリペプチド単位２〜１０個を共有結合にて融合させ、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を高めた融合ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチド単位２〜５個および前記した各種のリンカー部分を含む融合ポリペプチドが挙げられる。 4). Still another embodiment of the fusion polypeptide is a fusion polypeptide in which 2 to 10 of these polypeptide units are covalently fused to increase the binding ability to human IgG antibodies and IgG antibody derivatives. Preferably, fusion polypeptides containing 2 to 5 polypeptide units of the present invention and the various linker moieties described above are included.

５．ヒトＩｇＧ抗体等の吸着材料
また本発明の一つの実施態様としては、上記方法で得られたポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体の吸着材料、またはＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料を提供しうる。さらに、その吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体を分離生成する方法、またはＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法を提供しうる。 5. An adsorbing material such as a human IgG antibody, or an embodiment of the present invention, wherein the polypeptide obtained by the above method is immobilized on a water-insoluble carrier, or an adsorbing material for a human IgG antibody, or an IgG antibody Derivative adsorbent materials may be provided. Furthermore, it is possible to provide a method for separating and producing a human IgG antibody or a method for separating and purifying an IgG antibody derivative, characterized by using the adsorbing material.

本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットＣ２５０Ｌ等を例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本吸着材料の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。 Examples of the water-insoluble carrier used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cross-linked dextran, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by a combination thereof. Commercially available products include GCL2000, a porous cellulose gel, Sephacryl S-1000 obtained by covalently crosslinking allyldextran and methylenebisacrylamide, Toyopearl, an acrylate-based carrier, Sepharose CL4B, an agarose-based crosslinked carrier, and epoxy group. For example, Eupergite C250L, which is polymethacrylamide activated by the above, can be exemplified. However, the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers and activated carriers. Further, the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the present adsorbent material, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size. The form of the carrier can be any of beads, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.

本発明のポリペプチドを前記担体への固定化する方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化あるいは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。 A method for immobilizing the polypeptide of the present invention on the carrier is not particularly limited, but a method generally employed when immobilizing a protein or peptide on a carrier is exemplified. A compound that activates the carrier by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, etc., or introduces a reactive functional group on the surface of the carrier and immobilizes it as a ligand And a method of reaction and immobilization with a carrier, and addition of a condensing reagent such as carbodiimide or a reagent having multiple functional groups in the molecule such as glutaraldehyde in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists. Examples of the immobilization method include condensation and crosslinking.

６．ヒトＩｇＧ抗体等の精製法
本発明のポリペプチド結合担体を吸着材料として、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。本発明の一実施形態としての精製法は、ＳｐＡ様物質を担持させた吸着材料を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順（特許文献２に記載の手法に基づいて当業者が実施可能な手順）により達成することができる。すなわち、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムに通過させ、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティ・カラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体はカラム内の本発明の吸着材料に吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性もしくはアルカリ性の純粋な緩衝液をカラムに通過させ、所望のヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムは、強酸性もしくは強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。 6). Purification method of human IgG antibody, etc. The human IgG antibody or IgG antibody derivative can be separated and purified by affinity column chromatography purification method using the polypeptide binding carrier of the present invention as an adsorbing material. The purification method as one embodiment of the present invention is a procedure according to the affinity column chromatography purification method using an adsorbent material carrying a SpA-like substance (can be carried out by those skilled in the art based on the method described in Patent Document 2). Simple procedure). That is, after adjusting a buffer containing human IgG antibody or IgG antibody derivative to be neutral, the solution is passed through an affinity column packed with the adsorbing material of the present invention, and human IgG antibody or IgG antibody derivative To adsorb. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the desired human IgG antibody or IgG antibody derivative is adsorbed on the adsorption material of the present invention in the column. High purity purification is then achieved by passing a pure acidic or alkaline buffer adjusted to the appropriate pH through the column and eluting the desired human IgG antibody or IgG antibody derivative. The affinity column packed with the adsorbing material of the present invention can be reused by passing it through a pure buffer solution having strong acidity or strong alkalinity.

７．ヌクレオチド配列、融合蛋白質等
さらに本発明の一つの実施態様としては、前記方法により得られたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を一つ又はそれ以上有する組み換えＤＮＡ、またはその組み換えＤＮＡがプラスミド又はファージである組み換えＤＮＡ、またはその組み換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。 7). The nucleotide sequence, as the one embodiment of such invention further fusion protein, said nucleotide sequence encoding a polypeptide obtained by the method, recombinant DNA having the nucleotide sequence of one or more or a recombinant DNA plasmid, Alternatively, a recombinant DNA that is a phage, or a microorganism or cell containing at least one of the recombinant DNA can be obtained.

また、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドと細胞での蛋白質発現を補助する作用のある公知の蛋白質との融合蛋白質として取得することができる。すなわち、本発明のポリペプチドと該蛋白質との融合蛋白質をコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。該蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらの蛋白質に限定されるものではない。 In addition, the polypeptide of the present invention can be obtained as a fusion protein of the polypeptide and a known protein having an action of assisting protein expression in cells. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion protein of the polypeptide of the present invention and the protein can be obtained. Examples of the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.

８．変異の導入方法
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、ポリペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。 8). Method of introducing mutations Site-specific mutations for modifying the DNA encoding the polypeptide of the present invention should be introduced using recombinant DNA techniques, PCR methods, etc. well-known to those skilled in the art as follows. Can do. That is, the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed when, for example, appropriate restriction enzyme recognition sequences exist on both sides of the target site where mutation is desired in the gene encoding the polypeptide of the present invention. Cleavage the restriction enzyme recognition sequence with the restriction enzyme, remove the region containing the site where mutation is desired, and insert the DNA fragment mutated only into the target site by chemical synthesis or the like. Can do. In addition, the introduction of site-specific mutation by PCR is performed, for example, using a double-stranded plasmid encoding a polypeptide as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + and − chains. This can be done by the double primer method.

９．ベクター・形質展開細胞・ポリペプチドの製造方法
本発明のベクターは、前述したポリペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２（株式会社ニッポンジーン）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（株式会社ニッポンジーン）等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３（ストラタジーン・ジャパン株式会社）、Ｍ１３（タカラバイオ株式会社）、λｇｔ１１（株式会社ニッポンジーン）等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ＹＣｐ５０（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）、ｐＢＩ１０１（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン株式会社）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン株式会社）等をベクターとして用いることができる。 9. Vector / Transformation Cell / Polypeptide Production Method The vector of the present invention can be obtained by linking or inserting a gene encoding the above-described polypeptide into an appropriate vector. The DNA is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector. For example, when Escherichia coli is used as a host, plasmid DNA such as pBR322 (Nippon Gene Co., Ltd.), pUC18 (Takara Bio Inc.), pBluescript II (Nippon Gene Co., Ltd.), EMBL3 (Stratagene Japan Co., Ltd.), M13 ( In the case where phage DNA such as Takara Bio Inc., λgt11 (Nippon Gene Co., Ltd.) is used as a host, YEp13 (American Type Culture Collection (ATCC)), YCp50 (American Type Culture Collection (ATCC)), etc. When plant cells are used as hosts, pBI121 (Clontech Laboratories Inc.), pBI101 (Clo The tech Laboratories Inc.), etc. In the case of using animal cells as the host, can be used pcDNAI (Invitrogen Corporation), a pcDNAI / Amp (Invitrogen Corporation) or the like as a vector.

本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組み換えベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。 The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell. Examples of methods for introducing recombinant DNA into bacteria include a method using calcium ions and an electroporation method. Examples of the method for introducing the recombinant DNA into yeast include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method. Examples of methods for introducing recombinant DNA into plant cells include the Agrobacterium infection method, the particle gun method, and the polyethylene glycol method. Examples of methods for introducing recombinant DNA into animal cells include the electroporation method and the calcium phosphate method.

本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該融合蛋白質を採取し、該融合蛋白質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。 The polypeptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, producing and accumulating the polypeptide of the present invention in a culture (cultured cells or culture supernatant), and obtaining the desired polypeptide from the culture. It can be manufactured by sampling. In addition, the polypeptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, and generating and accumulating a fusion protein containing the polypeptide of the present invention in a culture (cultured cells or culture supernatant). The fusion protein can be collected from the protein, and the fusion protein can be cleaved with an appropriate protease to obtain the desired polypeptide.

本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２０〜４０℃で好気的に６〜２４時間培養することにより本発明のポリペプチドを菌体内に蓄積させ、回収する。 The method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture. Examples of the medium for culturing transformed cells obtained using bacteria such as Escherichia coli as a host include complete medium or synthetic medium such as LB medium, M9 medium and the like. In addition, the polypeptide of the present invention is accumulated in the microbial cells and collected by aerobically culturing at 20 to 40 ° C. for 6 to 24 hours.

本発明のポリペプチドの精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のポリペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。 For purification of the polypeptide of the present invention, the culture obtained by the above-described culture method is collected by centrifugation (cells are crushed with a sonicator or the like), affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration. Chromatography and the like can be performed alone or in appropriate combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target polypeptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
配列番号２をコードする遺伝子
以下の実施例１〜７では、ウイルス被覆蛋白質の一種である上記配列番号１で示されるポリペプチドに対してヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分またはＩｇＧ抗体誘導体のＦｃ部分への結合能を付与したポリペプチドの例示として、配列番号２、３、４で示される各ポリペプチドの取得方法について説明する。 Example 1
Gene encoding SEQ ID NO: 2 In Examples 1 to 7 below, human IgG antibody Fc portion or IgG antibody derivative to Fc portion of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 which is a kind of virus coat protein As an example of a polypeptide imparted with binding ability, a method for obtaining each polypeptide represented by SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 will be described.

以下の配列番号５〜８のＤＮＡは、後述するように、上記配列番号２およびそのＣ末端側にＨｉｓが６個連続する配列をコードする遺伝子のクローニングのために設計した。配列番号２のポリペプチドは、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位中、Ａｌａ−３がＰｈｅ、Ａｒｇ−１１がＰｈｅ、Ｌｅｕ−１２がＴｙｒ、Ｇｌｕ−１５がＬｅｕ、Ａｌａ−２５がＡｓｎ、Ｖａｌ−２８がＩｌｅ、にそれぞれ置換された変異体である。 The DNAs of the following SEQ ID NOs: 5 to 8 were designed for cloning of the gene encoding the above-mentioned SEQ ID NO: 2 and a sequence of 6 consecutive Hiss on the C-terminal side, as described later. In the polypeptide of SEQ ID NO: 2, Ala-3 is Phe, Arg-11 is Phe, Leu-12 is Tyr, Glu-15 is Leu, Ala-25 in the amino acid residue site of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1. Are mutants in which Asn and Val-28 are substituted with Ile, respectively.

配列番号５および６に記載の合成遺伝子３００ピコモルを混合し、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼにはＴａｋａｒａ社製ｐｙｒｏｂｅｓｔを用い、添付のバッファーとｄＮＴＰを用いた。反応液量は０．０５ｍｌとした。反応条件は９６℃５分１回、９６℃２分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを１０回とした。約１００ｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動より切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断した。 300 pmoles of the synthetic gene described in SEQ ID NOs: 5 and 6 were mixed, and an overlap PCR reaction was performed. As the polymerase, pyrobest manufactured by Takara was used, and the attached buffer and dNTP were used. The reaction volume was 0.05 ml. The reaction conditions were 96 ° C. for 5 minutes once, 96 ° C. for 2 minutes, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 10 cycles. About 100 bp of DNA was excised by agarose electrophoresis and cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII.

同様に、配列番号７および８に記載の合成遺伝子３００ピコモルを混合し、同様にオーバーラップＰＣＲ反応を行った。約１２０ｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動より切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した。 Similarly, 300 pmoles of the synthetic gene described in SEQ ID NOs: 7 and 8 were mixed, and an overlap PCR reaction was similarly performed. About 120 bp of DNA was excised by agarose electrophoresis and cleaved with restriction enzymes HindIII and EcoRI.

アマシャムファルマシア社製プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔのマルチクーニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに、オーバーラップＰＣＲ反応により得た上記２種の遺伝子をサブクローニングした。なお、プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔに挿入された遺伝子が、オーバーラップＰＣＲ反応により得た２種のＤＮＡがＨｉｎｄＩＩＩ切断サイトで結合したときに、配列番号２およびそのＣ末端側にＨｉｓが６個連続する配列をコードするように、配列番号５、６、７、８の遺伝子を設計した。また全ての制限酵素はＴａｋａｒａ社製である。前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１５は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。前記操作により作成された配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｔａｋａｒａ社製）の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。 The above two genes obtained by the overlap PCR reaction were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multi-cooling site of the plasmid vector pGEX-2T manufactured by Amersham Pharmacia. In addition, when two kinds of DNAs obtained by the overlap PCR reaction of the gene inserted into the plasmid vector pGEX-2T are combined at the HindIII cleavage site, six Hiss are consecutive on the C-terminal side of SEQ ID NO: 2. The genes of SEQ ID NOs: 5, 6, 7, and 8 were designed to encode the sequences. All restriction enzymes are manufactured by Takara. The plasmid vector pGEX-2T prepared by the above operation contains a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 15 shows the DNA sequence of the gene. Escherichia coli DH5α cells (manufactured by Takara) were transformed with pGEX-2T containing the gene encoding SEQ ID NO: 2 prepared by the above operation, and plasmid DNA was amplified and extracted by a conventional method.

（実施例２）
配列番号３をコードする遺伝子
実施例１で得た、配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを鋳型として、配列番号９および１０のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列番号２のアミノ酸配列においてＨｉｓ−８がＧｌｎに変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。 (Example 2)
Gene encoding SEQ ID NO: 3 Using pGEX-2T containing the gene encoding SEQ ID NO: 2 obtained in Example 1 as a template, using the primers of SEQ ID NOS: 9 and 10, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by the quick change method A gene encoding a mutant in which His-8 was converted to Gln was prepared.

クイックチェンジ法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従った。前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１６は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。 The quick change method followed the Stratagene protocol. The plasmid vector pGEX-2T prepared by the above operation contains a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 16 shows the DNA sequence of the gene.

実施例１と同様に、前記操作により作成された配列番号３をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。 In the same manner as in Example 1, E. coli DH5α cells were transformed with pGEX-2T containing the gene encoding SEQ ID NO: 3 prepared by the above operation, and plasmid DNA was amplified and extracted by a conventional method.

（実施例３）
配列番号４をコードする遺伝子
実施例２で得た、配列番号３をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを鋳型として、配列番号１１および１２のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列番号３のアミノ酸配列においてＭｅｔ−７がＧｌｎ、およびＳｅｒ−９がＡｓｎに変換された変異体をコードする遺伝子を作成し、さらに該遺伝子を鋳型として、配列番号１３および１４のプライマーを用い、クイックチェンジ法で前記変異体のアミノ酸配列においてＳｅｒ−３２がＬｙｓに変換された変異体、すなわち配列番号４をコードする遺伝子を作成した。 (Example 3)
Gene encoding SEQ ID NO: 4 Using pGEX-2T containing the gene encoding SEQ ID NO: 3 obtained in Example 2 as a template, using the primers of SEQ ID NOS: 11 and 12, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 by the quick change method A gene encoding a mutant in which Met-7 is converted to Gln and Ser-9 to Asn is prepared, and the mutation is performed by a quick change method using the gene as a template and primers of SEQ ID NOs: 13 and 14. A mutant in which Ser-32 was converted to Lys in the body amino acid sequence, that is, a gene encoding SEQ ID NO: 4 was prepared.

前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１７は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。 The plasmid vector pGEX-2T prepared by the above operation contains the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 17 shows the DNA sequence of the gene.

実施例１と同様に、前記操作により作成された配列番号４をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。 In the same manner as in Example 1, E. coli DH5α cells were transformed with pGEX-2T containing the gene encoding SEQ ID NO: 4 prepared by the above operation, and plasmid DNA was amplified and extracted by a conventional method.

（実施例４）
遺伝子の配列確認
実施例１〜３で作成した変異体遺伝子全てについて、ＤＮＡ塩基配列確認をＰＥＲＩＫＩＮＥＬＭＥＲＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。 Example 4
Confirmation of gene sequence For all the mutant genes prepared in Examples 1 to 3, DNA nucleotide sequence confirmation was performed using a DNA sequencer 310 Genetic Analyzer manufactured by PERIKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS.

（実施例５）
遺伝子の発現
得られた上記の配列番号２，３または４のアミノ酸配列をコードする遺伝子のいずれかを含むｐＧＥＸ−２Ｔを導入したＤＨ５α細胞をそれぞれ、アンピシリンを含むＬＢ培地にて終夜培養した。本培養液１０ｍＬを２×ＹＴ培地（１Ｌ、アンピシリン含有）に接種し、３７℃にて２時間培養した。その後、培養温度を２５℃に下げ、下げてからおよそ１時間後に、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトシド）を添加し、２５℃にて８時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）を含むＰＢＳ緩衝液２５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−２Ｔベクターマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合蛋白質として発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、上清画分すべてに、分子量３万５千の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる蛋白質発現を認めた。 (Example 5)
Expression of the gene Each of the DH5α cells into which pGEX-2T containing any of the above-described genes encoding the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, 3 or 4 was introduced was cultured overnight in LB medium containing ampicillin. 10 mL of the main culture was inoculated into 2 × YT medium (1 L, containing ampicillin) and cultured at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the culture temperature was lowered to 25 ° C., and approximately 1 hour after the temperature was lowered, IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside) was added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was continued at 25 ° C. for 8 hours. did. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation and resuspended in 25 mL of PBS buffer containing PMSF (1 mM), EDTA (0.5 mM), and DTT (1 mM). The cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction and an insoluble fraction. When a gene is introduced into the pGEX-2T vector multicloning site, GST is expressed as a fusion protein attached to the N-terminus. When each fraction was analyzed by SDS electrophoresis, protein expression considered to be induced by IPTG was observed in all the supernatant fractions at a molecular weight of 35,000.

（実施例６）
ＧＳＴ融合蛋白質でのポリペプチドの精製
実施例５において、ＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる各蛋白質は、Ｎ末端側にＧＳＴが付与し、さらにＣ末端側にＨｉｓが６個続いた配列が付与された形で発現される。上記のそれぞれの上清画分をアマシャムファルマシア社製ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムに添加し、ＰＢＳ緩衝液にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭＧｌｕｔａｈｉｏｎｅ、ｐＨ８．０）にて目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分を、アマシャムファルマシア社製ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムに添加し、洗浄用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄、続いて、溶出用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、２００ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にて、目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分のそれぞれを、ＰＢＳ緩衝液にて透析し、ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、目的のＧＳＴ融合蛋白質が高純度（９５％以上）で存在することを確認した。 (Example 6)
Purification of polypeptide with GST fusion protein In Example 5, each protein considered to be induced by IPTG was given GST on the N-terminal side and further a sequence of 6 Hiss on the C-terminal side. Expressed in the form. Each of the above supernatant fractions was added to a Glutathione Sepharose Fast Flow column manufactured by Amersham Pharmacia, and the column was washed with PBS buffer, followed by elution buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM Glutaione, pH 8.0). The target GST fusion protein was eluted and fractionated. These elution fractions are added to a Ni Sepharose Fast Flow column manufactured by Amersham Pharmacia, and the column is washed with a washing buffer solution (25 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 7.4), followed by elution. The target GST fusion protein was eluted and fractionated with a buffer solution (25 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole, pH 7.4). Each of these elution fractions was dialyzed with PBS buffer and analyzed by SDS electrophoresis. As a result, it was confirmed that the target GST fusion protein was present in high purity (95% or more).

（実施例７）
ポリペプチドの精製
ｐＧＥＸ−２Ｔベクターマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＴｈｒｏｍｂｉｎプロテアーゼでＧＳＴを切断することが可能な部位も導入される。上記の各ＧＳＴ融合蛋白質溶液のそれぞれに、アマシャムファルマシア社製Ｔｈｒｏｍｂｉｎを、ＧＳＴ融合蛋白質１ｍｇあたり１０Ｕｎｉｔ添加し、室温にて１８時間インキュベートした。これらの溶液をアマシャムファルマシア社製ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムに添加し、素通り画分を回収した。これらの溶出画分のそれぞれを、アマシャムファルマシア社製ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムに添加し、洗浄用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄、続いて、溶出緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、２００ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にて、目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分を、ＰＢＳ緩衝液にて透析し、トリシン‐ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、分子量７千５百の位置に目的のポリペプチドと考えられるバンドを確認した。 (Example 7)
Purification of polypeptide When a gene is introduced into the pGEX-2T vector multicloning site, a site capable of cleaving GST with Thrombin protease is also introduced. To each of the GST fusion protein solutions, 10 units of Thrombin manufactured by Amersham Pharmacia was added per 1 mg of the GST fusion protein, and the mixture was incubated at room temperature for 18 hours. These solutions were added to a Glutathione Sepharose Fast Flow column manufactured by Amersham Pharmacia, and the flow-through fraction was collected. Each of these elution fractions is added to a Ni Sepharose Fast Flow column manufactured by Amersham Pharmacia, and the column is washed with a washing buffer solution (25 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 7.4). The target GST fusion protein was eluted and fractionated with an elution buffer (25 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole, pH 7.4). These elution fractions were dialyzed with PBS buffer and analyzed by tricine-SDS electrophoresis. As a result, a band considered to be the target polypeptide was confirmed at a molecular weight of 75,500.

（実施例８）
ＢＩＡＣＯＲＥによるヒトＩｇＧ抗体への結合能の検討
表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア社製）を用いて、取得した各ポリペプチドのヒトＩｇＧ抗体への結合を検討した。ヒトＩｇＧ抗体をビアコア社製ＣＭ４チップに固定し、ＧＳＴ融合ポリペプチドをチップ上に流す実験系を試みた。リガンドの固定化は、カップリング剤としてＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）およびＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を用い、およびブロッキング剤としてＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いてアミンカップリング法で行った。シグマ社製ヒトＩｇＧ抗体をＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて１０００倍希釈した溶液を用いて、ビアコア社プロトコルに従ってヒトＩｇＧ抗体を固定化した。また、シグマ社製ヒト血清アルブミンをＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて１０００倍希釈した溶液を用いて、ビアコア社プロトコルに従ってヒト血清アルブミンを別のフローセルに固定化し、リファレンス・セルとした。測定時のランニング緩衝液およびＧＳＴ融合ポリペプチドの希釈液として、ＰＢＳ緩衝液に終濃度０．００５％となるようＰ−２０（ビアコア社製）を加えた緩衝液を用いた。取得した各種ＧＳＴ融合ポリペプチドを１０μＭになるよう調製し、流速２０μＬ／分で２分間添加した後、２分間にわたって測定物の解離を観察した。測定は２５℃で行った。結合反応曲線を解析するソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア社製)を用いて、結合反応曲線から結合速度定数Ｋａｓｓ、並びに解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとヒトＩｇＧ抗体の結合反応における解離定数Ｋ_D（Ｍ）を算出した。解離定数Ｋ_Dは、Ｋ_D＝Ｋｄｉｓｓ／Ｋａｓｓで計算される。 (Example 8)
Examination of binding ability to human IgG antibody by BIACORE Using biosensor Biacore 3000 (manufactured by Biacore) using surface plasmon resonance, binding of each obtained polypeptide to human IgG antibody was examined. An experiment system was attempted in which a human IgG antibody was immobilized on a Biacore CM4 chip and a GST fusion polypeptide was allowed to flow on the chip. Ligand immobilization was carried out by the amine coupling method using N-ethyl-N- (3-diethylaminepropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) as a coupling agent and Ethanolamine as a blocking agent. . Human IgG antibody manufactured by dissolving Sigma's human IgG antibody to 10 mg / mL with PBS buffer and further diluted 1000-fold with 10 mM acetate buffer (pH 5.0) according to Biacore protocol Was fixed. Further, human serum albumin manufactured by Sigma was dissolved in PBS buffer to 10 mg / mL, and further diluted 1000 times with 10 mM acetate buffer (pH 5.0), and human serum albumin was prepared according to Biacore protocol. Serum albumin was immobilized on a separate flow cell to serve as a reference cell. As a running buffer at the time of measurement and a diluted solution of the GST fusion polypeptide, a buffer solution obtained by adding P-20 (manufactured by Biacore) to a PBS buffer solution to a final concentration of 0.005% was used. The obtained various GST fusion polypeptides were prepared to 10 μM and added at a flow rate of 20 μL / min for 2 minutes, and then the dissociation of the measured substance was observed for 2 minutes. The measurement was performed at 25 ° C. Using the software BIA evaluation (Biacore) that analyzes the binding reaction curve, the binding rate constant Kass and the dissociation rate constant Kdis are calculated from the binding reaction curve, and from this in the binding reaction of various GST fusion polypeptides and human IgG antibodies The dissociation constant K _D (M) was calculated. The dissociation constant K _D is calculated as K _D = Kdis / Kass.

各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとヒトＩｇＧ抗体との間の、ＢＩＡＣＯＲＥ測定における結合反応曲線を図１に示した。図１において、図上方より順に、配列番号４、配列番号３、および配列番号２それぞれのＧＳＴ融合ポリペプチドが示す結合反応曲線を示した。図１において、縦軸は本発明のポリペプチドを担持したセルの測定値からリファレンス・セルの測定値を差し引いた値としてのレゾナンスユニット、横軸は時間を示した。 The binding reaction curve in BIACORE measurement between various GST fusion polypeptides and human IgG antibodies is shown in FIG. In FIG. 1, the binding reaction curves shown by the GST fusion polypeptides of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 are shown in order from the top of the figure. In FIG. 1, the vertical axis represents the resonance unit as a value obtained by subtracting the measured value of the reference cell from the measured value of the cell carrying the polypeptide of the present invention, and the horizontal axis represents time.

結合反応曲線の解析により得られたヒトＩｇＧ抗体との解離定数はそれぞれ、配列番号２のＧＳＴ融合ポリペプチドが１．７６×１０^-5Ｍ、配列番号３のＧＳＴ融合ポリペプチドが２．３５×１０^-5Ｍ、配列番号４のＧＳＴ融合ポリペプチドが１．７７×１０^-6Ｍであった。ＧＳＴ蛋白質にはヒトＩｇＧ抗体と結合する活性は見られなかった（図示せず）。これらの結果から、配列番号２〜４で示されるポリペプチドには、ヒトＩｇＧ抗体と結合する活性があることが示された。 The dissociation constants from the human IgG antibody obtained by analyzing the binding reaction curve are 1.76 × 10 ⁻⁵ M for the GST fusion polypeptide of SEQ ID NO: 2, and 2.35 × for the GST fusion polypeptide of SEQ ID NO: 3, respectively. The GST fusion polypeptide of 10 ⁻⁵ M and SEQ ID NO: 4 was 1.77 × 10 ⁻⁶ M. GST protein did not show any activity to bind to human IgG antibody (not shown). From these results, it was shown that the polypeptide represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 has an activity of binding to a human IgG antibody.

図１は、各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとＩｇＧの結合反応曲線を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing binding reaction curves between various GST fusion polypeptides and IgG.

Claims

配列番号２で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that binds to a human IgG antibody represented by SEQ ID NO: 2.

配列番号３で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that binds to a human IgG antibody represented by SEQ ID NO: 3.

配列番号４で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide that binds to a human IgG antibody represented by SEQ ID NO: 4.

配列番号２〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して９５％以上の配列相同性を有するポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide having a sequence homology of 95 % or more with respect to the polypeptide represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 4, and binding to a human IgG antibody.

請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。 A polypeptide having 1 to 10 amino acid residues covalently bonded to the N-terminus, C-terminus or amino acid side chain of the polypeptide according to any one of claims 1 to 4 , which binds to a human IgG antibody. Characteristic polypeptide.

請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを１ドメイン単位として、該ドメイン単位２〜１０個を共有結合にて融合させたポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とする融合ポリペプチド。 A polypeptide in which the polypeptide according to any one of claims 1 to 5 is used as one domain unit, and 2 to 10 of the domain units are covalently fused, and binds to a human IgG antibody. A fusion polypeptide.

請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料。 A material for adsorbing a human IgG antibody or IgG antibody derivative, wherein the polypeptide according to any one of claims 1 to 6 is immobilized on a water-insoluble carrier.

請求項７に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法。 A method for separating and purifying a human IgG antibody or IgG antibody derivative, wherein the adsorbent material according to claim 7 is used.

請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。 DNA encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 6 .

請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合蛋白質をコードするＤＮＡ。 DNA encoding a fusion protein comprising the polypeptide according to any one of claims 1 to 6 .

請求項９または１０に記載のＤＮＡを有するベクター。 A vector comprising the DNA according to claim 9 or 10 .

請求項１１に記載のベクターにより形質転換された形質転換細胞。 A transformed cell transformed with the vector according to claim 11 .

請求項１２に記載の形質転換細胞を用いた、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
The method for producing a polypeptide according to any one of claims 1 to 6 , wherein the transformed cell according to claim 12 is used.