JP4475385B2

JP4475385B2 - Humanized baculovirus

Info

Publication number: JP4475385B2
Application number: JP2003521847A
Authority: JP
Inventors: メイトランド、ノーマン
Original assignee: Procure Therapeutics Ltd
Current assignee: Procure Therapeutics Ltd
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2002-08-15
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2022-08-15
Also published as: WO2003016540A3; US7393524B2; EP1417323A2; GB0119852D0; CA2496542A1; WO2003016540A2; US20090004146A1; JP2005502343A; US20050009184A1

Description

本発明は、治療剤をコードする核酸分子及び少なくとも１種の細胞タイプをバキュロウィルスのターゲットにする機能を果たすポリペプチドをコードする核酸分子をバキュロウィルスゲノムが含むバキュロウィルス、前記バキュロウィルスを用いた治療方法及び前記バキュロウィルスを含む医薬組成物に関する。 The present invention uses a baculovirus whose baculovirus genome includes a nucleic acid molecule encoding a therapeutic agent and a nucleic acid molecule encoding a polypeptide that functions to target at least one cell type to baculovirus, and the baculovirus. The present invention relates to a therapeutic method and a pharmaceutical composition comprising the baculovirus.

遺伝子治療は、疾患の治療上の処置のために細胞の中への新しい遺伝的情報の導入及び任意に安定挿入を必要とする。遺伝子治療に関する主な論点は、効率のよい細胞への核酸のターゲッティングと選択された組織における高い水準での導入遺伝子発現の確立である。これらの一方もしくは両方の要求を容易にすることを意図する多くの方法論が開発されてきた。例えば、ＵＳ６０４３３３９では、核酸に融合した場合、その連結された核酸の細胞膜を横断したトランスロケーションを容易にするシグナルペプチドの使用が開示されている。ＵＳ６０８３７１４では、結合した核酸およびターゲッティング手段が開示されており、これはインテグリンレセプターに結合し、それゆえにインテグリンを発現する細胞をターゲッティングするポリカチオンポリリジンを使用している。ＥＰ１０１３７７０では、オリゴヌクレオチドに結合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）の使用が開示されている。その接合体はベクターＤＮＡに共有的に連結して、その複合体は細胞への感染するのに用いられるかもしれない。ＮＬＳ配列はベクターＤＮＡの核膜の通過を容易にするように作用し、それゆえ遺伝子の移送を核へ向ける。 Gene therapy requires the introduction of new genetic information into the cell and optionally stable insertion for therapeutic treatment of the disease. The main issue with gene therapy is the efficient targeting of nucleic acids to cells and the establishment of high levels of transgene expression in selected tissues. Many methodologies have been developed that are intended to facilitate one or both of these requirements. For example, US6043339 discloses the use of a signal peptide that facilitates translocation across the cell membrane of the linked nucleic acid when fused to a nucleic acid. US6083714 discloses bound nucleic acids and targeting means, which use polycation polylysine that binds to integrin receptors and therefore targets cells expressing integrin. EP 1013770 discloses the use of a nuclear localization signal (NLS) attached to an oligonucleotide. The conjugate may be covalently linked to vector DNA and the complex may be used to infect cells. The NLS sequence acts to facilitate passage of vector DNA through the nuclear membrane, thus directing gene transfer to the nucleus.

ある範囲のウィルスを主体とするベクターが、哺乳類細胞株を上首尾にトランスフェクトするのに使用されてきた。これらには、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、パポーバウィルス及びワクシニアウィルスが含まれる。これらのウィルスを主体とするベクターには無視できない不利益がある。アデノウィルスは遺伝子治療試行において、よく確立されているが、アメリカ合衆国での最近の問題から、その使用を制限するかもしれない（Wickham TJ,Gene Therapy,7:110.2000）。主な問題は、非選択的な細胞傷害性（特に肝臓）及び先在するそのウィルスに対する免疫反応にあると思われる。アデノウィルスキャプシド由来のペプチドに対して誘発された細胞溶解性Ｔ細胞の反応が、ベクターで形質導入された細胞の破壊を媒介することが示されており、また局在化した組織の損傷及び炎症に関連してきた。（Gilgenkrantz,H.et al. (1995) Hum Gene Ther 6,(1265-1274);Yang,Y. and Wilson,J.M.(1995) J Immunol 155,2564-2570)。内生的に感染しているアデノウィルスを特に高用量で用いた組換えの将来性は、潜在的な安全性の懸念事項でもある。 A range of virus-based vectors have been used to successfully transfect mammalian cell lines. These include adenovirus, adenovirus related virus, papova virus and vaccinia virus. These virus-based vectors have disadvantages that cannot be ignored. Adenoviruses are well established in gene therapy trials, but recent use in the United States may limit their use (Wickham TJ, Gene Therapy, 7: 110.2000). The main problem appears to be non-selective cytotoxicity (especially the liver) and immune response to the pre-existing virus. Cytolytic T cell responses elicited to peptides derived from adenovirus capsids have been shown to mediate the destruction of vector-transduced cells and also to localized tissue damage and inflammation. Have been related. (Gilgenkrantz, H. et al. (1995) Hum Gene Ther 6, (1265-1274); Yang, Y. and Wilson, J.M. (1995) J Immunol 155, 2564-2570). The potential for recombination using endogenously infected adenoviruses, especially at high doses, is also a potential safety concern.

組換えウィルスへ挿入される外部遺伝子物質の量の限界は、アデノウィルスキャプシドの画定されたサイズによる。アデノウィルスは、先在している物質と組換えを起こしうる。これは、内生アデノウィルスが人間界に広く行き渡った潜在的な欠点である。同様にアデノウィルスベクターは、関連する内生ヒトウィルスの複製を助ける能力があることが立証されている。 The limit on the amount of external genetic material that can be inserted into a recombinant virus is due to the defined size of the adenovirus capsid. Adenovirus can recombine with pre-existing material. This is a potential drawback that endogenous adenoviruses have spread throughout the human world. Similarly, adenoviral vectors have been demonstrated to be capable of helping replication of related endogenous human viruses.

安全性の懸念は、単純ヘルペスウィルスの臨床的使用にも関係する。ヒトの脳におけるウィルスの溶菌複製は脳炎と関連している(Latchman,D.S (1994).Mol Biotechnol,2,179-195)。 Safety concerns also relate to the clinical use of herpes simplex virus. Viral lytic replication in the human brain is associated with encephalitis (Latchman, D.S (1994). Mol Biotechnol, 2,179-195).

レトロウィルスのベクターが、臨床試験で広く使われているが、いくつもの不利益がこれらのウィルスに関連している。細胞への組込みが無作為であること、これが、主な安全上の懸念である。これらのウィルスは感染のため細胞***が必要であるため、これらのベクターの使用は制限されている。 Retroviral vectors are widely used in clinical trials, but a number of disadvantages are associated with these viruses. Random integration into cells is a major safety concern. Since these viruses require cell division for infection, the use of these vectors is limited.

哺乳類細胞に感染することが示されてきた他のベクターは、バキュロウィルスである。バキュロウィルスは桿状体ウィルスであり、それゆえ、組換えバキュロウィルスに挿入される遺伝物質の量の制限は、アデノウィルスキャプシドによるものほど制限されない。 Another vector that has been shown to infect mammalian cells is baculovirus. Baculovirus is a rod virus, and therefore the limit on the amount of genetic material inserted into a recombinant baculovirus is not as limited as with adenovirus capsids.

バキュロウィルスでは、ヒト細胞内で昆虫特異性プロモータによる自身の遺伝子は発現しない。バキュロウィルスがウィルス性遺伝子のウィルス遺伝子発現の結果として免疫反応を引き起こさせないので、これは魅力的な特徴である。しかしながら、哺乳類プロモータ制御の下、マーカーや治療遺伝子の挿入は、高いレベルの導入遺伝子の発現を可能にする。アデノウィルスベクターとは異なり、バキュロウィルスは先在する物質と組換えを起こさない。バキュロウィルスによる感染は、アデノウィルスベクターで示されたようなヒト内生ウィルスの複製を容易にすることはない。他の治療用のウィルスの多くとは対照的に、バキュロウィルスは無血清培養培地で大量に育てることができる。この生産方法は、容易に産業水準まで拡大でき、ウィルス及びプリオン剤を伴う治療剤の血清汚染の潜在的な危険を取り除く。最も重要なことに、他のすべてのウィルスベクターと異なり、バキュロウィルスに対する先在の免疫反応は存在しない。 Baculovirus does not express its own genes with insect-specific promoters in human cells. This is an attractive feature because baculovirus does not cause an immune response as a result of viral gene expression of the viral gene. However, under the control of mammalian promoters, the insertion of markers or therapeutic genes allows for high levels of transgene expression. Unlike adenoviral vectors, baculovirus does not recombine with pre-existing material. Infection with baculovirus does not facilitate the replication of human endogenous viruses as shown by adenoviral vectors. In contrast to many other therapeutic viruses, baculoviruses can be grown in large quantities in serum-free culture media. This production method can be easily extended to industrial standards and eliminates the potential risk of serum contamination of therapeutic agents with viruses and prion agents. Most importantly, unlike all other viral vectors, there is no pre-existing immune response to baculovirus.

組換えバキュロウィルスの構築物はよく文献に出ている。ＥＰ０３４０３５９（これを引用して本明細書の一部とする）では、導入ベクターの使用を通じて外来遺伝子を組み込んでいる組換えバキュロウィルスを獲得する方法が開示されている。この新規な導入ベクターは、ポリヘドリン遺伝子本体（外来遺伝子がクローン化され得るが）のＮ末端の少し下流に制限部位を組み込む。ポリヘドリン遺伝子の天然のＡＴＧ開始コドンは与えられず、その結果、制限部位前のＮ末端ポリヘドリンをコードする配列は、保持されるが翻訳できない。外来遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウィルスは、野生型のバキュロウィルス及び導入ベクターで、バキュロウィルスの感染性の高い昆虫細胞を同時トランスフェクトすることによって導入ベクターにより誘導される。 Recombinant baculovirus constructs are well documented. EP 0340359 (hereby incorporated by reference) discloses a method for obtaining a recombinant baculovirus incorporating a foreign gene through the use of a transfer vector. This new transfer vector incorporates a restriction site slightly downstream of the N-terminus of the polyhedrin gene body (although foreign genes can be cloned). The natural ATG start codon of the polyhedrin gene is not given, so that the sequence encoding the N-terminal polyhedrin before the restriction site is retained but cannot be translated. A recombinant baculovirus incorporating a foreign gene is derived from a wild-type baculovirus and a transfer vector by co-transfecting baculovirus highly infectious insect cells with the transfer vector.

同様にＵＳ６１２６９４４（これを引用して本明細書の一部とする）は、外来遺伝子、とりわけ単純ヘルペスウィルスの糖タンパク質ｇＧ１及びｇＧ２の効率よい発現のためのバキュロウィルス導入ベクターの構築物に関する。発現させるべき外来遺伝子は、翻訳開始部位に更にヌクレオチドを加えることなく、翻訳開始部位でバキュロウィルスポリへドリン遺伝子に近位している。 Similarly US Pat. No. 6,126,944 (incorporated herein by reference) relates to the construction of baculovirus transfer vectors for the efficient expression of foreign genes, in particular the herpes simplex virus glycoproteins gG1 and gG2. The foreign gene to be expressed is proximal to the baculovirus polyhedrin gene at the translation start site without adding additional nucleotides to the translation start site.

ＵＳ５７５０３８３（これを引用して本明細書の一部とする）は、バキュロウィルスのクローニングシステムを開示している。そのシステムは、必須遺伝子を用いるマーカーレスキューシステムである。その選択された必須遺伝子が不活性化される。ヌル突然変異を含むバキュロウィルスのクローニングは、それから調整可能なプロモータの制御下で、外来遺伝子に連結した遺伝子の機能的コピーを含むプラスミドで共感染した野生型宿主細胞に感染するためのウィルスを用いることにより成し遂げられる。バキュロウィルスヌル突然変異は、外来遺伝子に連結したレスキュー遺伝子によって「レスキュー(救出）」される。必須遺伝子の機能は回復し、外来遺伝子は発現される。必須遺伝子の一例としてｇｐ６４ｅｆｐ（envelope fusion protein：外膜融合タンパク質）が挙げられ、これは、ウィルス感染と増殖に必須のタンパク質をコードする。 US 5750383 (which is incorporated herein by reference) discloses a baculovirus cloning system. The system is a marker rescue system that uses essential genes. The selected essential gene is inactivated. Cloning of a baculovirus containing a null mutation then uses a virus to infect wild-type host cells co-infected with a plasmid containing a functional copy of the gene linked to a foreign gene under the control of a regulatable promoter Can be achieved. A baculovirus null mutation is “rescued” by a rescue gene linked to a foreign gene. The function of the essential gene is restored and the foreign gene is expressed. An example of an essential gene is gp64 efp (envelope fusion protein), which encodes a protein essential for viral infection and propagation.

開示されている方法ではバキュロウィルスを操作できるかもしれないが、従来の技術ではターゲットされた遺伝子治療に関するウィルスベクターとしてのバキュロウィルスの使用について述べられていない。 Although the disclosed method may manipulate baculoviruses, the prior art does not mention the use of baculoviruses as viral vectors for targeted gene therapy.

我々は、バキュロウィルスゲノムに組み込まれ、バキュロウィルスの移送を容易にしてそれにより、特異な細胞タイプに対する治療剤となるターゲッティング配列を含む組換えバキュロウィルスを開発した。 We have developed a recombinant baculovirus that contains a targeting sequence that is integrated into the baculovirus genome and facilitates the transport of the baculovirus, thereby providing a therapeutic agent for specific cell types.

ターゲッティングのための候補遺伝子の一例は、バキュロウィルスｇｐ６４であり、これは、広範にプロセッシングされたタイプ１の細胞膜内在糖タンパク質である。バキュロウィルス感染のｇｐ６４の役割は、ｇｐ６４に特異な抗体による感染の中和によって立証されている。ｇｐ６４は、低ｐＨ活性化膜融合活性にとって、必要でありまたその能力を有することも示されている。決定的なデータは欠けているが、その感染周期におけるｇｐ６４の役割についての間接的なデータは、そのタンパク質がバキュロウィルス感染に必須であることを強く示唆している。 An example of a candidate gene for targeting is baculovirus gp64, which is a widely processed type 1 intracellular membrane glycoprotein. The role of gp64 in baculovirus infection has been demonstrated by neutralizing infection with antibodies specific for gp64. gp64 has also been shown to be necessary and capable of low pH activated membrane fusion activity. Although definitive data is lacking, indirect data about the role of gp64 in the infection cycle strongly suggests that the protein is essential for baculovirus infection.

バキュロウィルスｇｐ６４外被タンパク質は、遺伝的情報の担体としての機能を混乱させることなく、新しく及びより特異的な付着配列としての迅速な挿入を可能にするものに、十分に変異しやすいことが見出されていた。ｇｐ６４外被タンパク質には長いループがある。これは以前に抗原提示のために用いられ、挿入には理想的である。改変ｇｐ６４が、モザイク膜で野生型ｇｐ６４と共に発現したときは、ウィルス感染には大きく影響しない。 The baculovirus gp64 coat protein has been found to be sufficiently mutated to allow rapid insertion as a new and more specific attachment sequence without disrupting its function as a carrier of genetic information. It was out. There is a long loop in the gp64 coat protein. This was previously used for antigen presentation and is ideal for insertion. When modified gp64 is expressed together with wild-type gp64 in a mosaic membrane, it does not significantly affect viral infection.

本発明の一態様によれば、治療剤をコードする核酸分子と少なくとも１種の細胞タイプへバキュロウィルスをターゲットする機能を果たすペプチドとをコードする核酸分子を含むようにバキュロウィルスゲノムが変異されているバキュロウィルスが提供される。 According to one aspect of the invention, the baculovirus genome is mutated to include a nucleic acid molecule encoding a nucleic acid molecule encoding a therapeutic agent and a peptide that functions to target the baculovirus to at least one cell type. Baculovirus is provided.

好ましい実施形態では、前記バキュロウィルスゲノムは、前記核酸分子の真核性の遺伝子発現に適合される。 In a preferred embodiment, the baculovirus genome is adapted for eukaryotic gene expression of the nucleic acid molecule.

典型的な前記適合例には、例示であってこれに限られないが、細胞／組織に特異的な発現を媒介する転写制御配列（プロモータ配列）の供給が含まれる。これらのプロモータ配列は、細胞／組織に特異的、誘発的もしくは構成要素であってもよい。 Typical examples of such adaptation include, but are not limited to, supply of transcriptional control sequences (promoter sequences) that mediate cell / tissue specific expression. These promoter sequences may be cell / tissue specific, inducible or constituent.

プロモータは技術認知用語であり、そして明確性のためには以下の特徴を含むが、これらは例示のみであって限定のためではなく、与えられる。エンハンサーエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’側にしばしば見出されるシス作用性の核酸配列である（エンハンサーは、遺伝子配列の３'側に見いだされもしくはイントロン配列の中にさえ位置することもでき、それゆえ位置非依存性である。）。エンハンサーは、エンハンサーが連結している遺伝子の転写速度を上げるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合すると示されてきたトランス作用性転写要因（ポリペプチド）に感応しやすい。転写因子の結合／活性（Eukaryotic Transcription Facors, David S Latchman,Academic Press Ltd. San Diegoを参照）は、いくつかの環境的合図に感応しやすい。 Promoter is a technically recognized term and includes the following features for clarity, but these are given by way of illustration only and not limitation. Enhancer elements are cis-acting nucleic acid sequences that are often found 5 'to the translation start site of genes (enhancers can be found 3' to gene sequences or even located in intron sequences. , And therefore position independent.) An enhancer functions to increase the transcription rate of the gene to which the enhancer is linked. Enhancer activity is sensitive to trans-acting transcription factors (polypeptides) that have been shown to bind specifically to enhancer elements. Transcription factor binding / activity (see Eukaryotic Transcription Facors, David S Latchman, Academic Press Ltd. San Diego) is sensitive to several environmental cues.

プロモータエレメントは、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列も含み、これらは転写開始の部位を選択する機能を果たす。またこれらの配列は、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にする機能を有するポリペプチドも結合する。 Promoter elements also include so-called TATA boxes and RNA polymerase initiation selection (RIS) sequences that serve to select sites for transcription initiation. These sequences also bind, among other things, polypeptides that have the function of facilitating selection of transcription initiation by RNA polymerase.

適合例にはまた、選択可能なマーカー及び自己複製の配列双方の提供が含まれ、これら双方は、真核細胞及び原核宿主のどちらかにおける前記ベクターの維持を容易にする。 Matching examples also include the provision of both selectable markers and self-replicating sequences, both of which facilitate the maintenance of the vector in either eukaryotic or prokaryotic hosts.

バキュロウィルスコード遺伝子の発現を容易にする適合例には、転写末端／ポリアデニル化した配列の供給が含まれる。これはまた、２シストロン又は複シストロン発現カセット内に配置されたバキュロウィルスコード遺伝子の発現を最大化する機能を有する内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry sites（IRES）)の供給も含む。 Examples of adaptations that facilitate the expression of baculovirus-encoding genes include the provision of transcription end / polyadenylated sequences. This also includes the provision of internal ribosome entry sites (IRES) that have the function of maximizing the expression of baculovirus-encoding genes located within a bicistronic or multicistronic expression cassette.

これらの適合は、本技術分野ではよく知られている。一般的な発現ベクター構築物及び組換えＤＮＡ技術に関するかなりの量の刊行論文がある。Sambrook et al(1989)Moleculer Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbour laboratory, Cold Spring Harbour, NY およびその参照文献；Marston, F(1987) DNA Cloning Techniques :A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons,Inc.(1994)を参照してほしい。 These adaptations are well known in the art. There is a considerable amount of published papers on general expression vector constructs and recombinant DNA technology. Sambrook et al (1989) Molecule Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA See Cloning: FM Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

本発明の好ましい実施形態では、前記真核細胞の発現は、癌細胞に特異的なプロモータエレメントの提供によるものである。好ましくは、前記プロモータは前立腺癌細胞で活性があるものである。
より好ましくは、プロモータエレメントは、表１に示された群から選択されるものである。 In a preferred embodiment of the invention, the expression of the eukaryotic cell is due to the provision of a promoter element specific for cancer cells. Preferably, the promoter is active in prostate cancer cells.
More preferably, the promoter element is one selected from the group shown in Table 1.

本発明の好ましい実施形態では、前記治療剤はポリペプチドである。
好ましくは、前記ポリペプチドは、表２に示された群から選択される腫瘍抑制ポリペプチドである。 In a preferred embodiment of the invention, the therapeutic agent is a polypeptide.
Preferably, the polypeptide is a tumor suppressor polypeptide selected from the group shown in Table 2.

さらに好ましく本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは抗原性ポリペプチドである。
好ましくは、腫瘍拒絶抗原前駆体は、表３で示された以下のファミリーから選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは前立腺腫瘍拒絶抗原である。 More preferably, in an embodiment of the invention, the polypeptide is an antigenic polypeptide.
Preferably, the tumor rejection antigen precursor is selected from the following families shown in Table 3.
In a further preferred embodiment, the polypeptide is a prostate tumor rejection antigen.

さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチドである。たとえば、シュードモナス外毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：Ａ０４６４６）である。 In a further preferred embodiment of the invention, said polypeptide is a cytotoxic polypeptide. For example, Pseudomonas exotoxin, ricin toxin, diphtheria toxin (Genbank acc. #: A04646).

またさらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは細胞周期停止誘発ポリペプチドである。
好ましくは、前記細胞周期停止ポリペプチドは、表４に示された群より選択される。 In still further preferred embodiments of the invention, the polypeptide is a cell cycle arrest inducing polypeptide.
Preferably, said cell cycle arrest polypeptide is selected from the group shown in Table 4.

さらに好ましい本発明の実施形態では、前記治療ポリペプチドは医薬活性があるポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドはサイトカインである。
好ましくは、前記サイトカインは表５に示された群から選択される。 In a further preferred embodiment of the invention said therapeutic polypeptide is a pharmaceutically active polypeptide. Preferably, the polypeptide is a cytokine.
Preferably, said cytokine is selected from the group shown in Table 5.

さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは抗体、又はその活性結合フラグメント、たとえばＦａｂフラグメントである。 In a further preferred embodiment of the invention, said polypeptide is an antibody, or an active binding fragment thereof, such as a Fab fragment.

Ｆａｂフラグメントよりも小さく、細胞性のターゲットに結合する抗体フラグメントもまた本発明の範囲内である。例えば、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）が挙げられる。 Antibody fragments that bind to cellular targets that are smaller than Fab fragments are also within the scope of the invention. An example is a single chain Fv molecule (scFv).

これらは、リンカー配列を介して対になったＨ鎖の可変領域とＬ鎖の可変領域とで成立する処理抗体フラグメントである。Adams and Schier (1999) Journal of Immunolpgical Methods 249-260を参照。 These are processed antibody fragments that are composed of an H chain variable region and an L chain variable region paired via a linker sequence. See Adams and Schier (1999) Journal of Immunolpgical Methods 249-260.

なお一層好ましい発明の実施形態では、前記ポリペプチドはアポトーシスを誘発するポリペプチドである。
好ましくは、前記アポトーシス誘発ポリペプチドは表６に示されたものである。 In an even more preferred embodiment of the invention, said polypeptide is a polypeptide that induces apoptosis.
Preferably, said apoptosis-inducing polypeptide is that shown in Table 6.

さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドはプロドラッグ活性化ポリペプチドである。
好ましくは、前記プロドラッグ活性化ポリペプチドは、表７に示されたものである。 In a further preferred embodiment of the invention said polypeptide is a prodrug activating polypeptide.
Preferably, the prodrug activating polypeptide is that shown in Table 7.

さらに好ましい本発明の実施態様では、前記ポリペプチドは抗血管新生活性を有する。例えば、アンジオスタチン、Ｔｉｅ２（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．ｎｏ：ＡＦ４５１８６５）、エンドスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．ｎｏ：ＮＭ１３０４４５）が挙げられる。 In a further preferred embodiment of the invention said polypeptide has anti-angiogenic activity. For example, angiostatin, Tie2 (Genbank acc. No: AF451865), endostatin (Genbank acc. No: NM130445) can be mentioned.

さらに好ましい本発明の実施態様として、前記治療剤がアンチセンス核酸分子である。
ここで用いられる場合、「アンチセンス核酸分子」又は「アンチセンス」という用語は、特定の遺伝子を構成するＤＮＡに又はその遺伝子のｍＲＮＡ転写物に、生理的条件下でハイブリダイズし、それにより遺伝子の転写及び／又はそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する核酸を表す。アンチセンス分子は、ターゲット遺伝子とハイブリダイズする際に、そのターゲット遺伝子の転写や翻訳を妨げるように設計されている。アンチセンス核酸の正確な長さやそのターゲットとの相補性の程度が、選択された特定のターゲットに依存し、これにはターゲットの配列およびその配列を構成する特定の塩基を含むことを当業者は理解するであろう。 In a further preferred embodiment of the present invention, the therapeutic agent is an antisense nucleic acid molecule.
As used herein, the term “antisense nucleic acid molecule” or “antisense” refers to a gene that hybridizes under physiological conditions to the DNA that constitutes a particular gene or to the mRNA transcript of that gene. A nucleic acid that inhibits the transcription and / or translation of its mRNA. Antisense molecules are designed to prevent transcription and translation of a target gene when hybridizing with the target gene. Those skilled in the art will appreciate that the exact length of an antisense nucleic acid and the degree of complementarity with its target will depend on the specific target selected, including the target sequence and the specific bases that make up the sequence. You will understand.

アンチセンス核酸は生理的条件下でターゲットに選択的に結合するように、換言すれば生理的条件下で、ターゲット細胞中の他のどの配列よりも実質上よりターゲット配列にハイブリダイズするように構築及び編成されるのが好ましい。 Antisense nucleic acids are constructed to selectively bind to the target under physiological conditions, in other words, to hybridize to the target sequence substantially more under physiological conditions than any other sequence in the target cell. And are preferably knitted.

遺伝子又はｍＲＮＡ転写物のどの領域に対するアンチセンスとなる核酸が置換されてもよいが、好ましい実施形態では、アンチセンス核酸が翻訳開始部位、転写開始部位又はプロモータ部位のようなＮ末端又は５’上流部位に一致するものである。加えて、３’側の非翻訳領域がターゲットであってもよい。３’側の非翻訳領域は、ｍＲＮＡを安定化に関連したタンパク質に対する結合部位として作用するシス作用性配列を含むものとして知られている。これらのシス作用性部位は、前記安定化タンパク質を結合させる機能を果たすヘアループ構造をしばしば形成する。安定化調整のこの形状のよく知られている例は、ヒストンｍＲＮＡのものにより示され、その多くは少なくとも部分的に、転写後的に調節される。 The antisense nucleic acid for any region of the gene or mRNA transcript may be replaced, but in a preferred embodiment the antisense nucleic acid is N-terminal or 5 ′ upstream, such as a translation start site, transcription start site or promoter site. It matches the site. In addition, the untranslated region on the 3 'side may be the target. The 3 'untranslated region is known to contain a cis-acting sequence that acts as a binding site for mRNA-related proteins. These cis-acting sites often form hair loop structures that serve to bind the stabilizing protein. A well-known example of this form of stabilization regulation is shown by that of histone mRNA, many of which are at least partially regulated post-transcriptionally.

本発明は、従って、特定のターゲット配列、例えば、細胞周期調整遺伝子（例えば、ｐ２１（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＮＭ＿０７８４６７、ｃ−ｍｙｃ（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：Ｄ１０４９３及びＤ９０４６７）、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質、ｐ１６（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＮＭ０５８１９６）、ｐ１５（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＢＣ００２０１０）、ｐ１８（マウス配列Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＢＣ０２７０２６）又はｐ１９（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＮＭ＿０７９４２１）およびカベオリンのようなアポトーシス阻害物質に対するアンチセンス核酸を組み込むことにより改変させたバキュロウィルスゲノムを意図している。 The present invention thus includes specific target sequences such as cell cycle regulatory genes (eg, p21 (Genbank acc. #: NM — 078467, c-myc (Genbank acc. #: D10493 and D90467), cyclin dependent kinase inhibitors, Inhibitors against apoptosis such as p16 (Genbank acc. #: NM058196), p15 (Genbank acc. #: BC002010), p18 (mouse sequence Genbank acc. #: BC027026) or p19 (Genbank acc. #: NM — 079421) and caveolin Contemplates a baculovirus genome that has been modified by incorporating an antisense nucleic acid.

本発明のさらに好ましい実施態様では、前記治療剤が二重鎖ＲＮＡ分子である。この実施態様において、バキュロウィルスゲノムは、上流（すなわち核酸分子の５’側）に位置する最初のプロモータ及び下流（すなわち核酸分子の３’側）に位置する二番目のプロモータの制御下で核酸分子を含みうる。プロモータの方向はセンス及びアンチセンス核酸分子の双方が生成されるようになっている。 In a further preferred embodiment of the invention, said therapeutic agent is a double stranded RNA molecule. In this embodiment, the baculovirus genome is a nucleic acid molecule under the control of a first promoter located upstream (ie 5 ′ of the nucleic acid molecule) and a second promoter located downstream (ie 3 ′ of the nucleic acid molecule). Can be included. The direction of the promoter is such that both sense and antisense nucleic acid molecules are generated.

遺伝子機能を特異的に除去する技術は、二重鎖ＲＮＡ、これを阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも言うが、これを細胞に導入することを通してなされ、その結果、ＲＮＡｉ分子に含まれた配列に相補的なｍＲＮＡの破壊が生じる。ＲＮＡｉ分子は、二重鎖ＲＮＡ分子を形成するため、お互いにアニール化した２つの相補的なＲＮＡ鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）で構成されている。ＲＮＡｉ分子は、一般に切除されるべき遺伝子のエキソンもしくはコード配列に由来する。あるいは前記ＲＮＡｉ分子は、遺伝子のコード配列／エキソン配列に隣接するイントロン配列又は５’及び／又は３’側の非コード配列に由来する。最近の研究では、コード配列に由来する１００−１０００ｂｐの範囲のＲＮＡｉ分子が遺伝子発現の効果的な阻害物質となることが示されている。驚くことに、ＲＮＡｉのわずかな分子が、作用機序が触媒的であることを示す遺伝子発現を阻止するのに必要である。ＲＮＡ合成又はプロセッシングの間にその影響を及ぼすことを示す細胞の細胞質において、いずれのＲＮＡｉが検出可能な場合、作用部位はいくらか不明であるようだ。 A technique for specifically removing a gene function is a double-stranded RNA, also referred to as an inhibitory RNA (RNAi), which is made by introducing it into a cell, and as a result, complementary to the sequence contained in the RNAi molecule MRNA destruction occurs. The RNAi molecule is composed of two complementary RNA strands (sense strand and antisense strand) annealed to each other to form a double-stranded RNA molecule. RNAi molecules are generally derived from exons or coding sequences of the gene to be excised. Alternatively, the RNAi molecule is derived from an intron sequence adjacent to the coding / exon sequence of the gene or a non-coding sequence 5 'and / or 3'. Recent studies have shown that RNAi molecules in the 100-1000 bp range derived from the coding sequence are effective inhibitors of gene expression. Surprisingly, a small molecule of RNAi is required to block gene expression indicating that the mechanism of action is catalytic. If any RNAi is detectable in the cytoplasm of a cell that shows its effects during RNA synthesis or processing, the site of action appears somewhat unknown.

この現象を説明する理論は存在するが、ＲＮＡｉ作用の正確な作用機序は知られていない。例えば、すべての生体は、外因性遺伝子発現の影響を制限する保護的作用機序を進化させてきた。例えばウィルスは、しばしば感染した生体に有害な影響を引き起こす。ウィルス遺伝子発現及び／又は複製は、それゆえ抑制する必要がある。加えて、遺伝的形質転換の急速な発展並びにトランスジェニック動物及び植物の供給は、導入遺伝子がまた外来の核酸として認識され、膨化現象（Singer and Selker, Curr Top Microbiol.Immunol.1995;197:165-77)、ジーンサイレンス現象（Matzkeand Matzke, Novartis Found Symp.1998;214:168-80;discussion 181-6.Review)、同時抑制（Stam et.al.,.Plant J.2000;21(1)27-42)といわれる様々な現象に付されるという認識を導いてきた。 There is a theory to explain this phenomenon, but the exact mechanism of action of RNAi is unknown. For example, all living organisms have evolved protective mechanisms of action that limit the effects of exogenous gene expression. For example, viruses often cause detrimental effects on infected organisms. Viral gene expression and / or replication must therefore be suppressed. In addition, the rapid development of genetic transformations and the supply of transgenic animals and plants has led to the fact that the transgene is also recognized as a foreign nucleic acid and the swelling phenomenon (Singer and Selker, Curr Top Microbiol. Immunol. 1995; 197: 165 -77), Gene Silence Phenomenon (Matzkeand Matzke, Novartis Found Symp.1998; 214: 168-80; discussion 181-6.Review), Simultaneous Suppression (Stam et.al.,. Plant J.2000; 21 (1) 27-42) has led to the perception that it is subject to various phenomena.

さらに好ましい実施形態では、前記治療剤がリボザイムである。
リボザイムは、本技術分野ではよく知られている触媒活性があるＲＮＡである。リボザイムは、基質ＲＮＡにハイブリダイズする配列と近くの隣接配列を有する触媒中心部を含む。もっとも簡素な触媒中心部は、ハンマーヘッドとして知られるＲＮＡモチーフである。触媒ＲＮＡが発見されて以来、疾患遺伝子のｍＲＮＡを選択的に除去することができるターゲット化遺伝子機能を有するリボザイムを設計することが切望されてきた。 In a further preferred embodiment, the therapeutic agent is a ribozyme.
Ribozymes are catalytically active RNAs well known in the art. Ribozymes contain a catalytic center with sequences that hybridize to substrate RNA and nearby flanking sequences. The simplest catalyst center is an RNA motif known as a hammerhead. Since the discovery of catalytic RNA, it has been anxious to design ribozymes with targeted gene function that can selectively remove disease gene mRNA.

本発明のさらに好ましい実施形態では、バキュロウィルスゲノムは、少なくとも1種の細胞タイプの細胞表面にバキュロウィルスを結合するポリペプチドをコードする核酸分子を含んでいる。 In a further preferred embodiment of the invention, the baculovirus genome comprises a nucleic acid molecule encoding a polypeptide that binds baculovirus to the cell surface of at least one cell type.

本発明の好ましい実施形態では、前記核酸が以下の群、すなわちＧｎＲＨ（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．ｎｏ：Ｌ０３３８０）、線維芽細胞成長因子；インスリン及びインスリン様成長因子；ニューロテンシン血小板由来成長因子（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．ｎｏ：ＮＭ＿００２６０９およびＮＭ＿００６２０６）；ソマトスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．ｎｏ：ＢＣ０３２６２５）から選択されたポリペプチドをコードする核酸である。 In a preferred embodiment of the present invention, said nucleic acid comprises the following groups: GnRH (Genbank acc. No: L03380), fibroblast growth factor; insulin and insulin-like growth factor; neurotensin platelet derived growth factor (Genbank acc. No : NM_002609 and NM_006206); a nucleic acid encoding a polypeptide selected from somatostatin (Genbank acc. No: BC032625).

本発明の好ましい実施形態は、前記ポリペプチドをコードする核酸は、前記ポリペプチドをバキュロウィルスのキャプシドポリペプチドに融合する部位で、バキュロウィルスゲノムへ挿入される。好ましくは、キャプシドポリペプチドはｇｐ６４である。 In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid encoding the polypeptide is inserted into the baculovirus genome at the site where the polypeptide is fused to a baculovirus capsid polypeptide. Preferably, the capsid polypeptide is gp64.

都合のいいことに、キャプシドポリペプチドにターゲッティングポリペプチドを融合することは、バキュロウィルス粒子表面でのそれの提示をもたらし、それにより前記細胞タイプにバキュロウィルスを提示し、それにより細胞ターゲッティングを容易にする。 Conveniently, fusing the targeting polypeptide to the capsid polypeptide results in its presentation on the surface of the baculovirus particle, thereby presenting the baculovirus to the cell type, thereby facilitating cell targeting. To do.

本発明の更なる態様によれば、すべての先の発明の態様もしくは実施形態によるバキュロウィルスを含む医薬組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、癌、理想的には前立腺癌の治療用医薬の製造における使用のものである。 According to a further aspect of the present invention there is provided a pharmaceutical composition comprising a baculovirus according to all previous inventive aspects or embodiments. Preferably, the composition is for use in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, ideally prostate cancer.

またさらなる本発明の態様によれば、本発明によるバキュロウィルスの治療上効果的な量の投与を含む治療方法を提供する。
本発明の好ましい方法では、前記治療は癌、より好ましくは前立腺癌である。
本発明の実施態様はここで、以下の材料、方法、ベクター及び図を参照して、例によってのみ示される。 According to yet a further aspect of the present invention there is provided a method of treatment comprising the administration of a therapeutically effective amount of a baculovirus according to the present invention.
In a preferred method of the invention, the treatment is cancer, more preferably prostate cancer.
Embodiments of the present invention will now be illustrated by way of example only with reference to the following materials, methods, vectors and figures.

材料及び方法
標的バキュロウィルスは、（ｉ）バクテリアプラスミド内での導入ベクターの生成、このプラスミドはバクテリア内で増殖し、そのＤＮＡ配列が組換えＤＮＡ配列の挿入を立証するために決定され；（ｉｉ）ｇｐ６４組換え体のどちらかの側における相同性非必須領域を介して、レシピエント昆虫細胞（ｓｆ９もしくはｓｆ２１）中へ同時トランスフェクションにより多切断されたＢｖゲノムへの導入ベクターの組換え、という２段階でつくられる。 Materials and Methods The target baculovirus is (i) generation of a transfer vector in a bacterial plasmid, this plasmid is propagated in bacteria and its DNA sequence is determined to verify the insertion of the recombinant DNA sequence; (ii) ) Recombination of the transfer vector into the Bv genome that has been polycleaved by co-transfection into recipient insect cells (sf9 or sf21) via homology non-essential regions on either side of the gp64 recombinant Made in two stages.

実験手順の一例は以下の通りである。
ＧｎＲＨ及びニューロテンシンレセプターに結合する、レセプターに必要とされた最小ペプチドをコードするＤＮＡ配列が決定され、両鎖についてＤＮＡオリゴヌクレオチドが化学的に合成され、これは、pBACsurfベクターへの挿入を容易にするためにＰｓｔＩ及びＫｐｎＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる（図４）。合成されたオリゴヌクレオチドは、それから、これらの制限エンドヌクレアーゼ部位を介して、ｐＢＡＣｓｕｒｆベクターに連結された。このペプチドの配列及びベクターのマップは後に示す。図５及び図６を参照。 An example of the experimental procedure is as follows.
A DNA sequence encoding the minimal peptide required for the receptor that binds to the GnRH and neurotensin receptors was determined, and DNA oligonucleotides were chemically synthesized for both strands, which facilitates insertion into the pBACsurf vector. To contain restriction endonuclease sites for PstI and KpnI (FIG. 4). The synthesized oligonucleotides were then ligated into the pBACsurf vector via these restriction endonuclease sites. The sequence of this peptide and the map of the vector are shown later. See FIG. 5 and FIG.

ＧｎＲＨペプチドコード配列（配列番号１）
ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＣＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣ
ＧｎＲＨアミノ酸配列（配列番号２）
ＬｅｕＧｌｎＧｌｎＨｉｓＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｙＡｌａＶａｌ
ニューロテンシンペプチドコード配列（配列番号３）
ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣ
ニューロテンシンペプチド（配列番号４）
ＬｅｕＧｌｎＧｌｕＬｅｕＴｙｒＧｌｕＡｓｎＬｙｓＰｒｏＡｒｇＡｒｇＰｒｏＴｙｒＩｌｅＬｅｕＡｌａＶａｌ GnRH peptide coding sequence (SEQ ID NO: 1)
CTGCAGCAACATTGGAGCTACGGCTTGCGCCCGGGCGCGGGTACC
GnRH amino acid sequence (SEQ ID NO: 2)
LeuGlnGlnHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyAlaVal
Neurotensin peptide coding sequence (SEQ ID NO: 3)
CTGCAGGAATTTGTACGAAAAAAAACCCGCGCCGCCCGTACATTTTGGCGGTACC
Neurotensin peptide (SEQ ID NO: 4)
LeuGlnGluLeuTyrGluAsnLysProArgArgProTyrIleLeuAlaVal

構築物についての全ＤＮＡ配列データは、最終構成物、とりわけｇｐ６４融合タンパク質のセグメントについて入手可能であろう。 Total DNA sequence data for the construct will be available for the final construct, particularly the segment of the gp64 fusion protein.

配列されたプラスミドは、それから、ｓｆ２１細胞への同時トランスフェクションによりBacvector-1000 Triple cut baculovirus DNA (Novagan)へ組み換えられる。その結果生じたバキュロウィルスは、組換えが起こった場合には単に生存可能であり、天然ｇｐ６４遺伝子座において挿入が起こらないので、、ｇｐ６４遺伝子について２倍体になる。これは、バキュロウィルスの高い感染性を維持するために必須であり、他の系、例えばＨＩＶにおいて観察されており、そこでenvタンパク質の改変が起こりうる。 The sequenced plasmid is then recombined into Bacvector-1000 Triple cut baculovirus DNA (Novagan) by co-transfection into sf21 cells. The resulting baculovirus is simply viable when recombination occurs and does not insert at the native gp64 locus, thus diploid for the gp64 gene. This is essential to maintain the high infectivity of baculovirus and has been observed in other systems, such as HIV, where env protein modification can occur.

pBACsurfベクターの更なる改変は、双方のヒト化配列（すなわち、ヒトプロモータ及び細胞表面付着配列）についての１回の組換え工程を容易にするために行われ、それにより第２のクローニング部位（ＭＣＳ２）が、組換え領域に挿入された。これは独特の（すなわち、このプラスミドに対して単一の切断部）ＲＥ部位を含んでいる。これは以下に示される。 Further modification of the pBACsurf vector is made to facilitate a single recombination step for both humanized sequences (ie, human promoter and cell surface attachment sequences), thereby creating a second cloning site (MCS2 ) Was inserted into the recombination region. This contains a unique (ie, a single break for this plasmid) RE site. This is shown below.

多組換えを誘導する他の方法は、単独改変pBACsurfを有するプロモータベクターpBACMAN2とBacvector-1000 Triple cut baculovirus DNAとをsf21昆虫細胞へ同時トランスフェクトすること及びポリメラーゼ連鎖反応により二重組換えのウィルスについて選別することである。これは、pBACsurf(MCS2)ベクターの容量が限られているので、大きな（＞３ｋｂ）プロモータフラグメントを挿入するときに選択する方法である。従って、組換えプラーク由来のウィルスＤＮＡは、野生種のＰＣＲ産生物及び挿入組換え体由来の大きな産生物により特徴付けられる。挿入の意義は、精製したＰＣＲ産物の直接的なＤＮＡの配列の決定により立証される。 Another method for inducing multiple recombination is to screen for double recombination viruses by co-transfecting promoter vector pBACMAN2 with single modified pBACsurf and Bacvector-1000 Triple cut baculovirus DNA into sf21 insect cells and polymerase chain reaction It is to be. This is the method of choice when inserting large (> 3 kb) promoter fragments due to the limited capacity of the pBACsurf (MCS2) vector. Thus, viral DNA from recombinant plaques is characterized by wild-type PCR products and large products from insert recombinants. The significance of the insertion is verified by direct DNA sequencing of the purified PCR product.

プロモータフラグメントは、ハイブリッドＣＡＧプロモータ（ＣＭＶエンハンサー（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＡＦ４７７２００））、鶏ベータアクチンプロモータ（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：Ｅ０２１９９）及びウサギベータグロブリンターミナーター（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＡＸ４５１７０６）を置換するために、pBACMAMベクターに挿入される。これを容易にするために、一般的な挿入構築物は、ｐＴ７ブルーベクターで準備され、これにより、そのプロモータはいずれかの指標遺伝子（エンハンストグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：Ｕ５７６０９）、又は共通のバクテリア指標クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ若しくはＣＡＴの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：Ｄ１４６４１）に融合したＥＧＦＰからなるハイブリッドのような、ヒト細胞で活性についてのもの）の上流に挿入される。この構築物は、ｐＴ７ブルーキャリアから切除され、ＳｐｈＩ／ＳｗａＩとＨｉｎｄIII／ＢｃII部位を介してpBACMAMベクターへ挿入される。pBACMAMベクターの多クローニング部位の使用（従って、ＢｇｌII、ＳｔｕI、Ｓａｅ８３８７、ＮｏｔI、ＫｐｎI、ＳｍａI、Ｂｓｕ３６そしてＭａｃI部位は保持している）、及びウサギベータグロブリンターミネーター（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃ．♯：ＡＸ４５１７０６）の上流へプロモータ構築物を挿入することも可能である。 The promoter fragment replaces the hybrid CAG promoter (CMV enhancer (Genbank acc. #: AF477200)), chicken beta actin promoter (Genbank acc. #: E02199) and rabbit beta globulin terminator (Genbank acc. #: AX451706). In order to be inserted into the pBACMAM vector. To facilitate this, a common insertion construct is prepared with the pT7 blue vector, whereby the promoter is either an indicator gene (Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) (Genbank acc. #: U57609), Alternatively, it is inserted upstream of a common bacterial indicator chloramphenicol acetyltransferase or activity in human cells, such as a hybrid consisting of EGFP fused to the gene for CAT (Genbank acc. #: D14641). This construct is excised from the pT7 blue carrier and inserted into the pBACMAM vector via the SphI / SwaI and HindIII / BcII sites. Use of multiple cloning sites in the pBACMAM vector (thus retaining the BglII, StuI, Sae8387, NotI, KpnI, SmaI, Bsu36 and MacI sites) and upstream of the rabbit beta globulin terminator (Genbank acc. #: AX451706) It is also possible to insert a promoter construct.

遺伝子地図はＧｅｎｅＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔｖ２（ＴｅｘｃｏＩｎｃ、ＵＳＡ）で作られる。 The genetic map is made with Gene Construction Kit v2 (Texco Inc, USA).

（実施例１）
１種の昆虫及び２種のヒト細胞株（表９）を感染するのに使用したバキュロウィルスは、強力な哺乳類ＣＡＧプロモータの制御の下で、ＥＧＦＰレポーター遺伝子運ぶように処理された組換えＡｃＭＮＰＶである。ヒト細胞は、蛍光顕微鏡を用いて、ＥＧＦＰ発現を視覚化して（図１）、４８時間後の感染を調べた。意義深いことに、視覚化した検査は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞へのin vitroでの感染の効率が、２９３細胞のものと等価であったことを示唆している（フローサイトメトリー解析で２５％、データは示していない）。はっきりとしたＥＧＦＰ発現は、昆虫Ｓｆ−９細胞中のＣＡＧプロモータからは見られない（データは示していない）。全ＲＮＡはすべての細胞から抽出し、バキュロウィルスｍＲＮＡに対して設計された６セットのプライマーに、ヒト細胞についてのポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨプライマーを加えたものを用いて、ＲＴーＰＣＲを実行した。 Example 1
The baculovirus used to infect one insect and two human cell lines (Table 9) is a recombinant AcMNPV engineered to carry an EGFP reporter gene under the control of a strong mammalian CAG promoter. is there. Human cells were examined for infection 48 hours later by visualizing EGFP expression using a fluorescence microscope (FIG. 1). Significantly, the visualized test suggests that the efficiency of in vitro infection of LNCaP prostate cancer cells was equivalent to that of 293 cells (25% by flow cytometry analysis, Data not shown). Clear EGFP expression is not seen from the CAG promoter in insect Sf-9 cells (data not shown). Total RNA was extracted from all cells and RT-PCR was performed using 6 sets of primers designed for baculovirus mRNA plus G3PDH primer as a positive control for human cells.

ｓｆ９細胞において、調べられた６つの遺伝子の中から４つの発現が、ＲＴ−ＰＣＲによって、感染していない細胞では検出されなかったが感染した細胞では検出され（図２）、これは、バキュロウィルス特有の発現であることを示していた。この例外は、ユビキチン遺伝子とｅｇｔ遺伝子である。バキュロウィルスユビキチンに対して設計されたプライマーを用いて、非感染細胞では発現水準が非常に低いが、感染昆虫細胞と非感染昆虫細胞の双方においてユビキチンの発現が検出された（図２）。これは、ユビキチンが高度に保存された分子であるという点において説明でき、同じ大きさのＲＴ−ＰＣＲ産物を生成するために、昆虫ユビキチンとバキュロウィルスユビキチンとの間に十分な相同性があるのかもしれない。バキュロウィルスユビキチンは、実際には、進化の間に昆虫細胞宿主由来であったかもしれない可能性もある。もう一方の例外は、感染及び非感染細胞のどちらでも発現しなかったｅｇｔ遺伝子であった（図２）。ｅｇｔは、幼生期の脱皮を避けるために、バキュロウィルスのライフサイクルのかなり初期に発現され、そしてｓｆ９細胞は蛹の卵巣組織に由来している。それゆえ、蛹の段階では見い出せず、またｅｇｔ発現に必要な要因が宿主の幼生形に存在すると仮定できる。 In sf9 cells, 4 out of 6 genes examined were detected by RT-PCR in uninfected cells but not in infected cells (FIG. 2), which is a baculovirus. It was a unique expression. The exceptions are the ubiquitin gene and the egt gene. Using primers designed for baculovirus ubiquitin, ubiquitin expression was detected in both infected and uninfected insect cells, although the expression level was very low in uninfected cells (FIG. 2). This can be explained in that ubiquitin is a highly conserved molecule, and there is sufficient homology between insect and baculovirus ubiquitins to produce RT-PCR products of the same size. It may be. It is possible that baculovirus ubiquitin may actually have been derived from an insect cell host during evolution. The other exception was the egt gene that was not expressed in either infected or uninfected cells (Figure 2). Egt is expressed very early in the baculovirus life cycle to avoid molting in the larval period, and sf9 cells are derived from pupal ovarian tissue. Therefore, it cannot be found at the stage of wrinkles, and it can be assumed that factors necessary for expression of egt exist in the larval form of the host.

（実施例２）
ヒト細胞での発現解析のため、２９３ヒト胚腎細胞株が、その報告されているバキュロウィルスによる感染の容易性（Condreay JP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999;96:127-132;Boyce FM, Bucher NLR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:2348-2352)、および発現を誘発されうる広い範囲の遺伝子のために選択された。加えて、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株（リンパ節転移癌細胞由来）は、前立腺癌遺伝子治療のモデルとして、とりわけこれらの細胞は、リポソーム主体技術によって形質導入することが難しいために選択された。これらの双方の細胞株についてのＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＧＡＧ制御ＥＧＦＰの高い発現レベルにもかかわらず、調べた６つの遺伝子のいずれも、双方の細胞株の非感染もしくは感染細胞でも発現しないことを示している（図３）。ハウスキーピング遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ、Ｇ３ＰＤＨが、かなり少ないＰＣＲサイクル（バキュロウィルスのｍＲＮＡをスクリーニングするときは３５サイクルであるのと比較して２５サイクル）を用いて、双方の細胞株における非感染及び感染細胞にも見出せた。これらの結果は、バキュロウィルスに見られる内生遺伝子の代表的な部分（そのほとんどが、通常のバキュロウィルス真核細胞宿主環境下で高度に発現し、また必須ヒト細胞プロセスと相互作用する）が、このウィルスがヒト細胞への感染に用いられる場合は発現しないことを示している。対照的に、哺乳類プロモータの制御下で、レポーター遺伝子から効率的にタンパク質は生成される。バキュロウィルスの遺伝子発現もゲノムの取込みも複雑でなさそうなため、このバキュロウィルスのヒト細胞での発現欠落が、バキュロウィルスの遺伝子治療のベクターとして、とりわけ一過性自己不活性化遺伝子プロトコールとして、安全性の更なる基礎となる。 (Example 2)
For expression analysis in human cells, the 293 human embryonic kidney cell line has been reported to be easily infected by baculovirus (Condreay JP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 127-132; Boyce FM, Bucher NLR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 2348-2352), and a wide range of genes that could induce expression. In addition, the LNCaP prostate cancer cell line (derived from lymph node metastasis cancer cells) was selected as a model for prostate cancer gene therapy, especially because these cells are difficult to transduce by liposome-based techniques. RT-PCR results for both of these cell lines show that despite the high level of expression of GAG-regulated EGFP, none of the six genes examined is expressed in uninfected or infected cells of both cell lines (FIG. 3). The housekeeping gene messenger RNA, G3PDH, uses significantly fewer PCR cycles (25 cycles compared to 35 cycles when screening for baculovirus mRNA), using both uninfected and infected cells in both cell lines. I also found it. These results indicate that a representative portion of the endogenous genes found in baculoviruses, most of which are highly expressed in normal baculovirus eukaryotic host environments and interact with essential human cellular processes. This indicates that this virus is not expressed when used to infect human cells. In contrast, proteins are efficiently produced from reporter genes under the control of a mammalian promoter. Since baculovirus gene expression and genomic uptake seem to be complex, the lack of expression of baculovirus in human cells is a baculovirus gene therapy vector, especially as a transient self-inactivating gene protocol. A further basis for safety.

図１は、バキュロウィルスを基盤とするベクターＡｃＭＮＰＶのレポーター遺伝子発現を表している。FIG. 1 represents the reporter gene expression of the vector AcMNPV based on baculovirus. 図２は、挿入した細胞ｓｆ９内で、バキュロウィルスのＡｃＭＮＰＶの発現を表している。FIG. 2 shows the expression of Baculovirus AcMNPV in the inserted cell sf9. 図３は、哺乳類細胞におけるバキュロウィルスのコードした遺伝子発現の欠落を表している。FIG. 3 represents the absence of baculovirus encoded gene expression in mammalian cells. 図４は、バキュロウィルスベクター、ｐＢＡｓｕｒｆ−１ＭＣＳ２を表している。FIG. 4 represents the baculovirus vector, pBAsurf-1 MCS2. 図５は、バキュロウィルスベクター、ｐＢＡｓｕｒｆ−１ＧｎＲＨ（ＭＫII）を表している。FIG. 5 represents the baculovirus vector, pBAsurf-1 GnRH (MKII). 図６は、バキュロウィルスベクター、ｐＢａｃＭａｍ２ＥＧＦＰを表している。FIG. 6 represents the baculovirus vector, pBacMam2 EGFP.

Claims

治療剤をコードする第１の核酸分子と、バキュロウィルスを少なくとも１種の細胞タイプの細胞表面に結合させる、配列番号４におけるアミノ酸配列を含むニューロテンシンペプチドに融合したバクロウィルスキャプシドポリペプチドをコードする第２の核酸分子とを含むように改変されているバキュロウィルスゲノムを有するバキュロウィルス。A first nucleic acid molecule encoding a therapeutic agent and a baculovirus capsid polypeptide fused to a neurotensin peptide comprising the amino acid sequence in SEQ ID NO: 4 that binds baculovirus to the cell surface of at least one cell type. A baculovirus having a baculovirus genome that has been modified to include a second nucleic acid molecule.

前記ゲノムが前記核酸分子の真核性遺伝子発現に適合されている請求項１に記載のバキュロウィルス。 2. A baculovirus according to claim 1, wherein the genome is adapted for eukaryotic gene expression of the nucleic acid molecule.

治療剤をコードしている前記核酸の発現が、癌特異的プロモータにより制御されている請求項１に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 1, wherein the expression of the nucleic acid encoding the therapeutic agent is controlled by a cancer-specific promoter.

前記癌特異的プロモータが前立腺癌細胞特異的プロモータである請求項３に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 3, wherein the cancer-specific promoter is a prostate cancer cell-specific promoter.

前記治療剤がポリペプチドである請求項１から４のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to any one of claims 1 to 4, wherein the therapeutic agent is a polypeptide.

前記ポリペプチドがｐ５３、網膜芽細胞腫、ＡＰＣポリペプチド、ＤＰＣ−４ポリペプチド、ＢＲＣＡ−１ポリペプチド、ＢＲＣＡ−２ポリペプチド、ＷＴ−１ポリペプチド、ＭＭＡＣ−１ポリペプチド、家族性ポリープ症大腸ポリペプチドから成る群より選択される腫瘍抑制ポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 The polypeptide is p53, retinoblastoma, APC polypeptide, DPC-4 polypeptide, BRCA-1 polypeptide, BRCA-2 polypeptide, WT-1 polypeptide, MMAC-1 polypeptide, familial polyposis colon The baculovirus according to claim 5, which is a tumor suppressor polypeptide selected from the group consisting of polypeptides .

前記ポリペプチドが抗原性ペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is an antigenic peptide.

前記抗原性ポリペプチドが前立腺腫瘍拒絶抗原である請求項７に記載のバキュロウィルス。The baculovirus according to claim 7, wherein the antigenic polypeptide is a prostate tumor rejection antigen.

前記ポリペプチドが細胞傷害性ポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is a cytotoxic polypeptide.

前記細胞傷害剤がシュードモナスエキソトキシン、リシントキシン、ジフテリアトキシンからなる群より選択される請求項９に記載のバキュロウィルス。Wherein said cytotoxic agent is Pseudomonas exotoxin, ricin toxin, diphtheria butoxy down or Ranaru baculovirus of claim 9 which is selected from the group.

前記ポリペプチドが細胞周期停止誘発ポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is a cell cycle arrest-inducing polypeptide.

前記ポリペプチドが、ｐ２１、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、ｐ１９、ＰＴＥＮから成る群より選択される請求項１１に記載のバキュロウィルス。The baculovirus according to claim 11, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of p21, p16, p15, p18, p19, PTEN .

前記治療ポリペプチドが医薬活性ポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 6. The baculovirus according to claim 5, wherein the therapeutic polypeptide is a pharmaceutically active polypeptide.

前記ポリペプチドがサイトカインである請求項１３に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 13, wherein the polypeptide is a cytokine.

前記サイトカインが、成長ホルモン、レプチン、エリトロポエチン、プロラクチン、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２のｐ５３サブユニット、ＩＬ１３、ＩＬ１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＩＦＮαから成る群より選択される請求項１４に記載のバキュロウィルス。The cytokine is growth hormone, leptin, erythropoietin, prolactin, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, p53 subunit of IL12, IL13, IL15, G-CSF, GM-CSF, CNTF The baculovirus according to claim 14, selected from the group consisting of: CT-1, LIF, Oncostatin M, IFNα .

前記ポリペプチドが抗体もしくはそれの活性結合フラグメントである請求項５に記載のバキュロウィルス。 6. The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is an antibody or an active binding fragment thereof.

前記フラグメントがＦａｂフラグメントである請求項１６に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 16, wherein the fragment is a Fab fragment.

前記ポリペプチドがアポトーシスを誘発するポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is a polypeptide that induces apoptosis.

前記ポリペプチドが、ｐ５３、アデノウィルスＥ３．１１．６Ｋ、アデノウィルスＥ４、アデノウィルスｆ４、キャスパーゼ、Ｆａｓリガンド、Ｃ−Ｃａｍ１、ＯＤＣ、ＯＡＺ、スペルミジン／スペルミンＮ１アセチルトランスフェラーゼ、ＺＮＦ１４５、ＰＴＥＮフォスファターゼ、アンドロゲンレセプター、Ｂｃｌ２から成る群より選択される請求項１８に記載のバキュロウィルス。The polypeptide is p53, adenovirus E3.11.6K, adenovirus E4, adenovirus f4, caspase, Fas ligand, C-Cam 1, ODC, OAZ, spermidine / spermine N1 acetyltransferase, ZNF145, PTEN phosphatase, androgen receptor, Bcl2. 19. A baculovirus according to claim 18 selected from the group consisting of:

前記ポリペプチドがプロドラッグ活性化ポリペプチドである請求項５に記載のバキュロウィルス。 6. The baculovirus according to claim 5, wherein the polypeptide is a prodrug activating polypeptide.

前記ポリペプチドが、サイトカインデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、ニトロレダクターゼＲｄｘＡ、チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１Ａ２、チトクロームＰ４５０ＣＹＰ２Ｅ１、チトクロームＰ４５０ＣＹＰ３Ａ４から成る群から選択される請求項２０に記載のバキュロウィルス。 21. The baculovirus according to claim 20, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of cytokine deaminase, thymidine kinase, nitroreductase RdxA, cytochrome P450 CYP1A2, cytochrome P450 CYP2E1, cytochrome P450 CYP3A4 .

前記ポリペプチドが抗血管新生(antiangiogenic)活性を有する請求項２１に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 21, wherein the polypeptide has anti-angiogenic activity.

前記ポリペプチドがアンジオスタチン、Ｔｉｅ２、エンドスタチンからなる群より選択される請求項２２に記載のバキュロウィルス。Said polypeptide Anjiosutachi down, Tie 2, baculovirus of claim 22 which is selected from Endosutachi down or Ranaru group.

前記治療剤がアンチセンス核酸分子である請求項１に記載のバキュロウィルス。The baculovirus according to claim 1, wherein the therapeutic agent is an antisense nucleic acid molecule.

前記アンチセンス核酸分子が細胞周期調整遺伝子をコードする核酸分子に結合する請求項２４に記載のバキュロウィルス。 25. The baculovirus of claim 24, wherein the antisense nucleic acid molecule binds to a nucleic acid molecule encoding a cell cycle regulatory gene.

前記細胞周期調整遺伝子が、ｐ２１、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、ｐ１９、ＰＴＥＮから成るより選択される請求項２５に記載のバキュロウィルス。26. The baculovirus according to claim 25, wherein the cell cycle regulatory gene is selected from p21, p16, p15, p18, p19, PTEN .

前記アンチセンス核酸分子が、アポトーシス阻害物質をコードする核酸分子に結合する請求項２４に記載のバキュロウィルス。 25. The baculovirus of claim 24, wherein the antisense nucleic acid molecule binds to a nucleic acid molecule that encodes an apoptosis inhibitor.

前記アポトーシス阻害物質がカベオリンである請求項２７に記載のバキュロウィルス。Baculovirus of claim 27 wherein the apoptosis-inhibiting substance is Kabeori down.

前記治療剤が二重鎖ＲＮＡ分子である請求項１に記載のバキュロウィルス。The baculovirus according to claim 1, wherein the therapeutic agent is a double-stranded RNA molecule.

前記治療剤がリボザイムである請求項１に記載のバキュロウィルス。The baculovirus according to claim 1, wherein the therapeutic agent is a ribozyme.

前記キャプシドポリペプチドがｇｐ６４である請求項１に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 1, wherein the capsid polypeptide is gp64.

前記細胞タイプが前立腺癌細胞である請求項１に記載のバキュロウィルス。 The baculovirus according to claim 1, wherein the cell type is a prostate cancer cell.

請求項１に記載のバキュロウィルスを含む医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising the baculovirus according to claim 1 .