JP4469938B2 - Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide - Google Patents
Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- JP4469938B2 JP4469938B2 JP2005005870A JP2005005870A JP4469938B2 JP 4469938 B2 JP4469938 B2 JP 4469938B2 JP 2005005870 A JP2005005870 A JP 2005005870A JP 2005005870 A JP2005005870 A JP 2005005870A JP 4469938 B2 JP4469938 B2 JP 4469938B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- histone methyltransferase
- methyltransferase activity
- screening method
- smyd3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドを用いたスクリーニング法に関する。 The present invention relates to a screening method for a histone methyltransferase activity regulator. More specifically, the present invention relates to a screening method using a high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide.
ＳＭＹＤタンパク質は、亜鉛フィンガー、ＭＹＮＤドメイン、ＳＥＴドメインを持つタンパク質である。ＳＭＹＤタンパク質として、ＳＭＹＤ１（配列番号：２）、ＳＭＹＤ２（配列番号：４）、ＳＭＹＤ３（配列番号：６）、ＳＭＹＤ４（配列番号：８）、ＳＭＹＤ５（配列番号：１０）の５つのタンパク質が知られている。（以下、これら５つのタンパク質を総称して「ＳＭＹＤファミリータンパク質」と称することもある。)ＳＭＹＤ３は、大腸癌や肝癌で遺伝子発現が増加すること、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を持つことが知られている（特許文献１参照）。 The SMYD protein is a protein having a zinc finger, a MYND domain, and a SET domain. There are five known SMYD proteins, SMYD1 (SEQ ID NO: 2), SMYD2 (SEQ ID NO: 4), SMYD3 (SEQ ID NO: 6), SMYD4 (SEQ ID NO: 8), and SMYD5 (SEQ ID NO: 10). ing. (Hereinafter, these five proteins may be collectively referred to as “SMYD family proteins”.) SMYD3 is known to have increased gene expression in colon cancer and liver cancer and to have histone methyltransferase activity. (See Patent Document 1).
ヒストンとは、真核細胞の核内に広く存在し、ＤＮＡとイオン結合している塩基性タンパク質である。ＤＮＡはヒストンとの規則的な結合により折りたたまれ、ヌクレオソームを形成する。さらに、ヌクレオソームの繰り返し構造がらせん状につながりクロマチンとよばれる高次構造を形成する。ヒストンは、通常Ｈ１（分子量２２，０００）、Ｈ２Ａ（分子量１３，７００）、Ｈ２Ｂ（分子量１３，７００）、Ｈ３（分子量１５，７００）、Ｈ４（分子量１１，２００）からなる。特に、Ｈ３及びＨ４は高く保存されている。ヒストンの特定のアミノ酸側鎖はメチル化、アセチル化、ＡＤＰリボシル化、リン酸化等の多様な修飾が起こることが知られており、クロマチンの高次構造形成や遺伝子発現調節、細胞周期制御等と深く関わっている。特に、ヒストンＨ３のＮ末端から4番目のリジン（Ｈ３Ｋ４）のメチル化、特にトリメチル化により、クロマチン凝縮が阻害され、転写活性化されることが知られている（非特許文献１及び２参照）。
Histones are basic proteins that are widely present in the nucleus of eukaryotic cells and ionically bond with DNA. DNA is folded by regular binding with histones to form nucleosomes. Furthermore, the repeating structure of nucleosomes is connected in a spiral to form a higher order structure called chromatin. Histone is usually composed of H1 (molecular weight 22,000), H2A (molecular weight 13,700), H2B (molecular weight 13,700), H3 (molecular weight 15,700), H4 (molecular weight 11,200). In particular, H3 and H4 are highly conserved. Specific amino acid side chains of histones are known to undergo various modifications such as methylation, acetylation, ADP ribosylation, phosphorylation, etc. Deeply involved. In particular, it is known that chromatin condensation is inhibited and transcription is activated by methylation, particularly trimethylation, of the fourth lysine (H3K4) from the N-terminus of histone H3 (see Non-Patent
ＳＭＹＤ３はヒストンＨ３のＮ末端から4番目のリジンのトリメチル化を行い、転写を活性化させる。その結果、細胞増殖が起こり、癌化することが示唆されている（非特許文献３参照）。このことから、ＳＭＹＤ３に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制剤は、転写活性化を抑制し、癌の予防剤又は治療剤として使用することができることが考えられる。しかし、野生型のＳＭＹＤ３タンパク質は、従来報告されている試験管内の酵素アッセイ系では非常に弱い活性しか示さないために、ＳＭＹＤ３に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制剤のスクリーニング方法には使用することができない状態にあった。
本発明の目的は、ＳＭＹＤファミリータンパク質を用いた実験系において、高酵素活性変異ポリペプチドを用いて、より効率的にヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤をスクリーニングすることができる方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method capable of screening a histone methyltransferase activity regulator more efficiently using a high enzyme activity mutant polypeptide in an experimental system using an SMYD family protein.
ＳＭＹＤ３は公知のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素である。しかし、試験管内の酵素アッセイ系で、該酵素を用いてスクリーニングを試みても、その活性は非常に小さく、野生型のＳＭＹＤ３タンパク質を用いてヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤をスクリーニングすることは非常に困難であった。 SMYD3 is a known enzyme having histone methyltransferase activity. However, even when screening is performed using the enzyme in an in vitro enzyme assay system, the activity is very small, and it is very difficult to screen for a histone methyltransferase activity regulator using wild-type SMYD3 protein. Met.
本発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号：６の1位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸配列において、N末端より４５アミノ酸（配列番号：６の１位のＭｅｔから４５位のＡｒｇまでのアミノ酸）が欠失したＳＭＹＤ３変異ポリペプチド（3XFLAG-SMYD3-Δ1タンパク質）、及びN末端より９９アミノ酸（配列番号：６の１位のＭｅｔから９９位のＰｒｏまでのアミノ酸）が欠失したＳＭＹＤ３変異ポリペプチド（3XFLAG-SMYD3-Δ2タンパク質）が野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の約３〜１０倍という高い酵素活性を持つという驚くべき知見を見出した。また、C末端より１７５アミノ酸（配列番号：６の２５１位のＬｙｓから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸）が欠失したＳＭＹＤ３変異ポリペプチド（3XFLAG-SMYD3-Δ4タンパク質）では、野生型ＳＭＹＤ３タンパク質と同等の活性値であることを確認した。以上のことから、ＳＭＹＤ３のＮ端を欠失させることがヒストンメチルトランスフェラーゼの活性上昇には重要であること、ＳＥＴドメインよりＣ端側はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性に影響を与えないことが示唆された。よって、Ｎ端を欠失させたＳＭＹＤ３変異ポリペプチドを用いることにより、効率よくヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤をスクリーニングする方法を提供することができる。
As a result of diligent research, the present inventors have found that 45 amino acids from the N-terminal in the amino acid sequence from Met at
また、ＳＥＴドメインがヒストン内のリジンをメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼの活性中心であることが示唆されている（Nat. Cell Biol.、Vol. ６、７３１−７４０（２００４））ことから、ＳＭＹＤ３以外のＳＭＹＤタンパク質であるＳＭＹＤ１、ＳＭＹＤ２、ＳＭＹＤ４、ＳＭＹＤ５もヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有している可能性が高い。そのため、ＳＭＹＤ１、ＳＭＹＤ２、ＳＭＹＤ４、ＳＭＹＤ５についても、ＳＭＹＤ３と同様に欠失変異体を作製することによって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を容易に測定することができ、効率よくヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤をスクリーニングすることができると考えられる。 Further, it is suggested that the SET domain is an active center of histone methyltransferase that methylates lysine in histone (Nat. Cell Biol., Vol. 6, 731-740 (2004)). The SMYD proteins SMYD1, SMYD2, SMYD4, and SMYD5 are also likely to have histone methyltransferase activity. Therefore, also for SMYD1, SMYD2, SMYD4, and SMYD5, it is possible to easily measure histone methyltransferase activity by preparing deletion mutants in the same manner as SMYD3, and efficiently screen for histone methyltransferase activity regulators. It is considered possible.
すなわち、本発明は、
（１）被検物質の存在下、
ＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするアミノ酸配列において、ＳＥＴドメインよりＮ末端側のアミノ酸の、１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつＳＥＴドメイン外のアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤファミリータンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異ポリペプチド、
ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質、及び
メチル基供与体
をインキュベーションし、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定することを特徴とする、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法、
（２）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の1位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸配列において、１位のＭｅｔから１９１位のＧｌｎまでのアミノ酸の、1位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつ１位のＭｅｔから１９１位のＧｌｎまでのアミノ酸、及び２４２位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の２位のＧｌｕから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（２）記載のスクリーニング方法、
（４）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の４６位のＧｌｙから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（２）記載のスクリーニング方法、
（５）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の１００位のＡｓｐから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（２）記載のスクリーニング方法、
（６）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の４６位のＧｌｙから１００位のＡｓｐまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（２）記載のスクリーニング方法、
（７）該変異ポリペプチドが、配列番号：６の４６位のＧｌｙから１００位のＡｓｐまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２５１位のＬｙｓから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するものである、（２）記載のスクリーニング方法、
（８）該ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質が、ヒストンＨ３又はそのＮ末端から４番目のリジンのメチル化部位を有する断片である、（１）〜（７）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（９）該メチル基供与体がS-アデノシル-L-メチオニンである、（１）〜（８）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（１０）該メチル基供与体がメチル基が標識されたS-アデノシル-L-メチオニンである、（９）記載のスクリーニング方法、
（１１）該メチル供与体が放射性標識されたものであり、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質に転移したメチル基の放射能を測定することにより該ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定する、（１０）記載のスクリーニング方法、
（１２）メチル化部位に特異的な抗体を使用することにより、該ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を免疫学的に測定する、（１）〜（８）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（１３）ＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするアミノ酸配列において、ＳＥＴドメインよりＮ末端側のアミノ酸の、１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつＳＥＴドメイン外のアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなり、かつ野生型タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異ポリペプチドを含有する、（１）〜（１２）いずれかに記載の方法に使用するためのスクリーニング用キット、
（１４）ＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするアミノ酸配列において、ＳＥＴドメインよりＮ末端側のアミノ酸の、１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつＳＥＴドメイン外のアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなり、かつ野生型タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法に使用するためのスクリーニング用キット、に関する。
That is, the present invention
(1) In the presence of the test substance,
In the amino acid sequence encoding the SMYD family protein, at least one or more amino acids are continuously deleted from Met at
A method for screening a histone methyltransferase activity regulator, comprising: incubating a substrate for histone methyltransferase activity and a methyl group donor, and measuring histone methyltransferase activity;
(2) In the amino acid sequence from Met at
(3) The amino acid starting from any amino acid from Glu at position 2 to Glu at
(4) The mutant polypeptide starts with any amino acid from Gly at position 46 to Glu at
(5) The mutant polypeptide starts with any amino acid from Asp at
(6) The amino acid starting from any amino acid from Gly at position 46 to Asp at
(7) The amino acid that the mutant polypeptide starts with any amino acid from Gly at position 46 to Asp at
(8) The screening method according to any one of (1) to (7), wherein the substrate for histone methyltransferase activity is a fragment having a methylation site of histone H3 or the fourth lysine from the N-terminus thereof,
(9) The screening method according to any one of (1) to (8), wherein the methyl group donor is S-adenosyl-L-methionine,
(10) The screening method according to (9), wherein the methyl group donor is S-adenosyl-L-methionine labeled with a methyl group,
(11) The screening according to (10), wherein the methyl donor is radiolabeled, and the histone methyltransferase activity is measured by measuring the radioactivity of the methyl group transferred to the substrate for histone methyltransferase activity. Method,
(12) The screening method according to any one of (1) to (8), wherein the histone methyltransferase activity is immunologically measured by using an antibody specific for a methylation site,
(13) In the amino acid sequence encoding an SMYD family protein, at least one or more amino acids are continuously deleted from Met at
(14) In the amino acid sequence encoding the SMYD family protein, at least one or more amino acids are continuously deleted from Met at
本発明のスクリーニング方法によって、ＳＭＹＤファミリータンパク質が関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、ＳＭＹＤ３に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制剤は、癌、免疫疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。 By the screening method of the present invention, a histone methyltransferase activity regulator involving SMYD family proteins can be efficiently screened. The histone methyltransferase inhibitor involved in SMYD3 can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer, immune diseases and the like.
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。 The terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. In the following, the terms used in this specification will be explained.
本発明において使用される「変異ポリペプチド（本明細書中、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドともいう）」とは、野生型のＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするアミノ酸配列において、ＳＥＴドメインよりＮ端側のアミノ酸の、１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつ野生型ＳＭＹＤファミリータンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体をいう。ここで野生型のＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするアミノ酸配列としては、ＳＭＹＤ１では配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＳＭＹＤ２では配列番号：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＳＭＹＤ３では配列番号：６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＳＭＹＤ４では配列番号：８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＳＭＹＤ５では配列番号：１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
The “mutant polypeptide (also referred to herein as a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide)” used in the present invention is an amino acid sequence encoding a wild-type SMYD family protein, which is N-terminal from the SET domain. A mutant in which at least one or more amino acids are continuously deleted from Met at
上記、「１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失した変異体」とは、例えば、Ｎ末端から１０以上のアミノ酸が欠失した変異体、２０以上のアミノ酸が欠失した変異体、３０以上のアミノ酸が欠失した変異体、４０以上のアミノ酸が欠失した変異体、４５以上のアミノ酸が欠失した変異体、９９以上のアミノ酸が欠失した変異体等を意味する。なお、ＳＥＴドメインよりＣ端側のアミノ酸配列は、欠失していてもよい。
The above-mentioned “variant in which at least one or more amino acids are deleted continuously from Met at
例えば、ＳＭＹＤ３の場合は、（１）配列番号：６の1位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸配列において、１位のＭｅｔから１９１位のＧｌｎまでのアミノ酸の、１位のＭｅｔから連続して少なくとも１以上のアミノ酸が欠失し、かつ１位のＭｅｔから１９１位のＧｌｎまでのアミノ酸、及び２４２位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されていてもよいアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体である。より具体的には、（２）配列番号：６の２位のＧｌｕから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体、（３）配列番号：６の４６位のＧｌｙから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体、（４）配列番号：６の１００位のＡｓｐから１９２位のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体、（５）配列番号：６の４６位のＧｌｙから１００位のＡｓｐまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体、（６）配列番号：６の４６位のＧｌｙから１００位のＡｓｐまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２５１位のＬｙｓから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異体、又は上記変異体と実質的に同様の性質を有するもの等が挙げられる。より具体的には、下記実施例にて使用される、野生型ＳＭＹＤ３タンパク質のＮ端から４５アミノ酸が欠失したＳＭＹＤ３Δ１及びＮ端から９９アミノ酸が欠失したＳＭＹＤ３Δ２等が挙げられる。
For example, in the case of SMYD3, (1) in the amino acid sequence from Met at
本明細書において、「ＳＥＴドメイン」とは、メチルトランスフェラーゼ活性を持つ酵素群が持つＳＥＴドメインと呼ばれる領域の中で特に保存されている配列を意味する。ＳＭＹＤ１では配列番号：２の１９４位のＧｌｙから２５４位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を意味する。ＳＭＹＤ２では配列番号：４の１９３位のＨｉｓから２４２位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を意味する。ＳＭＹＤ３では配列番号：６の１９２位のＧｌｕから２４１位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を意味する。ＳＭＹＤ４では配列番号：８の５３６位のＳｅｒから５７１位のＨｉｓまでのアミノ酸配列を意味する。ＳＭＹＤ５では配列番号：１０の１８８位のＧｌｙから２３７位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を意味する。
In the present specification, the “SET domain” means a sequence that is particularly conserved in a region called a SET domain possessed by a group of enzymes having methyltransferase activity. In SMYD1, it means the amino acid sequence from Gly at position 194 to Asp at position 254 of SEQ ID NO: 2. In SMYD2, it means the amino acid sequence from His at position 193 to Asp at position 242 in SEQ ID NO: 4. In SMYD3, it means the amino acid sequence from Glu at
「ＳＥＴドメイン外のアミノ酸」とは、ＳＥＴドメインよりＮ末端側のアミノ酸及びＳＥＴドメインよりＣ末端側のアミノ酸を意味する。たとえば、ＳＭＹＤ３では配列番号：６の１位のＭｅｔから１９１位のＧｌｎまでのアミノ酸、及び２４２位のＭｅｔから４２８位のＳｅｒまでのアミノ酸が該当する。
The “amino acid outside the SET domain” means an amino acid on the N-terminal side from the SET domain and an amino acid on the C-terminal side from the SET domain. For example, SMYD3 corresponds to amino acids from Met at
高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、作製することができる。 Highly enzyme-active SMYD family mutant polypeptides are described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular 94 (Current Protocols in Molecular 94). For example, it can be manufactured by the following method.
ヒトの脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、ＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするＤＮＡを取得する。また、オリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。こうして得られたＳＭＹＤファミリータンパク質をコードするＤＮＡを適切な制限酵素で切断することにより、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。 By constructing a cDNA library from human brain, heart, skeletal muscle, spleen, kidney, liver, small intestine, placenta, human normal cells derived from these tissues, and human umbilical vein endothelial cells, a SMYD family protein is obtained. Obtain the encoding DNA. The target SMYD family protein can also be obtained by performing PCR using oligonucleotides as sense and antisense primers and using cDNA prepared from mRNA of cells expressing mRNA complementary to these DNAs as a template. Can be prepared. A DNA encoding a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide can be obtained by cleaving the thus obtained DNA encoding the SMYD family protein with an appropriate restriction enzyme.
さらに、アミノ酸配列に基づいて、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによって、調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。 Furthermore, it can be prepared by chemically synthesizing DNA encoding a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide based on the amino acid sequence. The chemical synthesis of DNA can be performed using a Shimadzu DNA synthesizer using the thiophosphite method, a Perkin Elmer DNA synthesizer model 392 using the phosphoramidite method, or the like.
上記の方法で得られた高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドのＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。 Recombinant DNA (expression plasmid) is prepared by inserting the DNA of the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide obtained by the above method downstream of the promoter of an appropriate expression vector. By introducing the expression plasmid into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide can be obtained.
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドをコードする遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 Any host cell can be used as long as it can express the target gene, such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells. The expression vector can be autonomously replicated in the above host cell or can be integrated into the chromosome, and contains a promoter at a position suitable for transcription of a gene encoding a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide. Things are used.
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列」とは、例えば、（A）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（B）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（C）アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（D）アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（E）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用される高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドは、欠失、付加、挿入又は置換によっても、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。例えば、配列番号：２、４、６、８及び１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する部分ペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有する部分ペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有する部分ペプチドを挙げることができる。高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドのアミノ酸配列の欠失、付加、挿入又は置換は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。 “Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, added, inserted or substituted” means, for example, (A) one or two or more (preferably about 1 to 30 in the amino acid sequence, preferably An amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably (1 to 5) amino acids have been deleted, and (B) one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 30, preferably 1) About 10 to 10 amino acids, more preferably a number (1-5) amino acids added, (C) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 10) amino acid sequences An amino acid sequence into which about (1 to 5) amino acids have been inserted, or (D) one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 10) About one, more preferably a number (1 (5) A protein containing an amino acid sequence in which amino acids are substituted with other amino acids, or (E) an amino acid sequence combining them. When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited. However, the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide used in the present invention is a polypeptide having histone methyltransferase activity even by deletion, addition, insertion or substitution. For example, a partial peptide having at least 60% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10, preferably a partial peptide having 80% or more homology, more preferably 95 And a partial peptide having homology of at least%. Deletion, addition, insertion or substitution of the amino acid sequence of the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide can be performed by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique before filing.
ＳＭＹＤファミリータンパク質のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、本発明のスクリーニング方法に使用する測定方法を用いて測定することが可能である。該測定方法に関しては、後述する。 The histone methyltransferase activity of SMYD family proteins can be measured using the measurement method used in the screening method of the present invention. The measurement method will be described later.
「野生型ＳＭＹＤファミリータンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するか否かは、例えば、以下の様に確認することができる。
高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質及びメチル基供与体を接触させ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定し、同一の条件における野生型ＳＭＹＤファミリータンパク質のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性と比較することにより、調べることができる。たとえば、実施例３に記載の方法などに従って比較し、決定することができる。
“Whether having a histone methyltransferase activity three times or more that of the wild-type SMYD family protein can be confirmed, for example, as follows.
Contacting a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, a substrate for histone methyltransferase activity, and a methyl group donor, measuring histone methyltransferase activity and comparing it to the histone methyltransferase activity of wild-type SMYD family proteins under the same conditions Can be investigated. For example, the determination can be made by comparison according to the method described in Example 3.
「ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質」とは、ヒストン、例えば、ヒストンＨ３、Ｎ末端から４番目のリジンのメチル化部位を有するヒストンＨ３ペプチドの断片等が挙げられる。該ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質には、ラベル化抗体認識タグが付加していてもよい。 Examples of the “substrate for histone methyltransferase activity” include histones, for example, histone H3, a fragment of histone H3 peptide having a methylation site of the fourth lysine from the N-terminal. A labeled antibody recognition tag may be added to the histone methyltransferase activity substrate.
「メチル基供与体」としては、メチオニン、S-アデノシル-L-メチオニン（ＳＡＭ）、デカルボキシS-アデノシル-L-メチオニン（dcＳＡＭ）およびそれぞれの標識ラベル体等が挙げられる。該メチル基供与体は、標識でラベルされていてもよい。 Examples of the “methyl group donor” include methionine, S-adenosyl-L-methionine (SAM), decarboxy S-adenosyl-L-methionine (dcSAM), and respective labeled label bodies. The methyl group donor may be labeled with a label.
本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法に関する。該スクリーニング方法は、被検物質である化合物又はその塩の存在下、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドによるヒストン内のリジンのメチル化を検出又は測定することを１つの特徴とする。例えば、被検物質である化合物又はその塩の存在下、高酵素活性型ＳＭＹＤ３変異ポリペプチドによるヒストンＨ３のＮ末端から４番目のリジンのメチル化を検出又は測定することによって本発明を利用することができる。ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における活性を対照として調べるのが好適である。 The present invention relates to a screening method for a histone methyltransferase activity regulator. The screening method is characterized by detecting or measuring methylation of lysine in histones by a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide in the presence of a test compound or a salt thereof. For example, the present invention is used by detecting or measuring methylation of the fourth lysine from the N-terminus of histone H3 by a highly enzymatically active SMYD3 mutant polypeptide in the presence of a compound to be tested or a salt thereof. Can do. The influence of the test substance on the histone methyltransferase activity is preferably examined using the activity in the absence of the test substance as a control.
また、本発明のスクリーニング方法は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。 In addition, the screening method of the present invention can be used for pharmacological evaluation of candidate compounds for histone methyltransferase activity modulators.
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（Ａ）被検物質の存在下、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質及びメチル基供与体を接触させる工程、並びに、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）の後、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定し、被検物質の非存在下での高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性と比較する工程を含む、該活性を調節する作用を有する化合物又はその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
As a screening method of the present invention, specifically,
(A) a step of contacting a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, a histone methyltransferase activity substrate and a methyl group donor in the presence of a test substance; and
(B) after the step (A), comprising measuring a histone methyltransferase activity and comparing it with a histone methyltransferase activity of a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide in the absence of a test substance, The screening method of the compound which has the effect | action which modulates activity, or its salt is mentioned.
前記工程（Ａ）の「接触」は、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質及びメチル基供与体の本来の機能を妨げない溶液中において、被験物質、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質及びメチル基供与体とを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持する（すなわち、反応させる）ことによって行われ得る。 The “contact” in the step (A) is carried out in a solution that does not interfere with the original functions of the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, the histone methyltransferase activity substrate and the methyl group donor. By mixing the SMYD family mutant polypeptide, the substrate for histone methyltransferase activity and the methyl group donor and maintaining (ie, reacting) under appropriate reaction conditions, eg, appropriate reaction temperature, reaction time. Can be broken.
前記「高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質及びメチル基供与体の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液が挙げられる。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが挙げられる。 Examples of the “solution that does not interfere with the original functions of the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, histone methyltransferase activity substrate, and methyl group donor” include, for example, phosphate buffered physiological saline (PBS), HEPES Examples thereof include a solution such as a buffer and a Tris buffer. Preferably, a Tris buffer is used.
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、前記溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜９．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ８．３で、通常、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃、さらに好ましくは３０℃、通常、１分間〜３時間、好ましくは３分間〜２時間、より好ましくは５分間〜１時間３０分間、さらに好ましくは１時間維持すること等が挙げられる。 In addition, the “appropriate reaction conditions” are not particularly limited. For example, in the solution, pH 6.0 to 10.0, preferably pH 7.0 to 9.0, and more preferably pH 7.5 to 8.5, more preferably pH 8.3, usually 10 ° C. to 50 ° C., preferably 20 ° C. to 40 ° C., more preferably 25 ° C. to 37 ° C., more preferably 30 ° C., usually 1 minute to 3 hours , Preferably 3 minutes to 2 hours, more preferably 5 minutes to 1 hour 30 minutes, still more preferably 1 hour.
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、ＳＭＹＤファミリータンパク質をコードする遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発しうるｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。 Examples of the test substance include a compound or a salt thereof. In addition, in this specification, the said compound or its salt contains a low molecular compound, a high molecular compound, polypeptide or its derivative (s), a nucleic acid or its derivative (s), etc. Such a test substance may be a natural substance or a non-natural substance. Examples of polypeptide derivatives include modified polypeptides obtained by adding modifying groups, variant polypeptides obtained by altering amino acid residues, and the like. Examples of nucleic acid derivatives include modified nucleic acids obtained by adding modifying groups, variant nucleic acids obtained by modifying bases, peptide nucleic acids, and the like. Nucleic acids also include siRNA, antisense strand RNA, ribozymes, etc. that can induce RNAi against genes encoding SMYD family proteins.
本発明において、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、（１）標識されたメチル基供与体を使用する方法、（２）メチル化部位に特異的な抗体を使用する方法等が挙げられる。 In the present invention, the method for measuring histone methyltransferase activity is not particularly limited, and a method generally known in the art as a method for measuring histone methyltransferase activity can be used. For example, (1) a method using a labeled methyl group donor, (2) a method using an antibody specific for a methylation site, and the like can be mentioned.
（１）標識されたメチル基供与体を使用する方法は、検出可能なラベル、例えば、放射活性又は発色性ラベルで標識されたメチル基供与体を使用し、メチル基の基質への移行時に該標識を定量することによって行うことができる。
放射活性ラベルとしては、14C、3H等が挙げられる。放射活性ラベルで標識されたメチル基供与体を使用する場合、メチル基を基質に移行させ、直接定量することができる。定量法としては、シンチレーション計数法又はオートラジオグラフィー法等が挙げられる。
発色性ラベルとしてはクマリン誘導体、例えば、7-アミノ-4-メチルクマリン又は7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン等が挙げられる。発色性ラベルで標識されたメチル基供与体を使用する場合、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドによるメチル基の基質への移行時に、メチル基供与体は色を変え、これを定量することができる。定量法としては、分光法等が挙げられる。
(1) The method using a labeled methyl group donor uses a detectable label, for example, a methyl group donor labeled with a radioactive or chromogenic label, and the methyl group donor is transferred during transfer of the methyl group to the substrate. This can be done by quantifying the label.
Examples of radioactive labels include 14 C and 3 H. When a methyl group donor labeled with a radioactive label is used, the methyl group can be transferred to a substrate and directly quantified. Examples of the quantitative method include a scintillation counting method and an autoradiography method.
Examples of the chromogenic label include coumarin derivatives such as 7-amino-4-methylcoumarin and 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. When a methyl group donor labeled with a chromogenic label is used, the methyl group donor changes its color upon the transfer of the methyl group to the substrate by the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, and this can be quantified. it can. Examples of the quantitative method include spectroscopic methods.
（２）メチル化部位に特異的な抗体を使用する方法は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質を、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドによるメチル化時に、特異的抗体によって認識し得るエピトープとして使用し、メチル化を定量することによって行うことができる。
該方法に有用な抗体としては、例えば、Anti-H3K4-tri-methyl 抗体ab8580 （abcam社）、Anti-H3K4-tri-methyl 抗体 05-745（アップステート社）、Anti-H3K4-tri-methyl 抗体07-473（アップステート社）、Anti-H3K4mono-di-tri-methyl抗体05-791（アップステート社）等が挙げられる。また、該抗体は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質、例えばヒストンＨ３のＮ末端から４番目のリジンを含むペプチド断片を抗原として使用し、標準方法に従ってポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することによって得ることができる。かかる抗体は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。定量法としては、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、Harlow及びLane，Anti bodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載の方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
(2) The method using an antibody specific for a methylation site uses a substrate for histone methyltransferase activity as an epitope that can be recognized by a specific antibody when methylated by a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide. This can be done by quantifying methylation.
Examples of antibodies useful in the method include Anti-H3K4-tri-methyl antibody ab8580 (abcam), Anti-H3K4-tri-methyl antibody 05-745 (Upstate), Anti-H3K4-tri-methyl antibody 07-473 (Upstate), Anti-H3K4mono-di-tri-methyl antibody 05-791 (Upstate) and the like. The antibody can be obtained by preparing a polyclonal or monoclonal antibody according to a standard method using a histone methyltransferase substrate, for example, a peptide fragment containing the fourth lysine from the N-terminus of histone H3 as an antigen. . Such an antibody may be labeled with a conventional enzyme (for example, peroxidase), a fluorescent dye, a radioactive substance, avidin or biotin. There are various assay formats known to those skilled in the art for quantification. For example, the method described in Harlow and Lane, Anti bodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 can be used. For example, an ELISA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, an immunohistochemical staining method and the like can be mentioned.
その他、蛍光消光（Resonance Energy Transfer、"RET"）アッセイを使用してヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定することもできる。ドナーを上記メチル化部位に特異的な抗体に結合させ、アクセプターを、上記メチル化部位を含まない部分を認識する抗体又はヒストンに付加されたタグを認識する抗体と結合させる。ドナー及びアクセプターの組み合わせとしては、ユウロピウム（Eu）とアロフィコシアニン（APC）、EuとCy5等が挙げられる。蛍光をフルオロメーター内で、励起波長および発出波長で測定する。被検物質がヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが変化する。例えば、被検物質がヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制作用を有する場合、試験物質の存在しない対照サンプルと比較して検出可能シグナルが低下する。 Alternatively, histone methyltransferase activity can be measured using a fluorescence quenching (Resonance Energy Transfer, “RET”) assay. A donor is bound to an antibody specific for the methylation site, and an acceptor is bound to an antibody that recognizes a portion that does not include the methylation site or an antibody that recognizes a tag attached to a histone. Examples of donor and acceptor combinations include europium (Eu) and allophycocyanin (APC), Eu and Cy5, and the like. Fluorescence is measured in a fluorometer at excitation and emission wavelengths. When the test substance has a histone methyltransferase activity-regulating action, the detectable signal changes as compared to a control sample in which no test substance is present. For example, when the test substance has a histone methyltransferase inhibitory action, the detectable signal is reduced compared to a control sample in which no test substance is present.
上記方法により、種々の被験物質の存在下における高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定することによって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節能を有する物質を選抜するスクリーニングを行うことができる。例えば、被験物質下における活性が、被検物質非存在下における活性より有意な上昇又は減少を示す物質を、ヒストンメチルトランスフェラーゼ亢進能又は抑制能を有する物質として選抜することができる。このように選抜された物質はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤（つまり、ヒストンメチルトランスフェラーゼ亢進剤又は抑制剤）の有効成分として使用され得る。 By the above method, screening for selecting a substance having the ability to regulate histone methyltransferase activity can be performed by measuring the histone methyltransferase activity of the highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide in the presence of various test substances. . For example, a substance that exhibits a significant increase or decrease in activity under the test substance as compared with the activity in the absence of the test substance can be selected as a substance having the ability to enhance or suppress histone methyltransferase. The substance thus selected can be used as an active ingredient of a histone methyltransferase activity regulator (that is, a histone methyltransferase enhancer or inhibitor).
本発明は、高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドを使用するという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において有用である。本発明を実施すれば、効果的に候補化合物を選択することができる。 The present invention relates to a screening method characterized by using a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide, and known detection methods and the like can be used. In particular, a huge number of compounds can be used. Useful in screening assays, particularly high throughput screening (HTS). If this invention is implemented, a candidate compound can be selected effectively.
本発明の「スクリーニングキット」には少なくとも高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を保持してなる核酸構築物、該遺伝子が導入された細胞等のいずれかが含まれている。 The “screening kit” of the present invention includes at least one of a high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide, a gene encoding the polypeptide, a nucleic acid construct holding the gene, a cell into which the gene has been introduced, and the like. include.
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
− 高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドを含有してなるキット、
− 高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸構築物を含有してなるキット、
− 高酵素活性型ＳＭＹＤファミリー変異ポリペプチドをコードする遺伝子が導入された細胞を含有してなるキット、
等が挙げられる。
これらのキットは、リジンがメチル化されたヒストンを特異的に検出する抗体をさらに含有していてもよい。
As the screening kit of the present invention, specifically,
A kit comprising a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide;
A kit comprising a nucleic acid construct comprising a gene encoding a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide;
-A kit comprising cells into which a gene encoding a highly enzymatically active SMYD family mutant polypeptide has been introduced;
Etc.
These kits may further contain an antibody that specifically detects histones in which lysine is methylated.
また、各キットには、所望により、検出用試薬、緩衝液、標準物質、本発明のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含有させてもよい。 Each kit may contain a detection reagent, a buffer solution, a standard substance, instructions for carrying out the screening method of the present invention, and the like as desired.
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、ヒストンメチルトランスフェラーゼに関連して発症する疾患に対する治療又は予防作用を発揮しうる。例えば、本発明のスクリニーング方法によれば、ＳＭＹＤ３のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性が関与して発症する癌、免疫疾患等に有効な治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。 The compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can exert a therapeutic or preventive action against a disease that develops in relation to histone methyltransferase. For example, according to the screening method of the present invention, a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent effective for cancer, immune disease, etc. that develops with the involvement of SMYD3 histone methyltransferase activity can be screened.
上記「癌」としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍などの種々の悪性新生物が例示され、大腸癌及び肝癌等が包含され、さらにこれら癌の転移をも包含する。
「免疫疾患」としては、例えば、アトピー、喘息、リウマチ、膠原病、アレルギー等が例示される。
Examples of the “cancer” include various malignant neoplasms such as solid cancer, hemangioma, hemangioendothelioma, sarcoma, Kaposi sarcoma, and hematopoietic tumor, and include colon cancer, liver cancer, etc., and metastasis of these cancers Is also included.
Examples of the “immune disease” include atopy, asthma, rheumatism, collagen disease, allergy and the like.
また、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、ヒストンメチルトランスフェラーゼに関連する疾患、例えば、ＳＭＹＤ３が関与する癌、免疫疾患等の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。 In addition, the compound obtained by the screening method or a salt thereof provides a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of diseases associated with histone methyltransferase, such as cancers involving SMYD3 and immune diseases.
上記医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、該医薬組成物は、ヒストンメチルトランスフェラーゼに関連して発症する疾患に対して、該酵素の活性の抑制を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。例えば、本発明の医薬組成物は、癌、免疫疾患等、特に、ＳＭＹＤ３のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性に関連して発症する癌、免疫疾患等に対して、該酵素活性の抑制を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。該医薬組成物を癌の治療又は予防に用いる場合は、通常の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、とりわけ腫瘍細胞を事前感応化するためのDNA劣化剤を施すのと同時に、又はその前でも使用できる。 The pharmaceutical composition is characterized by containing the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof as an active ingredient. Therefore, the pharmaceutical composition exhibits an excellent effect that it can act on a disease caused by histone methyltransferase through suppression of the activity of the enzyme. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can act on cancers, immune diseases, etc., particularly cancers, immune diseases, etc. that develop in relation to the histone methyltransferase activity of SMYD3 through suppression of the enzyme activity. Exhibits an excellent effect. When the pharmaceutical composition is used for the treatment or prevention of cancer, conventional cancer therapy, for example, radiation therapy, chemotherapy, especially at the same time as or before applying a DNA-degrading agent for presensitizing tumor cells. But you can use it.
上記医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。 The content of the compound or salt thereof in the pharmaceutical composition can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, and may be a therapeutically effective amount. In the case of a compound, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.001 to 100 mg. In the case of a polypeptide or a derivative thereof, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.001 to 100 mg, a nucleic acid or a derivative thereof. In this case, for example, 0.00001 to 100 mg, preferably 0.0001 to 10 mg is desirable.
上記医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。 The pharmaceutical composition may further contain various auxiliaries that can stably hold the compound or a salt thereof. Specifically, pharmaceutically acceptable auxiliaries, excipients, binders, and stabilizers that exhibit the property of inhibiting the active ingredient from degrading before reaching the site where the active ingredient is to be delivered. Agents, buffers, solubilizers, isotonic agents and the like.
上記医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。 The dosage form of the pharmaceutical composition is appropriately selected according to the type of active ingredient; individual, organ, local site, tissue to be administered; age, weight, etc. of the individual to be administered. Examples of the administration form include subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, and local administration.
また、上記医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。 The dosage of the above pharmaceutical composition is also appropriately selected according to the type of active ingredient; individual, organ, local site, tissue to be administered; age, weight, etc. of the individual to be administered. Although it does not specifically limit as administration, When an active ingredient is a low molecular compound or a high molecular compound, as an amount of the said active ingredient, it is 0.0001-1000 mg / kg body weight, Preferably, it is 0.001-100 mg. / Kg body weight, in the case of a polypeptide or a derivative thereof, for example, 0.0001 to 1000 mg / kg body weight, preferably 0.001 to 100 mg / kg body weight, in the case of a nucleic acid or a derivative thereof, for example, 0.00001 to 100 mg / kg Administration may be performed a plurality of times, for example, 1 to 3 times per day so as to obtain a single dose of kg body weight, preferably 0.0001 to 10 mg / kg body weight.
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。 The present invention will be described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to such examples. In the following Examples, the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) was used as a genetic manipulation technique unless otherwise specified.
293T細胞への遺伝子導入
5x107個の293T細胞を、15cm dish（コーニング社）に播腫して一晩培養した。10μgの野生型SMYD3発現用プラスミドベクターpFlag-CMV-SMYD3とN末４５アミノ酸が欠失した変異型SMYD3発現用プラスミドベクターp3XFlag-CMV-SMYD3-Δ1、N末99アミノ酸が欠失した変異型SMYD3発現用プラスミドベクターp3XFlag-CMV-SMYD3-Δ2、C末175アミノ酸が欠失した変異型SMYD3発現用プラスミドベクターp3XFlag-CMV-SMYD3-Δ4（浜本ら，2004，Nature cell biol. 6, 731-740）（図1）を、FuGENE6（ロッシュ社）にて添付マニュアルに従い、293T細胞内に遺伝子導入した。
Gene transfer into 293T cells
5 × 10 7 293T cells were seeded in a 15 cm dish (Corning) and cultured overnight. 10 μg of wild-type SMYD3 expression plasmid vector pFlag-CMV-SMYD3 and a mutant SMYD3 expression plasmid vector p3XFlag-CMV-SMYD3-Δ1 from which N-terminal 45 amino acids are deleted, and a mutant SMYD3 expression from which N-terminal 99 amino acids are deleted Plasmid vector p3XFlag-CMV-SMYD3-Δ2, a plasmid vector p3XFlag-CMV-SMYD3-Δ4 for expression of mutant SMYD3 lacking the C-terminal 175 amino acids (Hamamoto et al., 2004, Nature cell biol. 6, 731-740) ( Fig. 1) was introduced into 293T cells using FuGENE6 (Roche) according to the attached manual.
293T細胞からのFLAGタグ付加SMYD3タンパク質の精製
遺伝子導入24時間経過後、培地を取り除き、15mlのPBS(-)（インビトロジェン社）で洗浄する。洗浄液を取り除いて1mlのPBS(-)を加え、セルスクレイパー（コーニング社）により細胞を剥がした後、ポリプロピレン製チューブに回収した。
5000rpmで５分間遠心した後、上清を取り除いて１mlのCelLytic-M溶液（シグマ社）を加え、懸濁した。その後、細胞懸濁溶液を21Gの注射針を付けたシリンジ（テルモ社）で吸い上げる。１０回程度この操作を繰り返して細胞を破砕し、氷上にて30分間静置した。15000rpmで1５分間遠心した後、上清を新たなポリプロピレン製チューブに回収した。120μlの50％抗HAアガロースゲル溶液（シグマ社）を上清に加え、ローテーターにより、1時間懸濁した。その後、10000rpmで1分間遠心して、上清を回収した。60μlの50％抗FLAG アガロースゲル溶液（シグマ社）を上清に加え、ローテーターにより２時間懸濁した。その後、10000rpmで1分間遠心して上清を取り除き、抗FLAG アガロースゲルを１mlのPBST緩衝液（組成：PBS(-), 0.1%Triton X-100）で7回洗浄した。抗FLAG アガロースゲルに100μlの溶出溶液（組成：PBS(-), 0.1%Triton X-100, 1mM DTT, 3x FLAG peptide（シグマ社）、Protease inhibitor cocktail（ロッシュ社））を加えて、ローテーターにより1時間懸濁した。その後、10000rpmで1分間遠心して上清を回収した。アガロースゲルに再び100μlの溶出溶液を加えて、ローテーターにより1時間懸濁し、上清を回収した。回収した200μlの上清をフィルター膜100K（ミリポア社）に移し、12000rpmで10分間遠心して、野生型FLAG-SMYD3及び3XFLAG-SMYD3-Δ1,2,4タンパク質の濃縮を行った。精製の状態を検討するために、4-20%SDS-PAGE用グラジエントゲルで泳動して単一の分子として単離されている事を確認した（図2）。
Purification of FLAG-tagged SMYD3 protein from 293T cells After 24 hours of gene introduction, the medium is removed and washed with 15 ml of PBS (-) (Invitrogen). The washing solution was removed, 1 ml of PBS (-) was added, the cells were peeled off with a cell scraper (Corning), and then collected in a polypropylene tube.
After centrifugation at 5000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and 1 ml of CelLytic-M solution (Sigma) was added and suspended. Thereafter, the cell suspension is sucked up with a syringe (Terumo) equipped with a 21G needle. This operation was repeated about 10 times to disrupt the cells, and left on ice for 30 minutes. After centrifugation at 15000 rpm for 15 minutes, the supernatant was collected in a new polypropylene tube. 120 μl of 50% anti-HA agarose gel solution (Sigma) was added to the supernatant, and suspended for 1 hour using a rotator. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute. 60 μl of 50% anti-FLAG agarose gel solution (Sigma) was added to the supernatant, and suspended for 2 hours using a rotator. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute, and the anti-FLAG agarose gel was washed 7 times with 1 ml of PBST buffer (composition: PBS (−), 0.1% Triton X-100). Add 100 μl of elution solution (composition: PBS (-), 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT, 3x FLAG peptide (Sigma), Protease inhibitor cocktail (Roche)) to anti-FLAG agarose gel, and add 1 with a rotator. Suspended for hours. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute. 100 μl of the elution solution was again added to the agarose gel, suspended for 1 hour with a rotator, and the supernatant was collected. The collected 200 μl supernatant was transferred to a filter membrane 100K (Millipore) and centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to concentrate the wild-type FLAG-SMYD3 and 3XFLAG-SMYD3-Δ1,2,4 proteins. In order to examine the state of purification, it was confirmed that it was isolated as a single molecule by running on a 4-20% SDS-PAGE gradient gel (FIG. 2).
精製酵素を用いた試験管内ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の定量
12.2 μlの酵素反応液（組成：50mM Tris (pH=9.0)、0.1% Triton X-100、1mM DTT、0.03μg/μl rHistone H3（アップステート社）、5μM S-adenosyl-L-[methyl-3H]methionine ([3H]SAM（アマシャムバイオサイエンス社）) をポリプロピレン製チューブに加え、その後、FLAG-SMYD3及び3XFLAG-SMYD3-Δ1,2,4各酵素溶液（組成：0.1% Triton-X100、167 mM Imidazole in PBS(-)）を１μM及び４μMになるように加え、蒸留水で最終容量を20μlとしてよく混合した。なお、表記濃度は全て終濃度である。
３０℃で1時間インキュベート後、５μlの反応液を５mMの非標識SAMで前処理を加えたDE81フィルターの中央部に滴下して室温で5分間乾燥させた。DE81フィルターに吸着されていないタンパク質以外の分子を取り除くため、2mlの10%TCA溶液で15分間洗浄した。同様の洗浄操作を3回繰り返した。最後に2mlの95%エタノール溶液で1分間洗浄した後、赤外線ランプ下で10分間乾燥させた。5mlの液体シンチレーションカクテル溶液を加えているバイアル瓶にDE81フィルターを浸した。液体シンチレーションカウンター（パッカード社）によりバイアル瓶中のcpm値を定量する事で、ヒストンメチルトランスフェラーゼであるSMYD3がヒストンH3にトリチウム標識メチル基を転移した程度を測定することが可能となる。その結果、N末より45アミノ酸及び99アミノ酸が欠失した変異型3XFLAG-SMYD3-Δ1,2タンパク質では、全長を発現させている野生型FLAG-SMYD3タンパク質と比較して活性値が約３〜10倍程度上昇している事が確認された（図3 ）。一方、C末より175アミノ酸が欠失した変異型3XFLAG-SMYD3-Δ4タンパク質では、野生型FLAG-SMYD3タンパク質と同様の活性値であることが確認された。また、酵素活性によってトリチウム標識メチル基がヒストンH3に転移した程度を検討するために、4-20%SDS-PAGE用グラジエントゲルで泳動後、BASイメージングシステム（富士フィルム）でrHistone H3（アップステート社）のメチル化を検出したところ、シンチレーションカウンターの値とほぼ同等の比活性値を示した（図4）。以上の結果から、野生型ＳＭＹＤ３タンパク質のN末より４５アミノ酸もしくは99アミノ酸が欠失する事により、酵素活性が向上することが確認された。同時に、液体シンチレーションカウンター（パッカード社）によりバイアル瓶中のcpm値を測定することでヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定することが可能であることが確認された。その結果、ＳＭＹＤ３に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
Quantification of in vitro histone methyltransferase activity using purified enzyme
12.2 μl of enzyme reaction solution (Composition: 50 mM Tris (pH = 9.0), 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT, 0.03 μg / μl rHistone H3 (Upstate), 5 μM S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] methionine ([ 3 H] SAM (Amersham Biosciences)) was added to a polypropylene tube, and then each enzyme solution of FLAG-SMYD3 and 3XFLAG-SMYD3-Δ1,2,4 (composition: 0.1% Triton-X100, 167 mM Imidazole in PBS (-)) was added to 1 μM and 4 μM, and mixed well with distilled water to a final volume of 20 μl.
After incubation at 30 ° C. for 1 hour, 5 μl of the reaction solution was added dropwise to the center of a DE81 filter pretreated with 5 mM unlabeled SAM and dried at room temperature for 5 minutes. In order to remove molecules other than proteins not adsorbed on the DE81 filter, the membrane was washed with 2 ml of 10% TCA solution for 15 minutes. The same washing operation was repeated 3 times. Finally, it was washed with 2 ml of 95% ethanol solution for 1 minute and then dried for 10 minutes under an infrared lamp. The DE81 filter was immersed in a vial containing 5 ml of liquid scintillation cocktail solution. By quantifying the cpm value in the vial with a liquid scintillation counter (Packard), it is possible to measure the degree of transfer of the tritium-labeled methyl group to histone H3 by SMYD3, which is a histone methyltransferase. As a result, the mutant 3XFLAG-SMYD3-Δ1,2 protein in which 45 amino acids and 99 amino acids were deleted from the N-terminus had an activity value of about 3-10 compared to the wild-type FLAG-SMYD3 protein expressing the full length. It has been confirmed that it has risen about twice (Fig. 3). On the other hand, it was confirmed that the mutant 3XFLAG-SMYD3-Δ4 protein in which 175 amino acids were deleted from the C-terminus had the same activity value as the wild-type FLAG-SMYD3 protein. In addition, in order to examine the degree of transfer of tritium-labeled methyl group to histone H3 due to enzyme activity, after running on a gradient gel for 4-20% SDS-PAGE, rHistone H3 (Upstate) was run with BAS imaging system (Fuji Film). ) Methylation was detected and showed a specific activity value almost equal to that of the scintillation counter (FIG. 4). From the above results, it was confirmed that deletion of 45 amino acids or 99 amino acids from the N-terminal of the wild type SMYD3 protein improved the enzyme activity. At the same time, it was confirmed that the histone methyltransferase activity can be measured by measuring the cpm value in the vial with a liquid scintillation counter (Packard). As a result, candidate compounds for histone methyltransferase inhibitors involved in SMYD3 can be screened.
本発明のスクリーニング方法によって、ＳＭＹＤファミリータンパク質に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤を効率よくスクリーニングすることができる。なお、ＳＭＹＤ３に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制剤は、癌、免疫疾患等の予防剤・治療剤として使用することができる。 By the screening method of the present invention, a histone methyltransferase activity regulator involved in SMYD family proteins can be efficiently screened. The histone methyltransferase inhibitor involved in SMYD3 can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer, immune diseases and the like.
配列番号：１は、野生型ＳＭＹＤ１タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type SMYD1 protein.
配列番号：２は、野生型ＳＭＹＤ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of wild-type SMYD1 protein.
配列番号：３は、野生型ＳＭＹＤ２タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type SMYD2 protein.
配列番号：４は、野生型ＳＭＹＤ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of wild-type SMYD2 protein.
配列番号：５は、野生型ＳＭＹＤ３タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type SMYD3 protein.
配列番号：６は、野生型ＳＭＹＤ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of wild-type SMYD3 protein.
配列番号：７は、野生型ＳＭＹＤ４タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type SMYD4 protein.
配列番号：８は、野生型ＳＭＹＤ４タンパク質のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of wild-type SMYD4 protein.
配列番号：９は、野生型ＳＭＹＤ５タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of the gene encoding wild type SMYD5 protein.
配列番号：１０は、野生型ＳＭＹＤ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of wild-type SMYD5 protein.
Claims (9)
配列番号：６の４６位のＧｌｙから１００位のＡｓｐまでのいずれかのアミノ酸から始まり、２４１位のＡｓｐから４２８位のＳｅｒまでのいずれかのアミノ酸で終わるアミノ酸配列からなり、かつ野生型ＳＭＹＤ３タンパク質の３倍以上のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する変異ポリペプチド、
ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性用基質、及び
メチル基供与体
をインキュベーションし、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を測定することを特徴とする、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性調節剤のスクリーニング方法。 In the presence of the test substance,
A wild-type SMYD3 protein consisting of an amino acid sequence starting from any amino acid from Gly at position 46 to Asp at position 100 and ending with any amino acid from Asp at position 241 to Ser at position 428 of SEQ ID NO: 6 A mutant polypeptide having at least three times histone methyltransferase activity ,
A substrate for histone methyltransferase activity, and
Methyl group donor
And measuring histone methyltransferase activity , screening method for a histone methyltransferase activity regulator .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005005870A JP4469938B2 (en) | 2005-01-13 | 2005-01-13 | Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005005870A JP4469938B2 (en) | 2005-01-13 | 2005-01-13 | Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006191843A JP2006191843A (en) | 2006-07-27 |
| JP4469938B2 true JP4469938B2 (en) | 2010-06-02 |
Family
ID=36798382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005005870A Expired - Fee Related JP4469938B2 (en) | 2005-01-13 | 2005-01-13 | Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4469938B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010001933A1 (en) * | 2008-07-01 | 2010-01-07 | 学校法人日本大学 | Histone modification inhibitor specific to target gene |
-
2005
- 2005-01-13 JP JP2005005870A patent/JP4469938B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006191843A (en) | 2006-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matsuoka et al. | p57KIP2, a structurally distinct member of the p21CIP1 Cdk inhibitor family, is a candidate tumor suppressor gene. | |
| KR100331363B1 (en) | Cyclin Composite Rearrangement and Its Uses | |
| Contzler et al. | Cornulin, a new member of the “fused gene” family, is expressed during epidermal differentiation | |
| Jeyaseelan et al. | A novel cardiac-restricted target for doxorubicin: CARP, a nuclear modulator of gene expression in cardiac progenitor cells and cardiomyocytes | |
| US6207452B1 (en) | Antibody of the anti-proliferation domain of human Bcl-2 | |
| US20080220455A1 (en) | p53-DEPENDENT APOPTOSIS-INDUCING PROTEIN AND METHOD OF SCREENING FOR APOPTOSIS REGULATOR | |
| KR20070073802A (en) | Wnt proteins and detection and treatment of cancer | |
| Götz et al. | Protein kinase CK2 interacts with a multi-protein binding domain of p53 | |
| AU2001265947B2 (en) | Enzymatic assays for screening anti-cancer agents | |
| US7364870B2 (en) | MK2 interacting proteins | |
| US20030228627A1 (en) | Assay for p53 function in cells | |
| AU2001265947A1 (en) | Enzymatic assays for screening anti-cancer agents | |
| AU2001274026A1 (en) | Protein complexes and assays for screening anti-cancer agents | |
| JP4469938B2 (en) | Screening method using high enzyme activity type SMYD family mutant polypeptide | |
| US20120070843A1 (en) | Dbc1, a novel native inhibitor of the anti-aging protein sirt1 | |
| JP2010501827A (en) | Screening method for agents that inhibit binding of MPHOSPH1 and PRC1 | |
| JP2002509862A (en) | Identification of factors mediating the interaction between heterotrimeric G protein and monomeric G protein | |
| D'Agnano et al. | Oligopeptides impairing the Myc‐Max heterodimerization inhibit lung cancer cell proliferation by reducing Myc transcriptional activity | |
| WO2021020505A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating cancer | |
| WO2006070804A1 (en) | Method of inhibiting telomerase activity and inhibitor | |
| JP2002516394A (en) | Assays, methods and means for modulating E2F activity | |
| Park | Role of galectin-1 in pre-mRNA splicing | |
| Williamson | Characterizing the interaction between Inhibitor of Growth (ING) proteins and the nucleosome | |
| JP2008515797A (en) | Evaluation of TSSK family members and TSKS as male contraceptive targets |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061219 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091016 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100112 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100126 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100126 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140312 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |