JP4468299B2 - Screening method for bacterial growth inhibitor - Google Patents

Description

本発明は、細菌の増殖抑制剤のスクリーニングのための手段に関する。より詳しくは、細菌に対する増殖抑制効果の評価方法、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法並びに黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株に関する。  The present invention relates to a means for screening bacterial growth inhibitors. More specifically, the present invention relates to a method for evaluating a growth inhibitory effect on bacteria, a method for screening a bacterial growth inhibitor, and a temperature-sensitive mutant of S. aureus.

近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性ブドウ球菌等の院内感染を引き起こす黄色ブドウ球菌等に代表されるように、薬剤に対して、耐性能を獲得する細菌の出現が注目されている〔Ａｐｆａｌｔｅｒ Ｐ．，Ｗｉｅｎ Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１５３，１４４−１４７（２００３）；チ（Ｃｈｉ ＣＹ．），Ｊ．Ｎｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，３７，１６−２３（２００４）〕。
細菌の薬剤耐性は、抗菌薬の作用標的、あるいは作用機作に由来する場合が多い。例えば、β−ラクタム薬はその基本骨格であるβ−ラクタム環が開裂して標的であるペニシリン結合タンパク質に共有結合して不活化することにより、抗菌作用を発揮している。この場合、細菌のβ−ラクタム薬耐性機構としてペニシリン結合タンパク質の変異よる薬剤親和性の低下、β−ラクタム環を開裂するβ−ラクタマーゼ産生による薬剤の不活化などが知られている。同様に、キノロン耐性においても作用標的であるＤＮＡジャイレースの変異による耐性化が知られている。In recent years, as represented by Staphylococcus aureus causing nosocomial infections such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant staphylococci, the appearance of bacteria that acquire resistance to drugs has attracted attention [Aplter P . , Wien Med. Wochenschr. 153, 144-147 (2003); Chi CY. Nicobiol. Immunol. Infect. 37, 16-23 (2004)].
Bacterial drug resistance often comes from the target or mechanism of action of antibacterial drugs. For example, β-lactam drugs exhibit antibacterial action by cleaving the β-lactam ring, which is the basic skeleton, and inactivating them by covalently binding to the target penicillin-binding protein. In this case, as a mechanism for resistance to β-lactam drugs in bacteria, reduction of drug affinity due to mutation of penicillin-binding protein, inactivation of drugs by β-lactamase production that cleaves β-lactam ring, and the like are known. Similarly, resistance to quinolone resistance is also known by mutation of DNA gyrase, which is an action target.

本発明によれば、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングするための新しい標的が提供される。
本発明は、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌に対する増殖抑制効果を簡便、迅速に評価すること、細菌増殖抑制剤の薬理評価を行なうこと等のいずれかを少なくとも達成する、細菌に対する増殖抑制効果の評価方法を提供することに関する。
また、本発明は、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌に対して、有効であり、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よくスクリーニングすること、作用機序が既存の抗菌薬等とは異なるアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングすること、既存の薬剤耐性細菌の薬剤耐性メカニズムの影響をうけにくいアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングすること等の少なくとも１つが可能な、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法を提供することに関する。
さらに、本発明は、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌に対して、有効であり、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よくスクリーニングすること、作用機序が既存の抗菌薬等とは異なるアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングすること、既存の薬剤耐性細菌の薬剤耐性メカニズムの影響をうけにくいアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングすること等の少なくとも１つを行なうことを可能にする、黄色ブドウ球菌の温度感受性株を提供することを目的とする。
本発明の要旨は、
〔１〕 被験試料存在下における下記Ａ．及び／又はＢ．：
Ａ． 配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を介して生じる事象、
Ｂ．該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、
を評価することを特徴とする、被験物質による細菌の増殖抑制効果の評価方法、
〔２〕 被験試料の存在下及び非存在下において、下記Ａ．及び／又はＢ．：
Ａ．配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を介して生じる事象、
Ｂ．該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、
を評価し、それにより、被験試料の存在下におけるＡ．の事象及び／又はＢ．の動態と被験物質の非存在下におけるＡ．の事象及び／又はＢ．の動態との間の変化に基づき、アンタゴニスト又はインヒビターを選別することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、
〔３〕 被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子の発現量と、該被験試料の非存在下における該遺伝子の発現量とを比較し、該被験試料の存在下において、該遺伝子の発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、前記〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕 被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量と、該被験試料の非存在下における該ポリペプチドの発現量とを比較し、該被験試料の存在下において、該ポリペプチドの発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、前記〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕 被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子によりコードされたポリペプチドの機能と、被験試料非存在下における該ポリペプチドの機能とを比較し、該被験試料の存在下において、該ポリペプチドの機能が低下することを指標として被験物質を選別する、前記〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔６〕 配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列の一部に変異を有する遺伝子を有する、黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株、
〔７〕 前記〔６〕記載の温度感受性変異株を用いて、被験物質の存在下及び非存在下における変化を検出することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、
〔８〕 （１）前記〔６〕記載の温度感受性変異株及び野生株それぞれに、被験試料を接触させるステップ、及び
（２）野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、前記〔６〕記載の温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステップ、
を含み、温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化を生じることを指標として被験試料を選別する、前記〔７〕記載の細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、
〔９〕 （１）配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子によりコードされたポリペプチド又はその断片と、被験試料を接触させ、混合物を得るステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた混合物において、該ポリペプチド又はその断片と結合する被験試料の有無を検出し、それにより、該ポリペプチド又はその断片と結合する被験試料を細菌の増殖抑制剤の候補物質として得るステップ、
（３）前記ステップ（２）で得られた候補物質と、ＳＡ０５４４、ＳＡ１２９３及びＳＡ１５１１からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を保持する細胞とを接触させるステップ、及び
（４）前記（３）で得られた細胞における細胞増殖阻害及び／又は細胞死の有無を検出し、それにより、細胞増殖阻害及び／又は細胞死を引き起こすことを指標として候補物質を選別するステップ、
含む、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、並びに
〔１０〕 （１）前記〔６〕記載の温度感受性変異株を、該温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、該野生型の細菌は生育でき、かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
（２）該温度感受性変異株を、該生育至適温度下に、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、該生育至適温度下に、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
（３）該野生型の細菌を、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、及び
（４）前記ステップ（１）で得られた結果と（２）で得られた結果との間又は前記ステップ（１）で得られた結果と（３）で得られた結果との間で比較し、実質的に同一の現象が検出されることを指標として、細胞増殖阻害及び／または細胞死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、
に関する。ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the new target for screening the antagonist or inhibitor which can suppress efficiently the proliferation of bacteria, such as various Gram positive bacteria including Gram-staphylococcus, and Gram negative bacteria, is provided.
The present invention provides a simple and rapid evaluation of the growth inhibitory effect on bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, including Staphylococcus aureus, and pharmacological evaluation of bacterial growth inhibitors. The present invention relates to providing a method for evaluating at least the effect of inhibiting growth against bacteria.
The present invention is effective against bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria including S. aureus, and bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria such as S. aureus. Efficient screening of antagonists or inhibitors that can efficiently suppress the growth of the drug, screening of antagonists or inhibitors whose mechanism of action is different from that of existing antibacterial drugs, etc., and drug resistance mechanisms of existing drug resistant bacteria The present invention relates to providing a method for screening a growth inhibitor of bacteria such as gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and gram-negative bacteria, which can be screened for antagonists or inhibitors that are hardly affected.
Furthermore, the present invention is effective against bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria including S. aureus, and bacteria such as gram-positive bacteria and gram-negative bacteria such as S. aureus. Efficient screening of antagonists or inhibitors that can efficiently suppress the growth of the drug, screening of antagonists or inhibitors whose mechanism of action is different from that of existing antibacterial drugs, etc., and drug resistance mechanisms of existing drug resistant bacteria It is an object to provide a temperature-sensitive strain of S. aureus that makes it possible to perform at least one such as screening an antagonist or inhibitor that is not easily affected.
The gist of the present invention is as follows.
[1] The following A. in the presence of the test sample. And / or B. :
A. A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) An event that occurs via at least one gene selected from the group consisting of:
B. Dynamics of a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof,
A method for evaluating the effect of inhibiting bacterial growth by a test substance, characterized in that
[2] In the presence and absence of the test sample, the following A. And / or B. :
A. A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) An event that occurs via at least one gene selected from the group consisting of:
B. Dynamics of a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof,
In the presence of the test sample. And / or B. In the absence of the test substance. And / or B. A method for screening a bacterial growth inhibitor, which comprises selecting an antagonist or an inhibitor based on a change between
[3] A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and SEQ ID NO: 9 in the presence of the test sample The expression level of at least one gene selected from the group consisting of a gene encoding an amino acid sequence (SA1511) is compared with the expression level of the gene in the absence of the test sample. The screening method according to the above [2], wherein the test substance is selected using as an index the decrease in the expression level of the gene,
[4] A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and SEQ ID NO: 9 in the presence of the test sample A comparison is made between the expression level of a polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of a gene encoding an amino acid sequence (SA1511) and the expression level of the polypeptide in the absence of the test sample. The screening method according to the above [2], wherein the test substance is selected using as an index the decrease in the expression level of the polypeptide in the presence of the test sample,
[5] A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and SEQ ID NO: 9 in the presence of the test sample Comparing the function of a polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of a gene encoding an amino acid sequence (SA1511) with the function of the polypeptide in the absence of the test sample, A screening method according to the above [2], wherein the test substance is selected using as an indicator that the function of the polypeptide decreases in the presence of
[6] Gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 A temperature-sensitive mutant of Staphylococcus aureus having a gene having a mutation in a part of at least one base sequence selected from the group consisting of (SA1511),
[7] A method for screening a bacterial growth inhibitor, comprising detecting a change in the presence and absence of a test substance using the temperature-sensitive mutant strain of [6] above,
[8] (1) a step of bringing the test sample into contact with each of the temperature-sensitive mutant strain and the wild strain according to [6], and (2) a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the wild strain, [6] a step of comparing a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the temperature-sensitive mutant strain according to [6],
The test sample is selected using as an indicator that a change occurs between a phenomenon that occurs when the test sample is contacted with a temperature-sensitive mutant strain and a phenomenon that occurs when the test sample is contacted with a wild strain. A method for screening a bacterial growth inhibitor according to [7] above,
[9] (1) A gene (SA0544) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, a gene (SA1293) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. Contacting a test sample with a polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of the encoding gene (SA1511) or a fragment thereof, and obtaining a mixture;
(2) In the mixture obtained in the step (1), the presence or absence of a test sample that binds to the polypeptide or a fragment thereof is detected, whereby the test sample that binds to the polypeptide or a fragment thereof is propagated by bacteria. Obtaining as a candidate substance of an inhibitor,
(3) contacting the candidate substance obtained in step (2) with a cell carrying at least one gene selected from the group consisting of SA0544, SA1293 and SA1511; and (4) said (3 ) Detecting the presence or absence of cell growth inhibition and / or cell death in the cells obtained in (1), thereby selecting a candidate substance using as an indicator that cell growth inhibition and / or cell death is caused,
A method for screening a bacterial growth inhibitor, and [10] (1) the temperature-sensitive mutant strain described in [6] above at an optimum temperature for growth of a wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant strain Observing a difference between a phenomenon that occurs when cultured and a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium can grow and is cultured under a temperature at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected;
(2) A phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant is cultured in the absence of a test sample at the optimal temperature for growth, and occurs when it is cultured in the presence of the test sample at the optimal temperature for growth. Observing the difference between the phenomenon,
(3) observing a difference between a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the absence of the test sample and a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the presence of the test sample; and (4) the above Compare between the result obtained in step (1) and the result obtained in (2) or between the result obtained in step (1) and the result obtained in (3). Screening a candidate substance that causes cell growth inhibition and / or cell death using as an index that the same phenomenon is detected in the method,
About.

本発明の１つの側面は、被験試料存在下における下記Ａ．及び／又はＢ．：
Ａ． 配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を介して生じる事象、
Ｂ．該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、
を評価することを特徴とする、被験物質による細菌の増殖抑制効果の評価方法に関する。
なお、本明細書において、前記配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４；アクセッション番号：ＮＰ＿３７３７９８）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３；アクセッション番号：ＮＰ＿３７４５７４）、配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１；アクセッション番号：ＮＰ＿３７４７９９）を、「指標遺伝子」と総称する場合もある。
前記「指標遺伝子」としては、具体的には、例えば、配列番号：１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：４又は５に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ１２９３）、配列番号：７又は８に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ１５１１）等が挙げられる。
また、本明細書においては、前記指標遺伝子の産物のうち、該指標遺伝子によりコードされるポリペプチド、具体的には、例えば、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ１２９３）、配列番号：９に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ１５１１）を、「指標ポリペプチド」という。
さらに、本明細書において、「アンタゴニスト」又は「インヒビター」とは、前記指標遺伝子又は指標ポリペプチドの発現、機能若しくは生理活性、前記指標遺伝子又は指標ポリペプチドと他の遺伝子又はその遺伝子産物との相互作用等を、中和、低減又は阻害しうる化合物をいう。
本発明の評価方法によれば、生存に必須の遺伝子を介して生じる事象及び／又はポリペプチドの動態に対する被験物質の作用が評価できる。
したがって、本発明の評価方法によれば、細菌、特に、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌に対して、有効であり、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌の増殖を、効率よく抑制しうる、細菌、特に黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌の増殖抑制剤として有用なアンタゴニスト又はインヒビターを、簡便、かつ迅速に、効率よく評価することができる。
本明細書において、「温度感受性変異株」とは、低温、例えば、３０℃では前記温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌と同様増殖できるが、高温、例えば、４３℃では野生型細菌とは異なり、増殖できないような変異株をいう。また、前記温度感受性変異株は、野生型の細菌の通常の生育温度では、該野生型の細菌と同様の挙動を示すが、前記生育温度より高い温度では、増殖に関連する酵素の機能阻害、高温下に発現するタンパク質の機能増大、高温下で発現する毒素の代謝阻害、タンパク質の異常なフォールディング若しくは異常な立体構造の発生、該異常なフォールディングの校正能の阻害、通常の温度で行なわれる転写の阻害、高温で行なわれる転写の促進、ＤＮＡ複製エラーの発生の増大、ＤＮＡ複製エラーの修復能の阻害等の種々の事象又は該事象を介して、増殖が阻害若しくは抑制され、又は死にいたる細胞等が含まれる。
なお、本明細書において、
（ａ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）、配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）を、「指標遺伝子」と総称する場合もある。前記「指標遺伝子」としては、具体的には、例えば、配列番号：１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：４又は５に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ１２９３）、配列番号：７又は８に示される塩基配列を有する遺伝子（ＳＡ１５１１）等が挙げられる。
また、前記指標遺伝子の産物のうち、該指標遺伝子によりコードされるポリペプチド、具体的には、例えば、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ１２９３）、配列番号：９に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド（ＳＡ１５１１）を、「指標ポリペプチド」という。
前記指標遺伝子は、黄色ブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株を、ニトロソ化合物、例えば、ニトロソグアニジン等、エチルメタンサルフェート等で処理し、３０℃で生育し、４３℃で生育しない細菌を選別することにより得られる温度感受性変異株のうち、当該指標遺伝子に温度感受性変異を持つ株の４３℃での増殖機能を相補する増殖機能を相補する遺伝子である。
前記指標遺伝子は、黄色ブドウ球菌の増殖に対して機能を発揮するものであれば、該指標遺伝子のバリアントであってもよい。かかる指標遺伝子のバリアントは、例えば、前記ＳＡ０５４４、ＳＡ１２９３及びＳＡ１５１１のいずれかが変異した黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株（例えば、ＳＡ０５４４について、ＴＳ１１２４株、ＴＳ５８１５株、ＳＡ１２９３について、ＴＳ４３１０株、ＴＳ２００５株、ＳＡ１５１１について、ＴＳ４５３０株、ＴＳ８２２９株等）を用いて、増殖機能の相補性試験を行なうことにより、容易に選別されうる。
前記増殖機能の相補性試験は、慣用の遺伝子導入方法で、前記変異株に、前記指標遺伝子のバリアントを導入し、得られた形質転換体を、野生型の黄色ブドウ球菌は生育し、温度感受性変異株は生育できない条件下に培養することにより行なわれうる。ここで、前記形質転換体が生育した場合、当該指標遺伝子のバリアントが、本発明に用いられうるものであることの指標として選別する。
前記「野生型の黄色ブドウ球菌は生育し、温度感受性変異株は生育できない条件」としては、例えば、ＬＢ培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、（ｐＨ７．０）〕中、４３℃で培養すること等が挙げられる。
前記指標遺伝子のバリアントとは、自然界において、天然の遺伝子が自然発生的に変異を起こして生じるものであり、コードされる産物が、本来の機能を発揮する程度のバリアントをいう。かかるバリアントとしては、例えば、（ｂ）前記指標遺伝子の塩基配列において、少なくとも１つの塩基の変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列を有し、かつコードされるポリペプチドが、前記増殖機能の相補性試験において、増殖機能を相補するものである塩基配列、すなわち、前記（ａ）の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが細菌の増殖に作用するものである塩基配列、
（ｃ）前記指標遺伝子の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件、好ましくは、中ストリンジェンシーの条件、より好ましくは、高ストリンジェンシーな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列を有し、かつコードされるポリペプチドが、前記増殖機能の相補性試験において、増殖機能を相補するものである塩基配列、すなわち、前記（ａ）の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが細菌の増殖に作用するものである塩基配列を有する遺伝子、
（ｄ）前記指標遺伝子の塩基配列に対し、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアラインメント（例えば、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ５、Ｆｉｘｅｄ Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｗｉｎｄｏｗｓｓｉｚｅ ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｇａｐ １０）により適切にアライメントした場合、少なくとも７０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつコードされるポリペプチドが、前記増殖機能の相補性試験において、増殖機能を相補するものである塩基配列、すなわち、前記（ａ）の塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが細菌の増殖に作用するものである塩基配列等が挙げられる。
本明細書において、前記「少なくとも１塩基」とは、１若しくは数個の塩基、すなわち、ヌクレオチド残基を意味する。かかる変異は、自然界において、天然の遺伝子に自然発生的に生じる変異に倣い、慣用の部位特異的変異導入法により、人為的に生じさせたものであってもよい。
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」としては、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性断片化サケ***ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェンシーには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェンシーには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。
本発明の評価方法においては、細菌に対する増殖抑制効果を評価するための指標として、前記Ａ．指標遺伝子を介して生じる事象、及び／又は
Ｂ．指標ポリペプチドの少なくとも１種若しくはその断片の動態、
が用いられる。
前記「Ａ． 指標遺伝子を介して生じる事象」としては、遺伝子の発現量、すなわち、指標遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の転写活性の増減、遺伝子量の増減等が挙げられる。
また、前記「Ｂ．指標ポリペプチドの少なくとも１種若しくはその断片の動態」としては、指標ポリペプチドの発現量の変化、指標ポリペプチドの機能、例えば、酵素活性、レセプター結合能等が挙げられる。
本発明の評価方法によれば、細菌、特に、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌に対して、有効であり、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌の増殖を、効率よく抑制しうる、細菌、特に黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌の増殖抑制剤として有用なアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よくスクリーニングすることもできる。
本発明の細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法は、１つの実施態様では、被験試料の存在下若しくは非存在下において、下記Ａ．及び／又はＢ．：
Ａ．配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、
配列番号：４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）、及び
配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を介して生じる事象、
Ｂ．該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、
を評価し、アンタゴニスト又はインヒビターを選別することを１つの大きな特徴とする。
本発明のスクリーニング方法は、黄色ブドウ球菌の増殖に必須の遺伝子若しくはその断片の動態と、該遺伝子を介して生じる事象と、該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態とのいずれかを評価するため、本発明のスクリーニング方法により選別されるアンタゴニスト又はインヒビターは、黄色ブドウ球菌に対して、有効であり、黄色ブドウ球菌の増殖を、効率よく抑制しうる増殖抑制剤であるという優れた効果を発揮する。さらに、前記遺伝子のホモログが、他のグラム陽性菌、さらにはグラム陰性菌にも存在する場合には、本発明のスクリーニング方法で得られる抗菌剤は、それらの菌種に対しても優れた増殖抑制効果を発揮する。また、本発明のスクリーニング方法に用いられる遺伝子が、既存抗菌剤の標的となっている遺伝子とは異なるため、本発明のスクリーニング方法で得られる抗菌剤は、新規の作用機序を持ち、したがって、耐性菌にも抗菌活性を持つことが期待される。
本発明のスクリーニング方法により選別されるアンタゴニスト又はインヒビターは、好ましくは、前記指標遺伝子の発現量を減少させる物質、前記指標遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量を減少させる物質、又は前記指標遺伝子によりコードされたポリペプチドの機能を低下させる物質である。
本発明のスクリーニング方法に供しうる被験試料としては、例えば、生物（例えば、植物、動物、微生物）等の細胞抽出物、該生物の無細胞抽出物、該生物の細胞培養物、該生物の組織培養物等の試料中に含まれた物質、化学的に合成された化合物、生物学的に産生された物質等が挙げられる。
前記被験試料には、例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー等の発現ライブラリー、ペプチド、ペプチドミメティックス、ホルモン、他のタンパク質、核酸、核酸アナログ〔例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等〕、コンビナトリアルケミストリーにより得られたコンビナトリアルライブラリーの化合物、前記指標遺伝子のアンチセンス核酸、前記指標遺伝子に特異的なリボザイム、前記指標遺伝子に特異的なＲＮＡｉ、前記指標ポリペプチドに対する抗体、前記指標ポリペプチドに対するＤＮＡアプタマー、他の化合物等も包含される。さらに、前記核酸、核酸アナログ、ＰＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ及び抗体は、より優れた適合性を呈する物質をスクリーニングする観点から、種々の修飾、誘導体化等を行なってもよい。
また、例えば、被験試料として、細胞抽出物、無細胞抽出物、細胞培養物、組織培養物等のように、複数の物質の混合物を用いる場合、被験試料に含まれる物質の中から、目的の作用を呈するアンタゴニスト又はインヒビターをさらに選別するために、被験試料を適切な方法、例えば、各種クロマトグラフィー、塩析、有機溶媒抽出等による物質の化学的性質及び／又は物理的性質の同一性若しくは類似性に基づく分画等により、被験試料中に含まれる物質を細分化させた画分を得、再度、該画分のそれぞれを本発明のスクリーニング方法に供し、目的の作用を呈する画分を選別することにより、アンタゴニスト又はインヒビターを選別することができる。なお、前記分画とスクリーニング方法とは、必要に応じて繰り返し行なってもよい。
本発明のスクリーニング方法においては、アンタゴニスト又はインヒビターを選別するための指標の１つとして、Ａ．指標遺伝子を介して生じる事象、及び／又は
Ｂ．指標ポリペプチドの少なくとも１種若しくはその断片の動態、
を評価する。
前記Ａ．の動態を評価するスクリーニング方法（態様１）としては、１つの側面では、
被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子（指標遺伝子）の発現量と、該被験試料の非存在下における該遺伝子の発現量とを比較し、該被験試料の存在下において、該遺伝子の発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、スクリーニング方法が挙げられる。
前記スクリーニング方法において、指標遺伝子の発現量は、例えば、レポーター遺伝子を用いた転写活性の測定、ＲＴ−ＰＣＲ若しくはノーザンブロット法による発現産物の定量解析等により測定されうる。
レポーター遺伝子を用いて、前記指標遺伝子の発現量を測定する場合、前記指標遺伝子の下流に、慣用の定量可能なレポーター遺伝子を作動可能に連結させ、得られた構築物を、適切な手段により直接的又は間接的に、宿主に導入し、前記レポーター遺伝子の発現産物を定量することにより測定されうる。
前記レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
前記宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株等）、酵母（サッカロミセス・セルビジエ等）等が挙げられる
前記構築物の宿主細胞への導入は、例えば、該構築物を、慣用のベクターに連結して、宿主細胞に導入すること、該構築物を直接的に宿主細胞に導入すること等により行なわれうる。
前記ベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合、ｐＵＣ誘導体（例えば、ｐＵＣ１９等）、商品名：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴなどのプラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３等が挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ等が挙げられる。宿主が動物の場合、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などが挙げられる。
前記構築物の宿主への導入方法としては、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等に代表される慣用の遺伝子導入方法等が挙げられる。
レポーター遺伝子の発現産物量は、該レポーター遺伝子の種類に応じた手段により測定されうる。例えば、レポーター遺伝子の発現産物が酵素である場合、酵素活性を測定すること、酵素の基質の分解産物等の生成量を測定すること、蛍光強度等を介して測定すること等が挙げられる。
ｍＲＮＡを測定するＲＴ−ＰＣＲの場合、前記指標遺伝子又はその特徴的な部分を特異的に増幅するプライマー対を用い、前記指標遺伝子又はその特徴的部分を増幅し、慣用の手法により定量することにより行なわれうる。
なお、前記「特徴的な部分」とは、公知のデータベースに登録された配列には実質的に見出されない指標遺伝子の部分を意味する。
前記プライマー対は、前記指標遺伝子の塩基配列と公知データベースに登録された配列とを参照して、慣用のプライマーデザイン用ソフトウェア等によりデザインされうる。前記プライマー対は、適宜、検出に適した標識物質（蛍光物質、放射性物質等）により標識されうる。プライマーの鎖長は、特に限定されないが、例えば、好ましくは、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、１７〜３０ヌクレオチドであることが望ましい。
ＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の量は、例えば、エチジウムブロマイドに基づく蛍光強度、標識物質の量等を介して定量されうる。
ノーザンブロット法の場合、前記プライマー対の場合と同様に、前記指標遺伝子の塩基配列と公知データベースに登録された配列とを参照してデザインされた指標遺伝子に特異的なプローブを用いて行なわれうる。前記プローブは、検出に適した標識物質（蛍光物質、放射性物質等）により標識されうる。プローブの鎖長は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、好ましくは、連続した少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、連続した１８ヌクレオチド以上であることが望ましい。
ノーザンブロット法による指標遺伝子のｍＲＮＡ量の測定は、ハイブリダイズしたプローブに由来する標識物質の量を介して、定量されうる。
前記スクリーニング方法においては、被験物質の存在下の場合において、被験物質非存在下の場合に比べ、指標遺伝子の発現量が減少していた場合、当該被験物質が、細菌の増殖抑制剤としての作用を有することの指標となる。
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、前記指標ポリペプチドに結合できることが知られていない被験試料を試験することができる。かかる試験は、被験試料の存在下、大腸菌の高産生株より調製した（精製又は部分精製品）を、該指標ポリペプチドに結合することが知られているリガンドの結合を可能にする条件と同様の条件下に維持し、該被験試料が、該指標ポリペプチドへの前記リガンドの結合を阻害するか否かを調べること、すなわち、前記「Ｂ．指標ポリペプチドの少なくとも１種若しくはその断片の動態」を評価する。
前記Ｂ．の動態を評価するスクリーニング方法（態様２）としては、
（１）前記指標ポリペプチド又はその断片と、被験試料とを接触させ、混合物を得るステップ、及び
（２）前記ステップ（１）で得られた混合物において、該ポリペプチド又はその断片と結合する被験試料の有無を検出するステップ、
を含む方法が挙げられる。なお、かかる態様２のスクリーニング方法は、前記態様１と組み合わせて行なってもよい。また、態様１のスクリーニング方法と組み合わせる場合、ステップ（Ａ）に先立って行なってもよく、ステップ（Ｂ）の後、同定されたアンタゴニスト又はインヒビターについて、態様２のスクリーニング方法を行なってもよい。
態様２の方法において、被験試料は、前記共鳴プラズモン解析等を行なうことにより選別されうる。
また、共鳴プラズモン相互作用解析の場合、例えば、
▲１▼ 被験試料又は指標ポリペプチドを固定化したチップに、対応して、指標ポリペプチド又は被験試料を含有した溶液を、一定の流速で、送液するステップ；及び
▲２▼ 適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度など）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）〕により相互作用を検出するステップ；
を行なえばよい。ここで、被験試料と指標ポリペプチドとからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、被験試料と指標ポリペプチドとが結合することの指標となる。
また、本発明のスクリーニング方法においては、被験試料存在下での指標遺伝子若しくはその断片又は指標ポリペプチド若しくはその断片の動態の評価の際、ランダム化されたペプチドをファージからディスプレイし、固定化受容体に対するアフィニティークロマトグラフィーによりスクリーニングを行なうファージディスプレイ法〔例えば、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、米国特許第５，２２３，４０９号明細書等〕、チップ上に固定されたペプチド、化合物等のコンビナトリアルケミストリー〔例えば、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、国際公開第９０／１５０７０号パンフレット、国際公開第９２／１００９２号パンフレット等〕、ペプチドライブラリーの合成及びスクリーニング〔例えば、クレーマー〔Ｋｒａｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８７、２５−３９，（１９９８）等〕、クラスター化アミノ酸ペプチドライブラリーを用いるペプチド−抗体相互作用のフィンガープリント解析〔例えば、クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２、４５９−４６５、（１９９５）〕、ペプチドミメティックコンビナトリアルライブラリーの作製及び利用〔例えば、オストレッシュ（Ｏｓｔｒｅｓｈ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６７、２２０−２３６（１９９６）；ドスナー（Ｄｏｓｎｅｒ）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４、７０９−７１５（１９９６）；ニーリー（Ｂｅｅｌｅｙ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，１２、２１３−２１６（１９９４）；アル−オバイディ（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，２０５−２２３、９（１９９８）；ウイリー（Ｗｉｌｅｙ）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．
Ｒｅｖ．，１３、３２７−３８４（１９９３）；ボーム（Ｂｏｈｍ）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，１０、２６５−２７２（１９９６）；及びフルビー（Ｈｒｕｂｙ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、４３、２１９−２６６（１９９７）等〕等を行なってもよい。
なお、ファージディスプレイの方法で、指標ポリペプチド又はその断片に結合する短いペプチドを同定し、次に同定されたペプチドをプローブにしてインヒビターをスクリーニングする方法も含まれる。
また、前記態様２のスクリーニング方法は、別の側面では、
被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子（指標遺伝子）によりコードされたポリペプチドの発現量と、該被験試料の非存在下における該ポリペプチドの発現量とを比較し、該被験試料の存在下において、該ポリペプチドの発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、スクリーニング方法（態様２’）；
被験試料の存在下における
配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子によりコードされたポリペプチドの機能と、被験試料非存在下における該ポリペプチドの機能とを比較し、該被験試料の存在下において、該ポリペプチドの機能が低下することを指標として被験物質を選別する、スクリーニング方法（態様２’’）が挙げられる。
前記態様２’のスクリーニング方法において、ポリペプチドの発現量は、該ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫化学的方法、例えば、慣用のウエスタンブロット法、慣用のＥＬＩＳＡ法等により測定されうる。
前記抗体は、ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであればよい。前記抗体は、例えば、ジョン Ｅ．コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント プロトコルズ イン イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９９２等に記載の方法にしたがい、前記指標遺伝子によりコードされるポリペプチド又はその一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、前記抗体は、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体であってもよい。さらに、前記抗体は、得られた抗体をペプチダーゼ等により処理することにより得られる抗体の断片であってもよい。前記抗体は、慣用の標識物質（例えば、蛍光物質、ペルオキシダーゼ等）により標識されうる。
前記態様２’のスクリーニング方法においては、被験物質の存在下の場合において、被験物質非存在下の場合に比べ、指標遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現量が減少していた場合、当該被験物質が、細菌の増殖抑制剤としての作用を有することの指標となる。
態様２’’のスクリーニング方法では、例えば、指標遺伝子を適切なベクターに連結し、得られた発現ベクターを指標ポリペプチドの発現に適した宿主に導入し、該指標ポリペプチドの発現に適した条件下に該宿主を培養することにより、指標ポリペプチドを発現させ、得られた指標ポリペプチドについて、機能を評価すればよい。
前記ベクター及び宿主は、前記と同様である。また、宿主への発現ベクターの導入は、前記遺伝子導入方法により行なわれうる。
なお、前記指標ポリペプチドは、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させてもよい。
発現した指標ポリペプチドは、慣用のタンパク質精製方法（例えば、遠心分離、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等）により適宜精製されうる。
指標ポリペプチドの機能は、例えば、酵素活性、リガンドの結合能等が挙げられる。
また、本発明によれば、前記指標ポリペプチドと、該指標ポリペプチドに結合するリガンド、例えば、アンタゴニスト、インヒビター等との結合部位に基づき、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患を治療するためのアンタゴニスト又はインヒビターをデザインすることができる。上記のようにデザインされた物質も本発明のスクリーニング方法における被験物質として用いることができる。したがって、前記アンタゴニスト又はインヒビターのデザイン方法も本発明に含まれる。
本発明の細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患を治療するためのアンタゴニスト又はインヒビターのデザイン方法は、下記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）前記指標ポリペプチドの少なくとも１種又はその断片へのアンタゴニスト又はインヒビターの結合部位を同定するステップ、
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）で同定された結合部位と、該ポリペプチドの構造との両方の分子モデリングを行ない、それぞれ、分子モデルを得るステップ、及び（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）で得られた分子モデルに基づき、該アンタゴニスト又は該インヒビターを改変し、それにより、該ポリペプチドに対する結合特異性又は親和性を改良するステップ
を含む方法である。
本発明のデザイン方法は、前記指標ポリペプチドの少なくとも１種又はその断片へのアンタゴニスト又はインヒビターの結合部位が用いられることに１つの大きな特徴がある。かかる結合部位を用いるため、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対してより適合する性質を発揮しうる構造をデザインすることが可能になるという優れた効果を発揮する。
また、本発明のデザイン方法は、前記結合部位と指標ポリペプチドの構造との両方の分子モデリングを行なうため、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対してより適合する性質を発揮しうる構造をデザインすることが可能になるという優れた効果を発揮する。
前記細菌感染症としては、例えば、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、大腸菌、インフルエンザ菌等による感染症等が挙げられる。
細菌感染症に関連する障害若しくは疾患としては、例えば、気管支炎、肺炎、腎盂腎炎、尿道炎、浅在性化膿性皮膚疾患、中耳炎等が挙げられる。
前記ステップ（ｉ）において、「アンタゴニスト又はインヒビター」には、本発明のスクリーニング方法により同定されたアンタゴニスト又はインヒビターが包含される。また、前記アンタゴニスト又はインヒビターは、本発明のスクリーニング方法により同定されたアンタゴニスト、インヒビター等を基に、前記ペプチドミメティックス作製技術、コンビナトリアルケミストリー技術等により、修飾、誘導体化等を行ない得られた誘導体化合物であってもよい。
前記ステップ（ｉ）において、前記結合部位は、例えば、前記アンタゴニスト又はインヒビターが、ポリペプチドの場合、慣用の部位特異的変異導入方法により作製した変異型アンタゴニスト又はインヒビターと、前記指標遺伝子若しくはその断片又は指標ポリペプチド若しくはその断片との結合親和性を調べること、あるいは、前記アンタゴニスト又はインヒビターから作製されたキメラペプチドと、前記指標遺伝子若しくはその断片又は指標ポリペプチド若しくはその断片との結合親和性を調べることにより決定されうる。
前記アンタゴニスト又はインヒビターが、ポリペプチドを除く化合物である場合、指標ポリペプチドについて、慣用の部位特異的変異導入方法により変異型指標ポリペプチドを作製し、得られた変異型指標ポリペプチドと、前記アンタゴニスト又はインヒビターとの結合親和性を調べ、結合が検出されない変異型指標ポリペプチドの改変アミノ酸残基に対応する指標ポリペプチドのアミノ酸残基に対して相互作用（例えば、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等）を生じる前記アンタゴニスト又はインヒビター内の官能基を決定することができる。
なお、前記相互作用を生じる官能基を決定するための指標の例として、
Ｉ． 共有結合は、例えば、アルキル化、アシル化、リン酸化などを受けやすい官能基により生じうる
ＩＩ． イオン性相互作用は、ポリペプチド上の正に荷電したアミノ酸残基又は負に荷電したアミノ酸残基と、かかる残基とは反対の電荷を有する官能基との間で生じうる
ＩＩＩ． イオン−双極子間相互作用及び双極子−双極子間相互作用は、例えば、強い電気陰性度の原子と弱い電気陰性度の原子との結合により電荷の片寄りが生じた双極子が存在する場合に生じうる
ＩＶ． 水素結合は、例えば、ＮＨ−、ＯＨ−などと、非共有電子対を有する電気陰性基との間で生じうる
Ｖ． ファンデルワールス力は、２つの中性な分子の間に生じうる。前記疎水性相互作用は、非極性分子間、分子の非極性部位間で生じうる
が挙げられる。
なお、かかる結合部位の同定においては、例えば、慣用のソフトウェアを用いた構造シミュレーション等をさらに行なってもよい。
ついで、ステップ（ｉｉ）において、前記結合部位と、前記指標ポリペプチドのそれぞれについて、分子モデリングを行なう。
前記分子モデリングは、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、例えば、二次元ＮＭＲ等による構造解析、Ｘ線回折による構造解析等により行なわれうる。
前記分子モデリングにおいて、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対してより適合する性質を発揮しうる構造をデザインする観点から、好ましくは、前記アンタゴニスト又はインヒビターと指標ポリペプチドとを混合して、複合体を形成させ、得られた複合体について、前記ＮＭＲによる解析を行なうこと、又は該複合体を結晶化し、得られた結晶について、Ｘ線構造解析により、３次元座標を得ることが望ましい。
ついで、ステップ（ｉｉｉ）において、前記ステップ（ｉｉ）で得られた分子モデルに基づき、アンタゴニスト又はインヒビターを改変し、それにより、該ポリペプチドに対する結合特異性又は親和性を改良する。
前記ステップ（ｉｉｉ）において、アンタゴニスト又はインヒビターの改変は、前記ステップ（ｉｉ）で得られた分子モデルに基づき、
１） アンタゴニスト又はインヒビターの官能基と指標ポリペプチドとの間の結合力を分子力場計算により算出し、より強い結合力を発揮しうる官能基と置換すること又は修飾基を導入すること、
２） アンタゴニスト又はインヒビターの官能基と指標ポリペプチドとの間の相互作用について、より強い相互作用を発揮しうる官能基と置換すること又は修飾基を導入すること、
３） 溶媒分子等もさらに考慮し、分子動力学法を用いて自由エネルギーを求め、安定して相互作用しうる化合物へ誘導すること、
等により行なわれうる。
本発明のデザイン方法によれば、例えば、指標ポリペプチドに対するＩＣ_５０が５０μＭ以下、好ましくは、５μＭ以下、より好ましくは、０．５μＭ以下となるアンタゴニスト又はインヒビターを設計することが可能になる。
本発明のデザイン方法により得られたアンタゴニスト又はインヒビターについて、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対する治療効果は、例えば、種々のグラム陽性菌、グラム陰性菌に対する最小発育阻止濃度の測定、全身感染、肺炎、***等の感染モデル動物を用いた治療効果の測定、各種動物における体内動態の測定等により評価され得る。
また、本発明には、前記ＳＡ０５４４、ＳＡ１２９３及びＳＡ１５１１からなる群より選ばれた遺伝子の塩基配列を有し、かつ該塩基配列によりコードされたポリペプチドが、細菌の増殖に関連する核酸又は該ポリペプチドの、細菌感染症等の疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための使用も含まれる。
さらに、本発明の１つの側面は、前記温度感受性変異株に関する。本発明の温度感受性変異株は、具体的には、配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列の一部に変異を有する遺伝子を有する、黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株が挙げられる。
本発明の温度感受性変異株に関する記載における「変異」とは、高温、例えば、４３℃において、菌の増殖に必須の機能を発揮することができない産物を生じる変異をいい、アミノ酸レベルで大きく構造、活性機能を変性させるような塩基の置換、欠失、付加又は挿入をいう。
本発明に用いられる温度感受性変異株は、より具体的には、例えば、ＴＳ１１２４株、ＴＳ５８１５株、ＴＳ２００５株、ＴＳ４３１０株、ＴＳ４５３０株、ＴＳ８２２９株等、具体的には、配列番号：３のアミノ酸配列（ＳＡ０５４４）のアミノ酸番号：２０４のセリンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ１１２４株）、
配列番号：３のアミノ酸配列（ＳＡ０５４４）のアミノ酸番号：１８９のグリシンに対応するコドンがアスパラギン酸に対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ５８１５株）、
配列番号：６のアミノ酸配列（ＳＡ１２９３）のアミノ酸番号：１００のグルタミン酸に対応するコドンがリジンに対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ２００５株）、
配列番号：６のアミノ酸配列（ＳＡ１２９３）のアミノ酸番号：９３のグリシンに対応するコドンがアルギニンに対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ４３１０株）、
配列番号：９のアミノ酸配列（ＳＡ１５１１）のアミノ酸番号：７５のフェニルアラニンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ４５３０株）；及び
配列番号：９のアミノ酸配列のアミノ酸番号：６のグリシンに対応するコドンがアスパラギン酸に対応するコドンに置換された塩基配列（ＴＳ８２２９株）
からなる群より選ばれた塩基配列を有する、温度感受性変異株が挙げられる。
また、上記の温度感受性変異株には、遺伝子工学的手法、例えば、部位特異的変異導入法であるオーバーラップエクステンション法等で作製された上記変異を持つ株、天然に生じる上記変異を持つ株も含まれる。
なお、本発明においては、本発明の温度感受性変異株を用いることにより、細菌の増殖抑制剤をスクリーニングすることができる。
したがって、本発明の他の側面は、本発明の温度感受性変異株を用いて、被験物質の存在下及び非存在下における変化を検出することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法（態様３）に関する。
本発明の態様３のスクリーニング方法は、
（１）前記温度感受性変異株及び野生株それぞれに、被験試料を接触させるステップ、及び
（２）野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、前記温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステップ、
を含み、温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化が生じることを指標として被験試料を選別する、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法が挙げられる。
本発明の態様３のスクリーニング方法において、「被験試料を接触させた場合に生じる現象」としては、例えば、細胞死、細胞増殖抑制、菌体成分の生合成中間体の蓄積、代謝産物の蓄積等が挙げられる。
前記ステップ（１）において、温度感受性変異株又は野生株と、被験試料との接触は、例えば、温度感受性変異株及び野生株の培養に適した培地に、適切な希釈率で、被験試料を添加し、培養に適した条件下に温度感受性変異株又は野生株を培養することにより行なわれうる。
前記「培養に適した条件」は、例えば、「図解微生物実験マニュアル（技報堂、１９９２年）」等に記載の培養条件に準じ、適宜設定されうる。
また、本明細書において、「温度感受性変異株」とは、起源となる野生株（すなわち、野生型の細菌）における変異により、温度感受性を示す、又はしめすようになった変異株をいう。
野生型の細菌を意味する。
野生株としては、例えば、黄色ブドウ球菌株、例えば、ＲＮ４２２０、Ｃｏｗａｎ、Ｖ８、Ｎｅｗｍａｎ、Ｌ１２、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、ＪＬ０２２、Ｎ３１５、ＲＮ８８４６、ＳＲＭ５５１、ＳＲＭ５６３、ＲＳ１５８７、２０９Ｐ、ＪＣ−１、ＡＴＣＣ２５９２３、ＳＭＩＴＨＮＣＴＣ８３２５、ＲＮ２６７７、ＲＮ４５１、ＲＮ２９０６、ＭＷ２、ＣＯＬ、２５２、４７６、大腸菌株、例えば、Ｋ１２、ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｍ６６、ＤＨ１０、ＣＦＴ０７３、Ｏ１５７、ＭＶ１１８４、Ｂ、ＭＬ、ＫＵ６４０１、ＡＴＣＣ２６、ＡＴＣＣ２５９２２等が挙げられる。
前記ステップ（１）において、細胞と、被験試料との接触は、例えば、被験試料を含有した培地、具体的には、Ｌ−ｂｒｏｔｈ（トリプトン：１重量％、酵母エキス：０．５重量％、塩化ナトリウム：０．５重量％ ｐＨ７．０）、スタフィロコッカス培地１１０（酵母エキス：０．２５重量％、ペプトン：１重量％，ゼラチン：３重量％、乳糖：０．２重量％、マンニット：１重量％、塩化ナトリウム：７．５重量％、リン酸水素二カリウム：０．５重量％、脱脂寒天：１．５重量％ ｐＨ７．０）、トリプトソイ寒天培地（トリプトン：１．５重量％、ソイペプトン：０．５重量％、塩化ナトリウム：０．５重量％、寒天：１．５重量％ ｐＨ７．３）、乳糖ブイヨン（肉エキス：０．３重量％、ペプトン：０．５重量％、乳糖：０．５重量％ ｐＨ６．９）、臨床用チオグリコレート培地（トリプトン：１．７重量％、ソイペプトン：０．３重量％、ブドウ糖：０．６重量％、塩化ナトリウム：０．２５重量％、チオグリコル酸ナトリウム：０．０５重量％、Ｌ−シスチン：０．０２５重量％、亜硫酸ナトリウム：０．０１重量％、寒天：０．０７重量％ ｐＨ７．０）、ミュラーヒントン培地（牛肉抽出液：３０重量％、カゼイン水解物：１．７５重量％、可溶性デンプン：０．１５重量％、寒天：１．７重量％ ｐＨ７．３）、テトラチオネート液体培地（ペプトン：０．２５重量％、カゼインペプトン：０．２５重量％、デソキシコール酸ナトリウム：０．１重量％、チオ硫酸ナトリウム：３重量％、炭酸カルシウム：１重量％ ｐＨ８．４）、マンニット食塩培地（肉エキス：０．２５重量％、ペプトン：１重量％、マンニット：１重量％、塩化ナトリウム：７．５重量％、フェノールレッド：０．００２５重量％、寒天：１．５重量％ｐＨ７．４）、ＰＥＡアザイド培地（肉エキス：０．５重量％、トリプトン：１．５重量％，塩化ナトリウム：０．５重量％、フェニルエタノール：０．１５重量％、窒化ナトリウム：０．０１重量％、寒天：１．５重量％ ｐＨ７．４）、ＹＣＣ液体培地（酵母エキス：０．５重量％、ペプトン：１．５重量％、ブドウ糖：０．４５重量％、リン酸二カリウム：０．２重量％、亜硫酸ナトリウム：０．０２重量％ ｐＨ７．２）、トリプトソイブイヨン培地（トリプトン：１．７重量％、ソイペプトン：０．３重量％、ブドウ糖：０．２５重量％、塩化ナトリウム：０．５重量％、リン酸二カリウム：０．２５重量％ ｐＨ７．３）等中、適当な温度で培養することにより行なわれうる。
前記培地中における被験試料の含有量は、適切な連続希釈率となるように設定されうる。
前記ステップ（２）において、野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、前記温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との比較は、例えば、肉眼観察、溶菌液のＨＰＬＣ分析、溶菌液のＬＣ／ＭＳ分析、共焦点顕微鏡観察等により行なわれうる。
前記ステップ（２）において、現象として、細胞増殖阻害を比較する場合、細胞増殖阻害は、ＤＮＡへの^３Ｈ−チミジンの取り込み、ＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込み、培養中における培養物の吸光度の変化、生菌数カウント、菌集落の有無等を指標として、評価されうる。
また、細胞死は、ＤＮＡへの^３Ｈ−チミジンの取り込み、ＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込み、細胞の形態、生菌数カウント、コロニー形成能等を指標として、評価されうる。
具体的には、細胞、特に、黄色ブドウ球菌の増殖の評価は、例えば、
− 該黄色ブドウ球菌を適切な培地中で培養して、増殖させ、
− 細胞が、対数増殖期の状態になった時点、例えば、培養開始２時間後、ＤＮＡ合成及び細胞増殖に対するパラメーターとして、^３Ｈ−チミジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等のＤＮＡ前駆体を添加し、適切な時間（例えば、３０分）培養し、
− その後、培養物から培地成分を除去し、その後、菌体を洗浄し、
− 得られた菌体について、該黄色ブドウ球菌のＤＮＡに取り込まれた^３Ｈ−チミジン、ＢｒｄＵ等のＤＮＡ前駆体の量を測定する
ことにより行なわれうる。前記^３Ｈ−チミジンは、得られた菌体を溶解させ、得られた溶解物について、シンチレーションカウンター等を用いて、放射活性を計測することにより評価されうる。また、前記ＢｒｄＵの量は、該ＢｒｄＵに対するモノクロナール抗体（抗ＢｒｄＵ抗体）を用いて検出され得、酵素、蛍光物質等の標識物質で標識された２次抗体を介して測定されうる。抗ＢｒｄＵ抗体と２次抗体との免疫反応は、用いられた標識物質に応じて、分光測光法、蛍光測定法等により定量化される。また、細胞、特に、黄色ブドウ球菌の増殖の評価は、慣用の方法、例えば、濁度の変化、コロニー形成、生菌数カウント等で行われてもよい。
黄色ブドウ球菌に対する被験試料の増殖阻害能は、前記「黄色ブドウ球菌の増殖の評価」を行なう方法において、該黄色ブドウ球菌の培養に際して、被験試料を含有した培地を用いることにより行なわれうる。なお、対照として、被験試料を含有しない培地を用いた培養を行なえばよい。また、前記増殖阻害能は、例えば、ドリューズら〔Ｄｒｅｗｓ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｐｒａｋｔｉｋｕｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９７６〕に記載の方法等に基づき、被験試料存在下及び非存在下における細菌の増殖を測定することにより、評価されうる。
前記「細胞死」は、例えば、吸光度等を指標にして測定した一定量の細胞を、寒天培地と混ぜ合わせ、又は寒天培地上に植菌し、適当な温度で培養し、生じたコロニー数をカウントすること、あるいはコロニーの有無を観察することによって測定することができる。被験試料存在下に、細菌を、例えば、５時間培養後、例えば、上記の方法で細胞死を測定することによって、評価されうる。
また、本発明のスクリーニング方法には、下記スクリーニング方法：
（１）配列番号：３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ０５４４）、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１２９３）及び配列番号：９に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＳＡ１５１１）からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子によりコードされたポリペプチド又はその断片と、被験試料を接触させ、混合物を得るステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた混合物において、該ポリペプチド又はその断片と結合する被験試料の有無を検出し、それにより、該ポリペプチド又はその断片と結合する被験試料を細菌の増殖抑制剤の候補物質として得るステップ、
（３）前記ステップ（２）で得られた候補物質と、ＳＡ０５４４、ＳＡ１２９３及びＳＡ１５１１からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子を保持する細胞とを接触させるステップ、及び
（４）前記（３）で得られた細胞における細胞増殖阻害及び／又は細胞死の有無を検出し、それにより、細胞増殖阻害及び／又は細胞死を引き起こすことを指標として候補物質を選別するステップ、
を含む、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法も含まれる。
前記ステップ（１）及び（２）は、前記態様２のスクリーニング方法と同様に行なわれうる。
また、前記ステップ（３）及び（４）は、前記態様１のスクリーニング方法と同様に行なわれうる。
また、本発明のスクリーニング方法には、
（１）本発明の温度感受性変異株を、該温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、該野生型の細菌は生育でき、かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
（２）該温度感受性変異株を、該生育至適温度下に、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、該生育至適温度下に、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
（３）該野生型の細菌を、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、及び
（４）前記ステップ（１）で得られた結果と（２）で得られた結果との間又は前記ステップ（１）で得られた結果と（３）で得られた結果との間で比較し、実質的に同一の現象が検出されることを指標として、細胞増殖阻害及び／または細胞死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法も含まれる。
なお、本明細書において、「温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌は生育でき、かつ温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度」は、具体的には、３７℃〜４５℃であり、好ましくは、４０〜４５℃であり、特に好ましくは、４３℃である。
また、「野生型の細菌の生育至適温度」は、野生型の細菌により異なる場合もあるが、例えば、３０℃等をいう。
かかるスクリーニング方法では、前記温度感受性変異株を、高温、例えば、３７℃又は４３℃で培養した場合に生じる現象と、野生型の細菌を被験物質存在下に培養した場合に生じる現象との間の類似性が指標となる。かかるスクリーニング方法における「現象」としては、菌の形態変化、基質、菌体成分の生合成中間体の蓄積、代謝産物の蓄積等が挙げられる。
本発明の黄色ブドウ球菌の必須遺伝子を標的にした増殖抑制剤のスクリーニング方法によれば、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、陰性菌、なかんずく耐性菌に対して有効であり、これらの菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害又は疾患を治療するためのアンタゴニスト又はインヒビターのデザイン方法によれば、細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対してより有効に、効率よく作用しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よく、得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の細菌の増殖に関連する核酸によれば、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターをスクリーニングするための新しい標的とすることができ、細菌の増殖の抑制に利用できるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の黄色ブドウ球菌の温度感受性株によれば、黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、陰性菌、なかんずく耐性菌に対して有効であり、これらの菌の増殖を、効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。
下記実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、反応条件、操作等について、用いた試薬に添付の説明書、モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニュアル〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１）〕等の記載が参照されうる。One aspect of the present invention is the following A. in the presence of a test sample. And / or B. :
A. A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) An event that occurs via at least one gene selected from the group consisting of:
B. Dynamics of a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof,
The present invention relates to a method for evaluating the effect of inhibiting the growth of bacteria by a test substance.
In the present specification, a gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SA0544; accession number: NP_373798) and a gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (SA1293; accession number). : NP_374574), and the gene (SA1511; accession number: NP_374799) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 may be collectively referred to as “index gene”.
Specific examples of the “indicator gene” include, for example, a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (SA0544), and a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 (SA1293). And a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 (SA1511).
Further, in the present specification, among the products of the indicator gene, a polypeptide encoded by the indicator gene, specifically, for example, a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544) The polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and the polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) are referred to as “index polypeptide”.
Further, in the present specification, the term “antagonist” or “inhibitor” refers to the expression, function or physiological activity of the indicator gene or indicator polypeptide, and the interaction between the indicator gene or indicator polypeptide and another gene or its gene product. A compound that can neutralize, reduce or inhibit the action and the like.
According to the evaluation method of the present invention, the effect of a test substance on events and / or polypeptide dynamics that occur via genes essential for survival can be evaluated.
Therefore, according to the evaluation method of the present invention, it is effective against bacteria, particularly various gram-positive bacteria including S. aureus, gram-negative bacteria, and various gram-positive bacteria including S. aureus, Efficiently and quickly, the antagonist or inhibitor useful as a growth inhibitor of bacteria, especially various gram-positive bacteria including staphylococcus aureus and gram-negative bacteria, which can efficiently inhibit the growth of gram-negative bacteria Can be evaluated well.
In the present specification, the term “temperature-sensitive mutant” means that it can grow at a low temperature, for example, 30 ° C., in the same manner as the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant, but at a high temperature, for example, 43 ° C. In contrast, it refers to a mutant strain that cannot grow. In addition, the temperature-sensitive mutant strain exhibits the same behavior as that of the wild-type bacterium at the normal growth temperature of the wild-type bacterium, but at a temperature higher than the growth temperature, the function inhibition of the enzyme related to the growth is inhibited. Increased function of protein expressed at high temperature, inhibition of metabolism of toxin expressed at high temperature, generation of abnormal folding or abnormal structure of protein, inhibition of proofreading ability of the abnormal folding, transcription performed at normal temperature Various events such as inhibition of transcription, promotion of transcription performed at high temperature, increase in occurrence of DNA replication error, inhibition of repair ability of DNA replication error, or cells through which growth is inhibited or suppressed, or death Etc. are included.
In this specification,
(A) a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) may be collectively referred to as “index gene”. Specific examples of the “indicator gene” include, for example, a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (SA0544), and a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 (SA1293). And a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 (SA1511).
Among the products of the indicator gene, a polypeptide encoded by the indicator gene, specifically, for example, a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), SEQ ID NO: 6 The polypeptide containing the amino acid sequence shown (SA1293) and the polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) are referred to as “index polypeptide”.
The indicator gene treats Staphylococcus aureus, for example, Staphylococcus aureus RN4220 strain, with a nitroso compound such as nitrosoguanidine, ethylmethane sulfate, etc., and selects bacteria that grow at 30 ° C. but do not grow at 43 ° C. Among the temperature-sensitive mutant strains obtained by this, a gene having a growth function that complements the growth function at 43 ° C. of a strain having a temperature-sensitive mutation to the indicator gene.
The indicator gene may be a variant of the indicator gene as long as it exhibits a function for the growth of Staphylococcus aureus. Such indicator gene variants are, for example, temperature-sensitive mutants of S. aureus in which any of SA0544, SA1293, and SA1511 is mutated (for example, TS0124, TS5815, and SA1293 for SA0544, TS4310, TS2005, About SA1511, TS4530 strain, TS8229 strain, etc.) can be easily selected by conducting a complementation test of proliferation function.
The complementation test of the proliferation function was carried out by a conventional gene introduction method, in which the variant of the indicator gene was introduced into the mutant strain, and the resulting transformant was grown with wild-type S. aureus, temperature sensitive. The mutant strain can be obtained by culturing under conditions where it cannot grow. Here, when the transformant grows, the variant of the indicator gene is selected as an indicator that it can be used in the present invention.
Examples of the “conditions in which wild-type S. aureus can grow and temperature-sensitive mutants cannot grow” include, for example, LB medium [composition: 1% by weight bactotryptone, 0.5% by weight yeast extract (pH 7.0). )], Culturing at 43 ° C. and the like.
The variant of the indicator gene refers to a variant in which a natural gene is naturally mutated in nature and the encoded product exhibits its original function. Examples of such variants include (b) a polypeptide having a base sequence having at least one base mutation (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) in the base sequence of the indicator gene and encoded. The base sequence that complements the proliferative function in the complementation test of the proliferative function, that is, the base sequence having at least one base substitution, deletion, addition or insertion in the base sequence of (a). And a base sequence whose encoded polypeptide has an effect on bacterial growth,
(C) Nucleic acid base sequence that can hybridize under stringent conditions, preferably medium stringency conditions, more preferably high stringency conditions, with a nucleic acid antisense strand comprising the indicator gene base sequence And the encoded polypeptide has a nucleotide sequence that complements the proliferation function in the complementation test of the proliferation function, that is, the antisense strand and the string of the nucleic acid comprising the nucleotide sequence of (a) above. A gene having a base sequence of a nucleic acid that hybridizes under a gentle condition and whose encoded polypeptide acts on bacterial growth,
(D) When appropriately aligned with the base sequence of the indicator gene by multiple alignment by ClustalW method by Higgins et al. (For example, Gap penalty 5, Fixed Gap penalty 10, window size 5, Floating Gap 10), Preferably, the polypeptide has a nucleotide sequence having a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and the encoded polypeptide complements the proliferation function in the proliferation function complementation test. Examples include a certain base sequence, that is, a base sequence having at least 70% sequence identity with the base sequence of (a) above, and the encoded polypeptide acts on bacterial growth. .
In the present specification, the “at least one base” means one or several bases, that is, nucleotide residues. Such a mutation may be artificially generated by a conventional site-directed mutagenesis method following a naturally occurring mutation in a natural gene in nature.
In the present specification, the “stringent conditions” include 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS and 5 ×. Incubate with a probe overnight at 42 ° C. in a solution containing Denhardt, 100 μg / ml denatured fragmented salmon sperm DNA and 50% formamide, low ionic strength, eg 2 × SSC, more stringent 0.1 × Wash under conditions such as SSC and / or higher temperature, 37 ° C or higher, stringent 42 ° C or higher, more stringency 50 ° C or higher, and even more stringent 60 ° C or higher. The conditions for performing are listed.
In the evaluation method of the present invention, as an index for evaluating the growth inhibitory effect against bacteria, the A.I. Events that occur via an indicator gene, and / or
B. Kinetics of at least one indicator polypeptide or fragment thereof,
Is used.
Examples of the above-mentioned “A. Events that occur through an indicator gene” include gene expression levels, that is, increase / decrease in transcription activity of indicator genes (DNA, mRNA), increase / decrease in gene amount, and the like.
The “B. Dynamics of at least one kind of indicator polypeptide or a fragment thereof” includes changes in the expression level of the indicator polypeptide, functions of the indicator polypeptide, such as enzyme activity and receptor binding ability.
According to the evaluation method of the present invention, it is effective against bacteria, particularly various gram-positive bacteria including staphylococcus aureus, gram-negative bacteria, and various gram-positive bacteria including staphylococcus aureus, gram-negative. Antagonists or inhibitors useful as growth inhibitors for various Gram-positive and Gram-negative bacteria such as Staphylococcus aureus that can efficiently inhibit the growth of bacteria can also be efficiently screened.
In one embodiment, the method for screening a bacterial growth inhibitor of the present invention is carried out in the presence or absence of a test sample by the following A. And / or B. :
A. The gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SA0544),
The gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (SA1293), and
A gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (SA1511),
An event that occurs via at least one gene selected from the group consisting of:
B. Dynamics of a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof,
One major feature is to assess antagonists and screen for antagonists or inhibitors.
The screening method of the present invention comprises any one of the dynamics of a gene essential for the growth of Staphylococcus aureus or a fragment thereof, an event that occurs through the gene, and the dynamics of a polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof. In order to evaluate, the antagonist or inhibitor selected by the screening method of the present invention is effective against Staphylococcus aureus and has an excellent effect of being a growth inhibitor that can efficiently suppress the growth of Staphylococcus aureus. Demonstrate. Furthermore, when the homologue of the gene is also present in other Gram-positive bacteria and even Gram-negative bacteria, the antibacterial agent obtained by the screening method of the present invention has an excellent growth against those bacterial species. Demonstrate the effect. In addition, since the gene used in the screening method of the present invention is different from the gene targeted by the existing antibacterial agent, the antibacterial agent obtained by the screening method of the present invention has a novel mechanism of action. Antimicrobial activity is also expected for resistant bacteria.
The antagonist or inhibitor selected by the screening method of the present invention is preferably a substance that decreases the expression level of the indicator gene, a substance that decreases the expression level of the polypeptide encoded by the indicator gene, or the indicator gene A substance that reduces the function of the encoded polypeptide.
Examples of test samples that can be used in the screening method of the present invention include cell extracts such as organisms (eg, plants, animals, microorganisms), cell-free extracts of the organisms, cell cultures of the organisms, and tissues of the organisms. Examples include substances contained in samples such as cultures, chemically synthesized compounds, biologically produced substances, and the like.
The test sample is obtained by, for example, an expression library such as a cDNA expression library, peptides, peptide mimetics, hormones, other proteins, nucleic acids, nucleic acid analogs (eg, peptide nucleic acid (PNA), etc.), combinatorial chemistry. Compound of the obtained combinatorial library, antisense nucleic acid of the indicator gene, ribozyme specific to the indicator gene, RNAi specific to the indicator gene, antibody to the indicator polypeptide, DNA aptamer to the indicator polypeptide, etc. These compounds are also included. Furthermore, the nucleic acid, nucleic acid analog, PNA, antisense nucleic acid, ribozyme, RNAi, and antibody may be subjected to various modifications, derivatizations, etc. from the viewpoint of screening for substances exhibiting better compatibility.
Further, for example, when a mixture of a plurality of substances such as a cell extract, a cell-free extract, a cell culture, a tissue culture, etc. is used as a test sample, the target sample is selected from the substances contained in the test sample. In order to further select antagonists or inhibitors that exhibit an action, the test sample is analyzed by an appropriate method, for example, the identity or similarity of the chemical and / or physical properties of the substance by various chromatography, salting out, organic solvent extraction, etc. A fraction obtained by subdividing a substance contained in a test sample is obtained by fractionation based on sex, etc., and each of the fractions is again subjected to the screening method of the present invention to select a fraction exhibiting a desired action. By doing so, antagonists or inhibitors can be selected. The fractionation and the screening method may be repeated as necessary.
In the screening method of the present invention, as one of the indicators for selecting antagonists or inhibitors, A. Events that occur via an indicator gene, and / or
B. Kinetics of at least one indicator polypeptide or fragment thereof,
To evaluate.
A. In one aspect, the screening method for assessing the kinetics of (aspect 1),
In the presence of the test sample
A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) The expression level of at least one gene selected from the group consisting of (indicator gene) is compared with the expression level of the gene in the absence of the test sample, and in the presence of the test sample, There is a screening method in which a test substance is selected using an expression level decrease as an index.
In the screening method, the expression level of the indicator gene can be measured, for example, by measuring transcriptional activity using a reporter gene, quantitative analysis of the expression product by RT-PCR or Northern blotting.
When measuring the expression level of the indicator gene using a reporter gene, a conventional quantifiable reporter gene is operably linked downstream of the indicator gene, and the resulting construct is directly added by an appropriate means. Or indirectly, it can be measured by introducing into a host and quantifying the expression product of the reporter gene.
Examples of the reporter gene include β-galactosidase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, luciferase gene and the like.
Examples of the host include Escherichia coli (Escherichia Coli K-12 strain HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, etc.), yeast (Saccharomyces cerevisiae, etc.) and the like.
Introduction of the construct into a host cell can be performed, for example, by linking the construct to a conventional vector and introducing the construct into the host cell, or directly introducing the construct into the host cell.
The vector can be appropriately selected depending on the host cell to be used. For example, when E. coli is used as the host cell, a pUC derivative (for example, pUC19 etc.), a trade name: pBluescript II (manufactured by Stratagene) Plasmid vectors such as pBR322, pCR3, and pCMVSPORT; and phage vectors such as λZAPII and λgt11. When the host cell is a yeast cell, examples of the vector include pYES2, pYEUra3 and the like. When the host cell is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned. When the host is an animal, examples thereof include pKCR, pEFBOS, cDM8, and pCEV4.
Examples of methods for introducing the construct into the host include conventional gene introduction methods such as the calcium chloride method and the electroporation method.
The expression product amount of the reporter gene can be measured by means according to the type of the reporter gene. For example, when the reporter gene expression product is an enzyme, measurement of enzyme activity, measurement of the production amount of a degradation product of the enzyme substrate, measurement via fluorescence intensity, and the like can be mentioned.
In the case of RT-PCR for measuring mRNA, by using a primer pair that specifically amplifies the indicator gene or a characteristic part thereof, the indicator gene or a characteristic part thereof is amplified and quantified by a conventional method. Can be done.
The “characteristic portion” means a portion of an indicator gene that is not substantially found in a sequence registered in a known database.
The primer pair can be designed by conventional primer design software or the like with reference to the base sequence of the indicator gene and the sequence registered in a known database. The primer pair can be appropriately labeled with a labeling substance (fluorescent substance, radioactive substance, etc.) suitable for detection. The chain length of the primer is not particularly limited. For example, it is preferably at least 15 consecutive nucleotides, more preferably 15 to 40 nucleotides, and more preferably 17 to 30 nucleotides.
The amount of the amplification product by RT-PCR can be quantified through, for example, the fluorescence intensity based on ethidium bromide, the amount of labeling substance, and the like.
In the case of the Northern blot method, as in the case of the primer pair, it can be performed using a probe specific to the indicator gene designed with reference to the base sequence of the indicator gene and the sequence registered in a known database. . The probe can be labeled with a labeling substance (fluorescent substance, radioactive substance, etc.) suitable for detection. The chain length of the probe is not particularly limited, but from the viewpoint of preventing non-specific hybridization, it is preferably at least 15 consecutive nucleotides, more preferably 18 consecutive nucleotides or more.
The measurement of the mRNA amount of the indicator gene by Northern blotting can be quantified via the amount of labeling substance derived from the hybridized probe.
In the screening method, in the presence of the test substance, when the expression level of the indicator gene is decreased compared to the absence of the test substance, the test substance acts as a bacterial growth inhibitor. It becomes an index of having.
According to the screening method of the present invention, for example, a test sample that is not known to be capable of binding to the indicator polypeptide can be tested. Such a test is similar to the conditions that allow binding of a ligand known to bind to the indicator polypeptide (purified or partially purified product) prepared from a high-producing strain of E. coli in the presence of the test sample. And whether the test sample inhibits the binding of the ligand to the indicator polypeptide, that is, “B. Kinetics of at least one indicator polypeptide or a fragment thereof” Is evaluated.
B. above. As a screening method (Aspect 2) for evaluating the kinetics of
(1) contacting the indicator polypeptide or a fragment thereof with a test sample to obtain a mixture; and
(2) detecting the presence or absence of a test sample that binds to the polypeptide or a fragment thereof in the mixture obtained in step (1);
The method containing is mentioned. In addition, you may perform the screening method of this aspect 2 in combination with the said aspect 1. When combined with the screening method of aspect 1, it may be performed prior to step (A), and after step (B), the screening method of aspect 2 may be performed for the identified antagonist or inhibitor.
In the method of aspect 2, the test sample can be selected by performing the resonance plasmon analysis or the like.
In the case of resonance plasmon interaction analysis, for example,
(1) Step of feeding a solution containing the indicator polypeptide or the test sample at a constant flow rate to the chip on which the test sample or the indicator polypeptide is immobilized; and
(2) Appropriate detection means [for example, optical detection (fluorescence, fluorescence deflection, etc.), combination with a mass spectrometer (matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometer: MALDI-TOF MS, electro A step of detecting an interaction by a spray ionization mass spectrometer: ESI-MS, etc.];
Should be done. Here, when a sensorgram indicating the formation of a complex composed of the test sample and the indicator polypeptide is presented, it is an indicator that the test sample and the indicator polypeptide are bound.
In the screening method of the present invention, when evaluating the dynamics of an indicator gene or a fragment thereof or an indicator polypeptide or a fragment thereof in the presence of a test sample, a randomized peptide is displayed from a phage, and an immobilized receptor Phage display method (eg, WO 91/17271 pamphlet, WO 92/01047 pamphlet, US Pat. No. 5,223,409 pamphlet, etc.) for screening by affinity chromatography against Combinatorial chemistry (eg, US Pat. No. 5,143,854, WO 90/15070, WO 92/10092, etc.), synthesis of peptide libraries and Screening [for example, Kramer [Kramer, Methods Mol. Biol. , 87, 25-39, (1998), etc.], fingerprint analysis of peptide-antibody interactions using clustered amino acid peptide libraries [see, eg, Kramer, Mol. Immunol. , 32, 459-465, (1995)], generation and utilization of peptidomimetic combinatorial libraries [e.g., Ostresh, Methods in Enzymology, 267, 220-236 (1996); Dosner, Bioorg . Med. Chem. 4, 709-715 (1996); Beeley, Trends Biotechn. 12, 213-216 (1994); al-Obeidi, Mol. Biotechn. 205-223, 9 (1998); Wiley, Med. Res.
Rev. , 13, 327-384 (1993); Comput. Aided Mol. Des. , 10, 265-272 (1996); and Hruby, Biopolymers, 43, 219-266 (1997), etc.].
In addition, a method of identifying a short peptide that binds to an indicator polypeptide or a fragment thereof by a phage display method, and then screening an inhibitor using the identified peptide as a probe is also included.
In another aspect, the screening method of the aspect 2 includes
In the presence of the test sample
A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) Comparing the expression level of a polypeptide encoded by at least one gene (indicator gene) selected from the group consisting of the expression level of the polypeptide in the absence of the test sample, A screening method (Aspect 2 ′) for selecting a test substance using as an index the decrease in the expression level of the polypeptide in the presence;
In the presence of the test sample
A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) The function of a polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of and the function of the polypeptide in the absence of the test sample, and in the presence of the test sample, There is a screening method (Aspect 2 ″) in which the test substance is selected using the decrease in function as an index.
In the screening method of aspect 2 ′, the expression level of the polypeptide can be measured by an immunochemical method using an antibody specific for the polypeptide, for example, a conventional Western blot method, a conventional ELISA method, or the like.
The antibody only needs to have the ability to specifically bind to a polypeptide. The antibody may be, for example, John E. In accordance with the method described in, for example, editing by John E. Coligan, Current Protocols in Immunology, 1992, rabbits, mice, etc. using the polypeptide encoded by the indicator gene or a part thereof Can be easily produced. The antibody may be an antibody modified by a known technique or an antibody derivative. Further, the antibody may be an antibody fragment obtained by treating the obtained antibody with a peptidase or the like. The antibody can be labeled with a conventional labeling substance (for example, fluorescent substance, peroxidase, etc.).
In the screening method of the above aspect 2 ′, when the expression level of the polypeptide encoded by the indicator gene is decreased in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance, the test substance Is an indicator of having an action as a bacterial growth inhibitor.
In the screening method of aspect 2 ″, for example, the indicator gene is linked to an appropriate vector, the obtained expression vector is introduced into a host suitable for the expression of the indicator polypeptide, and conditions suitable for the expression of the indicator polypeptide are obtained. The indicator polypeptide is expressed by culturing the host below, and the function of the obtained indicator polypeptide may be evaluated.
The vector and host are the same as described above. The expression vector can be introduced into the host by the gene introduction method.
The indicator polypeptide may be expressed as a fusion protein with His tag, GST or the like.
The expressed indicator polypeptide can be appropriately purified by a conventional protein purification method (for example, centrifugation, salting out, dialysis, ion exchange column chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, etc.).
Examples of the function of the indicator polypeptide include enzyme activity and ligand binding ability.
Further, according to the present invention, a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection is based on a binding site between the indicator polypeptide and a ligand that binds to the indicator polypeptide, such as an antagonist or an inhibitor. Antagonists or inhibitors can be designed to treat. Substances designed as described above can also be used as test substances in the screening method of the present invention. Therefore, the method for designing the antagonist or inhibitor is also included in the present invention.
The method of designing an antagonist or inhibitor for treating a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection of the present invention includes the following steps (i) to (iii):
(I) identifying the binding site of the antagonist or inhibitor to at least one of the indicator polypeptides or a fragment thereof;
(Ii) performing molecular modeling of both the binding site identified in step (i) and the structure of the polypeptide to obtain a molecular model, and (iii) obtained in step (ii), respectively. Modifying the antagonist or the inhibitor based on a specific molecular model, thereby improving the binding specificity or affinity for the polypeptide
It is a method including.
The design method of the present invention has one major feature in that the binding site of an antagonist or inhibitor to at least one of the indicator polypeptides or a fragment thereof is used. Since such a binding site is used, it exhibits an excellent effect that it is possible to design a structure capable of exhibiting more suitable properties against bacterial infections or disorders or diseases associated with bacterial infections.
In addition, since the design method of the present invention performs molecular modeling of both the binding site and the structure of the indicator polypeptide, it exhibits properties that are more suitable for bacterial infections or disorders or diseases associated with bacterial infections. The excellent effect of being able to design possible structures is demonstrated.
Examples of the bacterial infection include infections caused by Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, and the like.
Examples of the disorder or disease related to bacterial infection include bronchitis, pneumonia, pyelonephritis, urethritis, superficial suppurative skin disease, otitis media and the like.
In the step (i), the “antagonist or inhibitor” includes the antagonist or inhibitor identified by the screening method of the present invention. Further, the antagonist or inhibitor is a derivative obtained by performing modification, derivatization or the like by the peptide mimetics production technique, combinatorial chemistry technique, etc. based on the antagonist, inhibitor, etc. identified by the screening method of the present invention. It may be a compound.
In the step (i), for example, when the antagonist or inhibitor is a polypeptide, the binding site is a mutant antagonist or inhibitor prepared by a conventional site-directed mutagenesis method, the indicator gene or a fragment thereof, or Investigating the binding affinity with the indicator polypeptide or a fragment thereof, or examining the binding affinity between the chimeric peptide prepared from the antagonist or inhibitor and the indicator gene or a fragment thereof or the indicator polypeptide or a fragment thereof. Can be determined.
When the antagonist or inhibitor is a compound excluding the polypeptide, the indicator polypeptide is prepared by a conventional site-directed mutagenesis method, and the mutant indicator polypeptide obtained and the antagonist Alternatively, the binding affinity with the inhibitor is examined, and interaction with an amino acid residue of the indicator polypeptide corresponding to the modified amino acid residue of the mutant indicator polypeptide in which no binding is detected (for example, covalent bond, ionic interaction, Functional groups within the antagonist or inhibitor that produce ion-dipole interactions, dipole-dipole interactions, hydrogen bonds, van der Waals forces, hydrophobic interactions, etc.) can be determined.
In addition, as an example of an index for determining the functional group that causes the interaction,
I. Covalent bonds can occur, for example, with functional groups that are susceptible to alkylation, acylation, phosphorylation, etc.
II. An ionic interaction can occur between a positively charged amino acid residue or a negatively charged amino acid residue on a polypeptide and a functional group having a charge opposite to that residue.
III. Ion-dipole interaction and dipole-dipole interaction are, for example, when there is a dipole in which a charge is offset due to a bond between a strong electronegativity atom and a weak electronegativity atom. Can occur in
IV. Hydrogen bonding can occur, for example, between NH-, OH-, etc. and an electronegative group having an unshared electron pair
V. Van der Waals forces can occur between two neutral molecules. The hydrophobic interaction can occur between nonpolar molecules and between nonpolar sites of the molecule
Is mentioned.
In the identification of the binding site, for example, a structural simulation using conventional software may be further performed.
Next, in step (ii), molecular modeling is performed for each of the binding site and the indicator polypeptide.
The molecular modeling can be performed, for example, by nuclear magnetic resonance (NMR), for example, structural analysis by two-dimensional NMR, structural analysis by X-ray diffraction, or the like.
In the molecular modeling, preferably, the antagonist or inhibitor is mixed with an indicator polypeptide from the viewpoint of designing a structure capable of exhibiting more suitable properties against a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection. Then, a complex is formed, and the obtained complex is analyzed by the NMR, or the complex is crystallized, and the obtained crystal is obtained by three-dimensional coordinates by X-ray structural analysis. Is desirable.
Then, in step (iii), the antagonist or inhibitor is modified based on the molecular model obtained in step (ii), thereby improving the binding specificity or affinity for the polypeptide.
In step (iii), the modification of the antagonist or inhibitor is based on the molecular model obtained in step (ii),
1) calculating the binding force between the functional group of the antagonist or inhibitor and the indicator polypeptide by molecular force field calculation, substituting with a functional group capable of exerting stronger binding force, or introducing a modifying group;
2) Regarding the interaction between the functional group of the antagonist or inhibitor and the indicator polypeptide, substitution with a functional group capable of exerting a stronger interaction or introduction of a modifying group,
3) Further consider solvent molecules, etc., find free energy using molecular dynamics method, and lead to compounds that can interact stably,
Or the like.
According to the design method of the present invention, for example, the IC against the indicator polypeptide ₅₀ It is possible to design an antagonist or inhibitor that results in 50 μM or less, preferably 5 μM or less, more preferably 0.5 μM or less.
For the antagonist or inhibitor obtained by the design method of the present invention, the therapeutic effect on a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection is measured, for example, by measuring the minimum inhibitory concentration against various gram-positive bacteria and gram-negative bacteria. In addition, it can be evaluated by measuring the therapeutic effect using an infection model animal such as systemic infection, pneumonia, urinary tract infection, and the like, and measuring the pharmacokinetics in various animals.
In the present invention, a polypeptide having a base sequence of a gene selected from the group consisting of SA0544, SA1293, and SA1511 and encoded by the base sequence is a nucleic acid associated with bacterial growth or the Also included is the use of the peptide for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diseases such as bacterial infections.
Furthermore, one aspect of the present invention relates to the temperature sensitive mutant. Specifically, the temperature-sensitive mutant of the present invention comprises a gene (SA0544) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, a gene (SA1293) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the SEQ ID NO: : A temperature-sensitive mutant of S. aureus having a gene having a mutation in a part of at least one kind of base sequence selected from the group consisting of the gene (SA1511) encoding the amino acid sequence shown in 9:
“Mutation” in the description of the temperature-sensitive mutant strain of the present invention refers to a mutation that produces a product that cannot exhibit a function essential for bacterial growth at a high temperature, for example, 43 ° C., and has a large structure at the amino acid level. This refers to a base substitution, deletion, addition or insertion that denatures the active function.
More specifically, the temperature-sensitive mutant strain used in the present invention is, for example, TS1124 strain, TS5815 strain, TS2005 strain, TS4310 strain, TS4530 strain, TS8229 strain, etc., specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (SA0544) amino acid number: 204 nucleotide sequence in which the codon corresponding to serine is replaced with the codon corresponding to leucine (TS1124 strain),
A base sequence (TS5815 strain) in which the codon corresponding to glycine of amino acid number 189 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (SA0544) is substituted with a codon corresponding to aspartic acid,
A base sequence (TS2005 strain) in which the codon corresponding to glutamic acid of amino acid number 100 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (SA1293) is substituted with a codon corresponding to lysine;
A base sequence (TS4310 strain) in which the codon corresponding to glycine of amino acid number 93 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (SA1293) is substituted with a codon corresponding to arginine;
A base sequence (TS4530 strain) in which the codon corresponding to phenylalanine of amino acid number 75 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (SA1511) is replaced with a codon corresponding to leucine; and
A base sequence in which the codon corresponding to glycine of amino acid number 6 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is substituted with a codon corresponding to aspartic acid (TS8229 strain)
And a temperature-sensitive mutant having a base sequence selected from the group consisting of:
In addition, the above-mentioned temperature-sensitive mutant strains include strains having the above mutations produced by genetic engineering techniques, for example, the overlap extension method which is a site-specific mutagenesis method, and strains having the above naturally occurring mutations. included.
In the present invention, a bacterial growth inhibitor can be screened by using the temperature-sensitive mutant of the present invention.
Therefore, another aspect of the present invention is a method for screening a bacterial growth inhibitor comprising detecting a change in the presence and absence of a test substance using the temperature sensitive mutant of the present invention ( Aspect 3).
The screening method of aspect 3 of the present invention includes:
(1) contacting the test sample with each of the temperature-sensitive mutant strain and the wild strain, and
(2) comparing a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with a wild strain and a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the temperature-sensitive mutant strain;
The test sample is selected using as an indicator that a change occurs between a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with a temperature-sensitive mutant strain and a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with a wild strain. And a method for screening bacterial growth inhibitors.
In the screening method of aspect 3 of the present invention, “phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact” includes, for example, cell death, cell growth inhibition, accumulation of biosynthetic intermediates of bacterial cell components, accumulation of metabolites, etc. Is mentioned.
In the step (1), the contact of the temperature-sensitive mutant strain or the wild strain with the test sample is performed by adding the test sample at an appropriate dilution ratio to a medium suitable for culture of the temperature-sensitive mutant strain and the wild strain, for example. However, it can be carried out by culturing a temperature-sensitive mutant strain or a wild strain under conditions suitable for culture.
The “conditions suitable for culturing” can be appropriately set according to the culturing conditions described in “The Illustrated Microbial Experiment Manual (Gihodo, 1992)”, for example.
In the present specification, the term “temperature-sensitive mutant strain” refers to a mutant strain that exhibits or becomes temperature-sensitive due to a mutation in a wild strain (that is, a wild-type bacterium) as a source.
It means wild type bacteria.
Examples of wild strains include Staphylococcus aureus strains such as RN4220, Cowan, V8, Newman, L12, Reynolds, JL022, N315, RN8846, SRM551, SRM563, RS1587, 209P, JC-1, ATCC25923, SMITHNCTC8325, RN2677, RN451, RN2906, MW2, COL, 252, 476, E. coli strains such as K12, BL21, HB101, JM109, M66, DH10, CFT073, O157, MV1184, B, ML, KU6401, ATCC26, ATCC25922 and the like.
In the step (1), the contact between the cell and the test sample is, for example, a medium containing the test sample, specifically, L-broth (tryptone: 1% by weight, yeast extract: 0.5% by weight, Sodium chloride: 0.5 wt%, pH 7.0), Staphylococcus medium 110 (yeast extract: 0.25 wt%, peptone: 1 wt%, gelatin: 3 wt%, lactose: 0.2 wt%, mannitol 1% by weight, sodium chloride: 7.5% by weight, dipotassium hydrogen phosphate: 0.5% by weight, defatted agar: 1.5% by weight, pH 7.0), tryptic soy agar medium (tryptone: 1.5% by weight) , Soy peptone: 0.5 wt%, sodium chloride: 0.5 wt%, agar: 1.5 wt%, pH 7.3), lactose bouillon (meat extract: 0.3 wt%, peptone: 0.5 wt%, Lactose: 0.5 weight pH 6.9), clinical thioglycolate medium (tryptone: 1.7 wt%, soy peptone: 0.3 wt%, glucose: 0.6 wt%, sodium chloride: 0.25 wt%, sodium thioglycolate: 0 0.05% by weight, L-cystine: 0.025% by weight, sodium sulfite: 0.01% by weight, agar: 0.07% by weight, pH 7.0), Mueller Hinton medium (beef extract: 30% by weight, casein hydrolysis Product: 1.75% by weight, soluble starch: 0.15% by weight, agar: 1.7% by weight, pH 7.3), tetrathionate liquid medium (peptone: 0.25% by weight, casein peptone: 0.25% by weight) %, Sodium desoxycholate: 0.1% by weight, sodium thiosulfate: 3% by weight, calcium carbonate: 1% by weight, pH 8.4), mannitol salt medium (meat extract: .25 wt%, peptone: 1 wt%, mannit: 1 wt%, sodium chloride: 7.5 wt%, phenol red: 0.0025 wt%, agar: 1.5 wt% pH 7.4), PEA azide Medium (meat extract: 0.5 wt%, tryptone: 1.5 wt%, sodium chloride: 0.5 wt%, phenylethanol: 0.15 wt%, sodium nitride: 0.01 wt%, agar: 1. 5% by weight pH 7.4), YCC liquid medium (yeast extract: 0.5% by weight, peptone: 1.5% by weight, glucose: 0.45% by weight, dipotassium phosphate: 0.2% by weight, sodium sulfite : 0.02% by weight pH 7.2), tryptic soy bouillon medium (tryptone: 1.7% by weight, soy peptone: 0.3% by weight, glucose: 0.25% by weight, sodium chloride: 0.5% by weight, It can be carried out by culturing at an appropriate temperature in dipotassium acid: 0.25% by weight, pH 7.3) or the like.
The content of the test sample in the medium can be set to have an appropriate serial dilution rate.
In the step (2), a comparison between a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with a wild strain and a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the temperature-sensitive mutant strain is, for example, by visual observation, The analysis can be performed by HPLC analysis of the lysate, LC / MS analysis of the lysate, confocal microscope observation, and the like.
In the step (2), when comparing cell growth inhibition as a phenomenon, cell growth inhibition ³ It can be evaluated using H-thymidine incorporation, BrdU incorporation into DNA, changes in the absorbance of the culture during culture, viable count, presence or absence of bacterial colonies, etc. as indicators.
Cell death also affects DNA ³ It can be evaluated using H-thymidine incorporation, BrdU incorporation into DNA, cell morphology, viable count, colony-forming ability, etc. as indicators.
Specifically, the evaluation of the growth of cells, particularly S. aureus, is, for example,
-Culturing and growing the S. aureus in a suitable medium;
-When the cells are in a logarithmic growth phase, eg 2 hours after the start of culture, as parameters for DNA synthesis and cell proliferation, ³ DNA precursors such as H-thymidine and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) are added, and cultured for an appropriate time (for example, 30 minutes).
-Then remove the medium components from the culture, then wash the cells,
-The obtained microbial cells were incorporated into the DNA of the Staphylococcus aureus ³ Measure the amount of DNA precursors such as H-thymidine and BrdU
Can be done. Said ³ H-thymidine can be evaluated by dissolving the obtained bacterial cells and measuring the radioactivity of the obtained lysate using a scintillation counter or the like. The amount of BrdU can be detected using a monoclonal antibody (anti-BrdU antibody) against BrdU, and can be measured via a secondary antibody labeled with a labeling substance such as an enzyme or a fluorescent substance. The immune reaction between the anti-BrdU antibody and the secondary antibody is quantified by spectrophotometry, fluorescence measurement or the like according to the labeling substance used. In addition, the evaluation of the growth of cells, particularly S. aureus, may be performed by a conventional method, for example, turbidity change, colony formation, viable count, and the like.
The ability to inhibit the growth of a test sample against S. aureus can be performed by using a medium containing the test sample when culturing the S. aureus in the method for performing the “evaluation of growth of S. aureus”. In addition, what is necessary is just to perform culture | cultivation using the culture medium which does not contain a test sample as a control. In addition, the above-mentioned growth inhibitory ability can be determined by, for example, Drews et al. [Drews, Mikubiol. Prakticum, Berlin, 1976], and the like, can be evaluated by measuring bacterial growth in the presence and absence of the test sample.
The “cell death” refers to, for example, a certain amount of cells measured using absorbance as an index, mixed with an agar medium, or inoculated on an agar medium, cultured at an appropriate temperature, and the number of colonies produced is calculated. It can be measured by counting or observing the presence or absence of colonies. Bacteria can be evaluated in the presence of a test sample, for example, by culturing for 5 hours and then measuring cell death, for example, by the method described above.
The screening method of the present invention includes the following screening methods:
(1) A gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Contacting a test sample with a polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of (SA1511) or a fragment thereof, and obtaining a mixture;
(2) In the mixture obtained in the step (1), the presence or absence of a test sample that binds to the polypeptide or a fragment thereof is detected, whereby the test sample that binds to the polypeptide or a fragment thereof is propagated by bacteria. Obtaining as a candidate substance of an inhibitor,
(3) contacting the candidate substance obtained in step (2) with a cell carrying at least one gene selected from the group consisting of SA0544, SA1293, and SA1511; and
(4) a step of detecting the presence or absence of cell growth inhibition and / or cell death in the cells obtained in (3), thereby selecting a candidate substance using as an indicator that cell growth inhibition and / or cell death is caused ,
And a method for screening a bacterial growth inhibitor.
Steps (1) and (2) can be performed in the same manner as the screening method of aspect 2.
The steps (3) and (4) can be performed in the same manner as the screening method of the first aspect.
The screening method of the present invention includes
(1) a phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant of the present invention is cultured at an optimum temperature for growth of the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant, the wild-type bacterium can grow, and Observing the difference between the phenomenon that occurs when culturing at a temperature at which the growth of the temperature sensitive mutant is affected,
(2) A phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant is cultured in the absence of a test sample at the optimal temperature for growth, and occurs when it is cultured in the presence of the test sample at the optimal temperature for growth. Observing the difference between the phenomenon,
(3) observing a difference between a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the absence of the test sample and a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the presence of the test sample; and
(4) Comparison between the result obtained in step (1) and the result obtained in (2) or between the result obtained in step (1) and the result obtained in (3) In addition, a method for screening a bacterial growth inhibitor, which comprises selecting a candidate substance that causes cell growth inhibition and / or cell death using as an index that substantially the same phenomenon is detected, is also included.
In the present specification, “the temperature at which the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant strain can grow and the growth of the temperature-sensitive mutant strain is affected” is specifically 37 ° C. to 45 ° C. Yes, preferably 40-45 ° C, particularly preferably 43 ° C.
The “optimum temperature for growth of wild-type bacteria” may differ depending on the wild-type bacteria, but it means, for example, 30 ° C. or the like.
In such a screening method, between the phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant is cultured at a high temperature, for example, 37 ° C. or 43 ° C., and the phenomenon that occurs when a wild-type bacterium is cultured in the presence of a test substance. Similarity is an indicator. Examples of “phenomena” in such screening methods include morphological changes of bacteria, substrates, accumulation of biosynthetic intermediates of bacterial cell components, accumulation of metabolites, and the like.
According to the method for screening a growth inhibitor targeting an essential gene of Staphylococcus aureus of the present invention, it is effective against various Gram-positive bacteria including S. aureus, negative bacteria, and especially resistant bacteria. An excellent effect is obtained in that an antagonist or inhibitor capable of efficiently suppressing the growth of bacteria can be efficiently screened. In addition, according to the method for designing an antagonist or inhibitor for treating a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection of the present invention, it is more effective against a bacterial infection or a disorder or disease associated with a bacterial infection. There is an excellent effect that an antagonist or inhibitor that can act effectively and efficiently can be obtained efficiently. In addition, according to the nucleic acid related to the growth of the bacterium of the present invention, in order to screen for an antagonist or inhibitor that can efficiently suppress the growth of various gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and gram-negative bacteria. It has an excellent effect that it can be used for the suppression of bacterial growth. Furthermore, according to the temperature-sensitive strain of Staphylococcus aureus of the present invention, it is effective against various Gram-positive and negative bacteria including Staphylococcus aureus, and in particular, resistant bacteria. It has an excellent effect that an antagonist or inhibitor that can be suppressed can be efficiently screened.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples. Unless otherwise specified, for the reaction conditions, operations, etc., instructions attached to the reagents used, molecular cloning laboratory manual [Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, (2001)], etc. Can be referred to.

黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株を、ＬＢ液体培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、１重量％ 塩化ナトリウム、０．４％ エチルメタンサルフェート（ｐＨ７．０）〕を用いて変異処理し、ＬＢ寒天培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％酵母エキス、１重量％ 塩化ナトリウム、０．４重量％ エチルメタンサルフェート １．５重量％ 寒天（ｐＨ７．０）〕に塗布し、３０℃で培養した。ついで、生じたコロニーについて、前記ＬＢ寒天培地に、レプリカ法で播種し、２枚のレプリカプレートを作製した。
前記レプリカプレートの一方を３０℃で一夜インキュベートし、他方を４３℃で一夜インキュベートした。
その結果、４３℃でのインキュベーションでは、生育せず、３０℃でのインキュベーションで生育したコロニーを、温度感受性変異株として得た。S. aureus RN4220 strain was prepared using LB liquid medium (composition: 1% by weight bactotryptone, 0.5% by weight yeast extract, 1% by weight sodium chloride, 0.4% ethyl methane sulfate (pH 7.0)). Mutation-treated LB agar medium [Composition: 1% by weight bactotryptone, 0.5% by weight yeast extract, 1% by weight sodium chloride, 0.4% by weight ethyl methane sulfate 1.5% by weight agar (pH 7.0) ] And cultured at 30 ° C. Subsequently, the resulting colonies were seeded on the LB agar medium by a replica method to prepare two replica plates.
One of the replica plates was incubated at 30 ° C. overnight and the other was incubated at 43 ° C. overnight.
As a result, colonies that did not grow by incubation at 43 ° C. and grew by incubation at 30 ° C. were obtained as temperature-sensitive mutants.

黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株から、慣用の方法で、ゲノムＤＮＡを単離した。
得られたゲノムＤＮＡを、ＳｓｐＩ、ＥｃｏＲＶ等の制限酵素又はデオキシリボヌクレアーゼＩで部分消化し、ついで、得られた消化ＤＮＡ断片を、ベクタープラスミドｐＳＲ５１５に組込み、ゲノムＤＮＡプラスミドライブラリーを得た。
得られたゲノムＤＮＡプラスミドライブラリーを、エレクトロポレーション法で、前記実施例１で得られた変異株に導入し、得られた形質転換体を、クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、１重量％ 塩化ナトリウム、１．５重量％ 寒天（ｐＨ７．０）〕に塗布した。その後、前記平板培地を、４３℃で維持し、形質転換体を培養した。
２４時間培養後、前記平板培地上、４３℃で形成されたコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。その後、ゲノムＤＮＡに由来する挿入断片の解析を行なった。
ゲノムＤＮＡに由来する挿入断片の両端の塩基配列を決定した。ついで、決定された塩基配列と、すでにゲノムプロジェクトにより全ゲノムＤＮＡの塩基配列が決定されている黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株の塩基配列とを比較した。前記Ｎ３１５株のゲノムＤＮＡの塩基配列は、前記ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡの塩基配列とほぼ相同であると考えられている。そこで、前記比較の結果に基づき、ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡ由来の挿入断片の全塩基配列を推定した。
ゲノムＤＮＡプラスミドライブラリーを温度感受性変異株に導入した結果４３℃で増殖できるようになった形質転換体は、通常、複数株分離できるので、挿入断片の塩基配列を解析できるプラスミドも複数ある。解析することにより複数の挿入断片中に共通して見出された遺伝子は、前記変異株の高温感受性を相補する遺伝子であると考えられる
なお、挿入断片中に２種以上の遺伝子が共通して見出された場合、ＲＮ４２２０株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてそれぞれの遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られた各断片をそれぞれ別のプラスミドに組込み、単一の遺伝子を含有した組換えプラスミドを構築し、前記実施例１で得られた温度感受性変異株に該組換えプラスミドを導入して、４３℃における増殖能の相補を評価することにより、相補性試験を行なった。
前記相補性試験において、培地として、ＬＢ培地〔組成：１重量％ バクトトリプトン、０．５重量％ 酵母エキス、（ｐＨ７．０）〕を用いた。
その結果、配列番号：１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子、配列番号：４又は５に示される塩基配列を有する遺伝子及び配列番号：７又は８に示される塩基配列を有する遺伝子のそれぞれが、黄色ブドウ球菌の増殖に機能を果たす遺伝子（生存に必須の遺伝子）として得られた。また、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：３、６及び９に示す。Genomic DNA was isolated from S. aureus RN4220 by a conventional method.
The obtained genomic DNA was partially digested with restriction enzymes such as SspI and EcoRV or deoxyribonuclease I, and then the obtained digested DNA fragment was incorporated into the vector plasmid pSR515 to obtain a genomic DNA plasmid library.
The obtained genomic DNA plasmid library was introduced into the mutant strain obtained in Example 1 by electroporation, and the obtained transformant was treated with chloramphenicol-containing LB agar medium [composition: 1 Weight% bactotryptone, 0.5 weight% yeast extract, 1 weight% sodium chloride, 1.5 weight% agar (pH 7.0)]. Then, the said plate medium was maintained at 43 degreeC and the transformant was cultured.
After culturing for 24 hours, plasmid DNA was extracted from colonies formed at 43 ° C. on the plate medium. Thereafter, the insert fragment derived from genomic DNA was analyzed.
The nucleotide sequences at both ends of the insert fragment derived from genomic DNA were determined. Next, the determined base sequence was compared with the base sequence of S. aureus N315 strain whose base sequence of total genomic DNA had already been determined by the Genome Project. The base sequence of the genomic DNA of the N315 strain is considered to be almost homologous to the base sequence of the genomic DNA of the RN4220 strain. Therefore, based on the result of the comparison, the entire nucleotide sequence of the insert fragment derived from genomic DNA of RN4220 strain was estimated.
As a result of introducing a genomic DNA plasmid library into a temperature-sensitive mutant strain, multiple transformants that can grow at 43 ° C. can usually be isolated, so there are also several plasmids that can analyze the base sequence of the inserted fragment. It is considered that the genes commonly found in a plurality of insert fragments by analysis are genes that complement the high-temperature sensitivity of the mutant strain. Note that two or more genes are commonly found in the insert fragments. If found, each gene is amplified by PCR using the genomic DNA of RN4220 strain as a template, and the resulting fragments are incorporated into different plasmids to construct a recombinant plasmid containing a single gene. Then, the complementation test was performed by introducing the recombinant plasmid into the temperature-sensitive mutant obtained in Example 1 and evaluating the complementation of growth ability at 43 ° C.
In the complementation test, LB medium [composition: 1% by weight bactotryptone, 0.5% by weight yeast extract, (pH 7.0)] was used as the medium.
As a result, the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5, and the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8, respectively It was obtained as a gene that functions in the growth of Staphylococcus aureus (gene essential for survival). In addition, the amino acid sequences of the polypeptides encoded by the genes are shown in SEQ ID NOs: 3, 6 and 9, respectively.

細胞増殖阻害を評価する場合、被験試料として、化合物ライブラリーの化合物を含有したＬＢ培地中、３０℃又は３７℃で、黄色ブドウ球菌温度感受性株を培養する。また、対照として、前記条件下で黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株を培養する。
培養後、吸光度若しくは菌集落の有無によって細胞増殖阻害を評価する。
その結果、被験試料の存在により、ＲＮ４２２０株よりも温度感受性株の増殖がより強く阻害された場合、あるいは３０℃よりも３７℃の方が温度感受性株の増殖がより強く阻害された場合、該被験試料が、アンタゴニスト又はインヒビターとして選別される。When evaluating cell growth inhibition, a Staphylococcus aureus thermosensitive strain is cultured at 30 ° C. or 37 ° C. in an LB medium containing the compound library compound as a test sample. As a control, S. aureus RN4220 strain is cultured under the above conditions.
After culture, cell growth inhibition is evaluated by absorbance or presence / absence of bacterial colonies.
As a result, when the presence of the test sample inhibited the growth of the temperature sensitive strain more strongly than the RN4220 strain, or when the growth of the temperature sensitive strain was more strongly inhibited at 37 ° C than at 30 ° C, A test sample is selected as an antagonist or inhibitor.

温度感受性変異株を、ＬＢ培地中、温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌は生育でき、かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度（例えば、３７〜４３℃）の範囲の各温度および３０℃で培養する。また、前記温度感受性変異株に対応する野生株を前記温度で、あるいは前記温度感受性変異株を３０℃で、各種濃度の被験物質存在下あるいは非存在下でＬＢ培地中で培養する。
培養後、得られた温度感受性変異株及び野生株それぞれの細胞の形態を観察する。また、得られた温度感受性変異株及び野生株それぞれから、同じ細胞数単位の細胞抽出物を調製し、得られた細胞抽出物について、二次元電気泳動、ＨＰＬＣ等により、該細胞抽出物中に含まれる成分量、その組成比等を解析する。
次に、３０℃で培養した時と比較して、温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌は生育でき、かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度で培養した時の温度感受性株の形態変化、細胞抽出物中に含まれる成分量、その組成比等の変化を調べる。さらに、該温度感受性株あるいは温度感受性変異株の起源となる野生株を被験物質非存在下で培養した時と比較して、被験物質存在下で培養した時の細胞の形態変化、細胞抽出物中に含まれる成分量、その組成比等の変化を調べる。
その結果、両変化が実質的に同一の場合、該被験物質が、温度感受性変異した指標遺伝子もしくはそれによりコードされるポリペプチドのアンタゴニスト又はインヒビターとして選別される。The temperature-sensitive mutant can be grown in a temperature range (for example, 37 to 43 ° C.) in which the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant can grow in the LB medium and the growth of the temperature-sensitive mutant is affected. Incubate at each temperature and 30 ° C. In addition, the wild strain corresponding to the temperature-sensitive mutant is cultured in the LB medium at the above temperature, or the temperature-sensitive mutant at 30 ° C. in the presence or absence of various concentrations of the test substance.
After the culture, the cell morphology of each of the obtained temperature-sensitive mutant strain and wild strain is observed. In addition, a cell extract of the same cell number unit is prepared from each of the obtained temperature-sensitive mutant strain and wild strain, and the obtained cell extract is added to the cell extract by two-dimensional electrophoresis, HPLC, etc. Analyze the amount of components, composition ratio, etc.
Next, as compared with the case of culturing at 30 ° C., the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant strain can grow, and the temperature sensitivity when cultured at a temperature at which the growth of the temperature-sensitive mutant strain is affected. Changes in the shape of the strain, the amount of components contained in the cell extract, and the composition ratio thereof are examined. Furthermore, compared to when the wild-type strain, which is the origin of the temperature-sensitive strain or temperature-sensitive mutant strain, is cultured in the absence of the test substance, the morphological change of the cells when cultured in the presence of the test substance, in the cell extract Changes in the amount of components contained in the composition, the composition ratio, etc. are examined.
As a result, when both changes are substantially the same, the test substance is selected as an antagonist or inhibitor of the temperature-sensitive mutated indicator gene or the polypeptide encoded thereby.

本発明により、細菌の増殖に必須の新規遺伝子及びその産物を標的として抗菌化合物のスクリーニングに利用することが可能になり、その結果、既存抗菌薬とは異なる基本骨格と異なる作用機作を持ち、耐性が交叉しない新規抗菌薬を見出すことが可能となった。  According to the present invention, it becomes possible to use a novel gene essential for bacterial growth and its product as a target for screening antibacterial compounds. It has become possible to find new antibacterial drugs that do not cross resistance.

Claims (4)

被験試料の存在下における
配列番号：１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子、配列番号：４又は５に示される塩基配列を有する遺伝子及び配列番号：７又は８に示される塩基配列を有する遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１種の遺伝子の発現量と、該被験試料の非存在下における該遺伝子の発現量とを比較し、該被験試料の存在下において、該遺伝子の発現量が減少することを指標として被験試料を選別する、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法。 A gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the presence of the test sample, a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5, and a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 The expression level of at least one gene selected from the group consisting of is compared with the expression level of the gene in the absence of the test sample, and the expression level of the gene decreases in the presence of the test sample A method for screening a bacterial growth inhibitor , which comprises selecting a test sample using as an index. 配列番号：１又は２に示される塩基配列を有する遺伝子、配列番号：４又は５に示される塩基配列を有する遺伝子及び配列番号：７又は８に示される塩基配列を有する遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列の一部に変異を有する遺伝子を有する、黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株。SEQ ID NO: selected from the group consisting of the gene having the base sequence shown in 1 or 2 , SEQ ID NO: 4 or the gene having the base sequence shown in 5 and the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 A temperature-sensitive mutant of Staphylococcus aureus having a gene having a mutation in a part of at least one kind of base sequence. （１）請求項２記載の温度感受性変異株及び野生株それぞれに、被験試料を接触させるステップ、及び
（２）野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、請求項２記載の温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステップ、
を含み、温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化を生じることを指標として被験試料を選別することを特徴とする細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験試料を接触させた場合に生じる現象が細胞死又は細胞増殖抑制である、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法。(1) a step of bringing a test sample into contact with each of the temperature-sensitive mutant strain and wild strain according to claim 2, and (2) a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the wild strain, Comparing the phenomenon that occurs when the test sample is contacted with a temperature-sensitive mutant,
The test sample is selected using as an indicator that a change occurs between a phenomenon that occurs when the test sample is contacted with a temperature-sensitive mutant strain and a phenomenon that occurs when the test sample is contacted with a wild strain. it a method of screening for bacterial growth inhibitor characterized by that, the phenomenon that occurs when a test sample is brought into contact is a cell death or cell proliferation curbing method for screening bacterial growth inhibitor. （１）請求項２記載の温度感受性変異株を、該温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、該野生型の細菌は生育でき、かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ（ここで、前記現象が菌の形態変化、基質、菌体成分の生合成中間体の蓄積、又は代謝産物の蓄積である）、
（２）該温度感受性変異株を、該生育至適温度下に、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、該生育至適温度下に、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ（ここで、前記現象が菌の形態変化、基質、菌体成分の生合成中間体の蓄積、又は代謝産物の蓄積である）、
（３）該野生型の細菌を、被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、被験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ（ここで、前記現象が菌の形態変化、基質、菌体成分の生合成中間体の蓄積、又は代謝産物の蓄積である）、及び
（４）前記ステップ（１）で得られた結果と（２）で得られた結果との間又は前記ステップ（１）で得られた結果と（３）で得られた結果との間で比較し、実質的に同一の現象が検出されることを指標として、細胞増殖阻害及び／または細胞死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法。(1) A phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant according to claim 2 is cultured at an optimum temperature for growth of the wild-type bacterium that is the origin of the temperature-sensitive mutant, and the wild-type bacterium can grow. And a step of observing a difference between the temperature-sensitive mutant and a phenomenon that occurs when cultivated at a temperature at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected (wherein the phenomenon is a change in the morphology of the fungus, Accumulation of synthetic intermediates, or accumulation of metabolites) ,
(2) A phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant is cultured in the absence of a test sample at the optimal temperature for growth, and occurs when it is cultured in the presence of the test sample at the optimal temperature for growth. Observing the difference between the phenomenon (wherein the phenomenon is a morphological change of a fungus, a substrate, an accumulation of a biosynthetic intermediate of a cell component, or a metabolite)
(3) a step of observing a difference between a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the absence of the test sample and a phenomenon that occurs when the wild-type bacterium is cultured in the presence of the test sample (wherein the phenomenon Is the morphological change of the fungus, the accumulation of biosynthetic intermediates of substrates, cell components, or the accumulation of metabolites) , and (4) the results obtained in step (1) and obtained in (2) In comparison with the result or between the result obtained in the step (1) and the result obtained in (3), and using as an index that substantially the same phenomenon is detected, cell growth inhibition and A method for screening a bacterial growth inhibitor, which comprises selecting a candidate substance that causes cell death.