JP4465121B2 - 新規のアミドピリリウム蛍光染料 - Google Patents
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Description
本発明は、検体を検出する方法における標識基としてのアミドピリリウム化合物の使用ならびに新規のアミドピリリウム化合物に関する。
【0002】
キサンテンは、久しく公知で十分に研究された蛍光染料に数えられる。変換された基本骨格を有する使用された染料、3,10−ビス−(ジメチルアミノ)−5−メチル−6−オキソ−6H[1]−ベンゾピラノ[3,2−c]キノリニウム陽イオン、は、H. Harnisch, Liebigs Ann. Chem. 751, 155-158 (1971)によって記載された。
【0003】
この種の化合物は、ピランとの類似性のために、F.P. Schaefer, Topics in Applied Physics, Vol. I, Dye Laser, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1973 中のK.H. Drexhage, Structure and Properties of Laser Dyesによってアミドピリリウム化合物とも呼称されている。この刊行物中には、さらに染料140および141と呼称されるアミドピリリウム化合物が記載されている。分析学における蛍光−標識基としてのアミドピリリウム化合物の使用に対する指摘は、刊行物中には見出されない。
【0004】
これまで、化学的分析、医学的分析および生物学的分析において使用された蛍光染料は、多くの場合に600nm未満の範囲で吸収する。このことから標識基としての使用の場合、殊に生物学的系の場合には、重大な欠点が明らかになる:診断学的系のためには、安価な光源、例えばレーザーダイオード(635または680nm)またはヘリウム−ネオンレーザー(633nm)を使用することができることは、好ましい。蛍光染料の効果のある励起を保証するために、吸収最大は、できるだけ使用される光源の放出波長の付近にある。しかし、これは、公知の染料の場合には、しばしば定められていない。更に、多くの場合には、公知の染料の吸収スペクトルは、生物学的系からの蛍光物質の吸収と重なり合っている。従って、蛍光染料を記載された欠点なしに生物学的系中での検体の信頼できる正確な検出のために提供することは、望ましい。
【0005】
検体のための検出方法における標識基としての使用のために、信頼できる簡単な検出可能性と共に、種々の溶剤中、殊に水性系中での良好な溶解性が必要とされる。更に、この種の化合物は、簡単で安価に製造することができ、良好な保持可能性、即ち貯蔵能力を有するはずである。
【0006】
従って、本発明の課題は、公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避するために、殊に吸収最大を有し、安価な光源の使用を許容し、生物学的試料中に含有されている物質の吸収範囲外で吸収し、良好な溶解性を示しおよび/または蛍光量子収率を示す、検体を検出するための方法に適した、標識基として使用するための蛍光染料を提供することであった。
【0007】
この課題は、検体を検出するための方法における標識基としての一般式I
【0008】
【化8】
【0009】
〔式中、
Yは、酸素またはN−R8を表わし、
R1、R2、R3およびR8は、それぞれが出現する際に無関係に水素、フェニル基、アルキル鎖中に1〜3個のC原子を有するフェニルアルキル基、場合によっては有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有することができる、20個までのC原子、有利に6個までのC原子を有するポリエーテル基もしくは炭化水素基を表わすか、またはR1基、R2基、R3基およびR8基の1個以上に1個の隣接した置換基で1つの環系を形成させ、
R4、R5、R6およびR7は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基もしくはカルボキシ基または15個までのC原子を有する炭化水素基を表わし、この場合炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基および/またはヘテロアリール基を含みかつ場合によってはそれぞれ有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有していてよく、
この場合R4基、R6基およびR7基の中の1個以上の基は、隣接した置換基で1つの環系を形成することができ、
Cycは、芳香環、ヘテロ芳香環、キノイド環および/または脂環式環から選択された環系を含み、この環系が場合によっては有利にハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有していてよい有機基を表わし、
Xは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを意味する〕で示される化合物の使用によって解決された。
【0010】
一般式Iの化合物は、検体を定性的および/または定量的に測定するための方法における標識基として使用されることができる。これらの測定は、水性液体中、例えば体液、例えば血液、血清、血漿もしくは尿の試料中、廃水試料または食品中で実施されることができる。この方法は、例えばキュベット中での湿式試験として実施されることができるか、または相応する試薬担体上での乾式試験として実施されることができる。この場合、検体の測定は、唯一の反応により行なうことができるかまたは一連の反応によって行なうことができる。
【0011】
意外なことに、一般式Iの化合物の使用は、検体を測定するための化学的検出法、殊に医学的検出法および生物学的検出法において極めて良好な結果を示した。
【0012】
一般式Iの化合物は、蛍光染料が標識基として適しているような全ての公知の化学的検出法、医学的検出法および生物学的検出法において使用されることができる。この種の方法は、当業者に公知であり、したがってこれ以上記載する必要はない。
【0013】
特に好ましい実施態様において、一般式Iの化合物は、検出すべき検体に対して特異的なレセプターに共有結合される。特異的なレセプターは、全ての適した化合物または全ての適した分子であり、有利には、ペプチド、ポリペプチドまたは核酸である。化合物Iまたはこの化合物の共有結合は、例えば核酸ハイブリダイゼーション法または免役化学的方法で使用されることができる。この種の方法は、例えばSambrook他, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harborに記載されている。
【0014】
本発明のもう1つの課題は、殊に検体の検出法において標識基としての使用に適しておりかつ公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避する新規のアミドピリリウム化合物を提供することにあった。
【0015】
この課題は、一般式I
【0016】
【化9】
【0017】
〔式中、
Y、R1〜R7およびCycは、請求項1記載の意味を有し、
Xは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを表わし、
但し、Yが酸素である場合には、R1、R2およびR3は、メチルであり、R4、R5、R6およびR7は、水素であり、
Cycは、式IIまたはIII
【0018】
【化10】
【0019】
【化11】
【0020】
で示される構造を有していない〕で示される化合物によって解決された。
【0021】
化合物Iの利点は、殆んど任意の置換基の変形によって個々の化合物の性質、例えば吸湿性の性質、吸収最大の位置、溶解性の性質、蛍光減少時間および量子収率の高さが著しく変動し、それによって所望通りに選択されることができることにある。こうして、試料、例えば血清、血液または血漿等中での妨害物質での干渉は、減少されることができるかまたはむしろ全体的に回避されることができる。化合物Iの製造は、自体公知の方法により簡単で安価な方法で、次の実施例で詳説されているように行なうことができる。更に、この化合物は、問題なく取り扱うことができる。化合物Iのもう1つの利点は、蛍光の大きなストークスの移動にあり、それによって励起ビームの良好な分離が可能になる。更に、この化合物は、高い安定性を示し、このことは、殊に貯蔵能力に対してプラスの作用を示す。
【0022】
好ましくは、Yは、酸素を表わしおよび/またはR5は、場合によっては置換された芳香族の環系を含む。
【0023】
前記化合物は、有利に共有結合の能力を有する基、例えば−COOH、−NH2、−OHおよび/または−SHを有している。これらのカップリング基により、この化合物は、公知方法により担体および/または生体分子にカップリングされることができる。担体としては、全ての適当な材料、例えば多孔質ガラス、プラスチック、イオン交換樹脂、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体および/または親水性ポリマーが使用されることができる。生体分子は、有利にペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似物および/またはハプテンから選択される。
【0024】
意外なことに、吸収最大および蛍光量子収率は、本発明による化合物を上記の担体および生体分子にカップリングすることによって本質的に変化しない。
【0025】
1つの好ましい化合物種において、R1はR7と架橋しておりおよび/またはR2はR4と架橋しており、殊に5または6員環を有する環系が形成される。特に好ましい物質種において、式I中のCycは、式IV、VまたはVI
【0026】
【化12】
【0027】
【化13】
【0028】
〔式中、R1′、R2′およびR3′は、上記のR1、R2およびR3と同様に定義され、R9〜R11は、上記のR4〜R7と同様に定義される〕で示される構造を有している。
【0029】
他の好ましい化合物種において、R1′はR11と架橋しておりおよび/またはR2′はR10と架橋しており、環系、殊に5員環または6員環が形成される。
【0030】
特に好ましい化合物種の例は、一般式VIIa〜VIIf:
【0031】
【化14】
【0032】
【化15】
【0033】
〔式中、
点線は、場合によっては二重結合を表わし、この二重結合が存在する場合には、点線により結合されたR基を欠き、
X、Y、R1、R2、R3、R1′、R2′およびR3′は、上記と同様に定義され、Rは、それぞれ無関係に上記のR4と同様に定義される〕に表わされている。
【0034】
本発明による化合物の具体的な例は、次の第1表に表わされている。
【0035】
【表1】
【0036】
【表2】
【0037】
【表3】
【0038】
【表4】
【0039】
【表5】
【0040】
【表6】
【0041】
【表7】
【0042】
【表8】
【0043】
本発明は、次の実施例によって詳説される。図1、図2および図3は、本発明による化合物JA227(5)、NK13(16)またはNK14(18)の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す。
【0044】
実施例
アミドピリリウム化合物の製造
A.R5=Hを有する染料
前駆生成物の合成は、ハルニッシュ(Harnisch)およびブラク(Brack)(Liebigs Ann. Chem. 740 (1970), 164-168)の合成法と同様に行なわれる。染料合成は、100℃に減少された反応温度で実施される。この染料合成は、構造5(JA227)および構造15(JA210)について例示的に記載される。エダクトの製出は、次の実施例に含まれているかまたは刊行物に公知である。
【0045】
化合物JA210
第1工程:
9−エチル−4−ヒドロキシ−6,7,8,9−テトラヒドロ−1H−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン
7−アミノ−1−エチル−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン3.5gおよびマロン酸ジエチルエステル3.7gを180〜190℃に加熱する。カラム(長さ:10cm;直径:0.5cm)を介して、フラスコ中で固体が形成されるまでエタノールを留去する。固体をアセトン30ml中で希釈し、吸引濾過し、沈殿物をメタノールで洗浄する。沈殿物を五酸化燐上で乾燥する。
【0046】
収量:2.0g
CDCl3中での1H−NMRデータ:
【0047】
【外1】
【0048】
第2工程:
9−エチル−4−メトキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン
9−エチル−4−ヒドロキシ−6,7,8,9−テトラヒドロ−1H−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン2g(8.2ミリモル)をジメチルホルムアミド25ml中に懸濁させ、水酸化カリウム6.7g(0.12モル)を添加する。そのために、最大60℃でジメチルスルフェート8.6g(0.07モル)を滴加する(氷/食塩浴での冷却)。この懸濁液を水200ml中に搬送する。良好に濾過可能な沈殿物が形成され、この沈殿物を吸引濾過し、かつ乾燥する。
【0049】
収量:1.8g
融点:分解下に208℃
CDCl3中での1H−NMRデータ:
【0050】
【外2】
【0051】
第3工程:
9−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン
9−エチル−4−メトキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン0.5g(1.8ミリモル)を10%の塩酸5ml中で還流下に2時間加熱する。この懸濁液を10%の酢酸ナトリウム溶液でpH5に中和する。沈殿物を吸引濾過し、デシケーター中で乾燥する。
【0052】
d6−DMSO中での1H−NMRデータ:
【0053】
【外3】
【0054】
第4工程:
4−クロル−9−エチル−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン−3−カルボアルデヒド
ジメチルホルムアミド3mlに50〜55℃でオキシ塩化燐0.4gを滴加する。この溶液をなお50℃で1時間、攪拌する。引続き、同じ温度で攪拌しながらジメチルホルムアミド6ml中に溶解した9−エチル−4−メトキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン0.5g(1.8ミリモル)を添加する。なお、80〜90℃で5時間攪拌する。濃く黄色に呈色した溶液を水50mlおよび氷10g上に搬送し、室温で12時間攪拌する。明黄色の沈殿物を濾別し、乾燥する。
【0055】
CDCl3中での1H−NMRデータ:
【0056】
【外4】
【0057】
第5工程:
JA210
9−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン0.18g(1.69ミリモル)および4−クロル−9−エチル−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン−3−カルボアルデヒド0.2g(0.69ミリモル)を氷酢酸20ml中に溶解し、100℃の熱い油浴中で20分間加熱する。この溶液を水100ml中に注入し、沈殿物を濾別する。染料をクロマトグラフィー処理により精製する。
【0058】
DMSO−d6中での1H−NMRデータ:
【0059】
【外5】
【0060】
化合物JA227
4−(7−ヒドロキシ−1,2,3,4−テトラヒドロキノール−1−イル)−酪酸エチルエステル1.2g(4.5ミリモル)および4−クロル−7−ジメチルアミノ−1−メチル−キノール−2−オン−3−カルボアルデヒド1.2g(4.5ミリモル)を氷酢酸50ml中に溶解し、100℃の熱い油浴中で5分間加熱する。この溶液を15%の塩化ナトリウム溶液500ml中に滴加し、沈殿物を濾別する。染料をクロマトグラフィー処理により精製する。
【0061】
B.R5=(置換)フェニル環を有する染料
化合物の好ましい製出を構造18(NK14)、構造20(NK16)および構造23(NK21)につき例示する。エダクトの合成を、これが刊行物に公知でない限り、前記部分Aに記載の例と同様に実施する。ベンゾイル−安息香酸誘導体の合成を、6−(2−カルボキシ−3,4,5,6−テトラクロルベンゾイル)−1−エチル−7−ヒドロキシ−2,2,4−トリメチル−1,2−ジヒドロキノリンの刊行物に公知の製出と同様に行なう。
【0062】
化合物NK14
2−(4−ジメチルアミノ−2−ヒドロキシ)−ベンゾイル−安息香酸1.2g(3.9ミリモル)および9−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン1.0g(3.9ミリモル)を1,1,2,2−テトラクロルエタン40ml中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐5gを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに3時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水50mlおよびクロロホルム50mlで溶解し、有機相の分離後に水相をなお3回、クロロホルムそれぞれ50mlで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【0063】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール50ml中に溶解し、(60%の)過塩素酸10mlの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【0064】
収量:700mg
化合物NK16
9−(2−カルボキシベンゾイル)−8−ヒドロキシ−2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ[ij]キノリジン0.75g(2.22ミリモル)および9−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−6,7,8,9−テトラヒドロ−ピリド[2,3−g]キノール−2−オン0.57g(2.22ミリモル)を1,1,2,2−テトラクロルエタン40ml中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐5gを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに3時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水50mlおよびクロロホルム50mlで溶解し、有機相の分離後に水相をなお3回、クロロホルムそれぞれ50mlで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【0065】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール50ml中に溶解し、(60%の)過塩素酸10mlの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【0066】
収量:160mg
化合物NK21
6−(2−カルボキシベンゾイル)−1−エチル−7−ヒドロキシ−2,2,4−トリメチル−1,2−ジヒドロ−キノリン1.13g(3.1ミリモル)および7−ジメチルアミノ−4−ヒドロキシ−1−メチル−キノール−2−オン0.68g(3.1ミリモル)を1,1,2,2−テトラクロルエタン60ml中で物質が完全に溶解するまで、還流下に加熱する。次に、全部で五酸化燐4gを少量ずつ添加し、反応混合物をさらに3時間還流下に煮沸する。冷却後、前記混合物をフラスコからのそれぞれ水50mlおよびクロロホルム50mlで溶解し、有機相の分離後に水相をなお3回、クロロホルムそれぞれ50mlで抽出する。合わせた有機相をロータリーエバポレーターにより処理して乾燥物にし、引続き染料をカラムクロマトグラフィー処理により精製する。
【0067】
染料の画分をロータリーエバポレーターにより処理し、残留物をエタノール25ml中に溶解し、(60%の)過塩素酸8mlの添加後に水の滴加によって沈殿させる。吸引濾過後、染料の過塩素酸塩を注意深く水で洗浄し、デシケーター中で五酸化燐上で乾燥させる。
【0068】
収量:50mg
C.共役形成に関する例
NK41−マレインイミド
NK41 100mg(0.2ミリモル)を無水DMSO 10ml中に溶解し、無水マレイン酸100mg(1ミリモル)を添加する。この溶液を室温で約24時間攪拌する。10%の過塩素酸ナトリウム水溶液50mlを滴加し、沈殿した固体を濾別する。固体を酢酸ナトリウム25mgと一緒に無水酢酸5ml中に懸濁させ、30分間約80℃に加熱する。冷却後、10%の過塩素酸ナトリウム30mlを添加し、濾過し、固体を乾燥させる。
【0069】
【化16】
【0070】
NK41−マレインイミド−システイン共役
MK41−マレインイミド70mg(0.16ミリモル)をエタノール20ml中に溶解し、システイン22mg(0.16ミリモル)を少量ずつ添加する。室温で攪拌し、30分後に10%の過塩素酸ナトリウム溶液約50mlを滴加する。沈殿した固体を濾別し、乾燥させる。
【0071】
【化17】
【0072】
NK27−活性エステル
NK27 50mg(0.1ミリモル)をN−ヒドロキシスクシンイミド0.2ミリモルおよびジシクロヘキシルカルボジイミド0.2ミリモルと共にアセトニトリル20ml中に溶解する。室温で5時間攪拌し、生成物混合物をロータリーエバポレーターにより処理する。生成は、クロマトグラフィーにより行なう。
【0073】
【化18】
【0074】
NK27−dUTP共役
5−(3−アミノアリル)−dUTP10モルを0.1Mの硼酸ナトリウム緩衝液0.5ml(pH8)中に溶解し、アミン不含のジメチルホルムアミド1ml中のNK27−活性エステル5モルからなる溶液を添加する。この溶液を室温で15時間攪拌する。溶剤を真空中で留去し、残留物をクロマトグラフィーにより精製する。
【0075】
【化19】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明による化合物JA227(5)のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
【図2】 本発明による化合物NK13(16)のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
【図3】 本発明による化合物NK14(18)のエタノール中での吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す線図。
Claims (15)
- 検体を検出するための方法における標識基としての一般式I
Yは、酸素またはN−R8を表わし、
R1、R2、R3およびR8は、それぞれが出現する際に無関係に水素、フェニル基、アルキル鎖中に1〜3個のC原子を有するフェニルアルキル基、場合によっては有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有することができる、20個までのC原子、有利に6個までのC原子を有するポリエーテル基もしくは炭化水素基を表わすか、またはR1基、R2基、R3基およびR8基の1個以上に1個の隣接した置換基で1つの環系を形成させ、
R4、R5、R6およびR7は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、フェニル、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基もしくはカルボキシ基または15個までのC原子を有する炭化水素基を表わし、この場合炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基および/またはヘテロアリール基を含みかつ場合によってはそれぞれ有利にハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有していてよく、
この場合R4基、R6基およびR7基の中の1個以上の基は、隣接した置換基で1つの環系を形成することができ、
Cycは、芳香環、ヘテロ芳香環、キノイド環および/または脂環式環から選択された環系を含み、この環系が場合によっては有利にハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシ基、アルデヒド基、アルコキシ基および/またはアルコキシカルボニル基から選択された1個以上の置換基を有していてよい有機基を表わし、
Xは、場合によっては電荷平衡のために存在する陰イオンを意味する〕で示される化合物の使用。 - 化合物Iを検出すべき検体に対して特異的なレセプターに共有結合する、請求項1記載の使用。
- 検出法を核酸ハイブリダイゼーション法および免疫化学的方法から選択する、請求項1または2記載の使用。
- R1がR7と架橋しておりおよび/またはR2がR4と架橋しており、1つの環系、殊に5または6員環を形成している、請求項4記載の化合物。
- R1′がR11とおよび/またはR2′がR10と架橋しており、1つの環系、殊に5または6員環を形成している、請求項6記載の化合物。
- Yが酸素である、請求項4から8までのいずれか1項に記載の化合物。
- R5が場合によっては置換された芳香族の環系を含む、請求項4から9までのいずれか1項に記載の化合物。
- 共有結合の能力を有する基を有している、請求項4から10までのいずれか1項に記載の化合物。
- カップリング基が−COOH、−NH2、−OHおよび/または−SHである、請求項11記載の化合物。
- カップリング基により担体および/または生体分子にカップリングされている、請求項11または12記載の化合物。
- 担体が多孔質ガラス、イオン交換樹脂、プラスチック、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体および/または親水性ポリマーから選択されたものである、請求項13記載の化合物。
- 生体分子がペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、核酸類似物および/またはハプテンから選択されたものである、請求項13記載の化合物。
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