JP4461211B2 - Cells for measuring HIV infectivity titer - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞、より詳細には、HIV-1感染価の測定のために使用できる、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞に関する。
【0002】
【従来の技術】
1996年E.Bergerらにより、HIV-1の標的細胞への侵入過程には細胞側の主要ウイルスレセプターであるCD4分子以外に、T細胞指向性HIV-1はCXCR4を、マクロファージ指向性HIV-1はCCR5をコレセプターとして用いることが明らかにされ、それ以来、HIV-1の指向性およびウイルス侵入過程の解明が進んできた(Feng, Y. et al., HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G-protein-coupled receptor. Science 272: 872-877, 1996; Alkhatib, G. et al., CC-CCR5, a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 272: 1955 - 1958, 1996; Choe, H. et al., The beta-chemokine receptor CCR3 and CCR5 facillitate infection by primary HIV-1 isolates. Cell 85: 1135-1148, 1996; Debg, H. et al., Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 381: 661 - 666, 1996; 及びDRagic, T. et al., HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CCR5.Nature 381: 667 - 673, 1996)。HIV-1感染の測定系としては主として、HIV-1の構造蛋白であるgag蛋白p24のELISAによる測定系と、逆転写酵素の活性測定に基づく測定系が用いられてきたが、これらはウイルスの感染価そのものを反映した定量系ではない。
【0003】
現在用いられる感染価測定系としては、Emermanらにより開発されたCD4発現HeLa細胞 (HeLa CD4/LTR-bGal; 通称MAGI 細胞)を用いた測定系が知られている(Kimpton, J. et al., Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene. J.Virol. 66: 2232-2239, 1992)。この細胞株はHIV-1のLTR下流にSV40の核移行シグナルを付け加えたβ-ガラクトシダーゼを入れた発現ユニットを組み込んであり、感染したHIV-1が発現する転写活性因子であるTat蛋白により強力に駆動されるHIV-1 Promoter LTRによりβ-ガラクトシダーゼ酵素が感染細胞核内で発現することを利用した測定系である。この細胞は、in situにHIV-1感染多核細胞を計数できることからMultiple nuclear Activation of Galactosidase Indicator cell Assay (MAGI Assay)と呼ばれ、数多くの実験系に応用されてきた。しかしながら、MAGI 細胞の親株HeLa細胞は構成的にCXCR4を発現しているのでT細胞指向性HIV-1の感染価は測定することができるが、CCR5は発現していないことからマクロファージ指向性HIV-1をはじめとする多くの臨床分離株には応用しえないという問題点があった。
【0004】
そこで、MAGI 細胞にCCR5発現能を付与させることを目的として、Elongation Factor 1αのプロモーター下流にCCR5を組み込み、Blasticidine により選択できる発現ベクターpEFBOSbsrCCR5を構築し、これをMAGI細胞にトランスフェクションし、Blasticidine選択後、限界希釈することによりCCR5発現MAGI細胞(MAGIC-5 : MAGI-CCR5)が樹立された(巽 正志、小島朝人:HIV-1感染価測定に適したCCR5発現HeLa/CD4-LTR-beta-Gal細胞の樹立と応用について 第10回日本エイズ学会総会、1997年12月、熊本、Tatsumi,M. and Kojima,A.: Establishment of HeLa/CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998)。この細胞株はT細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1 の感染価をも計数しえることが判明し、MAGI細胞と異なり疑陽性を大幅に減じたクローンを選択できた。
【0005】
このMAGIC-5細胞株を用いたHIV-1感染価測定、ウイルスクローニング、臨床検体からのウイルス分離および感染性分子クローン樹立については、
巽 正志、小島朝人:HIV-1感染価測定に適したCCR5発現HeLa/CD4-LTR-beta Gal細胞の樹立と応用について 第10回日本エイズ学会総会、1997年12月、熊本;
Tatsumi,M. and Kojima,A.: Establishment of HeLa/CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998;
巽 正志 MAGIC-5A細胞による感染性HIV-1 分子クローンの確立 第13回日本エイズ学会 1998年12月 横浜;
Tatsumi, M. Efficient molecular cloning of infectious HIV-1 subtype C by MAGIC-5 virus cloning and long PCR. The XIthe International Congress of Virology, Sydney, Australia, August, 1999;並びに
蜂谷敦子、相沢佐織、田中真理、高橋由紀子、平林義弘、井田 節子、巽 正志、岡 慎一 CCR5発現Hela/CD4-LTR-beta Gal細胞(MAGIC5 clone 1-10)を用いた抗HIV薬耐性検査に関する検討 第13回日本エイズ学会 1999年12月 東京;
に報告されている。この細胞株はHIV-1 の感染価測定という基本的基盤をなすことから多くのHIV-1 研究領域に応用されうる可能性が想定された。現在、既に薬剤耐性Phenotype Assayおよび抗HIV薬剤スクリーニングなどに応用されてきている。
【0006】
一般に用いられているHIV-1 gag蛋白p24のELISAによる測定もしくは逆転写酵素の活性測定に基づくものに比較して迅速簡便かつ経済的であるものの、この細胞株によるHIV感染価測定は顕微鏡下におけるX-galにより青染した細胞核の計数による測定であったため、多検体の迅速処理には適していなかった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、HIV-1ウイルスの感染価自体を測定するのに適した細胞であって、T細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1を含む多くの臨床分離株に適用でき、かつ迅速簡便かつ経済的であり、多検体の迅速処理を可能とする細胞を提供することを解決すべき課題とした。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、種々の酵素活性基質が入手しやすく、測定感度も高く、測定手技の簡略化が可能なレポータータンパク質として分泌型アルカリホスファターゼを選定し、HIV感染により培養上澄中に分泌されるアルカリホスファターゼ(SEAP)をレポーター遺伝子として組み込んだインジケーター細胞の樹立を試みた。そして、この樹立した細胞株のHIV感受性をp-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光(Clonetech)及びCSPDを基質とした化学発光測定系(Toyobo Co. Ltd)で、MAGIC-5細胞のBlue Cell Countと比較検討した結果、この細胞株はHIV-1感受性においてMAGIC-5と高い相関を示した。またこの細胞株は、末梢血リンパ球培養で分離された広範囲のHIV-1に感受性を示し、そのウイルスのTropismにかかわらず検出可能であり、検出感度も十分に高いことが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【0009】
即ち、本発明によれば、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる、動物細胞が提供される。
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターとを有する。
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスコレセプターとしてCXCR4及び/又はCCR5を有し、さらに好ましくはHIV-1ウイルスコレセプターとしてCXCR4及びCCR5の両方を有する。
【0010】
好ましくは、分泌型レポータータンパク質は比色反応、蛍光発光または化学発光の何れか1種以上の測定系で検出できるタンパク質であり、より好ましくは、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼである。
【0011】
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1 LTR配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に形質転換することにより得られる。
好ましくは本発明の動物細胞は、哺乳類動物細胞に由来する細胞であり、より好ましくは、ヒトHela細胞又はヒトHOS細胞に由来する細胞である。
特に好ましい本発明の動物細胞は、受託番号FERM P−18078を有する動物細胞である。
【0012】
本発明の動物細胞は、HIV−1感染価の測定のために使用することができる。
【0013】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の動物細胞は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができることを特徴とする。
本発明の動物細胞はHIV-1が感染することができる細胞であれば、その種類は特には限定されない。
通常、HIV-1の感染には、HIV-1ウイルスレセプターCD4が必要とされることから、本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスレセプターCD4を有していることが好ましい。また、本明細書中で上記した通り、HIV-1の標的細胞への侵入過程には細胞側の主要ウイルスレセプターであるCD4分子以外に、T細胞指向性HIV-1はCXCR4を、マクロファージ指向性HIV-1はCCR5をコレセプターとして用いていることから、本発明の動物細胞もこれらのコレセプターを有していることが好ましい。広範なHIV-1の感染価を分析することを目的とする場合には、CXCR4及びCCR5の両方を発現している動物細胞を使用することが好ましい。
【0014】
これらのHIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターは出発となる動物細胞がもともと保持し、かつ発現している場合にはそれらをそのまま利用すればよい。また、出発となる細胞がこれらを発現していない場合には、好適な発現ベクターに上記レセプターまたはコレセプターをコードする遺伝子を組み込んだ組み換え発現ベクターを出発動物細胞に導入することにより、当該レセプターまたはコレセプターを当該動物細胞中に発現させることができる。
【0015】
本発明の動物細胞を樹立するために用いることができる出発細胞の種類は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類(例えば、ヒトまたはサルなどの霊長類や、マウス、ラット又はハムスターなどのげっ歯類など)の動物細胞であり、より具体的には、ヒト由来Hela細胞又はヒト由来HOS細胞などが挙げられる。
【0016】
目的のレセプター又はコレセプターを発現している細胞を選択するための手法としては、当該レセプター又はコレセプターを含む組み換え発現ベクター中に抗生物質耐性遺伝子を当該レセプター又はコレセプターと一緒に発現され得るように組み込んでおき、当該抗生物質を含む培地中で培養することにより、目的のレセプター又はコレセプターを発現する細胞を選択することができる。また、目的の細胞を一つの細胞に由来する単一の細胞としてクローニングするための手法としては限界希釈法を挙げることができる。
【0017】
例えば、構成的にCXCR4を発現しているHeLa細胞は出発細胞として使用する場合には、このHeLa細胞に抗生物質耐性遺伝子(例えば、ネオマイシン(Neo)耐性遺伝子)を乗せたマウスレトロウイルスベクターを形質転換してCD4を発現させ、所望によりLTR-βGal発現ユニットをハイグロマイシン(Hygromycin)耐性遺伝子ととも形質転換し、生育細胞を選択する。さらに、CD4発現増強のためのCD4発現とPuromycin耐性を形質転換体に付与する発現ベクター、並びにCCR5発現とBlastocitidine耐性を形質転換体に付与する発現ベクターを上記細胞に形質転換し、限界希釈法により目的とする細胞をクローニングする。この操作でクローニングされる目的細胞は、G418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計4種の選択薬剤に対して耐性を有している。
【0018】
本発明の動物細胞は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができることを特徴とする。本発明の動物細胞はHIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現し、発現した分泌型レポータータンパク質は細胞該に分泌され、培養液中に放出される。本発明の動物細胞を含む培養系にHIV-1を含む試料を添加し、その培養液を採取し、該培養液中に分泌されたレポータータンパク質を適当な方法で検出又は分析することにより、試料中のHIV-1の感染価を測定することができる。
【0019】
培養液中に分泌されたレポータータンパク質の検出方法は特に限定されないが、例えば、比色反応、蛍光発光または化学発光などにより検出する方法が挙げられる。分泌レポータータンパク質の種類は特に限定されないが、種々の酵素活性基質が入手しやすく、測定感度が高く、測定手技の簡略化が可能なものが好ましく、例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼなどが挙げられ、この中でもアルカリホスファターゼが特に好ましい。
【0020】
本発明によるHIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現する動物細胞を作成するための好ましい方法の一つとしては、HIV-1 LTR配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に形質転換する方法が挙げられる。上記方法で用いる発現ベクターには、所望の細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子が含まれていることが好ましい。
【0021】
例えば、本明細書中で上記したようなG418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計4種の選択薬剤に対して耐性を有し、CXCR4、CD4およびCCR5を発現する細胞に対して、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換することにより、本発明の動物細胞を作成することができる。この場合、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクター中に組み込むことができる薬剤耐性遺伝子としては、上記4種の薬剤耐性遺伝子以外であればよく、例えば、Zeocin耐性遺伝子などが挙げれる。
【0022】
より具体的には、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、HIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターとを有する細胞にトランスフェクションし、薬剤で選択し、生存コロニーを得ることができる。これらを増殖させたクローン細胞をマイクロプレートに2重に播き、一方はHIV-1を感染させ、他方は非感染対照とする。感染2日後、培養上清を採取し、65℃で15分間処理して内在性アルカリホスファターゼとHIVの不活化する。培養上清に分泌されたSEAPは例えば、p-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応で測定し選別することができる。HIV 非感染ではSEAP活性が低く、HIV感染により高いSEAP活性を示すクローンを選別することにより目的の細胞を樹立することができる。
上記した方法で樹立することができる細胞の一例としては、受託番号FERMP−18078を有する細胞が挙げられる。
【0023】
本発明の動物細胞の培養方法、培養条件は細胞の種類、性質などに応じて適宜選択することができる。例えば、HeLa 細胞に由来する細胞株の場合には、抗生物質(例えば、Kanamycin等)を含み、5% FCSを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco)中で37℃で5%CO2で培養することができる。
【0024】
本発明の動物細胞は、HIV-1感染価の測定のために使用することができる。具体的には、本発明の動物細胞をマイクロプレートに接種し、HIV-1を含む試料を培地で段階的に希釈し、各穴に添加する。適当な培養条件(例えば、温度37℃で5%CO2)で一定時間インキュベートした後、各穴の上清を回収し、内在性レポータータンパク質とHIVの不活化のために65℃で15分間加熱する。この上清を用いて常法に従って、レポータータンパク質のアッセイを行なうことができる。レポータータンパク質がアルカリホスファターゼの場合には、例えば、p-ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光、及びCSPDを基質とした化学発光測定系などを利用することができる。
【0025】
さらに本発明の動物細胞は、HIVの薬剤耐性試験に利用することができる。現在利用可能な抗HIV薬としては、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、本発明の動物細胞はこれら抗HIV薬に対するHIVの薬剤耐性を調べるのに有用である。
【0026】
具体的には、本発明の動物細胞をマイクロプレートに接種し、HIV-1を含む試料を培地で段階的に希釈し、各穴に添加する。さらに適当な希釈系列の抗HIV薬を添加し、適当な培養条件(例えば、温度37℃で5%CO2)で一定時間インキュベートした後、各穴の上清を回収する。以下HIV-1感染価の測定の場合と同様にして、レポータータンパク質をアッセイすることにより、抗HIV薬に対するHIVの薬剤耐性を調べることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【0027】
【実施例】
1.方法
全てのHeLa 細胞由来細胞株は、抗生剤として50μg/mlのKanamycinを含み、5% FCSを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco)で37℃で5%CO2で培養した。
既に本発明者が樹立したCCR5発現MAGI細胞株MAGIC-5Aは、元来の親株HeLa細胞にNeo耐性遺伝子を乗せたマウスレトロウイルスベクターによりCD4を発現し、LTR-βGal発現ユニットはHygromycin耐性遺伝子とともに乗せて選択されFACS(Fluorescent Activated Cell Sorter)で選別された細胞株であるMAGI細胞株にさらにCD4発現増強のため発現ベクターpEFBOSpacCD4(CD4発現とPuromycin耐性をTransformant に与える), CCR5発現のため発現ベクターpEFBOSbsr(CCR5発現とBlastocitidine耐性をTransformantに与える)により形質転換され限界希釈法によりクローニングされ樹立した細胞株で、G418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計4種の選択薬剤に耐性になっていた。
【0028】
HIV-1 subtype B由来の LTRの下流にpSEAP2-Basic (Clontech) からTranscriptional Blockerとともにレポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を組み込み、さらに新たな選択遺伝子としてZeocin耐性遺伝子を載せた発現ベクターを構築した(図1)。この発現ベクターをMAGIC-5A細胞株にトランスフェクション後、Zeocinで選択培養し生残したコロニー165個を得た。これらの増殖させたクローン細胞を96穴マイクロプレートに2重に播き、一方はHIV-1を感染させ一方は非感染対照とした。感染2日後培養上澄100μl採取し、内在性アルカリホスファターゼとHIVの不活化のため65℃で15分間処理し測定まで−20℃で保存した。検体中の分泌されたSEAPはL-Homoarginineを内在性アルカリホスファターゼ阻害剤として添加したp−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応で測定し選別した(Berger J. et al., Secreted placental alkaline phosphatase: a powerull new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1-10, 1988)。HIV 非感染ではSEAP活性が低く、HIV感染により高いSEAP活性を示すクローンを選別し、選択薬剤非存在下での連続2回の限界希釈法によりMAGIC-5/SEAP clone 3-1-1を樹立した。
【0029】
この樹立した細胞株のHIV感受性を、以下の方法により、p-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光(Clonetech)及びCSPDを基質とした化学発光測定系(Toyobo Co. Ltd)で、既にデータが蓄積されているMAGIC-5細胞のBlue Cell Countと比較検討した。
【0030】
(化学発光アッセイの方法)
100万細胞のMAGIC-5/SEAPインジケーター細胞を感染前日に96穴マイクロプレートの各穴に接種した。R5マクロファージ指向性HIV-1、Indie-C1(104bcc/ml)またはX4T細胞株指向性HIV-1 NL432(2×104bcc/ml)を培地で段階的に希釈し、各穴に添加し、37℃で5%CO2でインキュベートした。48時間のインキュベーション後、各穴の上清を回収し、65℃で15分間加熱し、Reporter Assay Kit-SEAP-(東洋紡)を用いて取扱説明書に従って化学発光アッセイを行なった。
【0031】
(比色アッセイの方法)
100万細胞のMAGIC-5/SEAPインジケーター細胞を感染前日に96穴マイクロプレートの各穴に接種した。R5マクロファージ指向性HIV-1、Indie-C1(106bcc/ml)またはX4T細胞株指向性HIV-1 NL432(2×106bcc/ml)を培地で段階的に希釈し、各穴に添加し、37℃で5%CO2でインキュベートした。HIV-1 NL432(1×106bcc/ml)も、開始濃度1mMで段階的に希釈したRT阻害剤AZTの存在下でインキュベートした。48時間のインキュベーション後、各穴の上清を回収し、65℃で15分間加熱し、Cullen, B.R. and Malim,M.M. Methods in Enzymology 216: 362-368, 1992の方法に従って比色アッセイを行なった。
【0032】
2.結果
200μg/ml のZeocin存在下の選択培養で総計162個の生残コロニーが得られた。しかしながら生残した殆どのコロニーはHIV感染の有無にかかわらず高いSEAPを分泌していた。2個の数少ないコロニーから、HIV非感染ではBackgroud 程度のSEAPしか検出せず、HIV感染により多量のSEAPを分泌する細胞群から2度にわたる限界希釈法で安定したHIV-1感受性を示したクローンMAGIC-5/SEAP 3-1-1 を樹立した。
MAGIC-5/SEAP 3-1-1は、FERM P−18078として、平成12年10月16日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305-8566)に寄託されている。
【0033】
MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の化学発光アッセイの結果を図2に、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の比色アッセイの結果を図3にそれぞれ示す。
MAGIC-5/SEAPはHIV-1感受性においてMAGIC-5Aと高い相関を示した。またこの細胞株は現在まで調べた限り、末梢血リンパ球培養で分離されたHIV-1全てに感受性を示し、そのウイルスのTropismにかかわらず検出可能であった。また検出感度について感染性分子クローンであるX4 HIV-1 NL432とR5 HIV-1 Indie-C1を用いた実験では、10000個のMAGIC-5/SEAP細胞に10 bcu (Blue Cell Unit; MAGIC-5A 細胞で予め感染価を測定してTiter を合わせてある)のHIV-1感染2日後の培養上澄中に化学発光基質では有意なSEAP活性が検出される程鋭敏であった。またこの細胞株ではその感染価測定のためMAGIC-5A のX-Gal染色のように固定染色の必要がないため、培養を継続でき、MAGIC-5A 細胞はHIV-1の増殖が可能であるため、培養を継続することによりさらに低い力価のHIV-1 の検出も可能である。この測定系は培養上澄に反応基質を添加するだけで迅速簡便で、さらに高感度にて広い範囲のHIV感染を検出することが可能であった。またMAGIC-5/SEAP細胞株は、親株のMAGIC-5Aと同様感染した細胞の核が青染することを利用して、分離ウイルスの感染価をBlue cell countのみならず、一個当たりのウイルス感染により産生されたTat 分子により転写発現されるSEAP の化学発光量として表現でき、分離ウイルスのTat蛋白の転写活性の比較も可能であると考えられた。
【0034】
3.考察
本発明では、HIV-1 感染価測定細胞として有用性が認められているMAGIC-5A細胞にさらに感染したHIV-1のTat蛋白で培養上澄中に分泌されるSEAPをReporter として組み込んだMAGIC-5/SEAP細胞株を樹立した。この細胞株樹立の過程で、SEAP発現ユニットを組み込んだMAGIC-5A細胞で選択薬剤Zeocin耐性のコロニー細胞群の殆どが、HIV-1非感染にもかかわらず、無視できない程バックグラウンドより有意に高いSEAP活性をその培養上澄に分泌することが判明した。このことはHIV-1 LTRが弱いながらもBasalなプロモーター活性を示すことと、組み込まれたHeLa細胞のゲノムの近傍に有意なトランスな転写活性を促進する領域があることを示している。当初Transcriptional Blocker (TB) をLTR下流に組み込んでいないSEAPの発現ユニットをMAGIC-5Aに組み込んだZeocin耐性コロニーの細胞群はTBを組み込んだ発現ユニットの細胞群より高いバックグラウンド 値を示したことからも(データは示さず)、感度のよいレポーター遺伝子を用いた場合、感染価測定に実際に使用に耐える細胞株を得る確率は高くないことが考えられた。
【0035】
本発明のMAGIC-5/SEAP細胞株は、親株MAGIC-5A細胞株の長所を全て備えている。すなわち現在一般的にHIV-1分離とその増殖および感染過程の測定に用いられているPBMCの培養による方法は、ウイルス分離に数週間にわたる培養を必要とするが、MAGIC-5A およびMAGIC-5/SEAPでは患者検体試料中に含まれる感染性のウイルス量によるが、104コピー/ml 以上の検体から2日から7日でウイルス分離が可能であり、PBMC法のようにドナーによる分離率のばらつきが認められない利点がある。さらに多くのHIV-1ウイルスでは増殖によりSyncytium形成により分離の確認がPBMC培養に比較して容易であり、MAGI細胞との共用により分離したHIV-1 のCoreceptor Usageが推定でき、さらにp24 gaga ELISA法やRT 測定などより迅速簡便なX-Gal染色あるいはSEAP活性の測定により感染の確定ができる。さらにMAGIC-5A細胞と同様にHIV-1 以外のPrimate LentivirusであるHIV-2 およびSIVの感染価も測定できる広いスペクトルを有する細胞株であることも判明した。
【0036】
今回のHIV-1感染測定細胞株MAGIC-5Aの改変を試みるに当たって、新たなレポータータンパク質としてSEAPを選定した根拠は以下の通りである。
(1) SEAPは細胞外の培養上澄中に分泌されるため、通常の高感度なレポーターアッセイに用いられるルシフェラーゼのように細胞溶解操作が不要であり、試料調製が容易であるのみならず、細胞を無傷のままでSEAPの発現、即ちHIV-1感染の経時的な変化を連続して同一培養で追跡できること。
(2) SEAPは胎盤性アルカリホスファターゼ由来で、多くの細胞が産生する内在性アルカリホスファターゼよりも熱安定性が高く、試薬に対する感受性にも違いがあることから、SEAPの活性を選択的に測定できること。
【0037】
(3) SEAPの基質として比色反応、蛍光反応、化学発光反応と、それぞれ研究室に装備されている機器に応じて選択の柔軟性があること。
(4) 特に検出感度の観点からはSEAP の化学発光による検出は、現在もっとも鋭敏であるとされるLuciferaseに優とも劣らない感度を示し、約10fg の極微量のSEAP が検出可能でなおかつ定量性においてその直線性は5桁までの広い測定レンジをもつこと。
【0038】
特にMAGIC-5A 細胞株によるたった一個の感染性HIV-1 検出の鋭敏性を備え、さらに単に培養上澄に酵素基質を添加するのみで感染価が測定できる操作の簡便性は、96穴マイクロプレートとLiminometerを用いることにより多検体を迅速簡易に測定できることから、容易に測定過程のロボット化が期待でき、薬剤耐性試験あるいは抗HIV薬剤スクリーニング試験等の様々なHIV-1感染測定系においてHigh Throughputな測定系の構築に応用が期待できる基盤技術を提供するものと考えられる。
【0039】
【発明の効果】
本発明により、HIV-1ウイルスの感染価自体を測定するのに適した細胞であって、T細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1を含む多くの臨床分離株に適用でき、かつ迅速簡便かつ経済的であり、多検体の迅速処理を可能とする細胞が提供されることになった。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、HIV-1subtype B 由来の LTRの下流にpSEAP2-Basic (Clontech) からTranscriptional BlockerとともにReporter Geneとして分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を組み込み、さらに新たな選択遺伝子としてZeocin耐性遺伝子を載せた発現ベクターpHIV−LTRbleoSEAPの構造を示す図である。プラスミドの大きさは5618bpである。
【図2】図2は、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の化学発光アッセイの結果を示す図である。
【図3】図3は、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の比色アッセイの結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an animal cell capable of expressing a secreted reporter protein by HIV-1 infection, more specifically, an HIV-1 infected secreted reporter protein that can be used for measurement of HIV-1 infectivity titer. It relates to animal cells that can be expressed.
[0002]
[Prior art]
In 1996, by E. Berger et al., In addition to CD4 molecule, which is the main viral receptor on the cell side, T cell-directed HIV-1 expressed CXCR4, macrophage-directed HIV-1 Has been shown to use CCR5 as a co-receptor, and since then, HIV-1 orientation and viral entry processes have been elucidated (Feng, Y. et al., HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G-protein-coupled receptor. Science 272: 872-877, 1996; Alkhatib, G. et al., CC-CCR5, a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 272: 1955-1958, 1996; Choe, H. et al., The beta-chemokine receptor CCR3 and CCR5 facillitate infection by primary HIV-1 isolates.Cell 85: 1135-1148, 1996; Debg, H. et al., Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1.Nature 381: 661-666, 1996; and DRagic, T. et al., HIV-1 entry into CD4 + cells is mediated by the chemokine receptor CC-CCR5. Nature 381: 667-673, 1996). As the measurement system for HIV-1 infection, the measurement system based on ELISA for the gag protein p24, which is the structural protein of HIV-1, and the measurement system based on the measurement of reverse transcriptase activity have been used. It is not a quantitative system that reflects the infectious value itself.
[0003]
As an infectious titer measurement system currently used, a measurement system using CD4-expressing HeLa cells (HeLa CD4 / LTR-bGal; commonly known as MAGI cells) developed by Emerman et al. Is known (Kimpton, J. et al. , Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene. J. Virol. 66: 2232-2239, 1992). This cell line incorporates an expression unit containing β-galactosidase with an SV40 nuclear translocation signal downstream of the HIV-1 LTR and is more potent than the Tat protein, a transcriptional activator expressed by infected HIV-1. This measurement system utilizes the expression of β-galactosidase enzyme in infected cell nuclei by driven HIV-1 Promoter LTR. This cell is called Multiple nuclear Activation of Galactosidase Indicator cell Assay (MAGI Assay) because it can count HIV-1-infected multinucleated cells in situ, and has been applied to many experimental systems. However, MAGI parental HeLa cells constitutively express CXCR4, so the infectious titer of T cell-directed HIV-1 can be measured, but CCR5 is not expressed, so macrophage-directed HIV- There was a problem that it could not be applied to many clinical isolates including 1.
[0004]
Therefore, for the purpose of conferring CCR5 expression ability on MAGI cells, CCR5 was incorporated downstream of the promoter of Elongation Factor 1α, and an expression vector pEFBOSbsrCCR5 that can be selected by Blasticidine was constructed, and this was transfected into MAGI cells. , CCR5-expressing MAGI cells (MAGIC-5: MAGI-CCR5) were established by limiting dilution (Masashi Tsuji, Asato Kojima: CCR5-expressing HeLa / CD4-LTR-beta- suitable for HIV-1 infectivity titer measurement) Establishment and application of Gal cells The 10th Annual Meeting of the AIDS Society of Japan, December 1997, Kumamoto, Tatsumi, M. and Kojima, A .: Establishment of HeLa / CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998). This cell line was found to be able to count not only T-cell-directed HIV-1 but also macrophage-directed HIV-1 infectivity titers, and unlike MAGI cells, clones with greatly reduced false positives could be selected.
[0005]
About HIV-1 infectivity titration, virus cloning, virus isolation from clinical specimens and establishment of infectious molecular clones using this MAGIC-5 cell line,
Masashi Tsuji, Asato Kojima: Establishment and application of CCR5-expressing HeLa / CD4-LTR-beta Gal cells suitable for HIV-1 infectivity titer 10th Annual Meeting of the Japan Society for AIDS Research, December 1997, Kumamoto;
Tatsumi, M. And Kojima, A .: Establishment of HeLa / CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus.The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998;
Masashi Tsuji Establishment of infectious HIV-1 molecular clones using MAGIC-5A cells The 13th Japan Society for AIDS Research December 1998 Yokohama;
Tatsumi, M. Efficient molecular cloning of infectious HIV-1 subtype C by MAGIC-5 virus cloning and long PCR. The XIthe International Congress of Virology, Sydney, Australia, August, 1999;
Reiko Hachiya, Saori Aizawa, Mari Tanaka, Yukiko Takahashi, Yoshihiro Hirabayashi, Setsuko Ida, Masashi Tsuji, Shinichi Oka Regarding anti-HIV drug resistance testing using CCR5-expressing Hela / CD4-LTR-beta Gal cells (MAGIC5 clone 1-10) Examination The 13th Japan AIDS Society December 1999 Tokyo;
Has been reported. Since this cell line forms the basic foundation for measuring the infectious titer of HIV-1, it was assumed that it could be applied to many HIV-1 research areas. Currently, it has already been applied to drug-resistant Phenotype Assay and anti-HIV drug screening.
[0006]
Although it is quick, simple and economical compared to the commonly used measurement of HIV-1 gag protein p24 by ELISA or the measurement of reverse transcriptase activity, the HIV infectious titer measurement using this cell line can be performed under a microscope. Since it was a measurement by counting cell nuclei stained with X-gal, it was not suitable for rapid processing of multiple specimens.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, the present invention is a cell suitable for measuring the infectivity titer of HIV-1 virus itself, and is applicable to many clinical isolates including not only T-cell-directed HIV-1 but also macrophage-directed HIV-1. An object to be solved is to provide a cell that can be applied, is quick, simple, and economical, and enables rapid processing of multiple specimens.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have selected secreted alkaline phosphatase as a reporter protein that allows easy acquisition of various enzyme active substrates, high measurement sensitivity, and simplification of measurement techniques. Then, we tried to establish indicator cells into which alkaline phosphatase (SEAP) secreted into the culture supernatant by HIV infection was incorporated as a reporter gene. Then, the HIV sensitivity of this established cell line was measured with a colorimetric reaction using p-Nitrophenol phosphate as a substrate, fluorescence emission using MUP as a substrate (Clonetech), and chemiluminescence measurement system using CSPD as a substrate (Toyobo Co. Ltd). As a result of comparison with Blue Cell Count of MAGIC-5 cells, this cell line showed high correlation with MAGIC-5 in HIV-1 sensitivity. In addition, this cell line was sensitive to a wide range of HIV-1 isolated by peripheral blood lymphocyte culture, and could be detected regardless of the Tropism of the virus, and the detection sensitivity was sufficiently high. The present invention has been completed based on these findings.
[0009]
That is, according to the present invention, an animal cell capable of expressing a secreted reporter protein by HIV-1 infection is provided.
Preferably, the animal cell of the present invention has HIV-1 virus receptor CD4 and HIV-1 virus co-receptor.
Preferably, the animal cell of the present invention has CXCR4 and / or CCR5 as HIV-1 virus co-receptors, and more preferably has both CXCR4 and CCR5 as HIV-1 virus co-receptors.
[0010]
Preferably, the secretory reporter protein is a protein that can be detected by any one or more measurement systems of colorimetric reaction, fluorescence, or chemiluminescence, and more preferably alkaline phosphatase, luciferase, or peroxidase.
[0011]
Preferably, the animal cell of the present invention is obtained by transforming an animal cell with an expression vector having a gene encoding a secreted reporter protein downstream of the HIV-1 LTR sequence.
Preferably, the animal cell of the present invention is a cell derived from a mammalian animal cell, more preferably a cell derived from a human Hela cell or a human HOS cell.
Particularly preferred animal cells of the invention are those having the accession number FERM P-18078.
[0012]
The animal cells of the present invention can be used for the determination of HIV-1 infectivity.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The animal cell of the present invention is characterized in that it can express a secreted reporter protein by HIV-1 infection.
The animal cell of the present invention is not particularly limited as long as it can be infected by HIV-1.
Usually, since HIV-1 virus receptor CD4 is required for HIV-1 infection, the animal cell of the present invention preferably has HIV-1 virus receptor CD4. In addition, as described above in the present specification, in addition to CD4 molecule, which is a major viral receptor on the cell side, HIV-1 is directed to CXCR4, macrophage-directed in the process of HIV-1 entry into target cells. Since HIV-1 uses CCR5 as a co-receptor, the animal cells of the present invention preferably also have these co-receptors. When it is intended to analyze a wide range of HIV-1 infectivity, it is preferable to use animal cells expressing both CXCR4 and CCR5.
[0014]
These HIV-1 virus receptor CD4 and HIV-1 virus co-receptor may be used as they are if they are originally retained and expressed by the starting animal cell. If the starting cell does not express them, a recombinant expression vector in which a gene encoding the above receptor or co-receptor is incorporated into a suitable expression vector is introduced into the starting animal cell, so that the receptor or The co-receptor can be expressed in the animal cell.
[0015]
The kind of the starting cell that can be used for establishing the animal cell of the present invention is not particularly limited, but is preferably a mammal (for example, a primate such as a human or a monkey, or a rodent such as a mouse, a rat or a hamster). And more specifically, human-derived Hela cells or human-derived HOS cells.
[0016]
As a technique for selecting cells expressing the receptor or co-receptor of interest, an antibiotic resistance gene can be expressed together with the receptor or co-receptor in a recombinant expression vector containing the receptor or co-receptor. And cells that express the target receptor or co-receptor can be selected by culturing in a medium containing the antibiotic. A limiting dilution method can be used as a method for cloning a target cell as a single cell derived from one cell.
[0017]
For example, when a HeLa cell that constitutively expresses CXCR4 is used as a starting cell, a mouse retroviral vector carrying an antibiotic resistance gene (for example, a neomycin (Neo) resistance gene) is transformed into the HeLa cell. Transform to express CD4, optionally transform LTR-βGal expression unit with hygromycin resistance gene and select growing cells. Further, the above cells were transformed with an expression vector for imparting CD4 expression and Puromycin resistance to the transformant for enhancing CD4 expression, and an expression vector for imparting CCR5 expression and Blastocitidine resistance to the transformant. Clone the cells of interest. The target cells cloned by this manipulation are resistant to a total of four selective drugs, G418, Hygromycin, Puromycin and Blastcitidin.
[0018]
The animal cell of the present invention is characterized in that it can express a secreted reporter protein by HIV-1 infection. The animal cell of the present invention expresses a secreted reporter protein by HIV-1 infection, and the expressed secreted reporter protein is secreted into the cell and released into the culture medium. By adding a sample containing HIV-1 to the culture system containing the animal cells of the present invention, collecting the culture solution, and detecting or analyzing the reporter protein secreted in the culture solution by an appropriate method, the sample is obtained. The infectious titer of HIV-1 can be measured.
[0019]
Although the detection method of the reporter protein secreted in the culture solution is not particularly limited, for example, a method of detecting by a colorimetric reaction, fluorescence emission, chemiluminescence, or the like can be mentioned. The type of secretory reporter protein is not particularly limited, but it is preferable that various enzyme-active substrates are easily available, have high measurement sensitivity, and can simplify the measurement technique, such as alkaline phosphatase, luciferase, or peroxidase. Of these, alkaline phosphatase is particularly preferable.
[0020]
One preferred method for producing animal cells that express a secreted reporter protein by HIV-1 infection according to the present invention includes an expression vector having a gene encoding the secreted reporter protein downstream of the HIV-1 LTR sequence. A method for transforming animal cells can be mentioned. The expression vector used in the above method preferably contains a drug resistance gene for selecting a desired cell.
[0021]
For example, a secreted reporter protein is expressed against cells expressing CXCR4, CD4, and CCR5 that are resistant to a total of four types of selective drugs such as G418, Hygromycin, Puromycin and Blastcitidin as described herein above. The animal cell of the present invention can be prepared by transforming an expression vector having a gene to be encoded. In this case, the drug resistance gene that can be incorporated into an expression vector having a gene encoding a secretory reporter protein may be other than the above four drug resistance genes, and examples thereof include a Zeocin resistance gene.
[0022]
More specifically, an expression vector having a gene encoding a secreted reporter protein is transfected into a cell having HIV-1 virus receptor CD4 and HIV-1 virus co-receptor and selected with a drug to obtain a surviving colony be able to. Cloned cells in which these have been propagated are plated twice on a microplate, one infected with HIV-1 and the other as an uninfected control. Two days after infection, the culture supernatant is collected and treated at 65 ° C. for 15 minutes to inactivate endogenous alkaline phosphatase and HIV. SEAP secreted into the culture supernatant can be measured and selected, for example, by a colorimetric reaction using p-Nitrophenol phosphate as a substrate. SEAP activity is low in non-HIV infection, and target cells can be established by selecting clones that show high SEAP activity due to HIV infection.
An example of a cell that can be established by the above-described method is a cell having a deposit number of FERMP-18078.
[0023]
The animal cell culture method and culture conditions of the present invention can be appropriately selected according to the type and nature of the cells. For example, in the case of cell lines derived from HeLa cells, 5% CO2 at 37 ° C in Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco) containing antibiotics (eg, Kanamycin etc.) and supplemented with 5% FCS2Can be cultured.
[0024]
The animal cells of the present invention can be used for the measurement of HIV-1 infectivity. Specifically, the animal cell of the present invention is inoculated on a microplate, and a sample containing HIV-1 is diluted stepwise with a medium and added to each well. Appropriate culture conditions (eg 5% CO at 37 ° C)2), And the supernatant of each well is collected and heated at 65 ° C. for 15 minutes to inactivate endogenous reporter protein and HIV. Using this supernatant, a reporter protein can be assayed according to a conventional method. When the reporter protein is alkaline phosphatase, for example, a colorimetric reaction using p-nitrophenol phosphate as a substrate, fluorescence emission using MUP as a substrate, and chemiluminescence measurement system using CSPD as a substrate can be used. .
[0025]
Furthermore, the animal cells of the present invention can be used for HIV drug resistance tests. Currently available anti-HIV drugs include reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors. The animal cells of the present invention are useful for examining HIV drug resistance to these anti-HIV drugs.
[0026]
Specifically, the animal cell of the present invention is inoculated on a microplate, and a sample containing HIV-1 is diluted stepwise with a medium and added to each well. Furthermore, an appropriate dilution series of anti-HIV drug is added, and appropriate culture conditions (for example, 5% CO at 37 ° C.2), And the supernatant of each well is collected. Thereafter, in the same manner as in the measurement of HIV-1 infectious titer, the drug resistance of HIV against an anti-HIV drug can be examined by assaying the reporter protein.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0027]
【Example】
1. Method
All HeLa cell-derived cell lines contain 50 μg / ml Kanamycin as an antibiotic and Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco) supplemented with 5% FCS at 37 ° C with 5% CO2.2In culture.
The CCR5-expressing MAGI cell line MAGIC-5A already established by the present inventor expresses CD4 by a mouse retroviral vector carrying the Neo resistance gene on the original parental HeLa cell, and the LTR-βGal expression unit is combined with the Hygromycin resistance gene. The MAGI cell line, a cell line selected by FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter), is further added to the expression vector pEFBOSpacCD4 (to give CD4 expression and puromycin resistance to Transformant), and the expression vector for CCR5 expression. A cell line transformed with pEFBOSbsr (confers CCR5 expression and Blastocitidine resistance to Transformant), cloned and established by the limiting dilution method, was resistant to a total of four selective drugs: G418, Hygromycin, Puromycin and Blastcitidin.
[0028]
Construction of an expression vector that incorporates secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene together with Transcriptional Blocker from pSEAP2-Basic (Clontech) downstream of LTR derived from HIV-1 subtype B, and further loaded with Zeocin resistance gene as a new selection gene (FIG. 1). This expression vector was transfected into the MAGIC-5A cell line and then selectively cultured with Zeocin to obtain 165 surviving colonies. These expanded clonal cells were double seeded in 96-well microplates, one infected with HIV-1 and the other as a non-infected control. Two days after infection, 100 μl of culture supernatant was collected, treated for 15 minutes at 65 ° C. for inactivation of endogenous alkaline phosphatase and HIV, and stored at −20 ° C. until measurement. The secreted SEAP in the specimen was selected by colorimetric reaction using p-nitrophenol phosphate with L-Homoarginine as an endogenous alkaline phosphatase inhibitor as a substrate (Berger J. et al., Secreted placental alkaline phosphatase : a powerull new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1-10, 1988). A clone with low SEAP activity in non-HIV infection and high SEAP activity in HIV infection was selected, and MAGIC-5 / SEAP clone 3-1-1 was established by serial limiting dilution in the absence of a selective drug. did.
[0029]
The HIV sensitivity of this established cell line was measured by the following methods using a colorimetric reaction using p-Nitrophenol phosphate as a substrate, fluorescence emission using MUP as a substrate (Clonetech), and chemiluminescence measurement system using CSPD as a substrate (Toyobo Co Ltd.) and compared with the Blue Cell Count of MAGIC-5 cells for which data has already been accumulated.
[0030]
(Method of chemiluminescence assay)
One million cells of MAGIC-5 / SEAP indicator cells were inoculated into each well of a 96-well microplate the day before infection. R5 macrophage-directed HIV-1, Indie-C1 (10Fourbcc / ml) or X4T cell line-directed HIV-1 NL432 (2 × 10Fourbcc / ml) is diluted stepwise with medium, added to each well, and 5% CO at 37 ° C.2Incubated with. After 48 hours of incubation, the supernatant of each well was collected, heated at 65 ° C. for 15 minutes, and chemiluminescent assay was performed using Reporter Assay Kit-SEAP- (Toyobo) according to the instruction manual.
[0031]
(Method of colorimetric assay)
One million cells of MAGIC-5 / SEAP indicator cells were inoculated into each well of a 96-well microplate the day before infection. R5 macrophage-directed HIV-1, Indie-C1 (106bcc / ml) or X4T cell line-directed HIV-1 NL432 (2 × 106bcc / ml) is diluted stepwise with medium, added to each well, and 5% CO at 37 ° C.2Incubated with. HIV-1 NL432 (1 × 106bcc / ml) was also incubated in the presence of the RT inhibitor AZT serially diluted at a starting concentration of 1 mM. After 48 hours of incubation, the supernatant of each well was collected, heated at 65 ° C. for 15 minutes, and a colorimetric assay was performed according to the method of Cullen, B.R. and Malim, M.M. Methods in Enzymology 216: 362-368, 1992.
[0032]
2. result
A total of 162 surviving colonies were obtained by selective culture in the presence of 200 μg / ml Zeocin. However, most surviving colonies secreted high SEAP with or without HIV infection. Clone MAGIC that showed stable HIV-1 susceptibility by two limiting dilutions from a group of cells that only detected Backgroud in the absence of HIV, and secreted a large amount of SEAP due to HIV infection, from a few colonies -5 / SEAP 3-1-1 was established.
MAGIC-5 / SEAP 3-1-1 is FERM P-18078, dated October 16, 2000, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki, Japan ( Deposited in postal code 305-8566).
[0033]
FIG. 2 shows the results of the chemiluminescence assay for HIV-1 against MAGIC-5 / SEAP, and FIG. 3 shows the results of the colorimetric assay for HIV-1 against MAGIC-5 / SEAP.
MAGIC-5 / SEAP was highly correlated with MAGIC-5A in HIV-1 sensitivity. As far as this cell line was examined to date, it was sensitive to all HIV-1 isolated in peripheral blood lymphocyte cultures and was detectable regardless of the Tropism of the virus. In addition, in an experiment using infectious molecular clones X4 HIV-1 NL432 and R5 HIV-1 Indie-C1 in terms of detection sensitivity, 10 bcu (Blue Cell Unit; MAGIC-5A cells were added to 10,000 MAGIC-5 / SEAP cells. The chemiluminescent substrate was so sensitive that significant SEAP activity was detected in the
[0034]
3. Consideration
In the present invention, MAGIC-, which incorporates, as a reporter, SEAP secreted into the culture supernatant by HIV-1 Tat protein further infected with MAGIC-5A cells recognized as useful as cells for measuring HIV-1 infectivity. 5 / SEAP cell line was established. In the process of establishing this cell line, the majority of colony cell groups resistant to the selective drug Zeocin in MAGIC-5A cells incorporating the SEAP expression unit are significantly higher than the background despite being non-infected with HIV-1. It was found that SEAP activity was secreted into the culture supernatant. This indicates that although HIV-1 LTR is weak, it shows Basal promoter activity and that there is a region that promotes significant trans transcriptional activity in the vicinity of the genome of the integrated HeLa cell. The cell group of Zeocin-resistant colonies that initially incorporated SEAP expression units that did not incorporate Transcriptional Blocker (TB) downstream of the LTR into MAGIC-5A showed higher background values than the cell groups of expression units that incorporated TB. However (data not shown), it was considered that when a sensitive reporter gene was used, the probability of obtaining a cell line that could actually be used for infectivity titration was not high.
[0035]
The MAGIC-5 / SEAP cell line of the present invention has all the advantages of the parental MAGIC-5A cell line. In other words, the PBMC culture method currently used to measure HIV-1 isolation and its proliferation and infection process generally requires several weeks of culture for virus isolation, but MAGIC-5A and MAGIC-5 / In SEAP, it depends on the amount of infectious virus contained in the patient sample.FourVirus separation is possible from 2 days to 7 days from specimens of copy / ml or more, and there is an advantage that variation in the separation rate by donors is not observed as in the PBMC method. Furthermore, in many HIV-1 viruses, confirmation of separation by syncytium formation by growth is easier compared to PBMC culture, and it is possible to estimate Coreceptor Usage of HIV-1 separated by sharing with MAGI cells, and p24 gaga ELISA method Infection can be confirmed by more rapid and simple X-Gal staining or SEAP activity measurement such as RT and RT measurement. Furthermore, as with MAGIC-5A cells, it was also found that the cell line has a broad spectrum capable of measuring the infectious titer of HIV-2 and SIV, which are other Prime Lentiviruses other than HIV-1.
[0036]
The rationale for selecting SEAP as a new reporter protein in attempting to modify the MAGIC-5A cell line for measuring HIV-1 infection this time is as follows.
(1) Since SEAP is secreted into the culture supernatant outside the cell, cell lysis is not necessary, unlike the luciferase used in normal high-sensitivity reporter assays, and not only sample preparation is easy, SEAP expression, that is, changes in HIV-1 over time can be continuously monitored in the same culture while the cells remain intact.
(2) SEAP is derived from placental alkaline phosphatase, has higher thermal stability than endogenous alkaline phosphatase produced by many cells, and has different sensitivities to reagents, so that SEAP activity can be measured selectively. .
[0037]
(3) Colorimetric reaction, fluorescence reaction, chemiluminescence reaction as a substrate for SEAP, and flexibility in selection depending on the equipment equipped in the laboratory.
(4) From the standpoint of detection sensitivity, SEAP chemiluminescence detection shows sensitivity that is not inferior to that of Luciferase, which is currently the most sensitive, and can detect a very small amount of SEAP of about 10 fg and is quantitative. The linearity has a wide measuring range up to 5 digits.
[0038]
In particular, the MAGIC-5A cell line has the sensitivity to detect only one infectious HIV-1, and the simple operation of measuring the infectious titer by simply adding an enzyme substrate to the culture supernatant is a 96-well microplate. And Liminometer can be used to quickly and easily measure multiple specimens, making it easy to robotize the measurement process, and high throughput in various HIV-1 infection measurement systems such as drug resistance tests and anti-HIV drug screening tests. It is considered to provide basic technology that can be expected to be applied to the construction of measurement systems.
[0039]
【The invention's effect】
The present invention is a cell suitable for measuring the infectious titer of HIV-1 virus itself, and can be applied to many clinical isolates including not only T-cell-directed HIV-1 but also macrophage-directed HIV-1. In addition, a cell that is rapid, simple and economical and enables rapid processing of multiple specimens has been provided.
[Brief description of the drawings]
[Fig. 1] Fig. 1 shows pSEAP2-Basic (Clontech) downstream of HIV-1 subtype B-derived LTR and Transcriptional Blocker together with secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene, and Zeocin resistance gene as a new selection gene It is a figure which shows the structure of expression vector pHIV-LTRbleoSEAP which carried | supported. The size of the plasmid is 5618 bp.
FIG. 2 shows the results of an HIV-1 chemiluminescence assay against MAGIC-5 / SEAP.
FIG. 3 shows the results of a colorimetric assay for HIV-1 against MAGIC-5 / SEAP.
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