JP4451135B2 - 生体接着指向体細胞療法 - Google Patents
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Description
本発明は、各種サイトカインを含む、対象遺伝子の局所発現用の生体接着指向遺伝子療法組成物に関する。本発明は、軟骨の再生に該組成物を使用する方法にも関する。さらに、本発明は、哺乳類の結合組織に該組成物を注入して骨関節炎を治療する方法に関する。
整形外科領域では、変性関節炎または骨関節炎は、最も多く見られる軟骨損傷を伴う疾患である。膝、腰、肩など、また、手首さえ、身体のほぼ全関節が罹患する。この疾患の病原は、ヒアリン関節軟骨の変性である(Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A:460-466, 1982)。関節のヒアリン軟骨は、変形して原繊維化し、最終的に陥凹する。変性した軟骨が幾分でも再生すれば、大半の患者は、衰弱を伴う疼痛をきたさずに、生活を営むことができるはずである。
経口、静脈内または筋肉内投与などの、関節に薬物を運ぶ伝統的な薬物送達経路は、非効率的である。関節内注入した薬物の半減期は、一般的に短い。薬物の関節内注入における別の短所は、関節炎などの慢性病態の治療のために関節腔で許容できる薬物レベルを実現するには、反復注入を頻繁に行なう必要があることである。このため、選択的に関節を対象にして治療薬を投与することができないので、継続的な関節内治療量を実現するために、哺乳類の身体全体に高濃度の薬物を投与することが必要であった。このように対象以外の臓器に投与すると、哺乳類身体の胃腸の不調や、血液、心臓血管、肝臓および腎臓系の変化といった、重度の副作用が抗関節炎薬により生じる傾向が、さらに悪化する。
整形外科の領域では、一部のサイトカインが整形外科疾患の治療を行なう対象薬物と考えられている。骨形成因子は、有効な骨形成刺激因子と考えられており(Ozkaynak et al., EMBO J, 9：2085-2093, 1990；SampathとRueger, Complications in Ortho, 101-107, 1994)、TGF‐βは、骨形成および軟骨形成の刺激因子として報告されている(Joyce et al., J Cell Biology, 110：2195-2207, 1990)。
トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)は、多機能サイトカインと考えられ(SpornとRoberts, Nature(London), 332：217-219, 1988)、細胞増殖、分化および細胞外マトリックスタンパク合成を調節する役割を果たす(Madri et al., J Cell Biology, 106：1375-1384, 1988)。TGF-βは、試験管内で上皮細胞と破骨細胞様細胞の増殖を抑制する(Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85：5683-5687, 1988)が、生体内では、軟骨内骨化と、最終的に骨形成を刺激する(Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995；Lind et al, A Orthop Scand, 64(5)：553-556, 1993；およびMatsumoto et al, In vivo, 8：215-220, 1994)。TGF-β誘発骨形成には、骨膜下多能性細胞の刺激が介在し、これが、最終的に軟骨形成細胞に分化する(Joyce et al, J Cell Biology, 110：2195-2207, 1990；Miettinen et al, J Cell Biology, 127-6：2021-2036, 1994)。
整形外科におけるTGF-βの生体作用が報告されている(Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107:1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5):553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994)。マウスの胚では、染色によって、TGF-βが、結合組織、軟骨および骨などの間葉に由来する組織と密接に結合することが認められている。発生学的所見に加えて、TGF-βは、骨形成および軟骨形成部位に存在する。また、ウサギの脛骨の骨折治癒も促進できる。最近、TGF-βの治療真価が報告されている(Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993)が、これは効果が短期間でコストが高いので、広範囲な臨床応用が制限されている。
関節炎治療のためのTGF-βの関節内注入は、望ましくない。理由は、注入したTGF-βが生体内で分解して不活性体となり、注入したTGF-βが作用する期間が短いためである。そのため、ヒアリン軟骨の再生には、TGF-βを長期間に放出する方法が新たに必要である。
軟骨細胞の自家移植による関節軟骨再生が報告されている(Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889-895, 1994)が、この手法は、軟組織の広範囲な切除を伴う手術が2回必要である。変性関節炎の治療に関節内注入で十分であれば、患者にとって、経済的にも、身体的にも有利になる。
特異的部位に特異的タンパク質を移行させる方法である遺伝子療法がこの問題に対する回答になると思われる(Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. Wolff, 3-25, 1994; and Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16): 1182-1184, 1997)。
米国特許第5,858,355号および第5,766,585号では、IRAP(インターロイキン-1レセプターアンタゴニストタンパク)遺伝子のウイルスまたはプラスミド構成体の生成、該構成体による滑膜細胞(第5,858,355号)および骨髄細胞(第5,766,585号)のトランスフェクション、およびトランスフェクト細胞のウサギの関節内への注入が開示されているが、TGF-βスーパーファミリーに属する遺伝子を使った結合組織の再生については開示されていない。
米国特許第5,846,931号および第5,700,774号では、TGF-β「スーパーファミリー」に属する骨形成因子(BMP)を含む組成物の、軟骨組織形成の維持および軟骨組織の誘発を促進する切断上皮小体ホルモン関連ペプチドと合わせた注入が開示されている。しかし、BMP遺伝子を使った遺伝子療法は開示されていない。
米国特許第5,842,477号では、足場となる骨膜／軟骨膜組織と軟骨細胞を含めた支質細胞の配合物の軟骨欠損部への移植が開示されている。この特許における開示では、これらの全３種類の要素が移植系に存在することが必要なので、足場物質の移植や骨膜／軟骨膜組織を必要としない本発明の簡単な遺伝子治療法が、引例では開示または提言されていない。
米国特許第6,315,992号では、TGF-β1でトランスフェクトした線維芽細胞を欠損膝関節に注入すると、欠損した哺乳類の関節にヒアリン軟骨が生成されることが開示されている。しかし、この特許では、本発明の生体接着組成物を使用する長所が開示されていない。
Leeら（Human Gene Therapy, 12: 1085-1813, 2001）では、TGF-β1でトランスフェクトした線維芽細胞ヒアリン軟骨を欠損膝関節に注入すると、欠損した哺乳類の関節にヒアリン軟骨が生成されることが開示されている。しかし、Leeらは、本発明におけるような生体接着組成物の使用を開示していない。
Mrowiecら（Blood Cells, Molecules, and Diseases 21(3):25-33, 1995）は、改良型バフィーコート血小板濃縮物を調製する新規技術を開示している。しかし、Mrowiecらは、遺伝子療法組成物として注入するための細胞との精製バフィーコートの混合を開示していない。
これらの従来技術が開示されているにもかかわらず、治療用遺伝子産物の、その必要部位への限局送達が、非常に現実的に、大いに求められている。特に、哺乳類宿主の結合組織再生に、一層有効で強力な治療法の開発が求められている。
本発明は必要な上記事項を満たしている。
本発明は、治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入した治療有効量の哺乳類体細胞群と、それを必要とする哺乳類部位への投与のための接着有効量の生体接着材料を含む組成物を対象としたものである。生体接着材料は、精製バフィーコートであるのがよい。また、該遺伝子は、サイトカインをコード化できる。さらに、サイトカインは、TGF-βスーパーファミリーに属することができる。その上、サイトカインは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7またはBMP-9であるのがよいが、これに限定されない。なおかつ、該遺伝子は、TGF-β1またはBMP-2をコード化できる。
上記の組成物では、細胞は、結合組織細胞であることができる。また、結合組織細胞は、線維芽または軟骨細胞であるのがよいが、これに限定されない。さらに、線維芽または軟骨細胞は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーをコード化する遺伝子などのサイトカインを含めた治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入される。
生体接着物質として精製バフィーコートを使用する場合、バフィーコート対細胞の量比は、体積換算で約１〜５：１であるのがよい。さらに、該比は、約１〜３：１であることができる。なお、該比は約１：１であるのがよい。
上記の組成物では、細胞を放射線照射することができる。また、細胞をDNAでトランスフェクトまたは形質導入しない細胞と混合できる。細胞は、互いに組織適合性であることができ、その場合、細胞は起源を同じくする生物に由来することができる。細胞は、起源の異なる生物からも誘導できる。
本発明は、上記の細胞を約‐70℃〜約‐196℃の温度で保存するための保存容器も対象としている。
本発明は、哺乳類の対象部位での遺伝子発現を限局させる方法で、接着有効量の生体接着材料を治療体細胞と混合し、組成物を形成し、該組成物をその必要部位に投与することことも含む方法も対象としている。この方法では、生体接着材料は、精製バフィーコートであるのがよい。また、この方法では、体細胞は、治療遺伝子を含む組換えベクターでトランスフェクトまたは形質導入することができる。治療遺伝子は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーをコード化する遺伝子などのサイトカインであるのがよいが、これに限定されない。
上記の方法では、該標的部位は、関節腔であることができ、該遺伝子は、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、またはBMP-7をコード化できる。特に、該遺伝子は、TGF-β1またはBMP-2をコード化できる。
上記の方法では、該細胞に対して放射線照射ができる。また、上記の方法では、該細胞は、宿主レシピエントに関して、同系でも同種異系でもどちらでもよい。
本発明は、上記方法も包含することができ、特に、体細胞は、治療遺伝子をコード化するDNAでトランスフェクトまたは形質導入した第一種の細胞と、治療遺伝子をコード化するDNAでトランスフェクトまたは形質導入しない第二種細胞の混合物を含む。該方法では、該細胞は、移植前に保存できる。また、特に、細胞は、移植前に、凍結保存剤中で保存できる。さらに、トランスフェクションまたは形質導入は、リポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、DEAE-デキストラン介在法またはウイルス介在法により実現できる。
別の実施態様では、本発明は、哺乳類にヒアリン軟骨を生成する方法を対象にしたものであり、a)操作してプロモーターと結合させたトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)または骨形成因子(BMP)をコード化するDNA配列を含む組換えベクターを生成し、b)試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、c)TGF-βまたはBMPをコード化するDNA配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内でヒアリン軟骨が生成するように、ヒアリン軟骨の生成に有効な量の(i)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、(ii)接着性に有効な量の生体接着材料、(iii)薬学的に許容可能なそのキャリア、を含む注入可能な混合細胞組成物を哺乳類の関節腔に注入することを含む方法を対象にしている。
本発明のさらに別の実施態様では、本発明は哺乳類にヒアリン軟骨を生成する方法を対象にしたものであり、a)操作してプロモーターと結合させたトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)または骨形成因子(BMP)をコード化するDNA配列を含む組換えベクターを生成し、b)試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、c)TGF-βまたはBMPをコード化するDNA配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内でヒアリン軟骨が生成するように、ヒアリン軟骨の生成に有効な量の(i)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、(ii)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導していない繊維芽または軟骨細胞群、(iii)接着性に有効な量の生体接着材料、および(iv)薬学的に許容可能なそのキャリア、を含む注入可能な混合細胞組成物を哺乳類の関節腔に注入することを含む方法を対象にしている。
さらに別の実施態様では、本発明は、骨関節炎を治療する方法を対象にしたものであり、a)操作してプロモーターと結合させたトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)または骨形成因子(BMP)をコード化するDNA配列を含む組換えベクターを生成し、b)試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、c)TGF-βまたはBMPをコード化するDNA配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内で骨および軟骨が生成するように、ヒアリン軟骨の生成に有効な量の(i)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、(ii)接着性に有効な量の生体接着材料、および(iii)薬学的に許容可能なそのキャリア、を含む注入可能な混合細胞組成物を哺乳類の関節腔に注入することを含む方法を対象にしている。
さらに別の実施態様では、本発明は、骨関節炎を治療する方法を対象にしたものであり、a)操作してプロモーターに結合させたトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)または骨形成因子(BMP)をコード化するDNA配列を含む組換えベクターを生成し、b)試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、c)TGF-βまたはBMPをコード化するDNA配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内で骨および軟骨の生成が生成するように、骨生成および軟骨生成に有効な量の(i)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した線維芽または軟骨細胞群、(ii)TGF-βまたはBMPをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導していない線維芽または軟骨細胞群、(iii)接着性に有効な量の生体接着材料、および(iv)薬学的に許容可能なそのキャリア、を含む注入可能な混合細胞組成物を哺乳類の関節腔に注入することを含む方法を対象にしている。
以下の発明の詳細な説明、本明細書に添付されている参照図および本明細書に添付されている特許請求の範囲から、本発明の各種目的をさらに十分理解されるであろう。
本明細書では、生体接着性「bioadhesive」または「bio-adhesive」組成物、処方品、材料などは、結合組織や、特に骨および軟骨を含めた生体組織と接着、結合または相互作用する天然に産する、または、合成の化合物を指すものであるが、これに限定されない。本発明で使用する生体接着物質では、接触部位における治療体細胞の滞留時間が長くなる。通常、生体接着材料は体細胞と混合して、接着有効混合物が生成される。
本明細書では、「生体由来キャリア分子」は、自然界で哺乳類に認められ、キャリアとして有用な分子を指すものである。その例は、アルブミン、グリコサミングリカン、ヘパリン、ヒアルロン酸、コラーゲン、バフィーコートなどが含まれる。体細胞を、これらのキャリア細胞と混合するのがよい。
本明細書では、「バフィーコート」または「バフィークラスト」という用語は、遠心分離した血液中の赤血球濃厚液の上層を成す、白血球および血小板を含む薄い黄色層を指す。
本明細書では、「結合組織」という用語は、他の組織や臓器を連結するか支える組織であり、哺乳類宿主の靭帯、軟骨、腱、骨、滑膜が含まれるが、これに限定されない。
本明細書では、「結合組織細胞」および「結合組織の細胞」は、線維芽細胞、軟骨細胞(cartilage cells, chondrocytes)、および、膠原細胞外マトリックスを分泌する骨細胞(破骨細胞／骨芽細胞）、並びに、脂肪細胞(fat cells, adipocytes)および平滑筋細胞など、結合組織中に認められる細胞が含まれる。結合組織細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞であるのが好ましい。本発明は、結合組織細胞、並びに、単一の種類の細胞の混合培養で実践できることが分かるであろう。組織細胞は、該細胞が宿主生物内で対象遺伝子を安定的に発現するように、組織細胞を関節腔に注入する前に化学物質や放射線照射で前処理できることも分かる。結合組織細胞は、宿主生物に注入する場合、負の免疫応答を惹起しないのが好ましい。この点で、細胞介在遺伝子療法または体細胞療法に同種異系細胞、並びに、自己細胞を使用するのがよいことが理解できるであろう。
本明細書では、「結合組織細胞系」は、共通の親細胞に由来する結合組織細胞が複数含まれる。
本明細書では、「ヘルパー細胞」は、治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入されない体細胞を指す。ある実施態様では、これらの細胞は、いかなる治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入されない。ヘルパー細胞は、治療体細胞と混合することによって、治療遺伝子産物が生成される。前記のヘルパー細胞は、線維芽細胞や軟骨細胞を含む結合組織細胞など、いずれかの細胞を含めることができる。
本明細書では、「ヒアリン軟骨」は、関節表面を覆う結合組織を指す。一例として、ヒアリン軟骨には、関節軟骨、肋軟骨および鼻軟骨があるが、これに限定されない。
特に、ヒアリン軟骨は自己再生されることが周知であり、改変に応答し、少ない摩擦で安定的に移動する。ヒアリン軟骨は、同一関節内で、あるいは関節間でも、厚さ、細胞密度、マトリックス組成、および機械的特性が異なり、しかも、同一の全体構造および機能が保持される。ヒアリン軟骨の機能の一部は、圧力への驚くべき剛性、弾性、優れた重量負荷分散機能、軟骨下骨へのピークストレスの最小化能、および高耐久性が含まれる。
肉眼的にまた、組織学的に、ヒアリン軟骨の外観は、滑らかな固い表面に見え、変形しにくい。軟骨の細胞外マトリックスは、軟骨細胞を含むが、血管、リンパ管、または神経はない。軟骨細胞とマトリックスの相互作用を維持する複雑な、高度に規則正しい構造が、低レベルの代謝活性を維持しながら、ヒアリン軟骨の構造と機能を維持するのに役立つ。参考文献O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998では、ヒアリン軟骨の構造と機能が詳細に記述されており、これを参考資料としてそのまま本明細書で援用する。
本明細書では、「注入可能な」組成物は、各種の三次元の足場、枠組み、メッシュまたはフェルト構造を除いた組成物であり、細胞が接着でき、さらに細胞が一層以上に増殖でき、一般に注入ではなく、移植するいずれかの材料または形状から構成されるのがよい。一般的に注入は、シリンジで行なう。しかし、対象組成物のどのような注入形態でも使用できる。例えば、カテーテル、吸入器、または温度依存ポリマーゲルも使用できる。
本明細書では、「哺乳類宿主」の用語は、ヒトを含む動物界の各種動物が含まれるが、これに限定されない。
本明細書では、「混合細胞」または「細胞の混合物」または「細胞混合物」は、複数の異なる細胞タイプの組み合わせを指す。細胞は、細胞介在遺伝子療法で使用するのが好ましい。さらに、細胞は、いずれかの治療遺伝子産物をコード化する遺伝子またはDNAでトランスフェクトまたは形質導入してある細胞を含む結合組織細胞が好ましい。特に、遺伝子産物は、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーである。さらに、混合物は、治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入されていないヘルパー細胞を含む。
トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリー遺伝子を本発明の実施例に使用できる治療遺伝子タイプの一例として、また、本発明を特定遺伝子に制限せずに使用すると、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーをコード化する遺伝子によりトランスフェクトまたは形質導入されていない細胞のTGFスーパーファミリー遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入した細胞に対する比率は、約3〜20：1の範囲内であるのがよい。該範囲は、約3〜10：1にすることができる。特に、該範囲は、細胞数に換算して約10：約1であることができる。しかし、これらの細胞の配合物が、部分および全層欠損関節中においてヒアリン軟骨が生成されるのに有効である限り、これらの細胞の比率を必ずしも特定の範囲に限定すべきでないことが分かる。
本明細書では、「患者」という用語は、ヒトを含む動物界のメンバーが含まれるが、これに限定されない。
本明細書では、「薬学的に許容されるキャリア」は、本発明の組成物の運搬効率を促進し、該組成物の有効性を長期化させることが技術上知られているキャリアを指す。
本明細書では、「体細胞」または「細胞」は、卵または***以外の身体の細胞を指す。
本明細書では、「保存」細胞は、哺乳類宿主に投与する前に、個別か一緒に保存されている混合細胞組成物を指す。細胞は、冷蔵庫で保存するのがよい。あるいは、細胞は、後から哺乳類宿主に投与するために保存するよう、約‐20℃〜‐70℃で冷凍するのがよい。細胞は、既知のプロトコルを使って融解できる。冷凍融解時間は、細胞の生育力と力価を至適化できる限り、いく通りもの方法で実施できる。
本明細書では、「トランスフォーミング成長因子‐β(TGF‐β)スーパーファミリー」は、胚の発達中の広範囲な分化過程に影響を与える、構造関連タンパク質群を含む。該ファミリーには、正常な男性発達に必要なミュラー阻害物質(MIS)(Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990)、背腹軸の形成と成虫原基の形態形成に必要なDrosophila decapentaplegic (DPP)遺伝子産物(Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987)、卵の植物極に局在するアフリカツメガエル(Xenopus) Vg-1遺伝子産物(Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987)、アフリカツメガエルの胚の中胚葉および前構造の形成を誘発できる(Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990)、アクチビン(Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986)およびde novoで軟骨および骨形成を誘発できる骨形成因子(BMP-2、3、4、5、6および7、オステオゲニン、OP-1などのＢＭＰ)(Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990)がある。TGF-β遺伝子産物は、脂肪生成、筋発生、軟骨形成、造血、上皮細胞分化を含む様々な分化過程に影響を与えることができる。詳細については、Massague, Cell 49:437, 1987を参照されたい。参考資料として、そのまま本明細書に援用する。
TGF-βファミリーのタンパク質は、初めに、大型前駆タンパク質として合成され、これが、その後、C末端からアミノ酸約110〜140個目の塩基性残基群でタンパク分解性開裂が生じる。該タンパク質のC末端領域は、すべて、構造的に関連し、別のファミリーのメンバーは、その相同性の程度に基づいて、異なるサブグループに分類できる。特定のサブグループ内の相同性は、70%〜90%のアミノ酸配列同一性の範囲であるが、サブグループ間の相同性は、有意に低く、一般に、わずか20%〜50%の範囲である。いずれの場合も、活性種は、明らかにC末端断片のジスルフィド結合二量体である。検討したファミリーメンバーの大半については、ホモ二量体種は、生物学的活性を有することが認められているが、他のファミリーメンバーについては、インヒビン(Ung, et al., Nature, 321:779, 1986)やTGF-β(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)のように、ヘテロ二量体も検出されており、これらは、明らかに、それぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質を有する。
TGF-βのスーパーファミリーメンバーは、TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(ニワトリ)、TGF-β1、TGF-β5(アフリカツメガエル)、BMP-2、BMP-4、ショウジョウバエDPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、ショウジョウバエ60A、GDF-1、アフリカツメガエルVgf、BMP-3、インヒビン-βA、インヒビン-βB、インヒビン-aおよびMISを含む。これらの遺伝子は、Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998で論じられており、参考資料として、そのまま本明細書に援用する。
好ましくは、TGF-β遺伝子スーパーファミリーのメンバーは、TGF-βとBMPである。さらに好ましい、メンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6またはBMP-7である。最も好ましい、メンバーは、ヒトまたはブタのTGF-β1またはBMP-2である。
本明細書では、「選択マーカー」は、導入されたDNAを安定的に維持する細胞によって発現される遺伝子産物を含み、形態トランスフォーメーションなどの改変表現型または酵素活性を該細胞に発現させる。トランスフェクト遺伝子を発現する細胞は、抗生物質や他の薬物への耐性を付与する酵素活性を有するものなど、選択マーカーをコード化する第二遺伝子を同一細胞に任意に導入することによって単離される。選択マーカーの例には、チミジンキナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、また、カナマイシン、ネオマイシンおよびゲンタマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質への耐性を付与するアミノグリコシドフォスフォトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンBフォスフォトランスフェラーゼ、キサンチン‐グアニンフォスリボシルトランスフェラーゼ、CAD(新規ウリジン生合成‐カルバミルフォスフェートシンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼの最初の３種の酵素活性を有する単一タンパク質)、アデノシンデアミナーゼおよびアスパラギンシンセターゼ(Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989)があるが、これに限定されない。参考資料として、そのまま本明細書に援用する。選択マーカーの使用は、請求の範囲に記載されている発明を実施するための要件ではないことが分かる。事実、ある実施態様では、選択マーカーは、請求の範囲に記載されている発明の遺伝子構成物には組み込まれていない。
本明細書では、「プロモーター」は、活性のあるDNA配列であることができ、真核細胞での転写を制御する。プロモーターは、真核、原核のいずれかの細胞またはその両方で活性を示すことができる。好ましくは、プロモーターは、哺乳類細胞中で活性を示す。プロモーターは、構成的に発現するか誘導可能であるのがよい。好ましくは、プロモーターは、誘導可能である。好ましくは、プロモーターは、細胞外刺激によって誘導可能である。さらに好ましくは、プロモーターは、ホルモンまたは金属で誘導可能である。さらに好ましくは、プロモーターは、重金属で誘導可能である。最も好ましくは、プロモーターは、メタロチオネイン遺伝子プロモーターである。同様に、同じく転写を制御する「エンハンサーエレメント」は、DNAベクター構築物に挿入し、本発明の構築物と共に使用し、対象遺伝子の発現を増強できる。
本明細書では、「DC-chol」の用語は、陽イオンコレステロール誘導体を含む陽イオンリポソームを意味する。「DC-chol」分子には、３級アミノ基、中鎖スペーサーアーム(2原子)およびカルバモイルリンカー結合(Gao et al., Biochem. Biophys. Res, Commun., 179:280-285, 1991)がある。
本明細書では、「SF-chol」は、一種の陽イオンリポソームと定義する。
本明細書では、リポソームと関連して使用する「生物学的に活性な」という用語は、機能的DNAおよび／またはタンパク質を標的細胞に導入する能力を意味する。
本明細書では、核酸、タンパク質、タンパク断片またはそれらの誘導体に関する「生物学的に活性な」という用語は、野生型の核酸またはタンパク質が誘発する既知の生物学的機能を擬似する核酸またはアミノ酸配列の能力として定義する。
本明細書では、「維持」という用語は、リポソーム送達と関連して使用する場合、細胞中に存在し続ける被導入DNAの能力を意味する。他の文脈で使用する場合、「維持」は、治療効果を付与するために対象細胞または組織中に存在し続ける対象DNAの能力を意味する。
生体接着材
治療体細胞は、生体接着材で完全に、または、部分的に取り囲まれるのがよい。生体接着材は、治療物質の放出プロファイルに影響を与えるのがよく、そのため、混合する生体接着材量は、治療物質の望みの放出プロファイルに干渉してはならず、有害な変化を加えてはならない。
適切な生体接着材は、接着性の他に、生体適合性、即ち、使用量で非毒性、非炎症性、実質的に非免疫性、並びに、血液適合性でなければならない。
生体接着材は、非特異的か特異的のいずれかの結合性を持つことができる。非特異的結合性の生体接着材は、一般に、細胞や細胞外マトリックス成分に接着し、治療部位で、例えば、電荷的相互作用を介して組織を形成する。非特異的結合性を持つ生体接着材の例には、CARBOPOL(登録商標)(BF Goodrich Performance Materials, Cleveland, OH)ポリマー、ホモポリマーおよびコポリマーを含むが、これに限定されない。CARBOPOL(登録商標)ポリマーには、高分子量、架橋アクリル酸系ポリマーがある。CARBOPOL(登録商標)ホモポリマーには、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋したアクリル酸ポリマーがある。CARBOPOL(登録商標)コポリマーには、長鎖(C10-C30)アルキルアクリレートで修飾し、アリルペンタエリスリトールで架橋したアクリル酸ポリマーがある。他の例は、カルボポルーポロキサマーゲル、ハイドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシセルロースナトリウム、グアガム、ポリビニルピロリドン、キトサン、ポリアクリル酸、ハイドロキシプロピルセルロース、ポリカルボフィル、デンプングリコール酸ナトリウム、アルギネートおよびそれらの混合物および／またはコポリマー、並びに、ポリエチレングリコールとの混合物、コポリマーまたはグラフト構築物が含まれる。
特異的結合性の生体接着材は、治療部位で組織の細胞およびマトリックス表面に露出した分子との特異的分子間相互作用を介して組織に接着する。特異的結合性の生体接着材の例は、レクチン、細胞接着分子およびインテグリンなどのレセプタータンパクに対するリガンドおよび抗体、並びに、アルブミンを含むが、これに限定されない。
特定の生体接着材は、体細胞の使用目的と配置、また、特に、細胞の接着が必要な治療部位の特性に応じて異なる。例えば、軟骨または骨領域では、バフィーコートを前記の固体または半固体表面に優先的に結合できる接着材として有効に使用できる。対象組織領域が正の電荷を有する場合、対象組織などへの治療体細胞の接着性を促進するために、負の電荷のポリマー分子を使用できたり、その逆も利用できる。
特定の治療部位への体細胞の一層特異的で指向性の強い付着が望ましい場合、キャリア組成物の使用に特異的結合性の生体接着材を選択できる。例えば、身体の特殊領域の組織のみで露出する分子に結合する生体接着材を使用できるので、それらの組織に結合するように体細胞を方向付けることができる。別の方法として、治療部位が疾患または損傷した組織領域である場合、疾患または損傷のためにその組織領域で露出した分子に結合する生体接着材を使って、治療部位に体細胞を送ることができる。
細胞表面上の多くの成分は、グリコシル化されており、露出した糖部分を持つ。レクチンは、タンパク質か、糖部分に結合した糖−タンパク共役体であるので、グリコシル化した細胞表面に結合することになる。対象治療部位が高度グリコシル化細胞である場合、レクチンは、組織に接着する生体接着材として使用できる。レクチンも、一般に、非免疫原性であるために有利である。レクチンの例は、Lyscopersicon eculantum(ミニトマト)アグルチニン、小麦胚芽アグルチニン、Urtica dioica(イラクサ)アグルチニン、ピーナッツアグルチニン、トマトレクチン、Ulex europaeus(ハリエニシダ）イソアグルチニンであるが、これに限定されない。
接着分子として既知のレセプタータンパクも、細胞表面に露出される。接着分子は、他の細胞表面で分子を特異的に認識し、結合することによって細胞−細胞結合を仲介する。従って、特定治療部位で細胞表面に露出した接着分子に結合するリガンドまたは抗体を、治療部位への特異的生体接着材として使用できる。
ある実施態様では、生体接着混合物は、非特異的結合性のものと特異的結合性の生体接着材から生成できる。前記混合物は、例えば、生体接着材と治療部位組織の間の非特異的電荷相互作用および特異的分子間相互作用を利用して、特定治療部位への治療体細胞−生体接着混合物の接着を改善できる。
本発明のある実施態様では、上記の生体接着−体細胞混合物を、望みの治療部位に送達できる。この部位は、関節腔を含む一般的な体内組織であるのが、これに限定されない。生体接着−体細胞は、その内容物を対象組織まで、あるいは、その付近まで有効に送達できる限り、注射器などの器具や技術を駆使して送達できる。
別の態様では、本発明は、好ましくはヒトの血清から生成するフィブリノーゲンおよびトロンビンから成る組成物の使用を対象とする。該組成物は、フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を混合すると、液状のりのような働きをするのがよい。さらに、ヒトの血清からフィブリノーゲンとトロンビンを単離する場合、該組成物は、無毒でなければならない。前記組成物は、例えばGreenplast(登録商標)(Greencross、韓国)から市販品を入手できる。特定の方法や特定の組成物調製法に限定されずに、一例を以下の通り実施できる。
１.滅菌シリンジを使ってフィブリノーゲン粉末(126〜256mg)をアプロチニン溶液(1.1ml)と混合する。
２.滅菌シリンジを使ってトロンビン粉末(5〜11mg)をNaCl(塩化ナトリウム)溶液(2.5ml)と混合する。
３.フィブリノーゲンとトロンビンを各溶液に溶解した後、2種類の溶液を約1：1の比率で混合し、組成物を生成する。
軟骨再生を引き起こすことを目的に、少なくとも約1：100までの組成物希釈液を注入または負荷用に混合し、接着性を生じた。
バフィーコート
バフィーコートは、治療体細胞と混合した後、治療体細胞から生成した治療遺伝子産物の発現によって効果を得る身体の部位に投与するのがよい。バフィーコートは、骨や軟骨などの固体基質、並びに、筋肉や他の組織などの半固体基質に接着する物理的性質を有するので、治療遺伝子産物の限局送達を実現するように、投与部位適所に治療体細胞を保持する一種の一時的な「接着剤（のり）」として使用できる。
本発明の特殊な実施態様では、バフィーコートは、関節腔に注射された結合組織細胞と混合した後、サイトカインなどの治療遺伝子を発現し、遺伝子産物の長時間の有効な送達を実現し、軟骨または骨を再生する。前記の方法は、骨関節炎の治療に有効である。
血液試料を遠心分離する場合、バフィーコートは、遠沈管の中間層を成す。最上層は、血漿で、最下層は、赤血球を含む。しかし、バフィーコートは、白血球と血小板を含む。様々なバフィーコート層内容物の精製法がある。本発明によれば、この層は、血液試料から抽出し、体細胞療法プロトコルで使用する細胞と混合できる。理論や作用機序に制約されることなく、哺乳類宿主に投与する細胞による精製バフィーコートを封入することによって、投与部位での遺伝子の発現効率が高くなると考えられる。その理由は、これらの細胞を発現するように、バフィーコートが、骨や軟骨などの哺乳類宿主内の生理的構造に細胞を結合、固定または定着するのに役立つからである。
精製バフィーコートの量が治療の有効性を実質的に高めるのに有効である限り、哺乳類宿主への組成物の投与前にどの位の量の精製バフィーコートを添加するのがよいかという点については、制限はない。ある実施態様では、細胞が軟骨発生に関連するので、細胞に添加するバフィーコート量が軟骨発生に有効である。従って、バフィーコート対細胞の量比は、注入可能な組成物の体積%で約1〜5の範囲にするのがよい。一般的には、該範囲は、約1〜3：1にするのがよい。特に、該範囲は、注入するバフィーコートと細胞の体積換算で約1：1にするのがよい。
バフィーコートの調製法に制限はなく、バフィーコートを調製できる、ある方法は、細い試験管中の抗凝固血液を遠心分離した後、バフィーコートをかき乱さずに、できるだけ多くの血漿を慎重に除去する方法である。次に、緩衝化2%グルタールアルデヒドを最上部に非常に穏やかに層化し、試験管を冷蔵庫中に約2時間放置する。これによって、固体血漿に封埋したバフィーコートが生成され、、細い木製スティックかこれと同様のものを使って試験管から取り出すことができる。次に、生成されたディスクは整形し、正常な組織で使用するため、小片を処理し、樹脂加工できる。その後、細長い管をかみそりの刃でバフィーコートの上下で(パラフィルム片上で)切断し、両端が開いた短い棒を作る。次に、ペーパークリップかアプリケータースティックで（チューブの直径に応じて)、充填されたバフィーコートを押出す。時に、1%融解寒天を使って、それを合わせる。その後、ペレットを処理する。バフィーコートの成分は、十分に解明されていないが、本発明のバフィーコートは、遠心分離した血液試料の中間層を成す。
遺伝子療法
本発明の生体接着材は、体細胞遺伝子療法の対象の哺乳類宿主に投与できる細胞と混合するのがよい。特に、バフィーコートを結合組織、特に線維芽細胞や軟骨細胞などの軟骨生成細胞と共に使用するのがよい。本発明の生体接着材は、サイトカインをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入した細胞と、それらの操作を行なっていない細胞の別の混合物と混合するのがよい。
軟骨欠損を治療するサイトカイン産生細胞と共にバフィーコートを使用する点で、該配合物は細胞単独よりも接着性が高い。従って、バフィーコート法は、細胞バフィーコート配合物の投与部位と欠損部位の間のより強い独立性を生じる。
細胞バフィーコート配合物では、動物テスト中の軟骨生成における成功率がさらに高くなる。さらに、新生軟骨の平均的な質は、細胞単独注入よりも実質的に良好である。言い換えれば、細胞バフィーコート配合組成物を使用する方が、生成された正常に近い軟骨の割合が高い。従って、認められた繊維性軟骨量は、細胞単独使用よりも細胞-バフィーコート組成物の方が低かった。
本発明は、哺乳類宿主の結合組織細胞への対象DNA配列の送達に関する生体外および生体内技術を開示している。生体外技術は、対象遺伝子産物の生体内発現を惹起するための、対象結合組織の培養、対象となるDNA配列、DNAベクターまたは他の送達ビヒクルの結合組織細胞への試験管内トランスフェクションとそれに続く改質結合組織細胞の哺乳類宿主の対象関節への移植に関する。
足場物質やフレームワークなどの物質、並びに、各種外来組織を、本発明の遺伝子療法プロトコルに従って、合わせて移植することが可能であるが、前記の足場物質や組織を本発明の注入系に含まないことも可能であることを理解する必要がある。好ましい実施態様では、細胞介在遺伝子療法または体細胞療法において、本発明は、トランスフェクトまたは形質導入結合組織細胞群を注入し、それによって外因性TGFスーパーファミリータンパクを関節腔で発現させる簡便法を対象にしたものである。
本明細書全体を通じて開示している結合組織疾患を治療する、ある生体外の方法は、タンパク質、またはその生物学的に活性な断片をコード化するDNA配列を含む初期生成組換えウイルスまたはプラスミドベクターを含む。次に、この組換えベクターを使って、試験管内培養した結合組織細胞群を感染またはトランスフェクトし、ベクターを含む結合組織群が生成される。その後、これらの結合組織細胞を、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞の混合物として哺乳類宿主の対象関節腔に、バフィーコートと一緒か別個に関節腔に移植し、関節内で各種細胞混合物を惹起し、それによって、関節腔内でタンパク質またはタンパク断片の連続発現を起こす。この対象DNA配列の発現は、少なくとも1種類の、結合組織障害を伴う有害な関節病変を実質的に軽減するのに有用である。
ヒトの患者を治療する細胞源は、自己線維芽細胞または軟骨細胞などの患者自身の結合組織細胞でよいが、同種異系細胞、並びに、細胞の組織適合性とは関係なく、異種細胞も使用できる点は、一般的な当業者なら理解できるであろう。
さらに具体的には、この方法は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバー、またはそれらの生物学的に活性な誘導体若しくは断片、並びに選択マーカー、またはそれらの生物学的に活性な誘導体若しくは断片をコード化できる遺伝子を含む。
本発明のさらなる実施態様は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーをコード化できる遺伝子またはそれらの生物学的に活性な断片の利用、また、DNAプラスミドベクターとして、利用する送達法には関係なく、送達時に対象細胞または組織内で安定な維持を行なうことが可能な一般的な当業者にとって既知であるDNAプラスミドベクターの利用を含む。
本発明の別の実施態様では、哺乳類宿主の治療で使用するための結合組織の少なくとも1個の細胞に産物をコード化する少なくとも1個の遺伝子を導入する方法が示されている。この方法には、産物を解読する遺伝子を結合組織細胞に導入する非ウイルス手段の利用がある。さらに具体的には、この方法には、リポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法またはDEAE-デキストラン仲介法があり、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバー、またはそれらの生物学的に活性な誘導体若しくは断片、並びに選択マーカー、またはそれらの生物学的に活性な誘導体若しくは断片をコード化できる遺伝子の利用がある。
本発明の別の実施態様では、哺乳類宿主の治療で使用するための結合組織の少なくとも1個の細胞に産物をコード化する少なくとも1個の遺伝子を導入する別の方法が、示されている。この方法は、対象細胞または組織にDNAベクター分子を送達するためにウイルスを利用する生物学的手段の利用を含む。好ましくは、ウイルスは擬似ウイルスであり、擬似ウイルスは対象細胞内で送達と安定な維持だけが可能であるが、対象細胞または組織内で複製する能力を保持しないように改変したゲノムである。改変したウイルスゲノムは、ウイルスゲノムが対象細胞または組織内で発現されるための対象の異種遺伝子を含むDNAベクター分子として働くように、組換えDNA技術でさらに操作する。
本発明の好ましい実施態様は、本明細書内で開示した生体外技術に従って、レトロウイルスベクターを使用して、哺乳類宿主の結合組織にTGF-βまたはBMP遺伝子を送達することによって実現する、対象となる関節腔にTGF-βまたはBMPを送達する方法である。言い換えれば、機能的TGF-βまたはBMPタンパクまたはタンパク断片をコード化する対象DNA配列を、選択したレトロウイルスベクターにサブクローニングする。次に、組換えウイルスベクターを適切な力価まで増殖させ、試験管内培養した結合組織細胞を感染させ、形質導入した結合組織細胞、好ましくは自己移植細胞、をバフィーコートと混合し、軟骨細胞などの結合組織細胞の任意の非トランスフェクト試料と共に、好ましくは関節内注入によって対象関節に移植する。
好ましい実施態様では、線維芽細胞を試験管内培養し、その後に遺伝子療法の送達系として利用する。本出願で開示した特定の結合組織の使用に限定されるものではないことは、明らかである。試験管内培養技術に他の組織源を利用することは可能であろう。本発明の遺伝子を使用する方法は、関節炎の予防と治療に使用できる。本出願では膝関節のみの治療において予防的か治療的な応用に限定されるものではないことも明らかである。感受性のある関節の関節炎の治療に本発明を予防か治療的に利用することが可能であろう。
本発明の別の実施態様では、患者に治療有効量で非経口投与する化合物が示されており、これは、TGF-βスーパーファミリータンパク質をコード化する遺伝子と適切な製剤用キャリアを含有する。
本発明の別の実施態様は、予防に有効な量で患者に非経口投与する化合物が示されており、これは、TGF-βスーパーファミリータンパク質をコード化する遺伝子と適切な製剤用キャリアを含有する。
本発明のさらなる実施態様では、関節腔への投与前に細胞を保存する。トランスフェクトまたは形質導入細胞を単独で保存してもよいし、任意に非トランスフェクトヘルパー細胞を単独で保存してもよいし、混合物を保存してもよいが、必ずしも同時に行なう必要はない。さらに、保存期間は、同一にする必要はない。従って、個別に保存した細胞は、注入前に任意に混合できる。別の方法として、細胞を別々に保存、注入し、関節腔内で混合物とすることができる。これらの細胞を、液体窒素下、約10%DMSO中で冷凍保存できることが、当業者なら認識できるであろう。別の実施態様では、保存組成物にバフィーコートを含むことができる。
本発明の別の実施態様には、前述の通り、産物を解読する遺伝子を含有するウイルスベクターを哺乳類宿主に直接導入することによって細胞の生体内感染を引き起こすことを含めて、哺乳類宿主の治療に使用する上で哺乳類宿主の結合組織の少なくとも1個の細胞中に産物をコード化する少なくとも1個の遺伝子を導入する方法がある。好ましくは、この方法は、関節内注入による哺乳類宿主への直接導入の実施を含む。この方法には、関節炎発症に敏感な哺乳類宿主における関節炎発症を実質的に防止する方法への利用がある。この方法には、治療目的の使用のための、関節炎の哺乳類宿主に対する方法への利用もある。さらに、この方法には、前述の通り、結合組織を修復、再生する方法への利用もある。
レトロウイルスが結合組織細胞の感染と合体を引き起こすことが必要なように、リポソームを利用したウイルスベクターは、細胞***によって制限されないことが、当業者なら認識できるであろう。前述の通りに非ウイルス手段を利用したこの方法には、遺伝子として、TGF-βスーパーファミリーに属するメンバーをコード化できる遺伝子と、任意に、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子の利用がある。また、選択マーカー遺伝子の使用は、本出願の請求範囲に記載されている発明を実施する必要要件ではない。
本発明の別の実施態様では、コラーゲンの生体内発現を惹起して軟骨などの結合組織を再生させることを目的として、本明細書内で開示しているいずれかの方法により、哺乳類宿主の結合組織へのTGF-βスーパーファミリーメンバーをコード化するDNA配列を送達している。
結合組織は、治療の対象とするのが困難な臓器である。技術上既知の薬物送達を実施する際、静脈内および経口経路は、これらの結合組織への進入が良好でなく、治療薬に哺乳類宿主の全身が曝露される点が不利である。さらに具体的には、既知である関節内注入により、関節にタンパク質を直接注入する。しかし、カプセル化タンパクの形で注入された薬物の大半は、関節内半減期が短い。本発明では、哺乳類宿主の治療に使用できるタンパク質を解読する遺伝子を哺乳類宿主の結合組織に投与することによって、これらの問題が解決される。さらに具体的には、本発明では、抗関節炎作用を有するタンパク質を解読する遺伝子を哺乳類宿主の結合組織に投与する方法が示されている。
本明細書に記載している実施例では、線維芽細胞や軟骨細胞、並びに、各種細胞型の混合物などの各種サイトカイン産生細胞により関節内でのコラーゲン合成が促進される。バフィーコートを含む組成物でも、コラーゲン合成が促進された。実施例では、総じて、関節に細胞約106個/mlの濃度で注入した。注入後2〜12週間の間に検体を採取した。細胞は、関節内を自由に移動し、これらの細胞に特異的親和性を持つ領域まで移動する。滑膜、半月、軟骨の欠損領域が、細胞接着が可能な部位であると思われる。注入後2〜12週で、部分的および完全に損傷した軟骨欠損部分に再生組織が検出された。損傷部分におけるこの特異的親和性は、臨床応用に際して、混合細胞を使用する別の利点である。足場物質や他の3次元構造などの各種物理的手段を含まずに、関節に細胞を注入するだけで変性関節炎を治癒させることができれば、大手術を行なわずに、患者を簡便に治療できる。
作用機序が何であれ、作用機序に関する特定の理論に制限されることなく、サイトカイン産生細胞、混合細胞組成物および本発明の組成物を含有するバフィーコートの使用によるヒアリン軟骨合成の所見は、高TGF-βまたはBMP濃度の長期持続がヒアリン軟骨再生を促進できることを示している。新たに形成された組織の性質は、組織学的方法により決められた。H＆E染色、マッソン三重染色およびサフラニン-Oによって、新たに形成された組織は、周囲のヒアリン軟骨と同一であることが判明した。
本発明の一例として以下の実施例を提示するが、これらに限定されない。
材料および方法
プラスミド構築
メタロチオネイン発現構築物(pM)を生成することを目的に、増幅に用いるオリゴヌクレオチド内に構築したXba IおよびBam HI制限部位を使って、ゲノムDNAによるポリメラーゼ連鎖増幅によって、メタロチオネインIプロモーター(‐660/+63)を生成した。増幅された断片をpBuescriptのXba I-Bam HI部位にサブクローニングした(Stratagene, La Jolla, CA)。プラスミドpmTβ１は、TGF-β1解読配列含有の1.2-kb Bgl II断片と3'末端の成長ホルモンポリA部位をpMのBam HI-Sal I部位にサブクローニングすることによって生成した。BMP2解読配列を含む1.2‐kb Sa1 I-Not I断片をpMTMLVのSal I‐Not I部位にサブクローニングして、プラスミドpMTBMP2を生成した。pMTMLVベクターは、レトロウイルスベクターMFGからgagおよびenv配列全体、並びに、Ψパッケージング配列の一部を欠失させて誘導した。
細胞培養およびトランスフェクション‐TGF-β1 cDNAを、線維芽細胞(NIH 3T3-TGF-β1)、ヒト***線維芽細胞(ヒト***-TGF-β1)および軟骨細胞(hChon-TGF-β1)にトランスフェクトした。それらを10%濃度のウシ胎仔血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地(GIBCO-BRL, Rockville, MD)中で培養した。TGF-β1 cDNA配列をメタロチオネイン遺伝子プロモーターでpmTβ1ベクターに追加した。ネオマイシン耐性遺伝子配列も該ベクターに挿入した。
このベクターを細胞に挿入するリン酸カルシウム法を用いた。トランスフェクト遺伝子配列のある細胞を選択する際、ネオマイシン(300mg/ml)を培地に添加した。次に、生存コロニーを選別し、TGF-β1 mRNAの発現を、ノーザン分析およびTGF-β1 ELISAアッセイ(R＆D Systems)で確認した。TGF-β1発現細胞を、液体窒素中で保存し、注入直前に培養した。
ノーザンブロット分析―総RNAをグアニジウムイソチオシアネート／フェノール／クロロホルムで細胞から単離した。10mgのRNAを0.66Mホルムアルデヒド含有1.0%アガロースゲルで電気泳動し、DURALON-UV膜に移し、UV STRATALINKER(STRATAGENE)で架橋した。ブロットを、1%ウシ胎仔血清アルブミン、7%(w/v)SDS、0.5Mリン酸ナトリウムおよび1mM EDTAの溶液中、65℃で、前ハイブリダイズし、続いてハイブリダイズした。ハイブリダイズしたブロットを、フィルム露出前、0.1%SDS、1x SSC、55℃で20分間洗浄した。RNAブロットを、ヒトTGF-β1用32P-標識cDNAプローブでハイブリダイズした。β-アクチン用プローブを使って、サンプル負荷を制御した。
ウサギへの細胞注入‐体重2.0〜2.5kgのニュージーランドホワイトウサギを動物モデルとして選択した。ケタミンおよびラウンパンで麻酔した後、各ウサギに無菌的にドレープをかけた。膝関節を露出し、部分および完全軟骨欠損をメスで作り出した。軟骨下骨を露出しないように注意しながら、ヒアリン軟骨層に部分欠損を作り出した。ヒアリン軟骨をすべて除去した後、完全欠損を作り出し、軟骨下骨を露出した。手術創を縫合した後、細胞106個/mlの濃度の細胞を関節内注入し、TGF-β1保持細胞をアッセイする際、飲料水に硫酸亜鉛を添加した。
組織検査−膝関節を採取した後、検体をホルマリンに固定し、硝酸で脱灰した。それらをパラフィンブロックに封埋し、0.8mmの厚さの切片に切断した。ヘマトキシリン−エオジン、サフラニン−Oおよびマッソン多重染色を利用して、再生した組織を顕微鏡で観察した。
バフィーコート調製−抗凝固処理した血液を遠心分離した後、血漿をできる限り慎重に除去する。次に、最下層を乱さずに、バフィーコート層を清潔な試験管に移し、1X PBSで3〜4回洗浄する。
実験法および結果
安定細胞系
リン酸カルシウム共沈法を使ってトランスフェクションを実施した(図1A〜1C)。生存コロニーの約80%がトランスジーンmRNAを発現した。これらの選択したTGF-β1産生細胞を硫酸亜鉛溶液中で培養した。細胞を100mM硫酸亜鉛中で培養した場合、該細胞はmRNAを産生した。TGF-β分泌率は、約32ng/106個細胞/24時間であった。
リン酸カルシウム共沈法を使ってトランスフェクションを実施した(図1A〜1C)。生存コロニーの約80%がトランスジーンmRNAを発現した。これらの選択したTGF-β1産生細胞を硫酸亜鉛溶液中で培養した。細胞を100mM硫酸亜鉛中で培養した場合、該細胞はmRNAを産生した。TGF-β分泌率は、約32ng/106個細胞/24時間であった。
BMP2 cDNAを含有するレトロウイルスベクターに感染させたNIH3T3線維芽細胞によって生物学的に活性なBMP2タンパクの産生を検査、確認するために、対照NIH3T3-メタロチオネイン(図1B)およびNIH3T3-BMP2細胞(図1C)と共にアルカリフォスファターゼ(ALP)活性アッセイを実施した。図1Cの青色は、BMP2タンパクの発現を示す。
NIH3T3細胞1.5 x 106個を6穴組織培養平板中で一晩増殖させた。指標細胞0.5 x 105個(MC3T3E1)を組織培養インサートに静置し、一晩増殖させた。培養インサートから培養培地を吸引し、培養インサートを6穴平板に移し、48〜72時間培養した。培養培地を培養インサートから吸引した。1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)を5ml添加し、細胞を洗浄した。3.7%ホルムアルデヒド/1X PBS溶液4mlを各インサートに添加し、細胞を4℃で20分間固定した。1X PBSで細胞を2回洗浄した。ALP染色溶液3mlを各インサートに添加し、培養インサートを暗所、室温で、約20分〜1時間培養し、青色の発色を調べた。ALP染色溶液は、0.1M Tris-HCl、pH8.5中0.1mg/mlナフトールAS-MXフォスフェート(Sigma N5000)、0.5% N-ジメチルホルムアミド(Sigma D8654)、2mM MgCl2、0.3mg/ml ファーストブルーBB塩(Sigma F3378)である。
ウサギ関節軟骨欠損の再生
部分および完全軟骨欠損を作り出した後、0.3mlのNIH3T3-TGF-β1細胞106個/mlを膝関節に注入した。注入から2〜6週間後に関節を調べた。部分損傷軟骨では、新たに形成されたヒアリン軟骨が認められた。注入から2週間後、ヒアリン軟骨が現われ、注入から6週間後、軟骨欠損部がヒアリン軟骨で覆われた(図2)。再生した軟骨は、経時的に厚さが厚くなった(図3)。注入細胞はTGF-β1を分泌し、それは、TGF-β1抗体による免疫組織化学的染色によって認めることができた(図3)。TGF-β1トランスフェクションなしの正常線維芽細胞を注入した反対側は、ヒアリン軟骨で覆われなかった。部分損傷領域では、再生ヒアリン軟骨は、サフラニン−O染色で赤色に着色した(図4)。新たに形成された軟骨の深さは、欠損の深さとほぼ同一であった。この所見は、注入した細胞がパラクリン作用形態によって周囲の正常軟骨を活性化することを示唆している。
部分および完全軟骨欠損を作り出した後、0.3mlのNIH3T3-TGF-β1細胞106個/mlを膝関節に注入した。注入から2〜6週間後に関節を調べた。部分損傷軟骨では、新たに形成されたヒアリン軟骨が認められた。注入から2週間後、ヒアリン軟骨が現われ、注入から6週間後、軟骨欠損部がヒアリン軟骨で覆われた(図2)。再生した軟骨は、経時的に厚さが厚くなった(図3)。注入細胞はTGF-β1を分泌し、それは、TGF-β1抗体による免疫組織化学的染色によって認めることができた(図3)。TGF-β1トランスフェクションなしの正常線維芽細胞を注入した反対側は、ヒアリン軟骨で覆われなかった。部分損傷領域では、再生ヒアリン軟骨は、サフラニン−O染色で赤色に着色した(図4)。新たに形成された軟骨の深さは、欠損の深さとほぼ同一であった。この所見は、注入した細胞がパラクリン作用形態によって周囲の正常軟骨を活性化することを示唆している。
NIH3T3- TGF-β1細胞を単独で使用する場合、完全損傷軟骨中の再生組織は、ヒアリン軟骨ではなく、線維性コラーゲンであった。サフラニン-O染色におけるその色は、ヒアリン軟骨で得られる赤色の代りに白色であった(図5)。軟骨は、線維組織に覆われており、これは、これらの細胞がオートクリン形態のみによって活性化されたことを意味する。TGF-β1によって刺激できる周囲の骨細胞は、肥厚した石灰化骨マトリックスの存在下でTGF-β1に刺激されなかったことが明らかであった。注入細胞は、このバリアがあるために、骨細胞を刺激できなかったと思われる。
対照NIH3T3またはNIH3T3-TGF-β1細胞(5.7 x 105)に6000ラドの放射線を照射し、ウサギの膝関節に注入した。これらの照射細胞は、組織培養皿中、3週間で完全に死滅した。注入手順は、先の未処理細胞のプロトコルと同じであった。注入から3週間または6週間後に、膝関節を採取した。検体をホルマリンに固定し、硝酸で脱灰した。検体切片をパラフィンに封埋した後、0.5mmの厚さの切片に切断した。図6では、サフラニン-O染色(A−DおよびA'−D')とヘマトキシリンーエオジン染色(E−FおよびE'−F')を切片に実施し、再生した軟骨組織を顕微鏡で観察した。（元の倍率：(A、B、A'およびB') x 12.5；(C−FおよびC'−F') x 400)
対照ヒト***線維芽細胞(hFSF)またはhFSF- TGF-β1細胞を、大腿骨顆の部分軟骨欠損(3 mm x 5 mm、深さ1.5mm)を呈したウサギの膝関節に注入した。これらの細胞(細胞2 x 106個/mlを0.5ml)は、前プロトコル通りに注入するか、もしくは、同一濃度の細胞20-25 mlを欠損部最上部に負荷した。後者の場合、細胞を欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に欠損部の底に定着させた。両例とも、同様のレベルの軟骨再生が得られた。注入後6週間目に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図7AおよびBは、hFSF (A)またはhFSF-TGF-β1細胞(B)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。C、E、およびGは、対照hFSF細胞を注入した大腿骨顆からの切片のサフラニン-O染色(CおよびE)およびH&E染色(G)を示す。D、F、およびHは、hFSF-TGF-β1細胞を注入した大腿骨顆からの切片のサフラニン-O染色(DおよびF)およびH＆E染色(H)を示す。(元の倍率：(CおよびD) x12.5；(E-H) x400)。
対照NIH3T3またはNIH3T3-TGF-β1細胞を、大腿骨顆の部分軟骨欠損(6mm x 6mm、深さ2mm)を含むイヌの膝関節に注入した。これらの細胞(細胞2 x 106個/mlを4ml)は、前プロトコル通りに注入するか、もしくは、同一濃度の細胞30〜35mlを欠損部最上部に負荷した。後者の場合、細胞を欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に欠損部の底に定着させた。両例とも、同様のレベルの軟骨再生が得られた。注入後6週間目に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図8AおよびBは、NIH3T3細胞(A)またはNIH3T3-TGF-β1細胞(B)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。C、E、およびGは、対照NIH3T3細胞を注入した大腿骨顆からの切片のサフラニン-O染色(CおよびE)およびH&E染色(G)を示す。D、F、およびHは、NIH3T3-TGF-β1細胞を注入した大腿骨顆からの切片のサフラニン-O染色(DおよびF)およびH&E染色(H)を示す。(元の倍率：(CおよびD) x12.5；(E-H) x400)。
再生した軟骨組織中のTGF-β1タンパク質の発現を検討することを目的に、注入から３週間後の修復組織の免疫組織化学的染色をTGF-β1抗体で実施した。結果は、再生軟骨の細胞のみに高レベルのTGF-β1タンパク発現を示しており、その多くは、明らかに、新たに生じた軟骨細胞であった(図9AおよびB)。二次抗体単独でプローブした同一組織からの切片には、染色は見られなかった(図9C)。(元の倍率：A x 12.5；(B〜C) x 40)
ウサギの膝関節を採取した後、検体をホルマリンに固定し、硝酸で脱灰した。検体切片を作製し、パラフィンに封埋した後、0.8mmの厚さの切片に切断した。切片のパラフィンを除去し、キシレンおよびエタノール中での連続培養によって水和した。1x PBS中で2分間の洗浄後、切片を3%H2O2で10分間ブロックした。TGF-β1タンパクに対する一次抗体を切片に塗布し、1時間培養した。対照切片は、この段階で一次抗体なしで1x PBS中で培養した。切片を洗浄し、HRP-共役二次抗体との培養前に、1x PBS中5%ミルクで20分間ブロックした。1x PBS中0.05%ジアミノベンジディン(DAB)で色素原反応を5分間実施した。次に、切片をヘマトキシリンで染色し、取り付けた。
この試験の免疫組織化学的染色データおよびイヌモデル試験のデータは、現細胞療法によるヒアリン軟骨再生の分子メカニズムの可能性を示唆している。膝関節に注入した繊維芽細胞は、何とか「逆分化」型プロセスのような未知の経路を経て軟骨細胞に分化したと思われる。この経路は、生体内で注入した線維芽細胞から分泌されるTGF-β1によって起こり、これが残っている軟骨細胞と線維芽細胞に様々な因子を放出させ、パラクリンまたはオートクリン様式のTGF-β1作用によってこの経路を進行させたと思われる。
hChon-TGF-β1または対照hChon細胞を、大腿骨顆の部分軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1.5mm)を含むウサギの膝関節に注入した。これらの細胞(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl)を欠損部に負荷した。次に、細胞を欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に該細胞を定着させた。注入後6週間目に検体を採取し、顕微鏡で観察した(図10A〜E）。図10AおよびDは、hChon-TGF-β1(A)または対照ｈChon(D)細胞の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図10B、C、およびEは、hChon-TGF-β1(BおよびC)または対照hChon細胞(E)を注入した大腿骨顆からの切片のマッソン三重(BおよびE)およびサフラニン-O染色(C)を示す。[元の倍率：(B、C、およびE) x12.5]
ウサギの関節軟骨欠損の再生
体重2.0〜2.5kgのニュージーランドホワイトウサギを動物試験に選択した。これらのウサギは成熟しており、タイドマークを有した。膝関節を露出し、部分軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ1〜2mm)又は全層軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ2〜3mm)を、大腿骨顆のヒアリン軟骨層に外科用メスで作り出した。対照ヒト軟骨細胞(hChon)、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物、またはNIH3T3-BMP-2細胞を、欠損のあるウサギの膝関節に注入した。これらの細胞(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl)を欠損部の最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物による実験では、欠損部作製から3週間後にこれらの細胞を欠損部に注入した。細胞注入から6週間または12週間後に大腿骨顆を採取して調べた。
体重2.0〜2.5kgのニュージーランドホワイトウサギを動物試験に選択した。これらのウサギは成熟しており、タイドマークを有した。膝関節を露出し、部分軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ1〜2mm)又は全層軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ2〜3mm)を、大腿骨顆のヒアリン軟骨層に外科用メスで作り出した。対照ヒト軟骨細胞(hChon)、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物、またはNIH3T3-BMP-2細胞を、欠損のあるウサギの膝関節に注入した。これらの細胞(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl)を欠損部の最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物による実験では、欠損部作製から3週間後にこれらの細胞を欠損部に注入した。細胞注入から6週間または12週間後に大腿骨顆を採取して調べた。
部分欠損を有するウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-TGF-β1細胞)注入による軟骨の再生
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に部分軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl、hChon対NIH3T3-TGF-β1細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図11AおよびCは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図11BおよびDは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に部分軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl、hChon対NIH3T3-TGF-β1細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図11AおよびCは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図11BおよびDは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
全層欠損のウサギへの混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-TGF-β細胞)注入による軟骨の再生
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を呈したウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対NIH3T3-TGF-β1細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から12週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図12AおよびDは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(D)の注入から12週間後の大腿骨顆図を示す。図12B、CおよびEは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(BおよびC)またはhChon単独(E)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色(BおよびE)およびサフラニン-O染色(C)を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を呈したウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対NIH3T3-TGF-β1細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から12週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図12AおよびDは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(D)の注入から12週間後の大腿骨顆図を示す。図12B、CおよびEは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(BおよびC)またはhChon単独(E)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色(BおよびE)およびサフラニン-O染色(C)を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
部分欠損を有するウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-BMP-2細胞)注入による軟骨の再生
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物を、大腿骨顆に部分軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl、hChon対NIH3T3-BMP-2細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図13AおよびCは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図13BおよびDは、hChonおよびNIH3T3- BMP-2細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物を、大腿骨顆に部分軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを15〜20μl、hChon対NIH3T3-BMP-2細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図13AおよびCは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図13BおよびDは、hChonおよびNIH3T3- BMP-2細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
全層欠損のウサギへの混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-BMP-2細胞)注入による軟骨の再生
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を持つウサギの膝関節に注入した。この場合、細胞は、欠損作製から３週間後に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対NIH3T3-BMP-2細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図14AおよびDは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)またはhChon単独(D)の注入から12週間後の大腿骨顆図を示す。図14B、CおよびEは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(BおよびC)またはhChon単独(E)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色(BおよびE)とサフラニン-O染色(C)を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
対照hChon、またはhChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を持つウサギの膝関節に注入した。この場合、細胞は、欠損作製から３週間後に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対NIH3T3-BMP-2細胞比が10：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から6週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図14AおよびDは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)またはhChon単独(D)の注入から12週間後の大腿骨顆図を示す。図14B、CおよびEは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(BおよびC)またはhChon単独(E)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色(BおよびE)とサフラニン-O染色(C)を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
全層欠損のウサギへの混合細胞(ヒト軟骨細胞およびヒト軟骨細胞-TGF-β1細胞)による軟骨の再生
対照ヒト軟骨細胞(hChon)、またはhChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対hChon-TGF-β1細胞比が1：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から６週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図15Aおよび15Cは、hChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図15Bおよび15Dは、hChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
対照ヒト軟骨細胞(hChon)、またはhChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物を、大腿骨顆に全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ2〜3mm)を持つウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを20〜25μl、hChon対hChon-TGF-β1細胞比が1：1)を欠損部最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に細胞を創傷部に浸透させた。注入から６週間後に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図15Aおよび15Cは、hChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物(A)またはhChon単独(C)の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図15Bおよび15Dは、hChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物(B)またはhChon単独(D)を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
部分軟骨欠損を有するウサギにおけるウサギバフィーコートおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物の注入による軟骨の再生
体重2.0〜2.5kgのニュージーランドホワイトウサギを動物試験に選択した。これらのウサギは成熟しており、タイドマークを有した。膝関節を露出し、部分軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ1〜2mm)を、大腿骨顆のヒアリン軟骨層に手術用メスで作り出した。対照ウサギバフィーコート(rBC)、またはウサギバフィーコートおよびTGF-β1産生細胞(NIH3T3-TGF-β1細胞、細胞2 x 106個/mlを15〜20μl)の混合物を欠損部に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に該混合物を創傷部に浸透させた。注入から6週間または8週間後に大腿骨顆を採取した。
体重2.0〜2.5kgのニュージーランドホワイトウサギを動物試験に選択した。これらのウサギは成熟しており、タイドマークを有した。膝関節を露出し、部分軟骨欠損(3mm x 6mm、深さ1〜2mm)を、大腿骨顆のヒアリン軟骨層に手術用メスで作り出した。対照ウサギバフィーコート(rBC)、またはウサギバフィーコートおよびTGF-β1産生細胞(NIH3T3-TGF-β1細胞、細胞2 x 106個/mlを15〜20μl)の混合物を欠損部に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に該混合物を創傷部に浸透させた。注入から6週間または8週間後に大腿骨顆を採取した。
細胞負荷から6週間または8週間後に検体を採取し、組織検査に供した。図16A、CおよびEは、ｒBCおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(AおよびC)またはバフィーコート単独(E)の負荷から6週間または8週間後の大腿骨顆図を示す。図16B、DおよびFは、ｒBCおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(BおよびD)またはｒBC単独(F)を負荷した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(B、DおよびF) x 12.5]
注入後6週間または8週間後にウサギバフィーコートおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物を注入したウサギにヒアリン軟骨の再生が得られた。対照的に、ウサギバフィーコート単独を注入後8週間目の場合、ヒアリン軟骨の有意な再生は認められなかった。
部分または全層欠損のウサギにおけるグリーンプラスト(GP)による混合細胞(ヒト軟骨細胞およびヒト軟骨細胞-TGF-β1細胞)注入での軟骨の再生
hChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物を、大腿骨顆の部分軟骨欠損または全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mmまたは2〜3mm)を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを10〜15μlまたは20〜25μl、1:100希釈GPによるhChon対hChon-TGF-β1比が1：1)を欠損部の最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に該細胞を創傷部に浸透させた。注入後6週間目に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図17Aおよび17Cは、部分(A)または全層欠損部(C)での、hChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図17Bおよび17Dは、部分(B)または全層欠損部(D)にhChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD)x 12.5]
hChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物を、大腿骨顆の部分軟骨欠損または全層軟骨欠損(3mm x 5mm、深さ1〜2mmまたは2〜3mm)を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物(細胞2 x 106個/mlを10〜15μlまたは20〜25μl、1:100希釈GPによるhChon対hChon-TGF-β1比が1：1)を欠損部の最上端に負荷した後、欠損部に15〜20分間放置し、縫合前に該細胞を創傷部に浸透させた。注入後6週間目に検体を採取し、顕微鏡で観察した。図17Aおよび17Cは、部分(A)または全層欠損部(C)での、hChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物の注入から6週間後の大腿骨顆図を示す。図17Bおよび17Dは、部分(B)または全層欠損部(D)にhChonおよびhChon-TGF‐β1細胞の混合物を注入した大腿骨顆の切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD)x 12.5]
本明細書で引用する全参考文献を、参考としてそのまま援用する。
本発明の特定の実施態様を例示するために上述したが、添付した請求の範囲に限定される本発明の範囲を逸脱せずに、本発明の内容に多数の変更を加えることが可能であることは、当業者なら分かるであろう。
以下に示す詳細な説明と添付図は、本発明をさらに詳しく説明したものである。従って、各図は例として示したにすぎず、本発明はこれらに限定されない。
図1Ａ〜1Cは、TGF-β1mRNA(A)およびBMP2(BおよびC)の発現を示す。図1Aでは、NIH 3T3細胞、または、亜鉛の存在下または不在下で増殖させたTGF-β1発現ベクターpmTβ1で安定的にトランスフェクトさせたNIH 3T3細胞から総RNAを単離した。総RNA(15mg)をTGF-β1 cDNAまたは対照のβアクチンcDNAで探索した。図1Bおよび1Cは、NIH3T3-BMP2細胞中のBMP2の発現を示す。図1Bおよび1Cは、対照NIH3T3-メタロチオネイン(B)およびNIH3T3-BMP2細胞(C)を示す。パネルCの青色は、BMP2タンパク質の発現を示す。
図2A〜2Bは、再生した軟骨の肉眼所見を示す。図2Aは、大腿骨顆上に長方形の部分軟骨欠損を作り、TGF-β1トランスフェクションを行なわないNIH 3T3細胞を膝関節に注入したことを示す。欠損部は覆われていない状態であった。図2Bは、NIH 3T3-TGF-β1細胞の注入後6週間目に、欠損部が新たに形成された組織で覆われていたことを示す。再生した組織の色は、周囲の軟骨の色とほぼ同一であった。
図3A〜3Dは、再生した軟骨の顕微鏡所見を示す(X 200)。図3Aおよび3Bは、対照細胞の注入後4週間目と6週間目の欠損部のヘマトキシリン−エオジン(H＆E)分析を示す。初期欠損部は組織で覆われていなかった。図3Cおよび3Dは、TGF-β1トランスフェクト細胞の注入後4週間目と6週間目の欠損部のヘマトキシリン−エオジン(H&E)分析を示す。4週間目、部分欠損部は、TGF-β1トランスフェクト細胞の注入後、ヒアリン軟骨に覆われた。注入後4週間目および6週間目、再生した組織は、厚さを増し、その高さは、6週間目には、正常軟骨とほぼ同一であった。組織検査上、再生軟骨(矢印)は、周囲のヒアリン軟骨と同一であった。
図4A〜4Bは、ウサギの関節中のTGF-β1発現の免疫組織化学的検査を示す(x 200)。褐色のイムノパーオキシダーゼ反応生成物は、NIH 3T3-TGF-β1細胞中の高レベルの組換えTGF-β1の発現を表す(図4B)。図4Aは、対照細胞を注入したウサギの関節のヒアリン軟骨を示す。
図5A〜5Bは、Ｈ＆Ｅ染色(A)およびサフラニン-O染色(B)を行なった再生組織の顕微鏡所見(X 200)を示す。図5Aは、部分損傷部のそれを示し、H＆E染色によって再生ヒアリン軟骨が認められる(黒色矢印)。図5Bは、完全に露出した軟骨領域では、再生組織(白色矢印)が線維性コラーゲンであったことを示す。
図6A〜6F及び6A'〜6F'は、放射線照射NIH3T3-TGF-β1線維芽細胞による軟骨の再生を示す。
図7A〜7Hは、TGF-β1を産生するヒトの***線維芽細胞による軟骨の再生を示す。
図8Ａ〜8Hは、イヌモデルにおけるNIH3T3-TGF-β1細胞による軟骨の再生を示す。
図9A〜9Cは、TGF-β1産出線維芽細胞の注入後3週間目のTGF-β1抗体による再生軟骨の免疫組織化学染色を示す。
図10A〜10Eは、TGF-β1産生ヒト軟骨細胞による軟骨の再生を示す。
図11Ａ〜11Dは、部分欠損ウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-TGF-β1細胞)注入による軟骨の再生を示す。図11Aおよび11Cは、hChon(ヒト軟骨細胞)およびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)かhChon単独(C)の注入後6週間目の大腿骨顆図を示す。図11Bおよび11Dは、hChon(ヒト軟骨細胞)およびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(B)かhChon単独(D)を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
図12Ａ〜12Eは、全層欠損ウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-TGF-β1細胞)注入による軟骨の再生を示す。図12Aおよび12Dは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(A)かhChon単独(C)の注入後12週間目の大腿骨顆図を示す。図12Bおよび12Eは、hChonおよびNIH3T3-TGF-β1細胞の混合物(BおよびC)かhChon単独(E)を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示し、図12Cは、該切片のサフラニン-O染色を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
図13A〜13Dは、部分欠損ウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-BMP-2細胞)を注入した軟骨の再生を示す。図13Aおよび13Cは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)かhChon単独(C)の注入後6週間目の大腿骨顆図を示す。図13Bおよび13Dは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(B)かhChon単独(D)を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：（BおよびD）x 12.5]
図14A〜14Eは、全層欠損ウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびNIH3T3-BMP-2細胞)を注入した軟骨の再生を示す。図14Aおよび14Dは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(A)かhChon単独(D)の注入後12週間目の大腿骨顆図を示す。図14Bおよび14Eは、hChonおよびNIH3T3-BMP-2細胞の混合物(BおよびC)かhChon単独(E)を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示し、図14Cは、該切片のサフラニン-O染色を示す。[元の倍率：(B、CおよびE) x 12.5]
図15Ａ〜15Ｄは、全層欠損ウサギにおける混合細胞(ヒト軟骨細胞およびヒト軟骨-TGF-β1細胞)注入による軟骨の再生を示す。図15Aおよび15Cは、hChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物(A)かhChon単独(C)の注入後6週間目の大腿骨顆図を示す。図15Bおよび15Dは、hChonおよびｈChon-TGF-β1細胞の混合物(B)かhChon単独(D)を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
図16Ａ〜16Fは、部分欠損のウサギの膝関節におけるヒトバフィーコートおよびNIH3T3-TGF-β1細胞混合物の注入による軟骨の再生を示す。
図17A〜17Dは、部分欠損部(A)または全層欠損部(C)でのhChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物を注入後6週間目の大腿骨顆図を示す。図17Bおよび17Dは、部分欠損部(B)または全層欠損部(D)でのhChonおよびhChon-TGF-β1細胞の混合物を注入した大腿骨顆切片のマッソン三重染色を示す。[元の倍率：(BおよびD) x 12.5]
Claims (16)
- 治療有効量の、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属するサイトカインをコード化する治療遺伝子でトランスフェクトまたは形質導入した線維芽細胞または軟骨細胞と、接着有効量の精製されたバフィーコートを含むヒアリン軟骨生成用または骨関節炎治療用組成物。
- 前記治療遺伝子が、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成因子（ＢＭＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記線維芽細胞または軟骨細胞をＴＧＦ−β１またはＢＭＰ−２でトランスフェクトまたは形質導入することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- バフィーコート対細胞の量比が体積換算で１〜５対１であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記細胞に放射線照射することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記細胞をいずれかのＤＮＡでトランスフェクトまたは形質導入していない細胞と混合することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- ヒトを除く哺乳類の標的部位で遺伝子発現を限局させる方法で、接着有効量の精製されたバフィーコートをＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するサイトカインをコード化する治療遺伝子を含む組換えベクターでトランスフェクトまたは形質導入された線維芽細胞または軟骨細胞と混合し、ヒアリン軟骨生成用または骨関節炎治療用組成物を形成し、該組成物を関節腔に投与することを含む方法。
- 前記治療遺伝子がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成タンパク（ＢＭＰ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記細胞を放射線照射することを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記組成物が、さらにＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するサイトカインをコード化する治療遺伝子を含む組換えベクターでトランスフェクトまたは形質導入していない細胞を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記細胞を移植前に保存することを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記トランスフェクションまたは形質導入を、リポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在法またはウイルス介在法で実現することを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 哺乳類にヒアリン軟骨を生成する方法であり、
ａ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成因子（ＢＭＰ）をコード化するＤＮＡ配列を含む組換えベクターを生成し、
ｂ）試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、
ｃ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化するＤＮＡ配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内でヒアリン軟骨が生成するように、ヒアリン軟骨の生成に有効な量の（ｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、（ｉｉ）接着性に有効な量の精製されたバフィーコート、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なそのキャリア、
を含む注入可能な混合細胞組成物をヒトを除く哺乳類の関節腔に注入することを含むヒアリン軟骨生成方法。 - 哺乳類にヒアリン軟骨を生成する方法であり、
ａ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成因子（ＢＭＰ）をコード化するＤＮＡ配列を含む組換えベクターを生成し、
ｂ）試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、
ｃ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化するＤＮＡ配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内でヒアリン軟骨が生成するように、ヒアリン軟骨の生成に有効な量の（ｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、（ｉｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導していない繊維芽または軟骨細胞群、（ｉｉｉ）接着性に有効な量の精製されたバフィーコート、（ｉｖ）薬学的に許容可能なそのキャリア、
を含む注入可能な混合細胞組成物をヒトを除く哺乳類の関節腔に注入することを含むヒアリン軟骨生成方法。 - 骨関節炎を治療する方法であり、
ａ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成因子（ＢＭＰ）をコード化するＤＮＡ配列を含む組換えベクターを生成し、
ｂ）試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、
ｃ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化するＤＮＡ配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内で骨および軟骨が生成するように、骨生成および軟骨生成に有効な量の（ｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した繊維芽または軟骨細胞群、（ｉｉ）接着性に有効な量の精製されたバフィーコート、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なそのキャリア、
を含む注入可能な混合細胞組成物をヒトを除く哺乳類の関節腔に注入することを含む骨関節炎治療法。 - 骨関節炎を治療する方法であり、
ａ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）または骨形成因子（ＢＭＰ）をコード化するＤＮＡ配列を含む組換えベクターを生成し、
ｂ）試験管内で前記組換えベクターで線維芽または軟骨細胞群をトランスフェクトまたは形質導入し、
ｃ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化するＤＮＡ配列の関節腔内での発現が起こり、関節腔内で骨および軟骨の生成が生成するように、骨生成および軟骨生成に有効な量の（ｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導した線維芽または軟骨細胞群、（ｉｉ）ＴＧＦ−βまたはＢＭＰをコード化する遺伝子でトランスフェクトまたは形質誘導していない線維芽または軟骨細胞群、（ｉｉｉ）接着性に有効な量の精製されたバフィーコート、（ｉｖ）薬学的に許容可能なそのキャリア、
を含む注入可能な混合細胞組成物をヒトを除く哺乳類の関節腔に注入することを含む骨関節炎を治療する方法。
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