JP4447557B2 - ジペプチドの製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いたジペプチドの製造法に関する。
ジペプチドの製造法としては、天然物からの抽出法、化学合成法、酵素法が知られている。天然物からの抽出法は、生産できるジペプチドの種類が限られている上、天然物中に含まれる目的のジペプチドの含量が低く生産性が悪い。化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護、脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報および特開昭５９−１０６２９８号公報）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５７３８号、米国特許第５６５２１１６号］が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護、脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、副生物の生成反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法は、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であることから、効率的な製造法とはいえない。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する酵素としては、アスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンから、アスパルチルフェニルアラニンを生成する活性を有する酵素［Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．２０１−２１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）および特開昭６２−２０８２９７号公報］、および該酵素を生産する微生物の菌体を酵素源に用いたアスパルチルフェニルアラニンの製造法（特公平８−２２２３８号公報）は知られているが、該酵素がアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジン以外のジケトピペラジンからジペプチドを生成する活性、および該酵素を生産する微生物の菌体を酵素源に用いたアスパルチルフェニルアラニン以外のジペプチドの製造法については知られていない。
また、２つのグリシンが互いに縮合したジケトピペラジンからグリシルグリシンを生成する活性を有する酵素も知られている［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１５６７−１５７２（１９８５）］が、該酵素が２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生成する活性を有することは知られていない。
種々のジケトピペラジンを分解する能力を有する微生物は多数知られている［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ，，８９，６０２−６０５（２０００）、Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．１６７−１７１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８３，３８６−３８８（１９９７）、生物工学会誌，７９，７１−７７（２００１）］が、ジペプチドを生成する微生物は知られていない。
酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報および特開昭５９−１０６２９８号公報）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５７３８号、米国特許第５６５２１１６号］が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護、脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、副生物の生成反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法は、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であることから、効率的な製造法とはいえない。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する酵素としては、アスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンから、アスパルチルフェニルアラニンを生成する活性を有する酵素［Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．２０１−２１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）および特開昭６２−２０８２９７号公報］、および該酵素を生産する微生物の菌体を酵素源に用いたアスパルチルフェニルアラニンの製造法（特公平８−２２２３８号公報）は知られているが、該酵素がアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジン以外のジケトピペラジンからジペプチドを生成する活性、および該酵素を生産する微生物の菌体を酵素源に用いたアスパルチルフェニルアラニン以外のジペプチドの製造法については知られていない。
また、２つのグリシンが互いに縮合したジケトピペラジンからグリシルグリシンを生成する活性を有する酵素も知られている［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，１５６７−１５７２（１９８５）］が、該酵素が２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生成する活性を有することは知られていない。
種々のジケトピペラジンを分解する能力を有する微生物は多数知られている［Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ，，８９，６０２−６０５（２０００）、Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．１６７−１７１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８３，３８６−３８８（１９９７）、生物工学会誌，７９，７１−７７（２００１）］が、ジペプチドを生成する微生物は知られていない。
本発明の目的は、ジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、垓水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法（ただし、ジケトピペラジンがアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンであり、かつジペプチドがアスパルチルフェニルアラニンである場合を除く）。
（２） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、生産するジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が７０％以上の微生物である上記（１）の製造法。
（３） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、
［１］被験微生物を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する培地を用いて培養する工程、
［２］上記［１］の工程で生育が認められる微生物を選択する工程、
［３］上記［１］の工程で用いたジケトピペラジンと上記［２］の工程で選択した微生物とを水性媒体中に存在せしめたとき、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積する微生物を選択する工程、
を含む方法により得られる微生物である上記（１）または（２）の製造法。
（４） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、
［１］被験微生物を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する培地に培養する工程、
［２］上記［１］の工程で生育が認められる微生物を選択する工程、
［３］上記［１］の工程で用いたジケトピペラジンと上記［２］の工程で選択した微生物とを水性媒体中に存在せしめたとき、該水性媒体中に生成、蓄積するジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が７０％以上である微生物を選択する工程、
を含む方法により得られる微生物である上記（２）の製造法。
（５） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６） ミクロバクテリウム属に属する微生物がミクロバクテリウム ルテオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｏｒｕｍ）である上記（５）の製造法。
（７） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有するミクロバクテリウム属、シノリゾビウム属またはシュードモナス属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
（８） ミクロバクテリウム属に属する微生物が、ミクロバクテリウム ルテオラムである上記（７）の製造法。
（９） α−アミノ酸がアラニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチンからなる群より選ばれるα−アミノ酸である上記（１）〜（８）のいずれか１つの製造法。
（１０） ２種のα−アミノ酸がアラニンとグルタミンであり、ジペプチトがアラニルグルタミンである上記（１）〜（９）のいずれか１つの製造法。
（１１） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物または該菌体の固定化物、或いは該菌体の機械的破砕物または超音波処理物であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか１つの製造法。
（１２） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物であるミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３）、ミクロバクテリウム エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４）、シノリゾビウム エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０）、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１）およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２）。
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の方法で用いられるジケトピペラジン
本発明で用いられる１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンは、１種または異なる２つのα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンであればいずれでもよい。
α−アミノ酸としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得るα−アミノ酸であれば特に限定されないが、好ましいα−アミノ酸としては、Ｌ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体をあげることができ、より好ましくは、Ｌ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体をあげることができる。
好ましいＬ−α−アミノ酸およびＤ−α−アミノ酸としては、Ｌ体およびＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、オルニチンなどをあげることができる。
α−アミノ酸の誘導体としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得る誘導体であれば特に限定されないが、好ましい誘導体としてはＮ−メチルアミノ酸などをあげることができ、具体的には、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グルタミン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−プロリン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−セリン、Ｎ−メチル−スレオニン、Ｎ−メチル−システイン、Ｎ−メチル−アスパラギン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチル−アルギニン、Ｎ−メチル−ヒスチジン、Ｎ−メチル−アスパラギン酸およびＮ−メチル−オルニチンなどをあげることができる。
Ｌ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸およびグリシンの誘導体としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得る誘導体であれば特に限定されないが、好ましい誘導体としてはヒドロキシアミノ酸などをあげることができ、具体的には、β−ヒドロキシグルタミン、β−ヒドロキシグルタミン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、α−ヒドロキシグリシン、β−ヒドロキシバリン、γ−ヒドロキシバリン、β−ヒドロキシロイシン、γ−ヒドロキシロイシン、δ−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシイソロイシン、γ−ヒドロキシイソロイシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニン、β−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−ヒドロキシメチオニン、β−ヒドロキシセリン、γ−ヒドロキシスレオニン、Ｓ−ヒドロキシシステイン、β−ヒドロキシアスパラギン、β−ヒドロキシチロシン、β−ヒドロキシリジン、γ−ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリジン、Ｎ−ヒドロキシリジン、β−ヒドロキシアルギニン、δ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−ヒドロキシアルギニン、β−ヒドロキシヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、β−ヒドロキシオルニチン、γ−ヒドロキシオルニチンおよびＮ−ヒドロキシオルニチンなどをあげることができる。
上記したジケトピペラジンの製造法としては、化学合成法［Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，３，４５３−４６０（２００１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５８，３２９７−３３１２（２００２）など］、酵素法［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８，９９７−１０１０（２００１）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，１３５５−１３６４（２００２）など］等をあげることができる。
例えば、アラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）と称す］の化学合成法による製造法としては、以下の方法をあげることができる。
アラニルグルタミン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇ−１２１０）を２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、１．５当量のベンジルオキシカルボニルクロライドを添加してベンジルオキシカルボニル化アラニルグルタミン（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎと称す。）を生成させる。該溶液に濃塩酸を添加してｐＨ２とし、生成したＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎの結晶を取得する。該結晶をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド：酢酸エチル＝４：１の溶液に溶解した後、１当量のＮ−ヒドロキシサクシンイミドと１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加してサクシンイミド化Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕと称す）を生成させる。次に、該溶液を減圧濃縮してＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕの結晶を取得し、該結晶をメタノール：水＝９５：５の溶液に懸濁する。該溶液にパラジウムカーボンを添加して、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を生成させた後、減圧濃縮することでｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の結晶を取得することができる。
化学合成法、酵素法は、アミノ酸の官能基の保護と脱保護をする必要がないため、α−アミノ酸の構造に依存することなく、効率的にジケトピペラジンを製造することができる。
２．本発明の方法で用いられる微生物
本発明の方法で用いられる２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、自然界から分離された微生物、該微生物に薬剤や紫外線処理を施すことにより得られる変異株、細胞融合株または遺伝子組換え株などをあげることができる。
２種のα−アミノ酸としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得るα−アミノ酸であれば、特に制限されないが、好ましくはＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる異なる２つのα−アミノ酸をあげることができる。
好ましいＬ−α−アミノ酸およびＤ−α−アミノ酸、並びにＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸およびグリシンの誘導体としては、上記１のアミノ酸および誘導体をあげることができる。
本発明の方法で用いられる２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物としては、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンから生産されるジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％である微生物をあげることができる。ただし、Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．２０１−２１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）、および特開昭６２−２０８２９７号公報に記載の酵素を生産する微生物は、本発明の微生物に含まれない。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンから生産されるジペプチドに占める１種のジペプチドの割合とは、２種のα−アミノ酸をＡ、Ｂとし、ＡとＢが互いに縮合したジケトピペラジンから生成したジペプチドをＡ−Ｂ、およびＢ−Ａ（−はアミド結合を表す）としたとき、生成した総ジペプチド量（Ａ−Ｂ＋Ｂ−Ａ）に対するＡ−Ｂ、またはＢ−Ａの割合をいう。
本発明の方法で用いられる微生物は、例えば以下の方法により取得することができる。
約０．５〜５ｇの採取した土壌を滅菌水に懸濁し、該土壌懸濁液を室温で１０分間〜１時間穏やかに振盪してから、１〜３０分間静置した後、０．０５〜２ｍｌの上澄液を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する寒天培地（以下、ＤＫＰ含有寒天培地と称す）に塗布し、２５〜６０℃で１〜５日間培養してコロニーを形成させる。
上記で用いるジケトピペラジンは、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンであれば特に限定されないが、好ましくはＬ−α−アミノ酸が縮合したジケトピペラジン、より好ましくはＬ−アラニンとＬ−グルタミンが互いに縮合したジケトピペラジンをあげることができる。
上記で用いるＤＫＰ含有寒天培地は、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含む培地であり、かつジケトピペラジンを唯一の炭素源として用いる場合は窒素源および無機塩類を、ジケトピペラジンを唯一の窒素源として用いる場合は炭素源および無機塩類を含む培地であればいずれの培地であってもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノールプロパノール等のアルコール類であり、かつ窒素非含有の物質をあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩等をあげることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等をあげることができる。
次に、出現したコロニーを、ＤＫＰ含有寒天培地およびＤＫＰ含有寒天培地からジケトピペラジンを除いた寒天培地に塗布し、２５〜６０℃で１〜５日間培養する。ＤＫＰ含有寒天培地で生育し、ＤＫＰ含有寒天培地からジケトピペラジンを除いた寒天培地では生育しない菌株を選択することにより、該ジケトピペラジンを資化する能力を有する微生物を取得することができる。
上記で取得した菌株を合成寒天培地に塗布して２５〜６０℃で１〜５日間培養した後、生育した微生物の１白金耳量を上記で用いたジケトピペラジンを含有する液体培地に植菌し、２５〜６０℃で１〜５日間、振盪培養する。
培養終了後、培養液の上清を分析し、ジケトピペラジンが検出されない培養液を与える菌株を、ジケトピペラジンを分解する能力を有する菌株として選択する。培養液の上清の分析法は、用いたジケトピペラジンを検出することができる方法であれば、いずれの方法であってもよく、例えば高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などをあげることができる。
上記で選択した菌株を合成寒天培地に塗布して２５〜６０℃で１〜５日間培養した後、１〜５ｇ／ｌのジケトピペラジンを含有する液体培地に１白金耳量植菌し、２５〜６０℃で１〜５日間振盪培養する。培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水などを用いて菌体を洗浄する。洗浄菌体は、そのまま、あるいは一旦−８０℃で凍結保存し、融解してからその後の操作に用いることができる。
菌体を凍結した場合は、常温で融解した後、湿菌体量で５〜５０ｇ／ｌになるように、緩衝液に懸濁して、菌体懸濁液を調製する。緩衝液は、いずれの緩衝液でもよく、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液などをあげることができる。
該懸濁液には、生成するジペプチドの分解活性を阻害するために、金属イオン、キレート剤またはジペプチドアナログなどを添加してもよい。
該懸濁液に１〜５ｇ／ｌになるようにジケトピペラジンを添加して反応液を調製し、該反応液を２５〜６０℃で１〜２４時間、穏やかに振盪する。反応終了後、該反応液を遠心分離した後、上清を分析し、ジペプチドの生成を検出する。ジペプチドの生成、蓄積が検出される反応液を与える菌株を選択することにより、ジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物を取得することができる。
ジペプチドの検出法は、ジペプチドを検出することができる方法であればいずれでもよく、例えば上清に含有されるジペプチドを９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化した後にＨＰＬＣ分析する方法をあげることができる。
上記した方法により取得できる本発明の微生物としては、例えばミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物をあげることができ、ミクロバクテリウム属に属する微生物としてはミクロバクテリウム ルテオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｏｌｕｍ）をあげることができる。
本発明の微生物として、より具体的には、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１０７株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０８株、およびこれらの菌株の継代培養により得られる微生物、これらの菌株を用いて作製される細胞融合株、突然変異株などをあげることができる。
上記した株は、本発明者らが土壌から新たに分離した微生物である。以下に、各々の菌株の同定結果を示す。
土壌から分離されたＮｏ．９３およびＮｏ．１１９株は、形態観察の結果、いずれもグラム陽性桿菌であった。Ｎｏ．９３株およびＮｏ．１１９株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５，２１０−２１３（１９９２）に記載の１６Ｓ ｒＤＮＡユニバーサルプライマー２９ｆと１４９２ｒをプライマーセットとして用い、それぞれの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列を増幅、取得した。ＰＣＲ産物をＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（ファルマシア社製）を用いて精製し、塩基配列を決定した。
決定したＮｏ．９３株およびＮｏ．１１９株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列をそれぞれクエリーにしてＢｌａｓｔ検索を行なったところ、いずれもグラム陽性細菌であるアクチノバクテリア綱のミクロバクテリウム属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡと高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡデータベースから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して系統解析を行なった。ｒＲＮＡ分子の２次構造情報を加味した多重アライメントファイルとして取得した関連菌種の配列に対して、Ｎｏ．９３株およびＮｏ．１１９株の配列をマルチアライメント作成ソフトｃｌｕｓｔａｌＷ（ＥＭＢＬのｃｌｕｓｔａｌＷダウンロードサイトより入手）のｐｒｏｆｉｌｅアライメントメニューを用いて整列した。
作成されたアライメントを基にＰＨＹＬＩＰパッケージのｄｎａｄｉｓｔプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｌａｂのダウンロードサイトより入手）を用いて木村の２パラメーターに基づく各菌株間の遺伝距離を計算し、ｎｅｉｇｈｂｏｒプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｌａｂのダウンロードサイトより入手）を用いて近隣結合法による系統関係の推定を行なった。系統樹の描画は、ＮＪｐｌｏｔプログラム（Ｐｏｌｅ Ｂｉｏ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓのダウンロードサイトより入手）を用いて行なった。また、ＰＨＹＬＩＰパッケージのＳｅｑｂｏｏｔプログラムを用いて１００セットの再抽出を行ない、ブートストラップ検定法による系統樹の各分枝の信頼度を確認した。
その結果、両株ともミクロバクテリウム属のミクロバクテリウム ルテオラム、ミクロバクテリウム オキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｘｙｄａｎｓ）、およびミクロバクテリウム リケファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）と極めて近縁であることが示された。またＮｏ．９３株は、特にミクロバクテリウム ルテオラムの配列と類縁性が高く、そのクラスタリングは９３％のブートストラップ値で支持された。しかしながら、Ｎｏ．９３株を含めたこれら４菌株の系統距離は極めて短く、これら菌株群内の正確な系統関係を解析することは困難であった。
そこで、これら３菌種とＮｏ．９３株の種レベルの分類学的関係を明確にするために、ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑実験を実施した。供試株としてはＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム ルテオラム、ミクロバクテリウム オキシダンス、およびミクロバクテリウム リケファシエンスの各基準株［それぞれ（財）醗酵研究所ＩＦＯ１５７４株、ＩＦＯ１５５８６株、ＩＦＯ１５０３７株］、陰性対照としてコリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株を用いた。各菌株から公知の方法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ハイドロキシアパタイトを用いて精製したＤＮＡを実験に用いた。
ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑実験の結果、Ｎｏ．９３株はミクロバクテリウム ルテオラムの基準株であるＩＦＯ１５０７４株と９７％以上の高いＤＮＡ／ＤＮＡ相同性を示した。また、１６Ｓ ｒＤＮＡ系統解析の結果、同様に近縁性が示されていたミクロバクテリウム オキシダンス、ミクロバクテリウム リケファシエンスの基準株との間にも比較的高いＤＮＮ／ＤＮＡ相同性を示したが、その値は５０〜６０％と近縁異種の菌株間に観察されるＤＮＡ／ＤＮＡ相同値と同等であった。
以上の結果から、Ｎｏ．９３株をミクロバクテリウム ルテオラ厶、Ｎｏ．１１９株をミクロバクテリウム エスピーであると同定した。
土壌から分離したＮｏ．１株およびＮｏ．１６４株は、形態観察の結果、グラム陰性の桿菌であった。Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株より調製したゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にして、上記した方法と同様の方法により、各々の株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列の塩基配列を決定し、Ｂｌａｓｔ検索に供したところ、αプロテオバクテリアのシノリゾビウム属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して、上記と同様の方法で系統解析を行なった。その結果、両株とも、シノリゾビウム属の菌株と系統群を形成し、シノリゾビウム モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）およびエンシファー アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に極めて近縁であった。エンシファー属は、シノリゾビウム属としてまとめられるべきであるとの勧告が国際微生物学連盟の原核微生物分類委員会に提言されている［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｎｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２，２３３７（２００２）］。
以上の系統解析結果と原核生物分類委員会の見解に基づき、Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株をシノリゾビウム エスピーと同定した。
土壌から分離したＮｏ．１０７株およびＮｏ．１０８株は、形態観察の結果、グラム陰性の桿菌であった。Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株より調製したゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にして、上記した方法と同様の方法により、各々の株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列の塩基配列を決定し、Ｂｌａｓｔ検索に供したところ、γプロテオバクテリアのシュードモナス属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して、上記と同様の方法で系統解析を行なった。その結果、両株とも、シュードモナス属の菌株と系統群を形成し、特にシュードモナス グラミニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）と極めて近縁であった。
以上の系統解析結果から、Ｎｏ．１０７株およびＮｏ．１０８株をシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）と同定した。
ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株は、ブタペスト条約に基づいて平成１５年１０月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１およびＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２として寄託されている。
３．本発明の製造法
本発明の製造法は、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法に関する。ただし、上記においてジケトピペラジンがアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンであり、かつジペプチドがアスパルチルフェニルアラニンである製造法は本発明に含まれない。好ましくは、上記においてジケトピペラジンがグリシンが互いに縮合したジケトピペラジンである製造法もまた本発明に含まれない。
また、本発明の製造法は、ミクロバクテリウム属、シノリゾビウム属またはシュードモナス属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法に関する。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物、ミクロバクテリウム属に属する微生物、シノリゾビウム属に属する微生物、およびシュードモナス属に属する微生物の培養は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物、ミクロバクテリウム属に属する微生物、シノリゾビウム属に属する微生物、およびシュードモナス属に属する微生物としては、上記２の微生物をあげることができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜６０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは４〜１０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物および該菌体の固定化物などの生菌体を含む処理物、並びに該菌体の機械的破砕物および超音波処理物などの粗酵素抽出物を含む処理物などをあげることができる。
ジペプチドの生成反応に用いられる酵素源は、特定のジケトピペラジンから３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのジペプチドを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
基質である１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンは、１〜５００ｇ／ｌの濃度で用いる。
ジペプチドの生成反応に用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ジペプチドの生成反応において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウ厶・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、各種ジペプチドの生成反応を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ジペプチドの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜６０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてジペプチドの分解を抑制するために塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）等の無機塩、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ベスタチン等のジペプチド分解活性の阻害物質などを添加することができる。
水性媒体中に生成したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の単離および精製方法によって行うことができる。
４．本発明の微生物
本発明の微生物としては、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３）、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０）、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１）およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２）をあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例で用いたアラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）と称す］は以下の方法により調製した。
５０ｇのＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇ−１２１０）を２００ｍｌの２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液に溶解した後、５１ｇのベンジルオキシカルボニルクロライドと１５０ｍｌの２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加して室温で２時間攪拌した。該溶液に濃塩酸を加えてｐＨ２とすることにより、ベンジルオキシカルボニル化アラニルグルタミン（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎと称す）の結晶８５ｇを取得し、乾燥させた。
次に、３５ｇのＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎの結晶を、２００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド：酢酸エチル＝４：１の溶液に溶解した後、１２ｇのＮ−ヒドロキシサクシンイミドを添加した。さらに２２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した後、５０ｍｌの酢酸エチルを添加して室温で１２時間攪拌した。該溶液に１ｍｌの酢酸を添加した後、濾過し、得られた濾液を減圧濃縮してサクシンイミド化Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕと称す）の結晶３０ｇを取得した。
該結晶をイソプロピルアルコールで洗浄し、乾燥して得られた２３ｇのＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕの結晶を、３００ｍｌの９５％メタノール水溶液に懸濁し、５００ｍｇのパラジウムカーボンを添加して室温で１２時間攪拌した。該溶液に１００ｍｌの水を加えた後、濾過し、得られた濾液を減圧濃縮して結晶を取得した。該結晶を２００ｍｌのメタノールと３０ｍｌのトリエチルアミンからなる溶液に懸濁して室温で１２時間攪拌した。該溶液を濾過して得られた結晶を、メタノールで洗浄した後、乾燥し、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の結晶８ｇを取得した。
また、ジケトピペラジンおよびジペプチドの分析、定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、以下の方法により行った。
ジケトピペラジンは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン交換カラム（７．８ｍｍＩＤ×３００ｍｍ、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて分析、定量した。移動相には５ｍｍｏｌ／ｌの硫酸とアセトニトリルを７：３で混合した溶液を用いた。移動相の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は６０℃、検出波長はＵＶ２５０ｎｍである。
ジペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。ＦＭＯＣ誘導体化は、１００ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈した試料に、等容量の６ｍｍｏｌ／ｌのクロロギ酸９−フルオレニルメチル（ＦＭＯＣ−Ｃｌ）アセトン溶液を加え、室温で４０分間静置することにより行った。
次に、該混合溶液に１．２５倍容量のヘキサンを加え激しく攪拌した後、上層のヘキサン層を取り除く操作を２回繰り返し、残った下層に等容量の２５０ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ５．５）とアセトニトリルの３：１の混合液を加え、ＦＭＯＣ化試料とした。
該ＦＭＯＣ化試料を、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、野村化学社製）を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、ジペプチドおよび試料に含有される不純物の種類により、下記の条件（１）または条件（２）を用いた。
条件（１）
移動相には、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５。アンモニア水でｐＨ調整）とメタノールの混合比が１７：３の移動相Ａとアセトニトリルと水の混合比が９：１の移動相Ｂを用いた。移動相の流速は１ｍｌ／分、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、０分のとき８２：１８であり、その後３０分かけて、１：９９まで直線的に変化させた。カラム温度は４０℃、励起波長２５４ｎｍ、検出波長６３０ｎｍの蛍光検出で測定した。
条件（２）
移動相には、６ｍｌ／ｌ酢酸溶液（ｐＨ３．６。トリエチルアミンでｐＨ調整）とアセトニトリルの混合比が８：２の移動相Ｃと６ｍｌ／ｌ酢酸溶液（ｐＨ３．６。トリエチルアミンでｐＨ調整）とアセトニトリルの混合比が３：７の移動相Ｄを用いた。移動相の流速は１ｍｌ／分、移動相Ｃと移動相Ｄの混合比は、０分のとき８５：１５であり、その後２５分かけて、０：１００まで直線的に変化させた。カラム温度は４０℃、励起波長２５４ｎｍ、検出波長６３０ｎｍの蛍光検出で測定した。
本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、垓水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法（ただし、ジケトピペラジンがアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンであり、かつジペプチドがアスパルチルフェニルアラニンである場合を除く）。
（２） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、生産するジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が７０％以上の微生物である上記（１）の製造法。
（３） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、
［１］被験微生物を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する培地を用いて培養する工程、
［２］上記［１］の工程で生育が認められる微生物を選択する工程、
［３］上記［１］の工程で用いたジケトピペラジンと上記［２］の工程で選択した微生物とを水性媒体中に存在せしめたとき、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積する微生物を選択する工程、
を含む方法により得られる微生物である上記（１）または（２）の製造法。
（４） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、
［１］被験微生物を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する培地に培養する工程、
［２］上記［１］の工程で生育が認められる微生物を選択する工程、
［３］上記［１］の工程で用いたジケトピペラジンと上記［２］の工程で選択した微生物とを水性媒体中に存在せしめたとき、該水性媒体中に生成、蓄積するジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が７０％以上である微生物を選択する工程、
を含む方法により得られる微生物である上記（２）の製造法。
（５） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物が、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６） ミクロバクテリウム属に属する微生物がミクロバクテリウム ルテオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｏｒｕｍ）である上記（５）の製造法。
（７） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有するミクロバクテリウム属、シノリゾビウム属またはシュードモナス属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
（８） ミクロバクテリウム属に属する微生物が、ミクロバクテリウム ルテオラムである上記（７）の製造法。
（９） α−アミノ酸がアラニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびオルニチンからなる群より選ばれるα−アミノ酸である上記（１）〜（８）のいずれか１つの製造法。
（１０） ２種のα−アミノ酸がアラニンとグルタミンであり、ジペプチトがアラニルグルタミンである上記（１）〜（９）のいずれか１つの製造法。
（１１） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物または該菌体の固定化物、或いは該菌体の機械的破砕物または超音波処理物であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか１つの製造法。
（１２） ２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物であるミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３）、ミクロバクテリウム エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４）、シノリゾビウム エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０）、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１）およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２）。
以下に本発明を詳細に説明する。
１．本発明の方法で用いられるジケトピペラジン
本発明で用いられる１種または２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンは、１種または異なる２つのα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンであればいずれでもよい。
α−アミノ酸としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得るα−アミノ酸であれば特に限定されないが、好ましいα−アミノ酸としては、Ｌ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体をあげることができ、より好ましくは、Ｌ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体をあげることができる。
好ましいＬ−α−アミノ酸およびＤ−α−アミノ酸としては、Ｌ体およびＤ体のアラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、オルニチンなどをあげることができる。
α−アミノ酸の誘導体としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得る誘導体であれば特に限定されないが、好ましい誘導体としてはＮ−メチルアミノ酸などをあげることができ、具体的には、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グルタミン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−プロリン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−セリン、Ｎ−メチル−スレオニン、Ｎ−メチル−システイン、Ｎ−メチル−アスパラギン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチル−アルギニン、Ｎ−メチル−ヒスチジン、Ｎ−メチル−アスパラギン酸およびＮ−メチル−オルニチンなどをあげることができる。
Ｌ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸およびグリシンの誘導体としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得る誘導体であれば特に限定されないが、好ましい誘導体としてはヒドロキシアミノ酸などをあげることができ、具体的には、β−ヒドロキシグルタミン、β−ヒドロキシグルタミン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、α−ヒドロキシグリシン、β−ヒドロキシバリン、γ−ヒドロキシバリン、β−ヒドロキシロイシン、γ−ヒドロキシロイシン、δ−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシイソロイシン、γ−ヒドロキシイソロイシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニン、β−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−ヒドロキシメチオニン、β−ヒドロキシセリン、γ−ヒドロキシスレオニン、Ｓ−ヒドロキシシステイン、β−ヒドロキシアスパラギン、β−ヒドロキシチロシン、β−ヒドロキシリジン、γ−ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリジン、Ｎ−ヒドロキシリジン、β−ヒドロキシアルギニン、δ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−ヒドロキシアルギニン、β−ヒドロキシヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、β−ヒドロキシオルニチン、γ−ヒドロキシオルニチンおよびＮ−ヒドロキシオルニチンなどをあげることができる。
上記したジケトピペラジンの製造法としては、化学合成法［Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，３，４５３−４６０（２００１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５８，３２９７−３３１２（２００２）など］、酵素法［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８，９９７−１０１０（２００１）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，１３５５−１３６４（２００２）など］等をあげることができる。
例えば、アラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）と称す］の化学合成法による製造法としては、以下の方法をあげることができる。
アラニルグルタミン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇ−１２１０）を２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、１．５当量のベンジルオキシカルボニルクロライドを添加してベンジルオキシカルボニル化アラニルグルタミン（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎと称す。）を生成させる。該溶液に濃塩酸を添加してｐＨ２とし、生成したＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎの結晶を取得する。該結晶をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド：酢酸エチル＝４：１の溶液に溶解した後、１当量のＮ−ヒドロキシサクシンイミドと１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加してサクシンイミド化Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕと称す）を生成させる。次に、該溶液を減圧濃縮してＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕの結晶を取得し、該結晶をメタノール：水＝９５：５の溶液に懸濁する。該溶液にパラジウムカーボンを添加して、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を生成させた後、減圧濃縮することでｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の結晶を取得することができる。
化学合成法、酵素法は、アミノ酸の官能基の保護と脱保護をする必要がないため、α−アミノ酸の構造に依存することなく、効率的にジケトピペラジンを製造することができる。
２．本発明の方法で用いられる微生物
本発明の方法で用いられる２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、自然界から分離された微生物、該微生物に薬剤や紫外線処理を施すことにより得られる変異株、細胞融合株または遺伝子組換え株などをあげることができる。
２種のα−アミノ酸としては、互いに縮合してジケトピペラジン構造を取り得るα−アミノ酸であれば、特に制限されないが、好ましくはＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸、グリシンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる異なる２つのα−アミノ酸をあげることができる。
好ましいＬ−α−アミノ酸およびＤ−α−アミノ酸、並びにＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ酸およびグリシンの誘導体としては、上記１のアミノ酸および誘導体をあげることができる。
本発明の方法で用いられる２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物としては、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンから生産されるジペプチドに占める１種のジペプチドの割合が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％である微生物をあげることができる。ただし、Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，ｐ．２０１−２１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９８）、および特開昭６２−２０８２９７号公報に記載の酵素を生産する微生物は、本発明の微生物に含まれない。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンから生産されるジペプチドに占める１種のジペプチドの割合とは、２種のα−アミノ酸をＡ、Ｂとし、ＡとＢが互いに縮合したジケトピペラジンから生成したジペプチドをＡ−Ｂ、およびＢ−Ａ（−はアミド結合を表す）としたとき、生成した総ジペプチド量（Ａ−Ｂ＋Ｂ−Ａ）に対するＡ−Ｂ、またはＢ−Ａの割合をいう。
本発明の方法で用いられる微生物は、例えば以下の方法により取得することができる。
約０．５〜５ｇの採取した土壌を滅菌水に懸濁し、該土壌懸濁液を室温で１０分間〜１時間穏やかに振盪してから、１〜３０分間静置した後、０．０５〜２ｍｌの上澄液を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含有する寒天培地（以下、ＤＫＰ含有寒天培地と称す）に塗布し、２５〜６０℃で１〜５日間培養してコロニーを形成させる。
上記で用いるジケトピペラジンは、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンであれば特に限定されないが、好ましくはＬ−α−アミノ酸が縮合したジケトピペラジン、より好ましくはＬ−アラニンとＬ−グルタミンが互いに縮合したジケトピペラジンをあげることができる。
上記で用いるＤＫＰ含有寒天培地は、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンを唯一の炭素源または窒素源として含む培地であり、かつジケトピペラジンを唯一の炭素源として用いる場合は窒素源および無機塩類を、ジケトピペラジンを唯一の窒素源として用いる場合は炭素源および無機塩類を含む培地であればいずれの培地であってもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノールプロパノール等のアルコール類であり、かつ窒素非含有の物質をあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩等をあげることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等をあげることができる。
次に、出現したコロニーを、ＤＫＰ含有寒天培地およびＤＫＰ含有寒天培地からジケトピペラジンを除いた寒天培地に塗布し、２５〜６０℃で１〜５日間培養する。ＤＫＰ含有寒天培地で生育し、ＤＫＰ含有寒天培地からジケトピペラジンを除いた寒天培地では生育しない菌株を選択することにより、該ジケトピペラジンを資化する能力を有する微生物を取得することができる。
上記で取得した菌株を合成寒天培地に塗布して２５〜６０℃で１〜５日間培養した後、生育した微生物の１白金耳量を上記で用いたジケトピペラジンを含有する液体培地に植菌し、２５〜６０℃で１〜５日間、振盪培養する。
培養終了後、培養液の上清を分析し、ジケトピペラジンが検出されない培養液を与える菌株を、ジケトピペラジンを分解する能力を有する菌株として選択する。培養液の上清の分析法は、用いたジケトピペラジンを検出することができる方法であれば、いずれの方法であってもよく、例えば高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などをあげることができる。
上記で選択した菌株を合成寒天培地に塗布して２５〜６０℃で１〜５日間培養した後、１〜５ｇ／ｌのジケトピペラジンを含有する液体培地に１白金耳量植菌し、２５〜６０℃で１〜５日間振盪培養する。培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を回収し、生理食塩水などを用いて菌体を洗浄する。洗浄菌体は、そのまま、あるいは一旦−８０℃で凍結保存し、融解してからその後の操作に用いることができる。
菌体を凍結した場合は、常温で融解した後、湿菌体量で５〜５０ｇ／ｌになるように、緩衝液に懸濁して、菌体懸濁液を調製する。緩衝液は、いずれの緩衝液でもよく、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液などをあげることができる。
該懸濁液には、生成するジペプチドの分解活性を阻害するために、金属イオン、キレート剤またはジペプチドアナログなどを添加してもよい。
該懸濁液に１〜５ｇ／ｌになるようにジケトピペラジンを添加して反応液を調製し、該反応液を２５〜６０℃で１〜２４時間、穏やかに振盪する。反応終了後、該反応液を遠心分離した後、上清を分析し、ジペプチドの生成を検出する。ジペプチドの生成、蓄積が検出される反応液を与える菌株を選択することにより、ジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物を取得することができる。
ジペプチドの検出法は、ジペプチドを検出することができる方法であればいずれでもよく、例えば上清に含有されるジペプチドを９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化した後にＨＰＬＣ分析する方法をあげることができる。
上記した方法により取得できる本発明の微生物としては、例えばミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物をあげることができ、ミクロバクテリウム属に属する微生物としてはミクロバクテリウム ルテオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｏｌｕｍ）をあげることができる。
本発明の微生物として、より具体的には、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１０７株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０８株、およびこれらの菌株の継代培養により得られる微生物、これらの菌株を用いて作製される細胞融合株、突然変異株などをあげることができる。
上記した株は、本発明者らが土壌から新たに分離した微生物である。以下に、各々の菌株の同定結果を示す。
土壌から分離されたＮｏ．９３およびＮｏ．１１９株は、形態観察の結果、いずれもグラム陽性桿菌であった。Ｎｏ．９３株およびＮｏ．１１９株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５，２１０−２１３（１９９２）に記載の１６Ｓ ｒＤＮＡユニバーサルプライマー２９ｆと１４９２ｒをプライマーセットとして用い、それぞれの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列を増幅、取得した。ＰＣＲ産物をＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（ファルマシア社製）を用いて精製し、塩基配列を決定した。
決定したＮｏ．９３株およびＮｏ．１１９株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列をそれぞれクエリーにしてＢｌａｓｔ検索を行なったところ、いずれもグラム陽性細菌であるアクチノバクテリア綱のミクロバクテリウム属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡと高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡデータベースから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して系統解析を行なった。ｒＲＮＡ分子の２次構造情報を加味した多重アライメントファイルとして取得した関連菌種の配列に対して、Ｎｏ．９３株およびＮｏ．１１９株の配列をマルチアライメント作成ソフトｃｌｕｓｔａｌＷ（ＥＭＢＬのｃｌｕｓｔａｌＷダウンロードサイトより入手）のｐｒｏｆｉｌｅアライメントメニューを用いて整列した。
作成されたアライメントを基にＰＨＹＬＩＰパッケージのｄｎａｄｉｓｔプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｌａｂのダウンロードサイトより入手）を用いて木村の２パラメーターに基づく各菌株間の遺伝距離を計算し、ｎｅｉｇｈｂｏｒプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｌａｂのダウンロードサイトより入手）を用いて近隣結合法による系統関係の推定を行なった。系統樹の描画は、ＮＪｐｌｏｔプログラム（Ｐｏｌｅ Ｂｉｏ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓのダウンロードサイトより入手）を用いて行なった。また、ＰＨＹＬＩＰパッケージのＳｅｑｂｏｏｔプログラムを用いて１００セットの再抽出を行ない、ブートストラップ検定法による系統樹の各分枝の信頼度を確認した。
その結果、両株ともミクロバクテリウム属のミクロバクテリウム ルテオラム、ミクロバクテリウム オキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｘｙｄａｎｓ）、およびミクロバクテリウム リケファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）と極めて近縁であることが示された。またＮｏ．９３株は、特にミクロバクテリウム ルテオラムの配列と類縁性が高く、そのクラスタリングは９３％のブートストラップ値で支持された。しかしながら、Ｎｏ．９３株を含めたこれら４菌株の系統距離は極めて短く、これら菌株群内の正確な系統関係を解析することは困難であった。
そこで、これら３菌種とＮｏ．９３株の種レベルの分類学的関係を明確にするために、ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑実験を実施した。供試株としてはＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム ルテオラム、ミクロバクテリウム オキシダンス、およびミクロバクテリウム リケファシエンスの各基準株［それぞれ（財）醗酵研究所ＩＦＯ１５７４株、ＩＦＯ１５５８６株、ＩＦＯ１５０３７株］、陰性対照としてコリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株を用いた。各菌株から公知の方法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ハイドロキシアパタイトを用いて精製したＤＮＡを実験に用いた。
ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑実験の結果、Ｎｏ．９３株はミクロバクテリウム ルテオラムの基準株であるＩＦＯ１５０７４株と９７％以上の高いＤＮＡ／ＤＮＡ相同性を示した。また、１６Ｓ ｒＤＮＡ系統解析の結果、同様に近縁性が示されていたミクロバクテリウム オキシダンス、ミクロバクテリウム リケファシエンスの基準株との間にも比較的高いＤＮＮ／ＤＮＡ相同性を示したが、その値は５０〜６０％と近縁異種の菌株間に観察されるＤＮＡ／ＤＮＡ相同値と同等であった。
以上の結果から、Ｎｏ．９３株をミクロバクテリウム ルテオラ厶、Ｎｏ．１１９株をミクロバクテリウム エスピーであると同定した。
土壌から分離したＮｏ．１株およびＮｏ．１６４株は、形態観察の結果、グラム陰性の桿菌であった。Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株より調製したゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にして、上記した方法と同様の方法により、各々の株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列の塩基配列を決定し、Ｂｌａｓｔ検索に供したところ、αプロテオバクテリアのシノリゾビウム属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して、上記と同様の方法で系統解析を行なった。その結果、両株とも、シノリゾビウム属の菌株と系統群を形成し、シノリゾビウム モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）およびエンシファー アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に極めて近縁であった。エンシファー属は、シノリゾビウム属としてまとめられるべきであるとの勧告が国際微生物学連盟の原核微生物分類委員会に提言されている［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｎｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２，２３３７（２００２）］。
以上の系統解析結果と原核生物分類委員会の見解に基づき、Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株をシノリゾビウム エスピーと同定した。
土壌から分離したＮｏ．１０７株およびＮｏ．１０８株は、形態観察の結果、グラム陰性の桿菌であった。Ｎｏ．１株およびＮｏ．１６４株より調製したゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型にして、上記した方法と同様の方法により、各々の株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分配列の塩基配列を決定し、Ｂｌａｓｔ検索に供したところ、γプロテオバクテリアのシュードモナス属に属する微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と高い相同性を有することが確認された。そこで、ｒＲＮＡ ｄａｔａｂａｓｅから関連菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を取得して、上記と同様の方法で系統解析を行なった。その結果、両株とも、シュードモナス属の菌株と系統群を形成し、特にシュードモナス グラミニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）と極めて近縁であった。
以上の系統解析結果から、Ｎｏ．１０７株およびＮｏ．１０８株をシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）と同定した。
ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株は、ブタペスト条約に基づいて平成１５年１０月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１およびＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２として寄託されている。
３．本発明の製造法
本発明の製造法は、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法に関する。ただし、上記においてジケトピペラジンがアスパラギン酸とフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジンであり、かつジペプチドがアスパルチルフェニルアラニンである製造法は本発明に含まれない。好ましくは、上記においてジケトピペラジンがグリシンが互いに縮合したジケトピペラジンである製造法もまた本発明に含まれない。
また、本発明の製造法は、ミクロバクテリウム属、シノリゾビウム属またはシュードモナス属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法に関する。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物、ミクロバクテリウム属に属する微生物、シノリゾビウム属に属する微生物、およびシュードモナス属に属する微生物の培養は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物、ミクロバクテリウム属に属する微生物、シノリゾビウム属に属する微生物、およびシュードモナス属に属する微生物としては、上記２の微生物をあげることができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜６０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは４〜１０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物および該菌体の固定化物などの生菌体を含む処理物、並びに該菌体の機械的破砕物および超音波処理物などの粗酵素抽出物を含む処理物などをあげることができる。
ジペプチドの生成反応に用いられる酵素源は、特定のジケトピペラジンから３０℃で１分間に１ｍｍｏｌのジペプチドを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
基質である１種もしくは２種のα−アミノ酸またはその誘導体が互いに縮合したジケトピペラジンは、１〜５００ｇ／ｌの濃度で用いる。
ジペプチドの生成反応に用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ジペプチドの生成反応において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウ厶・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、各種ジペプチドの生成反応を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ジペプチドの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜６０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてジペプチドの分解を抑制するために塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）等の無機塩、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ベスタチン等のジペプチド分解活性の阻害物質などを添加することができる。
水性媒体中に生成したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の単離および精製方法によって行うことができる。
４．本発明の微生物
本発明の微生物としては、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１３）、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１４）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０９）、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１０）、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１１）およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５１２）をあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例で用いたアラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）と称す］は以下の方法により調製した。
５０ｇのＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇ−１２１０）を２００ｍｌの２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液に溶解した後、５１ｇのベンジルオキシカルボニルクロライドと１５０ｍｌの２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加して室温で２時間攪拌した。該溶液に濃塩酸を加えてｐＨ２とすることにより、ベンジルオキシカルボニル化アラニルグルタミン（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎと称す）の結晶８５ｇを取得し、乾燥させた。
次に、３５ｇのＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎの結晶を、２００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド：酢酸エチル＝４：１の溶液に溶解した後、１２ｇのＮ−ヒドロキシサクシンイミドを添加した。さらに２２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した後、５０ｍｌの酢酸エチルを添加して室温で１２時間攪拌した。該溶液に１ｍｌの酢酸を添加した後、濾過し、得られた濾液を減圧濃縮してサクシンイミド化Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（以下、Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕと称す）の結晶３０ｇを取得した。
該結晶をイソプロピルアルコールで洗浄し、乾燥して得られた２３ｇのＺ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＮＳｕの結晶を、３００ｍｌの９５％メタノール水溶液に懸濁し、５００ｍｇのパラジウムカーボンを添加して室温で１２時間攪拌した。該溶液に１００ｍｌの水を加えた後、濾過し、得られた濾液を減圧濃縮して結晶を取得した。該結晶を２００ｍｌのメタノールと３０ｍｌのトリエチルアミンからなる溶液に懸濁して室温で１２時間攪拌した。該溶液を濾過して得られた結晶を、メタノールで洗浄した後、乾燥し、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の結晶８ｇを取得した。
また、ジケトピペラジンおよびジペプチドの分析、定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、以下の方法により行った。
ジケトピペラジンは、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン交換カラム（７．８ｍｍＩＤ×３００ｍｍ、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて分析、定量した。移動相には５ｍｍｏｌ／ｌの硫酸とアセトニトリルを７：３で混合した溶液を用いた。移動相の流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は６０℃、検出波長はＵＶ２５０ｎｍである。
ジペプチドは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。ＦＭＯＣ誘導体化は、１００ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈した試料に、等容量の６ｍｍｏｌ／ｌのクロロギ酸９−フルオレニルメチル（ＦＭＯＣ−Ｃｌ）アセトン溶液を加え、室温で４０分間静置することにより行った。
次に、該混合溶液に１．２５倍容量のヘキサンを加え激しく攪拌した後、上層のヘキサン層を取り除く操作を２回繰り返し、残った下層に等容量の２５０ｍｍｏｌ／ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ５．５）とアセトニトリルの３：１の混合液を加え、ＦＭＯＣ化試料とした。
該ＦＭＯＣ化試料を、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、野村化学社製）を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、ジペプチドおよび試料に含有される不純物の種類により、下記の条件（１）または条件（２）を用いた。
条件（１）
移動相には、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５。アンモニア水でｐＨ調整）とメタノールの混合比が１７：３の移動相Ａとアセトニトリルと水の混合比が９：１の移動相Ｂを用いた。移動相の流速は１ｍｌ／分、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、０分のとき８２：１８であり、その後３０分かけて、１：９９まで直線的に変化させた。カラム温度は４０℃、励起波長２５４ｎｍ、検出波長６３０ｎｍの蛍光検出で測定した。
条件（２）
移動相には、６ｍｌ／ｌ酢酸溶液（ｐＨ３．６。トリエチルアミンでｐＨ調整）とアセトニトリルの混合比が８：２の移動相Ｃと６ｍｌ／ｌ酢酸溶液（ｐＨ３．６。トリエチルアミンでｐＨ調整）とアセトニトリルの混合比が３：７の移動相Ｄを用いた。移動相の流速は１ｍｌ／分、移動相Ｃと移動相Ｄの混合比は、０分のとき８５：１５であり、その後２５分かけて、０：１００まで直線的に変化させた。カラム温度は４０℃、励起波長２５４ｎｍ、検出波長６３０ｎｍの蛍光検出で測定した。
ジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の取得
（１）：ジケトピペラジンを資化する能力を有する微生物のスクリーニング
土壌を採取し、約２ｇの該土壌を滅菌水１０ｍｌに懸濁した。該土壌懸濁液を室温で３０分間穏やかに振盪し、１０分間静置した後、０．１ｍｌの上澄液を、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）２ｇ／ｌを唯一の炭素源として含有する寒天培地Ａ〔硝酸アンモニウム２．５ｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．５ｇ／ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．１ｇ／ｌ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）０．１ｇ／ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．８８ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）０．３９３ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）０．０７２ｍｇ／ｌ、ホウ砂（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）０．０８８ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム［（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ］０．０３７ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸０．００１ｍｇ／ｌ、リボフラビン０．００２ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウ厶０．００２ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸０．００２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．０００１ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．００１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸０．００２ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２〕に塗布し、３０℃で２日間培養してコロニーを形成させた。該コロニーを、２ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む寒天培地Ａ、およびｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含まない寒天培地Ａに塗布し、３０℃で２日間培養した。ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む寒天培地Ａで生育し、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含まない寒天培地Ａでは生育しない菌株を選択した。
上記で選択した菌株を寒天培地Ｂ［普通ブイヨン培地（極東製薬工業社製）２０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２］に塗布して３０℃で１日間培養した後、液体培地Ａ〔グルコース２ｇ／ｌ、硝酸アンモニウム２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ／ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ）１０ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム［（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ］０．０３７ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．８８ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）０．３９３ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ）０．７２ｍｇ／ｌ、ホウ砂（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）０．０８８ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸０．００１ｍｇ／ｌ、リボフラビン０．００２ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．００２ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸０．００２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．０００１ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．００１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸０．００２ｍｇ／ｌ〕に２ｇ／ｌとなるようにｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を添加した４０ｍｌの培養液に、出現したコロニーの１白金耳分を植菌し、３００ｍｌ容のフラスコを用いて３０℃で１日間、振盪培養した。
培養上清をＨＰＬＣにて分析し、培養液中にｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）が残存していなかった菌株を、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を資化する能力を有する菌株として選択した。
（１）：ジケトピペラジンを資化する能力を有する微生物のスクリーニング
土壌を採取し、約２ｇの該土壌を滅菌水１０ｍｌに懸濁した。該土壌懸濁液を室温で３０分間穏やかに振盪し、１０分間静置した後、０．１ｍｌの上澄液を、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）２ｇ／ｌを唯一の炭素源として含有する寒天培地Ａ〔硝酸アンモニウム２．５ｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．５ｇ／ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．１ｇ／ｌ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）０．１ｇ／ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．８８ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）０．３９３ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）０．０７２ｍｇ／ｌ、ホウ砂（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）０．０８８ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム［（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ］０．０３７ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸０．００１ｍｇ／ｌ、リボフラビン０．００２ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウ厶０．００２ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸０．００２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．０００１ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．００１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸０．００２ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２〕に塗布し、３０℃で２日間培養してコロニーを形成させた。該コロニーを、２ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む寒天培地Ａ、およびｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含まない寒天培地Ａに塗布し、３０℃で２日間培養した。ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む寒天培地Ａで生育し、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含まない寒天培地Ａでは生育しない菌株を選択した。
上記で選択した菌株を寒天培地Ｂ［普通ブイヨン培地（極東製薬工業社製）２０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２］に塗布して３０℃で１日間培養した後、液体培地Ａ〔グルコース２ｇ／ｌ、硝酸アンモニウム２ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ／ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ）１０ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム［（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ］０．０３７ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．８８ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）０．３９３ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ）０．７２ｍｇ／ｌ、ホウ砂（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）０．０８８ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸０．００１ｍｇ／ｌ、リボフラビン０．００２ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．００２ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸０．００２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．０００１ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．００１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸０．００２ｍｇ／ｌ〕に２ｇ／ｌとなるようにｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を添加した４０ｍｌの培養液に、出現したコロニーの１白金耳分を植菌し、３００ｍｌ容のフラスコを用いて３０℃で１日間、振盪培養した。
培養上清をＨＰＬＣにて分析し、培養液中にｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）が残存していなかった菌株を、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を資化する能力を有する菌株として選択した。
ジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物の取得
（２）：ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を分解する能力を有する微生物のスクリーニング
実施例１で選択した菌株を寒天培地Ｂに塗布して３０℃で１日間培養した後、１白金耳量の菌体を２ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含有する４０ｍｌの液体培地Ａに植菌し、３００ｍｌフラスコを用いて、３０℃で１日間、振盪培養した。該培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を沈殿させ、該菌体を０．８５％の塩化ナトリウム水溶液に懸濁して遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）をする操作を２回繰り返した後、得られた菌体を−８０℃で１時間凍結した。
該凍結菌体を常温で融解した後、湿菌体重量が約２０ｇ／ｌになるように５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。該懸濁液０．９ｍｌおよび１０ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で８時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した。
その結果、多くの反応液でｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の減少が認められた。例えば、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株の反応液では、いずれも８時間で約０．５ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）が消失していた。
上記の菌株を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する菌株の候補とした。
（２）：ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を分解する能力を有する微生物のスクリーニング
実施例１で選択した菌株を寒天培地Ｂに塗布して３０℃で１日間培養した後、１白金耳量の菌体を２ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含有する４０ｍｌの液体培地Ａに植菌し、３００ｍｌフラスコを用いて、３０℃で１日間、振盪培養した。該培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を沈殿させ、該菌体を０．８５％の塩化ナトリウム水溶液に懸濁して遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）をする操作を２回繰り返した後、得られた菌体を−８０℃で１時間凍結した。
該凍結菌体を常温で融解した後、湿菌体重量が約２０ｇ／ｌになるように５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。該懸濁液０．９ｍｌおよび１０ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で８時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した。
その結果、多くの反応液でｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）の減少が認められた。例えば、ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株、ミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株の反応液では、いずれも８時間で約０．５ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）が消失していた。
上記の菌株を、２種のα−アミノ酸が互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する菌株の候補とした。
グリシンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）と称す］の分解活性
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌおよび５ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で８時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した結果、８時間で約０．１ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）が消失していた。
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌおよび５ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で８時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した結果、８時間で約０．１ｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）が消失していた。
ロイシンとフェニルアラニンが互いに縮合したジケトピペラジン［以下、ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）と称す］の分解活性
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌおよび３００ｍｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む７０％エタノール水溶液０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２４時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した結果、２４時間で約１０ｍｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）が消失していた。
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌおよび３００ｍｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）（Ｂａｃｈｅｍ社製）を含む７０％エタノール水溶液０．１ｍｌを２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２４時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＨＰＬＣにて分析した結果、２４時間で約１０ｍｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）が消失していた。
Ａｌａ−Ｇｌｎの生産
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株またはミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌに、終濃度がそれぞれ２ｇ／ｌおよび１ｍｍｏｌ／ｌになるように、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）および塩化コバルトを添加した１ｍｌの反応液を２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＦＭＯＣ化した後にＨＰＬＣにて分析した。結果を第１表に示す。
ミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株およびミクロバクテリウ厶 エスピーＮｏ．１１９株がｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）から生成するジペプチドに占めるアラニルグルタミンの割合は１００％であった。
実施例２で調製したミクロバクテリウム ルテオラムＮｏ．９３株またはミクロバクテリウム エスピーＮｏ．１１９株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌに、終濃度がそれぞれ２ｇ／ｌおよび１ｍｍｏｌ／ｌになるように、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）および塩化コバルトを添加した１ｍｌの反応液を２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２時間、穏やかに振盪した。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上清をＦＭＯＣ化した後にＨＰＬＣにて分析した。結果を第１表に示す。
グルタミニルアラニン（Ｇｌｎ−Ａｌａ）の生産
実施例２で調製したシノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株またはシュードモナス エスピー Ｎｏ．１０８株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌに、終濃度がそれぞれ２ｇ／ｌおよび１０ｍｍｏｌ／ｌになるように、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）およびＥＤＴＡを添加した１ｍｌの反応液を２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２時間、穏やかに振盪した。該反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を沈殿させ、上清をＦＭＯＣ化した後にＨＰＬＣにて分析した。結果を第２表に示す。
シノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．ｌ０７株およびシュードモナス エスピーＮｏ．１０８株がｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）から生成するジペプチドに占めるグルタミニルアラニンの割合は、それぞれ７３％、８７％、９４％および９２％であった。
実施例２で調製したシノリゾビウム エスピーＮｏ．１株、シノリゾビウム エスピーＮｏ．１６４株、シュードモナス エスピーＮｏ．１０７株またはシュードモナス エスピー Ｎｏ．１０８株の凍結融解菌体懸濁液０．９ｍｌに、終濃度がそれぞれ２ｇ／ｌおよび１０ｍｍｏｌ／ｌになるように、ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ−Ｇｌｎ）およびＥＤＴＡを添加した１ｍｌの反応液を２ｍｌ容のプラスチックチューブに入れて、３０℃で２時間、穏やかに振盪した。該反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して菌体を沈殿させ、上清をＦＭＯＣ化した後にＨＰＬＣにて分析した。結果を第２表に示す。
Claims (5)
- アラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有するミクロバクテリウム属、シノリゾビウム属またはシュードモナス属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源およびアラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体中からジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
- ミクロバクテリウム属に属する微生物が、ミクロバクテリウム ルテオラムである請求項１記載の製造法。
- ジペプチドがアラニルグルタミンである請求項１または２に記載の製造法。
- 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物または該菌体の固定化物、或いは該菌体の機械的破砕物または超音波処理物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
- アラニンとグルタミンが互いに縮合したジケトピペラジンからジペプチドを生産する能力を有する微生物であるミクロバクテリウム ルテオラム No.93株（FERM BP-08513）、ミクロバクテリウム エスピー（Microbacterium sp.） No.119株（FERM BP-08514）、シノリゾビウム エスピー(Sinorhizobium sp.) No.1株（FERM BP-08509）、シノリゾビウム エスピーNo.164株（FERM BP-08510）、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.） No.107株（FERM BP-08511）またはシュードモナス エスピー No.108株（FERM BP-08512）。
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